Несмотря на высокую сложность и ее сходство с ЦНС ENS она происходит из нейрального гребня (neural crest (NC)), источника и всех других ветвей ПНС [5]. Проспективные энтерические NC клетки мигрируют из двух основных областей нервной трубки: vagal области, которая соответствует сомитам 1–7, и копчиковой (sacral) области ниже сомита 28. Производные vagal ENS — которые дают большинство нейронов и гшлии энтерических ганглиев — вступают в мезенхиму передней кишки и мигрирруют в передне-заднем направлении, колонизируя кишку по всей длине [6]. Клональные и генетические исследования эмбрионов мыши показали, что энтерический компонент vagal NC генерирует два отдельных клона: первый, симпатоэнтерический клон, который происходит из нервной трубки на уровне сомитов 1–5 и вносит вклад в формирование энтерических ганглиев (по всей длине кишечника) и верхних шейных ганглиев симпатической цепи; и второй, симпатоадренальный клон, дающий потомство, которое колонизирует сначала энтерические ганглии передней кишки (пищевода и желудка) [7] (Fig. 1).

Рис. 1 Схематическое представление вклада vagal и sacral NC в формирование ENS. c-Ret-зависимый симпатоэнтерический (SE) клон (показан красным), происходит из vagal NC заднего мозга (соответствует уровню сомитов 1–5) и мигрирует вентрально, занимая весь кишечник и верхние шейные ганглии (SCG, первые ганглии симпатической цепи). c-Ret-независимый симпатоадренальный (SA) клон (показан голубым), происходит из туловищной части нервного гребня и занимает переднюю кишку (он исходит из НГ на уровне сомитов 6 и 7) а также ганглии симпатической цепи ниже SCG (голубые). Передняя кишка обеспечивается производными как SE так и SA. sacral нервный гребень (оранжевый) происходит из спиннгого мозга ниже уровня сомита 28 и колонизирует в основном заднюбю кишку . FG, пердняя кишкаt; HG, задняя кишка; MG, средняя; OV, слуховой пузырек ; SC, симпатическая цепь; SCG, верхний шейный ганглий (Modified from [7].)

Помимо vagal области клетки НГ эмигрируют из sacral части нервной трубки (ниже сомита 28), мигрируют в кишечник и участвуют в формировании postumbilical ENS [6] [8] [9] [10]. У эмбрионов кур первноачально (E4.5)клетки sacral НГ мигрируют в хвост в ростральном направлении и формируют ганглии Remak вдоль дорсального аспекта (и вне) задней кишки вплоть до отверстий желчного и панкреатического протоков. Позднее (E7.5), первые клетки sacral NC вступают в заднюю кишку и в течение последующих 2–3 дней их число увеличивается существенно, достигая максимума между E10–12. Значительное большинство клеток sacral-derived НГ ограничено толстой и прямой кишкой, и лишь немного клеток присутствуют в слепой (ceca) и postumbilical тонкой кишке [11•] (Fig. 1).

ENTERIC NERVOUS SYSTEM RET SIGNALLING PATHWAY

ЭНТЕРИЧЕСКАЯ НЕРВНАЯ СИСТЕМА: Путь Передачи Сигналов RET

Несколько молекул было идентифицировано, которые контролируют или прямо или косвенно морфогенез и дифференцировку ENS. Среди них RET receptor tyrosine kinase (RTK) и его функциональные лиганды glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) нейртурин. GDNF и nuerturin принадлежат к небольшому семейству близко родственных нейротрофных факторов, куда входят также персефин и артемин [12] [13] [14] [15]. Взаимодействие между GDNF или нейртурином и RET обеспечивается с помощью GFRα-1 или GFRα-2, соответственно — GPI-сцепленными внеклеточными белками [16] [17].Описаны некоторые мутации с потерей функции c-RET у пациентов с болезнью Hirschsprung's (врожденный мегаколон или врожденный аганглионоз), при которой отсутствуют энтерические ганглии в толстом кишечнике на участках разной длины [18]. Мыши, гомозиготные по нулевой мутации c-Ret, Gfrα-1 и Gdnf имели почти идентичные фенотипы, характеризующиеся неспособностью формировать ENS в задних частях передней кишки (пищевод и cardiac желудка) и агенезом почек [7] [19] [20] [21] [22] [23••] [24••].

Хотя роль GDNF, GFRα-1 и RET в развитии ENS млекопитающих была четко установлена, однако некоторые вопрося, касающиеся механизма действия этих молекул все еще остаются открытыми. Чтобы определить, действуют ли c-Ret мутации клеточно-автономно и идентифицировать их клеточные мишени, Natarajan et al. [25••] получали химерный кишечник путем трансплантации энтерических клеток НГ, выделенных от эмбрионов дикого типа, в аганглиолярную кишку (от RET-дефицитных эмбрионов) в органой культуре. Оказалось, что эффект c-Ret-нулевой мутации в основном клеточно-автономен и что первоначальный тип клеток, в которых обычно необходима функция RET, происходит из НГ, предшественника ENS. Следовательно, неспособность колонизации кишечника плода клетками НГ у RET-дефицитных эмбрионов не является результатом вторичных эффектов мутации на мезенхиму кишки и что аганглиолярная стенка кишки способна поддерживать миграцию и пролиферацию производных НГ дикого типа [25••].

Функциональные лиганды RET, GDNF и neurturin, способствуют выживанию in vitro, пролиферации и дифференцировке мультипотентных ENS предшественников в кишке относительно молодых плодов [25••] [26] [27] [28•] [29••]. Однако, Эффекты этих факторов роста стадио-специфичны, так как сходные культуры от плодов поздних стадий обнаруживают заметное снижение реакции на GDNF и neurturin, но могут эффективно выживать в присуствии других нейротрофных факторов, таких как NT-3 ([28•]; S Taraviras et al., unpublished data). Анализ ENS предшественников у RET-дефицитныъ мутантных эмбрионов показал, что они неспособны выживать и подвергаются апоптозу до или во время их инвазии мезенхимы передней кишки.

Исследования in vitro четко подтверждают роль RET синального пути в ENS нейрогенезе. Подтверждение этого предположения получено у нулевых мутантов по гену, кодирующему GFRα-2 и neurturin — молекул, способных к формированию RET-активируемых комплексов —, у которых возникают аномалии ENS. Таким образом, мыши с отсутствием этих молекул обнаруживают редукцию myenteric сплетения и нарушения желудочно-кишечной подвижности. Эти дефекты указывают на то, что neurturin является важным трофическим фактором для постмитотических энтерических нейронов и что он необходим для поддержания энтерических ганглиев [30••] [31••]. По-видимому, GDNF является критическим для выживания, прлиферации и дифференцировки во время ранних стадий формирования ENS и что нейртурин выступает как фактлор выживания во время поздних стадий. Известно, что очищенный энтерический НГ и энтерические нейроны отвечают сходным образом на GDNF и neurturin в культуре, очевидно, что неперекрывающаяся роль этих нейротрофных факторов является просто следствием их стадио-специфической экспрессии в кишечнике млекопитающих. Некоторые исследователи описывают экспрессию GDNF и neurturin в развивающемся кишечнике (см. [32]. Альтернативное объяснение этих находок заключается в том, что в противоположность in vitro результатам, GDNF и neurturin способны вызывать качественно различные реакции с помощью RET рецепторов in vivo. Эта гипотеза согласуется со сложностью внутриклеточных сигнальных путей, которые могут быть активированы двумя изоформами рецепторов RET (S Taraviras, V Pachnis, unpublished data).

SOX10

Другая молекула, критическая для развития ENS у млекопитающих - это SOX10, член семейства Sry-родственных генов, содержащего транскрипционные регуляторы [33]. Роль Sox10 выявлена с помощью позиционного клонирования Dominant megacolon (Dom) локуса у мышей. Животные, гетрозиготные по мутациии Dom mutation (Dom/+) обнаруживают региональные нехватки NC-производных энтерических ганглиев в толстой кишке, тогда как животные, гомозиготные по этой мутации (Dom/Dom)погибают во время эмбриогенеза и имеют тяжелые дефекты всех производных НГ в ПНС, включая кишечный аганглионоз [34] [35••] [36••]. Более того, пациенты с врожденным мегаколоном несут различные мутации, которые скорее всего нарушают функцию SOX10 [37] [38••].

Sox10 экспрессирутся во всех мигрирующих клетках НГ, вносящих вклад в формирование ПНС, включая и предшественников ENS до и во время инвации в мезенхиму кишки [35••] [39]. Однако механизм действия SOX10 пока неясен.

Endothelin-3 (ET-3)и рецептора эндотелина B (EDNRB) сигнальный путь

Эндотелины-1, -2 и -3 (ET1-3) входят в состав небольшого семейства из 21 аминокислотных пептидов, которые активируют G-protein-coupled heptahelical рецепторы (см. [40]). Хотя физиологические функции эндотелинов интенсивно изучаются многие годы, однако их роль еще до конца не понята. Показано, что ряд естественно появившихся и полученных таргеттингом мутации затрагивают структуру или экспрессию генов, кодирующих ET-3 или их рецепторы (EDNRB), обусловливают врожденный мегаколон как у человека, так и у мышей [41] [42] [43] [44].

Зрелые эндотелины получаются из больших молекул-предшественников, называемых препроэндотелины, которые расщепляются энзиматически и продуцируют биологически неактивные промежуточные продукты длиной в 38–41 аминокислоту, называемые "большими эндотелинами" ('big endothelins'). Большие эндтелины постепенно расщепляются с помощью endothelin converting enzyme 1 (ECE-1) до биологически активных эндотелинов длиной в 21 аминокислоту. Биологическое значение биохимичекого пути генерации активных эндотелинов выяснено у мышей, дефицитных по ECE-1 [45•]. Эти мыши имеют черепнолицевые и сердечные аномалии (обусловленые отсутствием продукции биологически активного ET-1) и неспособны генерировать эпидермальные меланоциты и энтерические нейроны и тем самым репродуцирующие фенотип, характерные и для ET-3- и EDNRB-дефицитных животных. Эти находки показывают, что ECE-1 является протеазой, ответственной за формирование in vivo активных ET-1 и ET-3, и что межклеточные пути передачи сигналов с помощью ET-1/ECE-1/EDNRA оси и ET-3/ECE-1/EDNRB оси оба участвуют в развитии отдельных субнаборов NC клеточных клонов [45•].

Эффекты ET-3 на клетки НГ и их производные зависят от стадии дифференцировки этих клеток. Таким образом, добавление ET-3 в культуры NC, полученные из только что эмигрировавших из нервной трубки клеток, вызывает драматическое увеличение скорости пролиферации и генерацию большого числа меланоцитов [46]. Однако эффекты ET-3 на энтерические клетки НГ, выделенные из кишки эмбрионов позвоночных совсем другие. В этом случае активация сигнального пути ET-3/EDNRB, по-видимому, ингибирует дифференцировку клеток НГ в постмитотические нейроны и тем самым поддерживает их в пролиферативном недифференцированном состоянии [29••] [47•]. Этот эффект не зависит от клеточного цикла. Кроме того ET-3 влияет на созревание и дифференцировку мезенхимных клеток кишки. Таким образом, ET-3 способствует in vitro развитию энтерических гладкомышечных клеток и соответственно ингибирует экспрессию ламинина α1 с помощью этих клеток [47•]. Возможно, что и in vivo, ET-3 (который продуцируется исключительно клетками кишки, не происходящими из НГ ) также направлен на множественные клеточные мишени, такие как мезенхимные гладкомышечные клетки кишечника плода и энтерический нервный гребень, который экспрессирует EDNRB.

Онтогенетический потенциал энтерического НГ

Нейральные стволовые клетки являются самовозобновляющимися мультипотенциальными предшественниками, которые могут генерировать широкий круг нейрональных и глиальных типов клеток внутри данного органа. In vitro исследования, в которых были выделены предшественники энтерической НС из кишки E14 эмбрионов крыс и помещены в клональные клеточные плотности было подтверждено, что вскоре после инвазии мезенхимы кишки, онтогенетический потенциал большой фракции энтерических клеток НГ ограничивается и что они необратимо детерминируются в направлении специфических путей дифференцировки [27]. Др. исследования, однако, указывают на то, что энтерические клетки НГ остаются в мультипотентном состоянии в течение обозримого периода после момента инвазии кишечника плодов млекопитающих. Так, производные НГ клетки, изолированные из кишечника эмбрионов крыс были способны давать потомство, экспрессирующее нейрональные или глиальные фенотипы в массовой культуре. [48]. Более того обратная трансплантация сегментов кишки в миграторные пути НГ у молодых эмбронов показали, что энтерические клетки НГ сохраняют свою способность мигрировать в удаленные сайты и экспрессировать нейрональные и глиальные маркеры [49] [50]. Энтерические Нг клетки вносили в кишку плода, поддерживаемую в органной культуре. Производные НГ клетки, взятые из кишечника эмбрионов мыши на ст. E11.5 самообновлялись и сохраняли множественый потенциал, генерируя потомство, экспрессирующее нейрональные и глиальные маркеры [25••]. Сходные самообновляющиеся мультипотентные предшественники идентифицированы в производных НГ клетках, выделенных из периферических нервов плодов крыс [51••]. Идентификация и изучение мультипотентных НГ стволовых клеток позволит ответить на некоторые вопросы детерминации и дифференцировки.

Conclusions

In vitro и in vivoидентифицированы некоторые внеклеточные и внутриклеточные молекулы, которые имеют (или скорее могут иметь) значение для разных аспектов гистогенеза энтерической НС. Описаны фенотипы многих мутаций генов млекопитающих и эффекты различных сигнальных путей in vitro. Имеющаяся информация позволяет очертить только в общем молекулярные и клеточные взаимодействия, управляющие формированием энтерических ганглиев (Fig. 2). Согласно такой модели, большая часть предшествеников энтерической НС генерируется стволовыми клетками НГ (NCSCs) [52], которые эмигрируют из заднего мозга и передних частей спинного мозга и мигрируют вентрально к шейным веточкам лорсальной аорты и передней кишке (Fig. 1 [7]). Во время этой пре-энтерической фазы миграции NCSCs, предназначенные для колонизации кишки экспрессируют SOX10, но негаивны в отношении RET RTK (SOX10⁺/ RET^-). Перед вступлением в переднюю кишку и под влиянием локальных сигналов НГ-производные предшественники энтерической НС (NCEPs) индуцируют экспрессию RET (SOX10⁺/ RET⁺). Микроусловия в стенке кишки и влияние GDNF — и возможно других членов GDNF-related семейства нейротрофных факторов — SOX10⁺/ RET⁺ NCEP клетки поддерживают свою мультипотентну способность, пролиферируют и колонизируют весь кишечник. 'Assisting' the GDNF (neurturin)/RET сигнаьного пути являются другими диффундирующими молекулами, такими как ET-3 и ее рецептор EDNRB, активация которых предупреждает терминальную дифференцировку NCEP клеток и позволяет пролиферативным сигналам вызывать максимальный эффект. Параллельно с пролиферацией большинство клеток, фракция NCEP клеток, дифференцируется и дает зрелые (постмитотические) нейроны и позднее, клетки глии. Возможно, что подавление экспрессии c-Ret является пререквизитом для дифференцировки глиальных клеток

Рис.2 Схематическое представление неоторых молекулярных и клеточных взаимодействий, которые важны для развития энтерической НС млекопитающих. NCSC, стволовые клетки НГ; NCEP, производные НГ предшественники энтерической НС (Modified from [25••].)

Когда количество NCEP клеток в кишке увеличивается и значительное их число дифференцирующихся клеток накапливается (под комбинированным влиянием GDNF и ET-3), скорость увеличения числа клеток и дифференцировка снижаются, чтобы соответствующие количества типов зрелых клеток аггрегировали и формировали функциональыне энтерические ганглии. Это скорее всего связано со снижением эффективной концентрации нейротрофных факторов, продуцируемых стенкой кишки (таких как GDNF) и снижением чувствительности NCEP клеток к активации cognate signalling receptors (таих как RET). Однако, возможно, что небольшое число NCEP клеток выживает в кишке в течение все жизниживотного и что при соответствующих условиях таие клетки способны дифференцироваться в дополнительные нейрональные и глиальные клетки. RET-экспрессирующая субпопуляция энтерических нейронов, по-видимому, нуждается в нейртурине (neurturin) для своео выживания и нормальной функции. Пока неясно, участвую ли описанные выше молекулы и взаимодействия в пролиферации и дифференцировке НГ-производных предшественников кресцовой энтерической НС.