(Рис.1.) Timeline | Key events in hunting the Src

v-src и c-src

c-src был первым из нескольких прото-онкогенов, обнаруженных в геноме позвоночных. В 1989 за это эпохальное открытие Bishop и Varmus получили Нобелевскую премию по Физиологии и Медицине. Установлено, что прото-онкогены м.б. мутационно изменены в опухолях человека. В результате были получены антитела против erbB2, пригодные для успешного лечения рака груди, а abl ингибитор оказался эффективен для лечения хронической миэлогенной лейкемии.

Затем Hanafusa и сотр. показали, что м. происходить рекомбинация между вирусной и клеточной формами src, и что имеется функциональная взаимосвязь между двумя формами. Клеточное происхождение src формально было подтверждено в начале 1980s, когда было показано. что клонированный c-src ген имеет типичную структуру клеточного гена с кодирующими экзонами и некодирующими итронами (Рис. 2a). Последовательности c-src показали, что они отличаются от таковых у v-src С-терминальными заменами и некоторыми точечными мутациями. В 1984 Bishop, Hanafusa и группа Shalloway установили, что c-src обладает низкой трансформирующей активностью как в линиях клеток млекопитающих, та и в фибробластах эмбрионов кур, хотя при высоких уровнях экспрессии и появляются некоторые признаки трансформации. Как же активируется трансформирующая способность src?

(Рис.2.) | Comparison between v-Src и c-Src.

The Src protein

В 1977 Joan Brugge и Ray Erikson иммунопреципитировали 60-kDa фосфобелок из фибробластов, трансформированных RSV. Этот белок был сначала назван pp60^v-src , сейчас просто v-Src.

Предполагалось, что Src м.б. протеин-киназой, это было подтверждено в 1978. Две группы исследователей преципитировали белок из клеточных экстрактов сывороткой кроликов, имеющих опухоли. Было установлено, что если иммунные комплексы инкубированы с [γ-³²P]ATФ, то тяжелая цепь иммуноглобулинов оказывается фосфорилированной. Этот причудливый 'immune complex kinase assay', теперь в игре. Вскоре был выявлен белковый продукт cellular src, который также обладал протеин-киназной активностью, но она намного ниже, чем у v-Src, что согласуется с низкой трансформирующей активностью c-Src.

До сих пор протеин-киназы фосфорилировали только сериновый и треониновые остатки. Сначало было установлено, что Src м. фосфорилировать треониновые остатки. Затем было установлено, что Src является в действительности тирозин-специфической киназой. На следующий год (1980), Tony Hunter и Bart Sefton показали, что фосфорилируемой с помощью Src аминокислотой является тирозин и что Src фосфорилирует свой собственный тирозин. В том же году Stan Cohen установили, что epidermal growth factor receptor (EGFR), ранее считавшийся треонин-киназой, на самом деле является тирозин-киназой. Src и EGFR стали прототипами большого семейства киназ, участвующих в дифференцировке и росте клеток.

Затем было установлено, что основным сайтом форсфорилирования тирозина у v-Src является Tyr416, который расположен внутри активационной петли, общей для всех протеин-киназ. Это фосфорилирование является результатом внутримолекулярного аутофосфорилирования. Хотя c-Src и фосфорилируется in vitro по этому сайту, in vivo он фосфорилируется в др.месте. В 1984, Jo Bolen's и Joan Brugge's показали. что c-Src активируется в результате связывания с серединой Т антигена polyomavirus (событие важное для способности вируса трансформировать), а в следующем году Sara Courtneidge установила, что активация является результатом дефосфорилирования тирозина. Затем группа Jonathan Cooper и Tony Hunter's картировала in vivo место фосфорилирования тирозина в Tyr527, который отсутствует у v-Src (Рис. 2b). Итак, если фосфорилирование Tyr416 обусловливает активацию Src, то фосфорилирование Tyr527 - его ингибирование. Более того, если фосфорилирование Tyr416 является результатом аутофосфорилирования, то фосфорилирование Tyr527 - результатом действия др. киназы, Csk (carboxy-terminal Src kinase), идетифицированной Okada и Nakagawa в 1989. Фосфорилирование Tyr527 является ключевым событием в регуляции c-Src, и делеция этого остатка м. объяснить активацию v-Src.

Мутации в N-терминальной половине v-src давали fusiform или host-range фенотипы, а мутации в c-src вызывали активацию трансформирующей активности. Эта часть белка, по-видимому, играет двойную роль, регулируя активность Src киназы и обеспечивая ее взаимодействие с мишенями в клетках-хозяевах. Некоторая ясность наступила в результате изучения родственной нерецепторной тирозин-киназы, Fps. Был охарактеризован трансформирующий белок Fujinami sarcoma virus, gag–fps fusion. Было установлено, что у Gag–Fps белка как и Src, N-терминальная область важна для трансформации. Сравнение аминокислотных последовательностей Src и Fps не выявило гомологии. Но в 1986 такая область гомологии обнаружена и названа SH2, или Src homology 2, домен (SH1 является каталитическим доменом). В 1990 группа Pawson's и Hanafusa's сделала важное открытие, что этот домен связывает phosphotyrosyl пептиды in vitro. Через распознавание фосфорилированных остатков тирозина SH2 домены вовлечены в образование многих типов сигнальных комплексов.

Второй важный момент в функции N-терминальной области Src снова выявлен в результате изучения неродственного sarcoma virus. В 1988, Bruce Mayer клонировали трансформирющий ген птичьего вируса саркомы CT10 (chicken tumour 10, Claude's agent), названного crk (pronounced 'crack'). Mayer и Hanafusa заметили, что часть Crk гомологична области Src, которая лежит N-терминальнее домена SH2, а также сегменту внутри phospholipase Cγ, и назвали этот новый домен Src homology 3, или SH3, доменом. Этот домен также участвует в межбелковых взаимодействиях, а богатые пролином target-последовательности идентифицированы в 1993 группой Baltimore.

Итак, Src содержит два домена, участвующие в межбелковых взаимдействиях на N-конце, каталитический домен и регуляторный домен на С-конце, который подвергается фосфорилированию ингибирующего тирозина. Считается, что SH2 взаимодействует с фосфотирозином С-конца. Предполагается, что это взаимодействие м. давать неактивную конформацию в результате ингибирующего эффекта фосфорлирования. Это подтверждено в 1991 группой Laudano. Liu и Pawson затем показали, что фосфопептид с высоким сродством связывающий SH2, м. активировать Src, очевидно, конкурируя с фосфорилированным концом за связывание c-Src SH2 домена. Но картина еще сложнее. Группа Morgan, Draetta и Cooper показала, что ингибирование активности Src киназы с помощью Csk зависит не только от SH2домена, но и от SH3 домена. SH3 домен также участвует и во внутримолекулярном взаимодействии, которое ингибирует активность. Это согласуется с тем, что мутации в SH3 активируют c-Src.

Трехмерная структура Src и родственной Src-family киназы Hck установлена в 1997группой John Kuriyan, и Michael Eck и Steve Harrison. Это был сурприз. В противополжность существующей гипотетической модели домены SH3 и SH2 оказались позади киназного домена (Рис. 3). Домен SH2 взаимодействует с фосфотрозином 527, как и предполагалось, тогда как домен SH3 взаимодействует с короткой полипролиновой спиралью типа II между SH2 и киназными доменами. Эти два взаимодействия запирают молекулу в закрытое неактивное состояние. These two interactions locked the molecule in a closed, inactive state. Стало ясным как SH2- и SH3- домены лигандов или мутации в v-Src активируют киназную активность Src.

(Рис.3.) | Activation of c-Src.

Итак, Src это сложная молекулярная машина, регулируемая путем образования и разрушения внутримолекулярных взаимодействий. Взаимодействие phosphotyrosine–SH2 оказалось центральным механизмом в клеточной регуляции.

Src function

Трансформация с помощью активированной Src вызывает широкий спектр феноипических изменений, включая морфологическую трансформацию и приобретение якоря и независимость от факторов роста. Сначала, Ambros et al. установили, что если клетки инфицированые ts мутантами, сдвигать к пермиссивной температуре, то клеточная поверхность очень быстро покрывается мелкими складками, даже в отсутствие синтеза белка. Затем в класическом эксперименте Hartmut Beug и Thomas Graf показали, что если ядро удалено из ts-инфицированных клеток до температурного сдвига, то морфологическая трансформация все еще происходит в энуклеированном цитопласте, тогда как другие события, такие как увеличение потребления hexose, не происходят. Наконец, Mark Groudine и Hal Weintraub показали, что src трансформация является результатом существенных изменений в экспрессии генов. Итак, трансформация инициируется в результате действия Src в цитоплазме и эти цитоплазматические события ведут к изменению экспрессии генов, которое необходимо для последующих событий.

Kathy Radke из лаб автора, и независимо Eleanor и Ray Erikson, идентифицировали 36-kDa белок (p36/calpactin I/annexin II), который подвергается фосфорилированию после трансформации с помощью RSV. Это был первый из идентифицированных v-Src субстратов. Jon Cooper и Tony Hunter выявили дополнительные субстраты. Затем в лаб. Herman Eisen's полукчены поликлональные и моноклональные антитела, распознающие фосфотирозины. Tom Parsons и его сотр. с их помощью выделили phosphotyrosyl белки из RSV-трансформированных клеток. Некоторые из этих субстратов, включая focal adhesion kinase (FAK) и Cas (Crk-and Src-associated substrate), оказались белками фокальной адгезии, важные для передачи сигналов интегрина, указывая тем самым, что Src участвует в этом процессе. Многие из субстратов для Src оказались также фосфорилируемыми с помощью тирозин-киназы рецепторами факторов роста в ответ на присоединение лиганда. Это указывает на то, что фосфорилирование этих субстратов м. участвовать в регуляции роста. Такими субстратами, напр., являются адапторный белок Shc и транскрипционый фактор Stat3 (Рис. 4)

(Рис.4.) | Signalling by Src.

Mitogen-activated protein kinase (MAPK) фосфорилируется не только Src, но и с помощью киназы двойной специфичности MEK (mitogen-activated protein kinase kinase 1). Kevan Shokat и сотр. показали также, что некоторые phosphotyrosyl белки из RSV-трансформировнных клеток и в самом деле фосфорилируются непосредственно v-Src.

Однако взаимосвязь между фосфорилированием тирозина и активацией сигнального пути стала проясняться, когда было установлено, что phosphotyrosyl остатки ведут себя как места для содержания (docking) для SH2-домен-содержащих сигнальных молекул. Эти сигнальные молекуля затем инициируют сигнальыне пути, которые передают сигналы в ядро, цитосклет и др. клеточным компонентам. Одной из таких сигнальных молекул является phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K). Malcolm Whitman из группы Lew Cantley's показал в 1988 что активность сигнальных молекул, фосфорилированных в D-3 позиции инозитолового кольца, и многие сигнальные пути зависят от PI3K. Затем в 1986 Dennis Stacey показал, что микроинъекции нейтрализующих антител против Ras блокируют трансформацию NIH-3T3 с помощью v-Src. Было принято, что Ras активация является центральной в трансформации с помощью Src. Позднее, однако, Dana Aftab из лаб. автора показала, что Src м. трансформировать некоторые типs клеток и в отсуnствие активации Ras, т.е. существуют и др. пути трансформации. Др. сотр., Elicia Penuel, показала, что Ras и PI3K инициируют параллельные пути, оба участвующие в трансформации.

Еще один путь сигнализации, участвующий в Src трансформации, открыт недавно (Richard Jove). Транскрипционный фактор Stat3 усиливает ДНК-связывающую активность в Src-трансформированных клетках. Это связано с фосфорилированием тирозина с помощью Src или промежуточных киназ, таких как Janus kinase (JAK) или Etk. Доминантно-негативные мутанты Stat3 блокируют трансформацию. Однако, идея, что Stat3 обеспечивает Src трансформацию, не была принята всеми, т.к. передача сигналов Stat signalling. как полагали, обеспечивает скорее дифференцировку, чем пролиферацию. Это препятсвие было преодолено Jackie Bromberg из Jim Darnell's группы, показавшим. что конституитивно активный димерный мутант Stat3 iиндуцирует трансформацию.

Всегда подразумевалось, что трансформация с помощью v-Src возникает в результате конституитивной активации того же самого пути, который временно активируется с помощью c-Src в физиологических условиях. Т.к. экспрессия v-Src индуцирует пролиферацию клеток, то было естественно предположить, что c-Src также регулирует пролиферацию клеток. Группы Bishop, Hunter и Courtneidge показали, что platelet-derived growth factor (PDGF) активирует c-Src путем доставки его к PDGF рецепторам. Это было первое ясное указание на то, что м. существовать связь между передачей сигналов через рецепторы факторов роста и c-Src функцией. В 1993 Sara Courtneidge и ее коллеги обнаружили, что экспрессия доминантно-негативной (каталитически неактивной) Src или микроинъекции антител против Src блокируют митогенез и c-myc индукцию с помощью PDGF. Более того, David Shalloway и др. обнаружили, что c-Src активируется во время G2/M перехода клеточного цикла, а лаб. Courtneidge lпоказала, что эта активность необходима для G2/M перехода. Итак, c-Src участвует в регуляции пролиферации клеток.

Но в1983 Joan Brugge установил, что высокие уровни c-Src обнаруживаются в дифференцированных нейронах, а 3 гда спустя, и в тромбоцитах. Следовательно, Src д. обладать добавочной функцией. Уже было известно, что c-Src локализуется в фокальных adhesions. Jim Ferrell из лаб. автора и Andy Golden из Joan Brugge's показали, что связывание ВКМ компонента, fibrinogen, с тромбоцитами вызывает их активацию, а взаимодействие тромбоцитарных интегринов с фибриногеном активирует фосфорилирование тирозина. Открытие. что FAK является суюстратом для Src подтверждает также идею, что Src м. участвовать в передаче интегрин-зависимых сигналов.

Итак, c-Src участвует в нескольких клеточных процессах, включая передачу сигналов, зависимых от ростовых факторов и интегринов, и контроль клеточного цикла. В 1991 Phil Soriano сообщил, что Src^-/- мыши жизнеспособны и что едиственным проявлением у них является osteopetrosis. Семейство Src включает родственные киназы, некоторые из них (Lck, Hck, Blk, Fgr и Lyn) экспрессируются в первую очередь в гематопоэтических клонах. Однако два члена семейства, очень близкие Src, Fyn и Yes, имеют почти повсеместное распределение как и Src. Эти киназы компенсируют нехватку Src во всех тканях кроме остеокластов. Soriano и др. показали, что Src/Fyn- и Src/Yes-двойные нокаутные особи погибают перинатально, а Src/Fyn/Yes-triple нокаутные погибают на ранних стадиях эмбриогенеза. Фибробласты из таких эмбрионов обнаруживают дефекты в передаче сигналов интегринов; они не обнаруживают дефектов в митогенном ответе на факторы роста, но обусловливают экспрессию SV40 большого T антигена в этих клетках.

Выявлен широкий спектр функций для Src семейства киназ, от контроля развития B- и T клеток до обучаемости и памяти, регуляции апоптоза и контроля клеточного цикла. В обзоре 1997 Sheila Thomas и Joan Brugge по клеточным функциям, регулируемым Src family kinases 97 страниц и около 600 ссылок¹⁰⁷. Из этого и еще одного обзора¹⁰⁸ (Рис.4.) следует, что Src и его родственники подобно кусочкам Lego, используются как связки внутри сложной сигнальной сети, контролирующей поведение клеток. Семейство Src контролируется с помощью различных импульсов (Рис. 5), не только с помощью тирозин-киназных рецепторов и интегринов, но также с помощью G-protein-coupled рецепторов, таких как β-adrenergic receptor; с помощью антигенов и Fc рецепторов; с помощью цитокиновых рецепторов, таких как TRANCE; с помощью рецепторов protein-tyrosine фосфатаз, таких как PTPα; и даже с помощью стероидных рецепторов, таких как progesterone receptor. Активация Src позволяет SH2 и/или SH3 доменам участвовать в межмолекулярных взаимодействиях, которые направлют Src к их субстратам. Src фосфорилирует субстраты в цитозоле или на внутренней поверхности плазматических мембран (оболочек) (напр., адаптор Shc, Rho GTPase-activating protein p190, и Stat3); в cell–matrix adhesions (ассоциированные с цитоскелетом белки, такие как FAK, Cas, paxillin, ezrin и cortactin); и в межклеточных adhesions (junctional белки, такие как β-catenin, p120 и plakoglobin). Фосфорилирование этих белков или прямо модифицирует их функции или ведет к сборке сигнальных комплексов , которые инициируют сигнальыне каскады. Поведение клеток, трансформированных мутантно активированными формами Src, является результатом конституитивной активации биологической реакций, регулируемых c-Src или ее родственниками. Так, независимость от ростовых факторов, по-видимому. отражает активацию сигнального пути, который обычно регулируется рецепторами ростовых факторов (напр., Ras–MAPK, PI3K, Stat3). Сходным образом. морфологическая трансформация редуцирует слипчивость и инвазивность трансформированных клеток и разрушает контакты между клетками и матриксом, а также между клетками, которые отражают роль Src в контроле подвижности клеток; Src м. регулировать подвижность клеток через фосфорилирование цитоскелетных компонентов, регулируя активацию Rho-family GTPases, и путем усиления синтеза и секреции протеаз, которые деградируют внеклеточный матрикс.

(Рис.5.) | Regulation of c-Src by surface receptors.

Имеются доказательства, что Src м. участвовать в breast cancer. Активность c-Src киназы повышена в клетках опухолей молочных желез. Члены семейства EGFR также активируются или избыточно экспрессируются в клетках таких опухолей. Группа Sally Parsons' показали. что c-Src усиливает митогенную реакцию на EGF. Обнаружено фосфорилирование тирозина Src субстрата Stat3 в клетках некоторых опухолей груди. Активация Src обнаруживается также в карциноме толстой кишки. Подъем активности c-Src киназы выявляется уже в ранних событиях карциногенеза колона, в полипах. В 1999, Tim Yeatman's группа сообщила. что субнабор опухолей толстого кишечника человека содержит мутации c-src, вызывающие укорочение С-конца Src белка и активирующие каталитическую и трансформирующую функции. Итак спустя почти 90 лет после открытия Peyton Rous' , что вирус м.вызывать опухоли за счет мутаций укорочения вирусной Src, они открыты и в его клеточном гомологе.

Epilogue

Уже известны ингибиторы Src и Src-family киназ, которые м. привести к созданию соединений для лечения опухолей и созданию лекарства для целенаправленного лечения остеопороза.

The hunting of the Src

Links

v-src и c-src

The Src protein

Src function

Epilogue