Во всем мире показатели рождаемости близнецов (определяемые как доля родов близнецов на 1000 родов) варьировались от менее 10 родов близнецов на 1000 родов в более бедных регионах Латинской Америки и Юго-Восточной Азии до до 30 родов в некоторых африканских странах в период 2010-2015 годов (Monden et al., 2021). Большая часть различий между странами, а также во времени обусловлена различиями в дизиготных (DZ) двойнях (Bortolus et al., 1999; Monden et al., 2021). В этой статье мы используем термин "двойня" для обозначения процесса, в результате которого при одной беременности рождается два или более потомка.

Близнецы DZ возникают после двойной овуляции, когда обе яйцеклетки оплодотворяются и превращаются в эмбрионы. Спонтанная DZ двойня носит семейный характер, связана с возрастом и паритетом матери и демонстрирует поразительные глобальные различия (Hall, 2003; Hoekstra et al., 2008; Smits and Monden, 2011). Частота DZ-близнецов со временем увеличилась благодаря использованию ART и увеличению возраста матерей (Monden et al., 2021). Напротив, монозиготные (MZ) близнецы редко встречаются в семьях, и их распространенность довольно сходна в мире и во времени (3-4 пары MZ на 1000 рождений) (Bulmer, 1970; Bortolus et al., 1999) и стабильна в зависимости от возраста матери (Bulmer, 1970; Hamamy et al., 2004; Hoekstra et al., 2008). Поэтому преобладает гипотеза о том, что MZ-близнецы возникают случайным образом. MZ-близнецы возникают, когда потомство одной оплодотворенной яйцеклетки делится на ранних стадиях развития, давая начало двум или более эмбрионам. Механизм, лежащий в основе MZ-близнецов, остается загадкой биологии развития человека. Частота двойни MZ несколько увеличивается после использования ART (Vitthala et al., 2009). В частности, длительное культивирование эмбрионов (т. е. культивирование бластоцисты) при ЭКО связано с увеличением частоты двойни MZ примерно в 2 раза (Vitthala et al., 2009; Ding et al., 2018; Hviid et al., 2018; Busnelli et al., 2019; Hattori et al., 2019), но механизм, ответственный за этот эффект, неизвестен.

Многоплодие ассоциирует с повышенным риском болезненности и смертности матери и потомства (D'Alton and Breslin, 2020). Понимание механизмов, задействованных в этом процессе, может быть полезным для управления предотвратимыми рисками, связанными с двойней. Здесь мы рассмотрим последние данные генетических и эпигенетических исследований близнецов.

Генетический компонент DZ близнецовости (Bulmer, 1970) неоднократно отмечался в данных по многим поколениям, которые показали, что рождение близнецов DZ группируется в семьях (Lewis et al., 1996; Meulemans et al., 1996). Этот генетический компонент, вероятно, включает материнские гены, влияющие на двойную овуляцию, а также материнские гены, влияющие на способность к успешному вынашиванию многоплодной беременности. Изначально существовал оптимизм, что сильные животные модели двойни DZ, например, работы, проведенные на овцах, приведут к идентификации генов у людей с помощью исследований генов-кандидатов. Считалось, что хорошо изученные локусы, приводящие к множественной овуляции, например, у овец породы меринос Бурула, дадут ключ к разгадке множественной овуляции у людей (Wilson et al., 2001). Мутации в трех генах, GDF9, BMP15 и BMPRB1, относящихся к пути TGFβ, важны для роста фолликулов яичников и влияют на частоту двоен у овец. У людей редкие и низкочастотные варианты в этих генах вряд ли могут быть причиной более чем небольшой доли риска близнецов DZ. Palmer et al. (2006) и Luong et al.. (2011) изучали мутации в этих генах у матерей близнецов DZ (MoDZT) из склонных близнецовых семей. Редкие варианты в кодирующих областях были обнаружены только в GDF9, и их значение было неизвестно (Palmer et al., 2006). На основании этих результатов исследователи пришли к выводу, что вариации на пути TGFβ будут иметь лишь ограниченный вклад в частоту близнецов DZ у людей.

Ранние исследования генов-кандидатов у людей предложили в качестве подходящего кандидата высокополиморфный локус ингибитора протеазы (PI) (на хромосоме 14), кодирующий альфа-1-антитрипсин (AAT). Некоторые из Z- и S-аллелей этого локуса ассоциируются с DZ-близнецами (Lieberman et al., 1979; Clark and Martin, 1982; Boomsma et al., 1992). Однако эти данные все еще нуждаются в подтверждении. Gajbhiye et al. (2018) провели обзор большинства исследований генов-кандидатов и пришли к выводу, что мы "все еще далеки от решения генетических проблем близнецов DZ".

Поиск общих генетических вариантов, т.е. генов с частотой минорных аллелей 1-50%, которые лежат в основе двойни DZ, стал возможен благодаря широкогеномным исследованиям ассоциаций (GWAS). В этом случае генетическая вариативность измеряется большим количеством однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs) по всему геному. В 2016 году Mbarek et al. (2016) проанализировали данные SNP 1980 матерей спонтанных DZ-близнецов (т. е. DZ-близнецов, рожденных без использования репродуктивных технологий) и 12 953 из контрольных групп. Исследование выявило ассоциацию с DZ-близнецами для двух SNP, которые были воспроизведены в базе данных deCODE Icelandic. Один из них был обнаружен для бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона (FSHB), а другой - для члена семьи SMAD 3 (SMAD3). Аллели риска, близкие к FSHB и SMAD3, увеличивали частоту рождения близнецов в исландской популяции на 18 % и 9 % соответственно (Mbarek et al., 2016). Гены, кодирующие FSH, всегда были сильными кандидатами на индукцию DZ-близнецов.

SMAD3 (хромосома 15) стал совершенно новой находкой для DZ-близнецов. Ведущий SNP расположен в первом интроне SMAD3. SMAD3 высоко экспрессируется в яичниках человека, стимулирует пролиферацию гранулезных клеток и стероидогенез. В области хромосомы 15q22.33 также находится член семейства SMAD 6 (SMAD6). SMAD3 и SMAD6 являются частью сигнальной системы трансформирующего фактора роста-и (TGFβ)/BMP. Человеческая область 15q22.33, содержащая SMAD3 и SMAD6, гомологична области на хромосоме 10 в геноме крупного рогатого скота. Этот регион ассоциирован с двойней и повышенной частотой овуляции у крупного рогатого скота (Kirkpatrick and Morris, 2015; Kamalludin et al., 2018). SNPs, ассоциированные с двойней DZ, также влияют на другие репродуктивные признаки у женщин, включая более ранний возраст рождения первого ребенка, большее общее количество детей в течение жизни, более ранний возраст наступления естественной менопаузы и более низкий риск развития синдрома поликистозных яичников (PCOS) (Hayes et al., 2015; Lyle et al., 2023). Аллель rs17293443-C в SMAD3 был связан только с более поздним возрастом рождения последнего ребенка. Обсуждалась роль rs11031006, расположенного в высоко консервативной области перед геном FSHB человека, в различных аспектах фертильности (Bohaczuk et al., 2021). Авторы предположили, что этот регион регулирует транскрипцию FSHB, и обнаружили, что минорный аллель rs11031006 повышает транскрипцию FSHB за счет увеличения связывания стероидогенного фактора 1 (SF1) с энхансером, это указывает на то, что rs11031006 может модулировать уровень FSH. Более крупный мета-анализ GWAS (GWAMA), включающий 8265 MoDZT и 26 252 DZ-близнеца (прокси для признака "быть матерью DZ-близнецов"), а также 682 000 контролей, подтвердил ассоциацию с FSHB и SMAD3 (Mbarek et al., 2023). Мета-анализ также выявил значимые генетические регионы, вовлеченные в женскую фертильность, такие как гонадотропин-рилизинг гормон 1 (GNRH1) и рецептор фолликулостимулирующего гормона (FSHR). GNRH1 и FSHR участвуют в том же гормональном пути, что и FSHB, приводящем к овуляции (Casarini and Crйpieux, 2019). Также были выявлены другие геномные регионы с пока неизвестными ассоциациями с женской фертильностью, такие как ZFPM1 и IPO8. Генные тесты выявили ARL₁₄EP в качестве причинного гена в области FSHB на хромосоме 11. ARL₁₄EP ранее был связан с другим репродуктивным фенотипом - PCOS (Lyle et al., 2023), что подчеркивает связь между DZ-близнецами и другими признаками женской фертильности. Однако механизм (механизмы), с помощью которого ARL₁₄EP влияет на фертильность, остается неясным. Несмотря на то что генные тесты указывают на ARL₁₄EP как на причинный ген, они не исключают FSHB, и оба гена, вероятно, влияют на процессы, приводящие к DZ-близнецам. Несколько совпадений оказались чуть ниже порога значимости для всего генома, и ожидается, что в процесс двойни DZ будет вовлечено больше генетических регионов. Увеличение размера выборки и включение большего числа предков в пока еще только европейские когорты поможет выявить другие геномные регионы, тем более что распространенность близнецов DZ сильно варьирует в зависимости от предков (Monden et al., 2021).

Существует очень мало доказательств генетического вклада в возникновение MZ-близнецов. Частота MZ-близнецов после ART в 2,25 раза выше по сравнению со спонтанными зачатиями (Vitthala et al., 2009), при этом наибольшим фактором риска является длительная культура эмбрионов (т. е. культура бластоцисты) при ЭКО (Vitthala et al., 2009; Ding et al., 2018; Hviid et al., 2018; Busnelli et al., 2019; Hattori et al., 2019). Частота MZ-близнецов в 10 раз выше среди пациентов с синдромом Beckwith–Wiedemann (Weksberg, 2002; Bliek et al., 2009), нарушением импринтинга, риск которого также повышается после ART (Doornbos et al., 2007; Brioude et al., 2018). ART может влиять на эпигенетические метки в организме плода и плаценты: в исследованиях на людях и животных сообщается об изменениях в метилировании ДНК в импринтированных генах, повторяющихся элементах и других геномных локусах (Mani et al., 2020). На правильное эпигенетическое программирование потенциально влияют многие аспекты ART , включая манипуляции с эмбрионом, культивирование и перенос, а также воздействие на гаметы и/или эмбрионы изменений уровня гормонов, температуры, pH и напряжения кислорода (Mani et al., 2020).

MZ близнецы появляются в критические периоды для эпигенетического (пере)программирования. Первая волна глобального эпигенетического перепрограммирования происходит во время гаметогенеза (Hales et al., 2011). Затем, вскоре после оплодотворения, начинается следующий раунд эпигенетического перепрограммирования, и предимплантационный эмбрион проходит несколько волн глобального деметилирования ДНК, за которыми следует метилирование de novo (Zhu et al., 2018). Эти волны совпадают с дифференцировкой изначально плюрипотентных клеток в различные клеточные линии. Правильное формирование паттернов метилирования ДНК жизненно важно для эмбрионального развития (Jones, 2012). Эпигенетическая регуляция экспрессии генов контролирует функциональную активность промоторов генов, энхансеров и других регуляторных областей генома. При метилировании ДНК - основном механизме эпигенетической регуляции - метильная группа (CH3) добавляется к цитозин-фосфат-гуаниновым (CpG) динуклеотидам в геноме. Аденин, тимин, цитозин и гуанин - четыре строительных блока ДНК. Перенос метильной группы в положение C5 цитозина в определенных местах генома может регулировать экспрессию генов и имеет решающее значение для тканеспецифических процессов. Метилирование ДНК и другие репрессивные эпигенетические модификации, например модификации гистонов, отвечают за подавление эмбриональных генов в дифференцированных клетках и поддержание специфической для родителей экспрессии импринтированных генов (Jones, 2012; Slieker et al., 2015).

Вдохновленные ранее зарегистрированными ассоциациями между MZ-близнецами, искусственными репродуктивными технологиями (ART) и нарушениями импринтинга, мы обратились к геномному эпигенетическому исследованию ассоциаций (EWAS), связанных с принадлежностью к MZ-близнецам. С помощью мета-анализа были объединены эпигенетические данные из четырех стран (van Dongen et al., 2021a).

Данные о метилировании ДНК, полученные из образцов крови и проб со щек, были проанализированы в шести независимых когортах близнецов: двух из Нидерландов, двух из Великобритании, одной когорте из Финляндии и одной из Австралии (van Dongen et al., 2021a). Контрольную группу составили DZ-близнецы, которые, как и MZ-близнецы (но в отличие от одиночек), имели схожие пренатальные условия, что позволило проконтролировать возможное влияние совместного пребывания в утробе матери с близнецом. В исследовании не проводилось различий между MZ-близнецами, родившимися после спонтанной беременности, и близнецами, зачатыми с помощью ART, поскольку эта информация была доступна не для всех близнецов в данном исследовании. Однако большинство близнецов родились до внедрения АРТs.

Профили метилирования ДНК были получены с помощью метилирующих массивов Illumina, в основном массива Illumina Infinium 450k, который измеряет ~450 000 CpG-сайтов, и нового массива Illumina Infinium EPIC, который захватывает ~850 000 CpG-сайтов. Использование микрочипов метилирования ДНК позволяет исследовать сайт-специфическое метилирование ДНК во всем геноме человека, а также обеспечивает высокую пропускную способность образцов. Консорциум Dutch Biobank-Based Integrative Omics Study (BIOS) (Sinke et al., 2022) разработал в Нидерландах процедуры контроля качества (QC), предварительной обработки и анализа данных массивов метилирования ДНК.

На первом этапе был проведен анализ обнаружения данных о метилировании ДНК (из образцов цельной крови) взрослых близнецов MZ и DZ (средний возраст 35 лет) из Нидерландского регистра близнецов (NTR). В анализ был включен один случайно выбранный близнец из каждой пары 924 пар MZ-близнецов (всего 924 человека) и 1033 пары DZ-близнецов (включая 419 пар близнецов, в которые были включены оба близнеца из одной пары). В результате анализа было выявлено 243 дифференциально метилированных позиции (DMP) между близнецами MZ и близнецами DZ. Размер эффекта варьировал от 0,3 до 6 % разницы в уровнях метилирования ДНК. Повторные анализы были проведены в четырех независимых когортах с использованием ДНК, выделенной из образцов крови взрослых людей со средним возрастом от 18 до 58 лет, и выявили сильное совпадение эффектов: корреляции (r) между размерами эффектов варьировали от 0,84 до 0,97. Эффекты, выявленные в образцах ДНК взрослых близнецов, также показали сильное совпадение с эффектами в образцах ДНК детей, полученных из другой ткани, имеющей четкую эмбриональную клеточную линию, - клеток щек (r = 0,87). Образцы щек состоят в основном из эпителиальных клеток (Theda et al., 2018; van Dongen et al., 2018), которые происходят из эктодермальной линии, в то время как лейкоциты происходят из мезодермальной линии клеток. Было проведено несколько анализов чувствительности: Метилирование ДНК у MZ-близнецов сравнивалось с метилированием ДНК у не близнецов (родителей, братьев и сестер); метилирование ДНК у DZ-близнецов сравнивалось с метилированием ДНК у не близнецов; анализ повторялся в полных парах близнецов и в случайно выбранном близнеце из каждой пары; анализ повторялся отдельно для пар близнецов мужского и женского пола. Разница в метилировании ДНК между близнецами MZ и другими группами была очень устойчивой во всех сравнениях, в то время как близнецы DZ не отличались заметно от не близнецов, это указывает на то, что результаты первичного EWAS в основном отражают дифференциальное метилирование ДНК у близнецов MZ.

Все результаты EWAS крови из всех пяти независимых когорт близнецов были впоследствии объединены в мета-анализе (общий объем выборки = 5723); это позволило выявить 834 CpG (рис. 1), которые значительно отличались между MZ-близнецами и DZ-близнецами. Мы называем их "MZ-DMPs": из них 497 (60 %) имели более низкий уровень метилирования у MZ-близнецов (MZ-hypo-DMPs), а 337 (40 %) - более высокий уровень метилирования (MZ-hyper-DMPs).

Figure 1. Monozygotic (MZ) twinning DMPs identified in a meta-analysis of data from 5723 twins. Воспроизведено с разрешения из Nature Communications 2021 (van Dongen et al., 2021a)...

Чтобы получить некоторое представление о свойствах MZ-DMPs, мы оценили их корреляцию в продольных образцах крови, корреляцию между различными тканями и их наследуемость (т.е. степень, в которой вариации DMPs объясняются наследственными вариациями ДНК).

Характеристика корреляции между продольными уровнями метилирования ДНК в повторных образцах крови, собранных в среднем с интервалом в 5 лет, показала, что MZ-DMPs имеют в среднем промежуточный уровень метилирования в крови (среднее = 0,52) и высоко стабильны во времени (средняя продольная корреляция = 0,85). Высокая стабильность ожидается для участков, уровень метилирования которых устанавливается в раннем возрасте, и это указывает на высокую надежность измерения метилирования ДНК.

Чтобы изучить корреляцию между тканями, мы рассмотрели корреляцию между образцами крови и образцами со щёк от одних и тех же людей (van Dongen et al., 2016), а также между образцами крови и посмертными образцами мозга, основываясь на ранее опубликованных данных о метилировании из сопоставленных образцов крови и мозга (Hannon et al., 2015). Некоторые из CpG показали сильную корреляцию между уровнями метилирования в крови и клетках щёк (средняя корреляция по всем CpG составила 0,44), а также между кровью и мозгом (средняя r = 0,27-0,43, для четырех различных областей мозга). В недавнем исследовании были охарактеризованы CpG, которые гипервариабельны в разных тканях (hvCpGs), но уровень метилирования которых коррелирует между тканями, полученными из разных зародышевых слоев (Derakhshan et al., 2022). В этих CpG уровень метилирования, вероятно, устанавливается в раннем эмбрионе (т. е. до формирования различных зародышевых слоев) (Derakhshan et al., 2022). Интересно, что значительная часть (37 %) MZ-DMPs входила в список hvCpGs, выявленных в недавней работе (Derakhshan et al., 2022). Аналогичным образом, среди MZ-DMP наблюдалось сильное обогащение для предполагаемых метастабильных эпи-аллелей (MEs) человека. MEs - это локусы с сильно варьирующим состоянием метилирования (даже у генетически идентичных индивидуумов), но в пределах индивидуума состояние метилирования в таких локусах является системным (стабильным в разных тканях) (Rakyan et al., 2002). MEs обогащены вблизи определенных классов транспозируемых элементов, включая длинные промежуточные ядерные элементы (LINEs) и эндогенные ретровирусы (ERVs) (Silver et al., 2015; Kessler et al., 2018). Считается, что на уровень метилирования в MEs влияют генотип, периконцепционное воздействие окружающей среды и, предположительно, стохастические процессы. Ранее было описано, что MEs демонстрируют "эпигенетическое суперподобие" междуMZ близнецами (van Baak et al., 2018). Обогащение MEs среди MZ-DMPs поразительно, поскольку состояние их метилирования устанавливается примерно в момент имплантации эмбриона (Kessler et al., 2018). Это совпадает со временем, когда, как считается, происходит большинство случаев двоен MZ (дающих начало монохориальным диамниотическим близнецам MZ).

Наконец, мы изучили наследственность, то есть то, могут ли наблюдаемые нами паттерны метилирования ДНК быть подвержены влиянию геномных вариаций (вариаций последовательности ДНК). Для этого мы сравнили степень сходства MZ- и DZ-близнецов (van Dongen et al., 2016). Паттерн близнецовых корреляций в крови показал, что корреляции уровня метилирования 834 сайтов MZ-DMP у близнецов MZ в среднем почти в три раза больше, чем у близнецов DZ (средняя корреляция MZ = 0,58, средняя корреляция DZ = 0,20), это означает значительную наследуемость, которая в среднем намного больше, чем средняя наследуемость 19 % всех геномных аутосомных сайтов метилирования (van Dongen et al., 2016). Такая картина близнецовых корреляций согласуется с неаддитивными генетическими эффектами (доминирование или эпистаз) или может возникнуть, если состояние метилирования устанавливается до дробления эмбриона в случае MZ-близнецов, которые, следовательно, имеют сходные уровни метилирования после расщепления, в то время как оно устанавливается отдельно в двух эмбрионах в случае DZ-близнецов, которые, следовательно, имеют менее сходные уровни метилирования ДНК (van Baak et al., 2018).

Для 184 пар MZ-близнецов, включенных в Нидерландский регистр близнецов в рамках проекта EWAS, данные о хориальности были доступны благодаря соединению данных детской когорты NTR с Национальным автоматическим архивом патологической анатомии Нидерландов (PALGA) (van Beijsterveldt et al., 2016). Была выдвинута гипотеза, хотя эмпирически она никогда не демонстрировалась, что если зигота расщепляется вскоре после оплодотворения, то возникают дихориальные MZ-близнецы, тогда как расщепление через 3 дня после оплодотворения приводит к монохориальным близнецам (Beck et al., 2021). Сравнивали метилирование ДНК щек в трех группах: (i) дихориальные MZ близнецы (~1/3 всех MZ близнецов, и предположительно возникшие в результате раннего расщепления), (ii) монохориальные диамниотические MZ близнецы (~2/3 всех MZ близнецов), и (iii) монохориальные моноамниотические MZ близнецы (более 1% MZ близнецов, и предположительно возникшие в результате позднего расщепления) (Machin, 2005). В целом, корреляции между MZ-близнецами из этих трех групп не показали различий при рассмотрении участков метилирования в масштабе всего генома. Напротив, MZ-DMP показали более сильное сходство у монохориальных моноамниотических близнецов MZ (среднее r = 0,57), и несколько меньшее сходство у монохориальных диамниотических близнецов (среднее r = 0,45) и дихориальных близнецов MZ (среднее r = 0,41). Небольшие средние различия были обусловлены подмножеством МЗ-DMPs, которые показали более значительные различия. Одним из объяснений этой закономерности может быть то, что часть состояния метилирования устанавливается до расщепления монохориальных близнецов. В локусах, где состояние метилирования устанавливается очень рано, близнецы, расщепившиеся позже, с большей вероятностью унаследуют то же состояние метилирования через митоз, чем близнецы, расщепившиеся раньше, до установления состояния метилирования. Однако группы были небольшими, и результаты исследования требуют повторения.

Если посмотреть на геномные локализации MZ DMPs (рис. 1), то бросается в глаза обогащение вблизи теломер и центромер: DMPs с более низким уровнем метилирования у близнецов MZ (MZ-гипо-DMPs) гораздо чаще, чем случайно, встречались вблизи теломер (45 % всех MZ-гипо-DMPs), а DMPs с более высоким уровнем метилирования у близнецов MZ (MZ-гипер-DMPs) группировались вблизи центромер (41 % MZ-гипер-DMPs). MZ-гипо-DMPs и MZ-гипер-DMPs также были обогащены в межгенных регионах и CpG-островах. Сильное обогащение для MZ-гипо-DMPs также наблюдалось в регионах с репрессией Polycomb (Kundaje et al., 2015), обычно связанных с транскрипционно замалчиваемыми генами развития и характеризующихся H3K27me3 (триметилирование лизина 27 гистона H3). С другой стороны, MZ-гипер DMPs были обогащены двумя другими состояниями хроматина, связанными с конденсированной ДНК, содержащей более широкую группу транскрипционно репрессированных регионов, а именно гетерохроматином и состоянием хроматина, связанным с "генами и повторами ZNF". Гетерохроматин - это плотно упакованная форма конденсированной ДНК, обычно встречающаяся вокруг теломер и центромер.

Факторы транскрипции (TF) - это белки, которые инициируют и регулируют транскрипцию своих целевых генов путем связывания с их специфической последовательностью узнавания (т.е. мотивом) в ДНК. Метилирование мотивов TF является общим механизмом, связанным с глушением экспрессии целевого гена. Чтобы получить некоторое представление о функциональных последствиях MZ-DMPs, мы изучили их перекрытие с сайтами связывания TF в ДНК. MZ-DMPs были обогащены сайтами связывания различных TFs, экспрессируемых в ранних эмбрионах, включая homeobox TFs, которые являются хорошо известными регуляторами экспрессии генов и дифференцировки клеток в раннем эмбриональном развитии. Затем были проанализированы гены-мишени, регулируемые обогащенными TFs. Целевые гены были вовлечены в ранние эмбриональные процессы, включая "переднюю/заднюю спецификацию паттерна", "эмбриональное развитие хордовых" и "развитие нервной трубки". Анализ путей, основанный на ближайших генах MZ-DMPs, показал обогащение путей, включая "спецификацию клеточной судьбы", "клеточную адгезию" и "сигнализацию Wnt". Будущие функциональные исследования должны изучить, как эти пути могут быть связаны с возникновением MZ близнецов.

Опубликованные результаты Genetics of DNA Methylation Consortium (Min et al., 2021) содержат количественные локусы метилирования (mQTL); это локусы, несущие генетические варианты, связанные с уровнем метилирования близлежащих CpG (т.е. цис- mQTLs) или с уровнем метилирования удаленных CpGs (т.е. транс- mQTLs). Уровень метилирования в MZ-DMPs был связан с цис- и транс mQTLs. Интересно, что транс mQTLs включали несколько ключевых локусов эпигенетических модификаторов, таких как TRIM28 и DNMT3B, а также ключевые регуляторы плюрипотентности DPPA4 (Maldonado-Saldivia et al., 2007; Masaki et al., 2007) и DPPA2 (Hernandez et al., 2018). Транс mQTLs - это локусы, в которых генотип связан с уровнем метилирования CpG на расстоянии более 1 Мб, и они могут регулировать множество генов. При рассмотрении транс-mQTL, связанных с метилированием в MZ-DMPs, количество MZ-DMPs, затронутых каждым транс-QTL, варьировало от 1 до 15.

При ряде врожденных заболеваний наблюдается повышенная частота MZ-близнецов среди пораженных особей, например, почти 10-кратное увеличение частоты MZ-близнецов (Weksberg, 2002; Bliek et al., 2009) при синдроме Beckwith–Wiedemann (MIM130650) (Myrianthopoulos, 1976; Schinzel et al, 1979; Hall, 2003; Glinianaia et al., 2008; Pharoah and Dundar, 2009; Holmes, 2012) и Amyoplasia (Hall, 2021), а также в 3-10 раз выше частота MZ-близнецов среди младенцев с различными типами дефектов нервной трубки (Kdllйn et al., 1994; van Dongen et al., 2021b). Другой яркий пример - сиреномелия (синдром русалки), редкий врожденный порок развития, при котором ноги ребенка срастаются. Сообщалось, что частота встречаемости этого порока в 100 раз выше у MZ-близнецов (Davies et al., 1971). Для таких нарушений была выдвинута гипотеза, что пораженные одиночки начали жизнь как пара MZ-близнецов в утробе матери без ее ведома - так называемый синдром исчезающего близнеца (Jauniaux et al., 1988; Landy and Keith, 1998). В настоящее время инструменты для исследования этой гипотезы отсутствуют.

По оценкам, 12 % беременностей у людей могут начинаться с многоплодия (MZ или DZ), но большая часть из них сопровождается потерей всех эмбрионов или одного исчезающего близнеца, в результате чего до срока донашивается менее 2 % многоплодных беременностей (Boklage, 1990). Эти оценки были получены путем подгонки кривых к зарегистрированным показателям выживаемости на различных эмбриональных/плодных стадиях близнецов, выявленных ультразвуком, а также зарегистрированной частоте близнецов среди выкидышей и мертворожденных, и последующей экстраполяции на вероятность выживания до клинического распознавания беременности (Boklage, 1990). Отдельные оценки для MZ- и DZ-близнецов отсутствуют.

Чтобы проверить, насколько хорошо можно предсказать статус MZ-близнецов, был разработан классификатор MZ-близнецов на основе метилирования ДНК. С помощью penalized регрессионных моделей интересующий нас признак, в данном случае "принадлежность к MZ-близнецам" с двумя уровнями (да/нет), был регрессирован на уровни метилирования ДНК на большом количестве геномных участков. Цель состояла в том, чтобы выявить подмножество участков метилирования ДНК с наилучшими предсказаниями и получить формулу для предсказания принадлежности к MZ-близнецам на основе уровней метилирования ДНК в этих участках. Мы использовали модели эластичной регрессии, которые допускают некоторую степень корреляции между участками метилирования ДНК в модели. Модели были обучены с помощью 10-кратной кросс-валидации. Предиктор достиг площади под кривой (AUC) 0,77 в когорте NTR (N~1000 образцов крови в тестовом наборе данных) и AUC 0,80 в независимом наборе данных близнецов из Австралии (N = 606 образцов крови). Показатели были аналогичными для ДНК щёк (N = 1237) и для монохориальных или дихориальных MZ-близнецов.

AUC - это функция чувствительности и специфичности. В тестовом наборе данных из Нидерландского регистра близнецов чувствительность, то есть доля правильно предсказанных близнецов MZ, составила до 84 %, а специфичность, то есть доля близнецов DZ, правильно классифицированных как не-MZ, составила 57 %. До 63% членов семьи были правильно классифицированы как не-MZ. В данных из Австралии чувствительность была выше, но специфичность ниже: до 92 % близнецов MZ были правильно предсказаны как близнецы MZ, до 47 % близнецов DZ были правильно предсказаны как не-MZ, и до 45 % членов семьи были правильно предсказаны как не-MZ близнецы. Данный предиктор тестировался только на близнецовых когортах, и DZ-близнецы и члены семьи в обучающих и тестовых наборах данных могли включать неизвестное количество MZ-многояйцевых близнецов, если DZ-близнецы или другие члены семьи имели исчезающего со-близнеца.

Прогностическая точность показателя метилирования ДНК MZ не достигает 100 %, но уже сейчас он может стать ценным биомаркером MZ-близнецов, который можно использовать для изучения гипотезы исчезающих близнецов при заболеваниях, которые тесно связаны с MZ-близнецами, таких как синдром Беквита-Видеманна (Weksberg, 2002; Bliek et al, 2009), амиоплазия (Hall, 2021) и дефекты нервной трубки, включая анэнцефалию и spina bifida (van Dongen et al., 2021b), путем получения показателей метилирования у пациентов, которые представлены как одиночки.

Полученные данные дают убедительные намеки на эпигеномное событие у MZ-близнецов, но остаются регистрируемыми и могут представлять собой причину, следствие или побочный продукт события MZ-близнецов. Подобный характер был выявлен у взрослых близнецов и воспроизведен у детей. Основываясь только на этих данных, невозможно сказать, когда эта характеристика установлена. Необходимы дальнейшие функциональные исследования на клеточных или животных моделях, чтобы определить, как именно эта сигнатура связана с MZ-близнецами.

Частота MZ-близнецов увеличивается после AРТ, причем наибольшим фактором риска является длительная культура эмбрионов (т. е. культура бластоцисты) при ЭКО (Vitthala et al., 2009; Ding et al., 2018; Hviid et al., 2018; Busnelli et al., 2019; Hattori et al., 2019). Механизмы, лежащие в основе этой ассоциации, еще предстоит выяснить. Необходимы исследования, изучающие влияние методов культивирования на эпигенетическую сигнатуру двойников MZ.

Несмотря на то, что эпигенетическая сигнатура близнецов MZ является ценным инструментом для исследований, мы считаем, что она не совсем готова для прогнозирования на индивидуальном уровне. Хотя мы признаем, что существует спрос на такой тест со стороны людей, ищущих убедительные доказательства того, что они являются единоутробными близнецами, специфичность теста слишком низка для прогнозирования на индивидуальном уровне.

Обнаружение сильной и стабильной эпигенетической сигнатуры у MZ-близнецов указывает на метилирование ДНК как на биологический маркер, на котором в дальнейшем могут быть сосредоточены функциональные исследования для выяснения биологии MZ-близнецов. Данные о близнецах DZ получены в результате анализа геномных ассоциаций, а ассоциация между признаком и вариантом ДНК также требует дальнейшей работы для установления причинно-следственных вариантов. Важно отметить, что до сих пор исследования проводились в европейских популяциях близнецов. Будущие исследования в различных популяциях, вероятно, будут способствовать более тонкому картированию причинных вариантов и позволят лучше понять, почему показатели близнецов так сильно различаются в разных странах (Smits and Monden, 2011; Monden et al., 2021). Полученные недавно данные уже открывают множество возможностей для определения на индивидуальном уровне либо полигенной оценки риска двойни DZ у женщин, либо метилированной сигнатуры двойни MZ. Остаются интригующие вопросы. Например, существует ли фенотипическое выражение у мужчин высокого полигенного риска двойни DZ? И имеет ли фенотипические последствия характер метилирования ДНК MZ-близнецов?