CONNEXINs
КОННЕКСИНЫ

Щелевые мостики кодируются мультигенным семейством коннексинов. Каждый ген коннексина экспрессируется в виде уникального паттерна и кодирует полипептид, олигомеризуется, образуя гидрофильные мембранные канальцы с различной проводимостью и запирающей способностью. Кардиальные миоциты соединяются электрически с помощью щелевых контактов, кластеров низкорезистентных межклеточ- ных канальцев, сформированных коннексинами. Отмечается изменчи- вость в количестве и пространственном распределении различных типов коннексинов, которые участвуют в региональной дифференцировке электрофизиологических свойств сердца. Идентифицированы продукты нескольких Сх генов в сердце млекопитающих (eg, Cx45, Cx43, Cx40, and Cx37), и показано, что их экспрессия регулируется во время развития миокарда. Cx43, Cx40, и Cx45 являются компонентами щелевых контактов миоцитов, установлено также, что Сх40 спрес- сируется в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов. У эмбрионов мыши первые сокращения выявляются на 8.5 days post coctum (dpc), а на 14.5 dpc заканчивается формирование четырехкамерного сердца. На 8.5 dpc только с reverse-transcriptase polymerase chain reaction > выявляются транскрипты генов Cx43, Cx40, и Cx37 в сердце мыши (очень низкий уровень активности этих генов. С 9.5 dpc, все 3 транскрипта обнаружимы в целых in sctu-hybridized эмбрионах, наиболее интересным было мечение сосудистой системы Cx40 и Cx37 anti-sense зондами и обнаружение Cx37 транскрптов и/или белков в сосудистых эндотелиальных клетках на всех изучен- ных стадиях. Напротив, только продукты гена Cx37 обнаруживались в эндокардиальных клетках эндокарда. В сердце Cx37 экспресиро- вался исключительно в тех клетках, которые исключали какое-либо прямое вовлечение этого коннексина в передачу (propagation) электрической активности между миоцитами и в синхронизацию сокращений. Показано, что коннексин43 является наиболее обильным в работающем миокарде желудочков, а коннексин40 и 45 преимущественно экспрессируется в атриовентрикулярной проводящей системе у ряда видов.	Cх40 КОННЕКСИН 40 Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток (ES) мыши в кардиомиоциты сопровождалась экспрессией сердце-специфических генов, таких как МНСα и -β", MLC-2v и гена Сх40. Ген Сх40 тесно связан с дифференцировкой кардиомиоцитов, возможно неорганизованной "эмбриональной" проводящей ткани (Oyamada et al.,1996 ). Между 9.5 и 11.5 dpc, обнаруживается активация гена Сх40 в миоцитах в соответствии с каудоростральным градиентом , распространяющимся через примитивное предсердие и общую вентрикулярную камеру (9.5 dpc) а затем через правый желудочек (11.5 dpc). Во время этого периода происходит четкая временная и ассиметричная экспрессии гена Cx40 , которая накладывается на функциональную регионализацию. Сравнение распределния Cx40 и Cx43 на вышестоящих стадиях показывает, что эти коннексины перекрываются в левом желудочке или комплементарны в атриальной ткани и правом желудочке(Delorme et al.,1997 ). Cх43 КОННЕКСИН 43 Ген connexin 43 экспрессируется во многих областях эмбрионов Cx43 играет важную роль в развитии сердца ,т.к. целенаправленное разрушение локуса Gja1, кодирующего Cx43 , обусловливает гибель новорожденных, обусловленную конотрункальными дефектами. Возникновение D-конфигурации в восходящей части сердечной петли у CX43-дефицитных мышей существенно заторможено так, что правый желудочек остается в краниомедиальном положении и соединяется с трактом оттока под более острым углом на стадии ED10 и ED11. Развивается "crisscross" конфигурация, с ротированными эндокардиальными подушками на 90 градусов , горизонтальной мышечной вентрикулярной перегородкой и параллельным ходом эндокардиальных гребней тракта оттока. После ED12 образуются большие межтрабекулярные карманы на вентрикулярной стороне обеих shelf-like миокардиальных структур, которые поддерживают эндокардиальные гребни тракта оттока . Итак, задержка развития D-конфиругации в восходящей части петли эмбрионального сердца предопределяет развитие миокардом в месте соединения правого желудочка с трактом оттока больших межтрабекулярных карманов(Ya et al 1998). . На роль Cx43 в развитии сердца указывает также обнаружение Cx43 мутаций у пациентов с ВПС при visceroatrial heterotaxia (VAH) болезни, характеризующейся lateralcty defects. Cx43 мутации у этих пациентов не нарушают образования канальцев щелевых мостиков , а скорее нарушают регуляцию запирания (gating) Cx43 gap junctional channels (Brctz Cunningham et al 1995). Получали трансгенных мышей(Brctz Cunningham et al 1995) Cx43 мутации были ассоциированы у разных субклассов VAH пациентов со стенозом легочной артерии. Это подтверждает, что регуляция GJC наиболее важна для морфогенеза тракта оттока. Экспрессия трансгена ограничена областями, где экспрессируется эндогенный ген, в дорсальной части нервной трубки и клетках нервного гребня, включая и те, что мигрируют в тракт оттока сердца. Так как клетки нервного гребня необходимы для нормального морфогенеза сердца и в частности для разделения тракта оттока, то можно предположить что дефекты сердца у CMV43 трансгенных мышей возникают в результате нарушений клеток кардиального нервного гребня. Однако ни у Cx43 ни у CMV43 мышей дефекты сердца не имеют классической картины, связанной с удалением кардиального нервного гребня, напр. с разрывом аортальной дуги ( aortic arch disruption) персистенцией артериального протока (persistent truncus arteriosus), двойным выходм из правого желудочка (double outlet right ventricle) и дефектами межжелудочковой перегородки. У CMV43 и Cx43 мышей нарушения клеток нервного гребня не связаны с исчезновением кардиального нервного гребня, а скорее с subtle изменениями в миграционной пролиферации или дифференцировке клеток нервного гребня. И обнаружение дефектов развития в коронарной васкулатуре (coronary vasculature) у CMV43 трансгенных мышей согласуется с участием клеток нервного гребня, производные которых, дающие парасимпатическую иннервацию сердца, участвуют в развертывании коронарных сосудов. Более того, так как проводящие волокна Пуркинье ( Purkinje conduction fibers) распределяются вместе с коронарными сосудами, то обнаружение аномалий проводящей системы не неожиданны. Присутствие дефектов краниальных и спинальных ганглиев у CMV43 трансгенных мышей также важно в этом контексте , так как эти структуры содержат клетки нервного гребня. Дефекты сердца у CMV43 кроме того включают гипертрофию желудочка и другие нарушения миокарда. Эта патология может возникать вторично в результате обструкции тракта оттока, аномалий коронарных сосудов и нарушения проводящей системы. Альтернатива - эти другие дефекты могут отражать зависимость развития кардиомиоцитов от нормального паттерна иннервации. Нарушения сердца у Cx43 нокаутных мышей также связаны с вовлечением клеток кардиального нервного гребня и эти аномалии могут быть частично компенсированы CMV43 трансгеном . Предполагается, что у нокаутных мышей повреждения не связаны с пертрубациями GJC между миокардиальыми клетками , а между клетками нервного гребня, связанными с развитием сердца. CMV43 трансгенные мыши обнаруживают также дефекты краниальной части нервной трубки с разной пенетрантностью. Такие же дефекты нервной трубки обнаружены и у Cx43 накаутных мышей также с частичной пенетрантностью. Частичная пенетрантность может отражать мультифакториальную природу процесса , регулирующего закрытие нервной трубки. Существует возможность того, что дефекты развития нервной трубки у CMV43 и Cx43 мышей возникают вторично в результате нарушений клеток нервного гребня. Мутанты Splotch особленно наглядны в этом отношении, так как у них имеются аномалии сердца, сходные с теми, что возникают в результате пертрубаций клеток нервного гребня. Кроме того у них имеется большое количество пузырьков щелевых мостиков (gap junctional vesicles)в развивающейся нервной трубке. Это позволяет предположить, что дефекты закрытия нервной трубки могут быть результатом пертрубаций GJC и клеток нервного гребня. Cх45 КОННЕКСИН 45 Использовали антисыворотку против connexin45 человека ,которая в HeLa cells, трансфицированных для экспрессии connexin45, давала точечное иммуномечение по краям клеток, демонстрируя присутствие щелевых контактов . Довольно низкие уровни connexin45 mRNA обнаружены с помощью Northern blots в кардиальных тканях мышей и крыс и белка connexin45 ниже уровня детекции с помощью Western blots. Конфокальная микроскопия иммуномеченных вентрикулярных тканей выявила, что основаня часть работающего миокарда является иммунонегативной в отношении connexin45. Четко определяемая зона клеток, экспрессирующих connexin45, была локализована на эндокаридальной поверхности там же, где миоциты, экспрессирующе connexin40, т.е. в проводящей системе . Это противоречит предположению о широком распространении connexin45 в работающих вентрикулярных миоцитах . Комерческая антисыворотка к connexin45 давала широко распространенное мечение по всему вентрикулярному миокарду , однако эта метка ингибировалась 6 аминокислотным пептидом, частью connexin43, что указывает на наличие перекрестной реакции с connexin43 . Таким образом, connexin45 участвует в модуляции электрофизиологических свойств вентрикулярной проводящей системы(Coppen et al 1998) .

Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток (ES) мыши в кардиомиоциты сопровождалась экспрессией сердце-специфических генов, таких как МНСα и -β", MLC-2v и гена Сх40. Ген Сх40 тесно связан с дифференцировкой кардиомиоцитов, возможно неорганизованной "эмбриональной" проводящей ткани (Oyamada et al.,1996 ). Между 9.5 и 11.5 dpc, обнаруживается активация гена Сх40 в миоцитах в соответствии с каудоростральным градиентом , распространяющимся через примитивное предсердие и общую вентрикулярную камеру (9.5 dpc) а затем через правый желудочек (11.5 dpc). Во время этого периода происходит четкая временная и ассиметричная экспрессии гена Cx40 , которая накладывается на функциональную регионализацию. Сравнение распределния Cx40 и Cx43 на вышестоящих стадиях показывает, что эти коннексины перекрываются в левом желудочке или комплементарны в атриальной ткани и правом желудочке(Delorme et al.,1997 ).

Cх43

КОННЕКСИН 43

Ген connexin 43 экспрессируется во многих областях эмбрионов Cx43 играет важную роль в развитии сердца ,т.к. целенаправленное разрушение локуса Gja1, кодирующего Cx43 , обусловливает гибель новорожденных, обусловленную конотрункальными дефектами. Возникновение D-конфигурации в восходящей части сердечной петли у CX43-дефицитных мышей существенно заторможено так, что правый желудочек остается в краниомедиальном положении и соединяется с трактом оттока под более острым углом на стадии ED10 и ED11. Развивается "crisscross" конфигурация, с ротированными эндокардиальными подушками на 90 градусов , горизонтальной мышечной вентрикулярной перегородкой и параллельным ходом эндокардиальных гребней тракта оттока. После ED12 образуются большие межтрабекулярные карманы на вентрикулярной стороне обеих shelf-like миокардиальных структур, которые поддерживают эндокардиальные гребни тракта оттока . Итак, задержка развития D-конфиругации в восходящей части петли эмбрионального сердца предопределяет развитие миокардом в месте соединения правого желудочка с трактом оттока больших межтрабекулярных карманов(Ya et al 1998). .

На роль Cx43 в развитии сердца указывает также обнаружение Cx43 мутаций у пациентов с ВПС при visceroatrial heterotaxia (VAH) болезни, характеризующейся lateralcty defects. Cx43 мутации у этих пациентов не нарушают образования канальцев щелевых мостиков , а скорее нарушают регуляцию запирания (gating) Cx43 gap junctional channels (Brctz Cunningham et al 1995).

Получали трансгенных мышей(Brctz Cunningham et al 1995) Cx43 мутации были ассоциированы у разных субклассов VAH пациентов со стенозом легочной артерии. Это подтверждает, что регуляция GJC наиболее важна для морфогенеза тракта оттока.

Экспрессия трансгена ограничена областями, где экспрессируется эндогенный ген, в дорсальной части нервной трубки и клетках нервного гребня, включая и те, что мигрируют в тракт оттока сердца. Так как клетки нервного гребня необходимы для нормального морфогенеза сердца и в частности для разделения тракта оттока, то можно предположить что дефекты сердца у CMV43 трансгенных мышей возникают в результате нарушений клеток кардиального нервного гребня. Однако ни у Cx43 ни у CMV43 мышей дефекты сердца не имеют классической картины, связанной с удалением кардиального нервного гребня, напр. с разрывом аортальной дуги ( aortic arch disruption) персистенцией артериального протока (persistent truncus arteriosus), двойным выходм из правого желудочка (double outlet right ventricle) и дефектами межжелудочковой перегородки. У CMV43 и Cx43 мышей нарушения клеток нервного гребня не связаны с исчезновением кардиального нервного гребня, а скорее с subtle изменениями в миграционной пролиферации или дифференцировке клеток нервного гребня. И обнаружение дефектов развития в коронарной васкулатуре (coronary vasculature) у CMV43 трансгенных мышей согласуется с участием клеток нервного гребня, производные которых, дающие парасимпатическую иннервацию сердца, участвуют в развертывании коронарных сосудов. Более того, так как проводящие волокна Пуркинье ( Purkinje conduction fibers) распределяются вместе с коронарными сосудами, то обнаружение аномалий проводящей системы не неожиданны. Присутствие дефектов краниальных и спинальных ганглиев у CMV43 трансгенных мышей также важно в этом контексте , так как эти структуры содержат клетки нервного гребня. Дефекты сердца у CMV43 кроме того включают гипертрофию желудочка и другие нарушения миокарда. Эта патология может возникать вторично в результате обструкции тракта оттока, аномалий коронарных сосудов и нарушения проводящей системы. Альтернатива - эти другие дефекты могут отражать зависимость развития кардиомиоцитов от нормального паттерна иннервации.

Нарушения сердца у Cx43 нокаутных мышей также связаны с вовлечением клеток кардиального нервного гребня и эти аномалии могут быть частично компенсированы CMV43 трансгеном . Предполагается, что у нокаутных мышей повреждения не связаны с пертрубациями GJC между миокардиальыми клетками , а между клетками нервного гребня, связанными с развитием сердца. CMV43 трансгенные мыши обнаруживают также дефекты краниальной части нервной трубки с разной пенетрантностью. Такие же дефекты нервной трубки обнаружены и у Cx43 накаутных мышей также с частичной пенетрантностью. Частичная пенетрантность может отражать мультифакториальную природу процесса , регулирующего закрытие нервной трубки. Существует возможность того, что дефекты развития нервной трубки у CMV43 и Cx43 мышей возникают вторично в результате нарушений клеток нервного гребня. Мутанты Splotch особленно наглядны в этом отношении, так как у них имеются аномалии сердца, сходные с теми, что возникают в результате пертрубаций клеток нервного гребня. Кроме того у них имеется большое количество пузырьков щелевых мостиков (gap junctional vesicles)в развивающейся нервной трубке. Это позволяет предположить, что дефекты закрытия нервной трубки могут быть результатом пертрубаций GJC и клеток нервного гребня.

Cх45

КОННЕКСИН 45

Использовали антисыворотку против connexin45 человека ,которая в HeLa cells, трансфицированных для экспрессии connexin45, давала точечное иммуномечение по краям клеток, демонстрируя присутствие щелевых контактов . Довольно низкие уровни connexin45 mRNA обнаружены с помощью Northern blots в кардиальных тканях мышей и крыс и белка connexin45 ниже уровня детекции с помощью Western blots. Конфокальная микроскопия иммуномеченных вентрикулярных тканей выявила, что основаня часть работающего миокарда является иммунонегативной в отношении connexin45. Четко определяемая зона клеток, экспрессирующих connexin45, была локализована на эндокаридальной поверхности там же, где миоциты, экспрессирующе connexin40, т.е. в проводящей системе . Это противоречит предположению о широком распространении connexin45 в работающих вентрикулярных миоцитах . Комерческая антисыворотка к connexin45 давала широко распространенное мечение по всему вентрикулярному миокарду , однако эта метка ингибировалась 6 аминокислотным пептидом, частью connexin43, что указывает на наличие перекрестной реакции с connexin43 . Таким образом, connexin45 участвует в модуляции электрофизиологических свойств вентрикулярной проводящей системы(Coppen et al 1998) .

КОННЕКСИНЫ

Cх40

КОННЕКСИН 40

Cх43

КОННЕКСИН 43

Cх45

КОННЕКСИН 45