The organization and evolution of K⁺ channel genes

Эволюция K⁺ каналов указывает на то, что они являются древними белками не высоко специализированными neuro-machines. Все полностью секвенированные геномы - эукариотические, эубактериальные и archaeal - содержат, по краней мере, один K⁺ канал. Ни один из типов ионных каналов не обладает такой повсеместностью. K⁺ каналы являются членами основателями 'S4-superfamily' ионных каналов, предназначенных для передачи электрических сигналов, далеких от K⁺ каналов, обнаруживаемых исключительно у эукариот. Циклическими нуклеотидами-запираемые каналы развиваются из K⁺ каналов путем приобретения ими домена, связывающего циклические нуклеотиды вблизи N-конца; Ca²⁺ и Na⁺ каналы, каждый из которых является мономером, содержащим 4 внутренних повтора, развиваются из K⁺ каналов посредством двух удвоений гена, Ca²⁺ каналы появляются у одноклеточных организмов, таких как протисы, а Na⁺ каналы возникают с появлением нейронов у многоклеточных организмов. Поры-формирующие последовательности этих нейронально специализированных каналов участвуют в создании альтернативной ионной специфичности.

У людей, многие, но не все гены K⁺ каналов подвергаются множественному сплайсингу. are multiply spliced. В некоторых случаях, вся кодирующая область лежит внутри одного экзона, тогда как в другирх она сегментирована на множественные экзоны, которые в некоторых, но не во всех, примерах четко соответствуют функциональным доменам. Гены K⁺ каналов в целом не обнаруживают хромосомного кластрирования.

Characteristic structural features of K⁺ channels

Имеется два больших класса K⁺ каналов, определяемых с помощью трансмембранной топологии: six-transmembrane-helix voltage-gated (K_v) и two-transmembrane-helix inward-rectifier (K_ir) субтипы (Рис. 1). Все K⁺ каналы обладают 'signature sequence' между двумя наиболее С-терминальными трансмембранными спиралями, которые считываются с минорыми вариациями TMxTVGYG (используя однобуквенный аминокислотный код ). Кроме того, все K_v-типа каналы имеют чрезвычайно необычные 'S4 последовательности' , в которых лизин или аргинин появляются в каждой третьей или четвертой позиции во всем остальном гидрофобном участке, создавая четвертый трансмембранный сегмент. Известны и некоторые вариации признаков этой большой последовательности; 'slowpoke' подсемейство Ca²⁺-aктивируемых K⁺ каналов, которое архитектурно сходно с K_v субтипом, но имеет добавочный трансмембранный сегмент вблизи N-конца, а также '2P' каналы, имеющие субъединицу, которая тандемно спаривается с двумя последовательностями K⁺ канала. (Большинство 2P каналов формируются из пар K_ir-подобных последовательностей, но мало известно, с каким K_v-типом и K_ir-типом связаны они в тандем.)

Структурная информация на сегодня ограничена K⁺ каналами из одиночного бактериального белка, KcsA, топологии K_ir (Рис. 2). Однако структурные интерполяции на базе электрофизиологических экспериментов на эукариотических каналах K⁺ находятся в такой прекрасной гармонии со структурой бактериальных каналов, что м. с уверенностью экстраполировать структурные свойства с KcsA на все семейство. K⁺ каналы формируются в виде тетрамеров из идентичных или сходных субъединиц, ранжированных в четырехстороннюю симметрию вокруг заполненного водой ион-проводящего пути (за исключением 2P тандемных каналов, которые преимущественно димеры. ) Общим для всех субъединиц K⁺ канала является структурная сердцевина, состоящая из двух трансмембранных спиралей, легко идентифицируемая по алгоритму гидрофобности, разделенная с помощью re-entrant pore-loop, несущей сигнатурную последовательность (Рис. 1). Наиболее С-терминальная трансмембранная спираль и сигнатурная последовательность формируют большую часть выстилки aqueous поры и поэтому несут структурные детерминанты высокой K⁺ избирательности, присущей большинству K⁺ каналов. Трансмембранный участок водной поры KcsA за счет интерференции с др. K⁺ каналами, является высоко симметричным. Самая узкая часть поры, 'selectivity filter', диаметром в 3 Å трубка, внезапно начинающаяся на внеклеточной стороне белка и распространяющаяся обычно в плоскости мембраны на 10-15 Å. Стенка этой структуры незаряжена, но высоко гидрофильна, выстлана в основном двенадцатью backbone carbonyl группами, по три от каждой субъединицы. Пора затем расширяется до 10 Å сферической, заполненной водой послости примерно на полпути через мембрану. Стенка этой полости сконструирована в основном из aliphatic боковых цепочек, выляется в противовес интуитивности гидрофобной по природе, т.к. является внутриклеточной концевой порой. В KcsA структуре (Рис. 2), пора закрытана внутриклеточной стороне за счет пересечения четырех трансмембранных спиралей в 'teepee'-подобную структуру; эта преграждающая область почти определенно представляет собой закрытое состояние , аналогичное 'gate' K_v каналов, конформационному переключению, как известно, открывающему и закрывающему пору. И в K_v и при K_ir топологии, оба С- и N-концы располагаются на цитоплазматической стороне мембраны.

В six-transmembrane K_v каналах первые четыре трансмембранные сегменты, S1-S4, формируют модуль, который каким-то образом контролирует открытие и закрытие поры (Рис. 3). Первые три из этих сегментов возможно являются спиральными почти по всей своей длине и локализованы на lipid-exposed периферии membrane-embedded комплекса. Четвертый трансмембранный сегмент, S4, который не подвергается воздействию липидов, как полагают, образует чувствительный к напряжению (voltage) элемент этих каналов. Эти S4 последовательности обнаруживаются также в некоторых классах каналов , которые имеют низкую или не имеют voltage-зависимой пропускной способности, такой как Ca²⁺-активируемые K⁺ каналы и циклическими нуклеотидами контролируемые каналы.

Все K_v каналы имеют законсервированный домен, обозначаемый T1, в области непосредственно примыкающей к N-терминальной стороне первой трансмембранной спирали. Известна структура растворимого, выделенного T1 домена канала K_v1.1 из Aplysia californica (Рис. 4). Эта структура сохраняется в интактном канале в определенной 'hanging gondola' формации, в которой тетрамерный T1, co-axial с порой, отделен примерно 20 Å от membrane-embedded части канала, соединенной с помощью нитей белка, которые предопределяют окно ( 'windows') примерно в 20 Å шириной, через которое ионы получают доступ на внутриклеточную сторону поры. Большинство, если не все K_v каналы ассоциированы с врунтриклеточной, глбулярной 'β subunits' с неизвестной функцией, которая связывает нижнюю часть T1 домена.

Localization and function

K⁺ каналы обнаруживаются во множестве различных типов клеток, выполняющих столь различные биологические задачи, что невозможно суммировать все их. Все K⁺ каналы, однако, выполняют одну базовую функцию: формирование трансмембранной текучести ( 'leak') чрезвычайно специфичной для ионов K⁺. Т.к. клетки почти универсально поддерживают цитоплазматические концентрации K⁺ значительно более высокие, чем вне клеток, то открытие K⁺ канала автоматически ведет к negative-going изменениям в электрическом напряжении поперек клеточной мембраны. Эта 'membrane hyperpolarization' происходит в различных физиологических контекстах для варьирующих целей. Она происходит, напр., при завершении потенциала действия в электрически возбудимых клетках, таких как нервы, мышцы, гормон-секретирующие adrenal chromaffin и панкреатические β клетки. Но более тонкие функции известны в невозбудимых клетках. K⁺ каналы играют критическую роль в клеточном рециклинге K⁺, необходимом для электролитического баланса, поддерживаемого с помощью почечного эпителия; в гиперполяризации T и B клеток, являющейся предварительным условием для митогенеза и пролиферации в иммунном ответе; в электрической настройке механосенсорных клеток в слуховой трансдукции, которая является центральной в кинетике пропускания K⁺ канальцев; в защитных клетках из зеленых растений, нуждающихся в K⁺ каналах для регуляции осмотиечкого тока, необходимого для регуляции газового и водного обмена в листьях; даже в эритроцитах, часто рассматриваемых как пассивный багаж с гемоглобином, используются K⁺ каналы, возможно для регуляции объема и поддержания клеточной формы.

В целом, активность K⁺ каналов эффективно и тонко регулируется с помощью ткане-специфического контроля транскрипции и с помощью биохимического действия на белки каналов. Некоторые K⁺ каналы постоянно активны, но большинство действует временами, будучи пропускными ('gated') в ответ на физиологические сигналы. K_v каналы активируются с помощью деполяризующих изменений напряжения (voltage); некоторые Ca²⁺-активирумые K⁺ каналы чувствительны как к напряжению, так и уровню Ca²⁺ в цитоплазме, тогда как др. отвечают только на Ca²⁺; разные классы K_ir каналов непосредственно открываются внутриклеточными факторами, такими как G белки, нуклеотиды, или полиамины. Кроме того, фосфорилирование белка часто модулирует чувствительность K⁺ каналов к их первичным физиологическим сигналам или само выступает в качестве активирующего сигнала.

K⁺ каналы обнаруживаются в основном в плазматических мембранах, но в целом они не случайно распределены по клеточной поверхности. Напр., некоторые K⁺ каналы несут последовательности, которые позволяют им ассоциировать с поддерживающими (scaffolding) белками, конкурируя за белок-взаимодействующие последовательности, такие как PDZ домены. Это свойство делает возможным механизм кластрирования каналов в специфических областях нейрона, напр., обеспечивая ко-локализацию в пресинаптических окончаниях Ca²⁺-активруемых KMechanism of permeation and gating

Наиболее фундаментальной задачей всех K⁺ каналов является катализ быстрого проникновения ионов K⁺ и отторжение биологически многочисленных потенциальных конкурентов, таких как Na⁺, Ca²⁺, и Mg²⁺. Недавнее выяснение структуры KcsA проливает свет на молекулярные детали этого каталитического механизма. Имеется два свойства каналов, существенных для достижения утонченной ионной избирательности и прохождения с высокой скоростью K⁺: во-первых, точная координация дегидратированных с помощью белка K⁺; во-вторых, присутствие множественных ионов внутри пути проникновения. Основной идеей является то, что K⁺ каналов поры имеют электронегативные кислородные половинки - как теперь известно, могущие быть основными остовом carbonyl групп сигнатурных последовательностей - расположенные в виде клетки (решетки), с которой дегидратированный ион K⁺ в точности совпадает, но с которой ион Na⁺ совпадает настолько плохо, что энергетически предпочитает оставаться в водном растворе. Др. словами, K⁺ тесно связывается с порой. Уже это одно свойство обеспечивает высокую избирательность для K⁺, но оно не позволяет проходить с высокой скоростью канал, т.к. для этого плотная связь иона медленно диссоциирует от его стенок. Чтобы достичь высокой скорости диссоциации, три ион-связывающих сайта, расположеные в одном файле внутри поры, находятся достаточно близко, чтобы ионы электростатически отталкивали др. др.

Хотя неизвестна структура высокого разрешения K_v каналов, однако известны некоторые основные характеристики пропускной способности этих voltage-зависимых каналов. Центральным событием, инициирующим открытие канала, является движение наружу S4 трансмембранного сегмента, (Рис. 3b), т.к. этот сегмент несет многочисленные позитивно заряженные остатки, то это конформационное движение энергетически обеспечивается деполяризующим напряжением (voltage). Известно лишь, что открытие K_v каналов является прямым следствием движений S6 вблизи внутриклеточного конца поры.

Другой тип пропуска у некоторых K_v каналов называется 'N-type inactivation', это процесс, ведущий к спонтанному закрытию канала в ответ на поддерживаемую деполяризацию. Конформационные изменения, вызывающие эту инактивацию, связаны с физической блокировкой внутриклеточного конца открытой поры с помощью channel's N-терминальных 20 или около того остатков, которые действуют как закрепленные блокаторы поры с помощью 'ball-and-chain' механизма.

Осуществлены кристаллографические и спектроскопические исследования очищенных белков некоторых каналов. Удалось кристаллизовать некоторые изолированные водно-растворимые домены и ассоциированные субъединицы эукариотических K⁺ каналов и смоделированы каналы полной длины на базе этих отдельных структурных элементов. Избыточная экспрессия и кристаллизация K⁺ каналов полной длины все еще технически недостижима, но cryo-electron microscopy и single-particle image reconstruction algorithms начаты для получения структуры ионных каналов с низким разрешением (~ 20 Å).

Т.к. субъединицы некоторых K⁺ каналов, обычно экспрессируемых в индивидуальной клетке, и субъединицы внутри одного и того же подсемейства м. собираться в одни и те же тетрамеры, то набор K⁺ каналов в данной ткани всегда сильно гетерогенен. Что предопределяет композицию K⁺ каналов в данной клетке? Как клетка регулирует функцию K⁺ каналов, контролируя смесь субъединиц, пригодных для сборки в тетрамеры ? Сегрегируют ли субъединицы K⁺ канала внутри клетки с помощью поддерживающих белков ? Вопросы, пока не имеющие ответов.

An overview of the potassium channel family

The organization and evolution of K+ channel genes

Characteristic structural features of K+ channels

Localization and function

The organization and evolution of K⁺ channel genes

Characteristic structural features of K⁺ channels