Methylation
МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК


Модификация ДНК с помощью метилирования является специфичной формой регуляции генов, при которой метилированные CpG динуклеотиды сохраняются в последующих клеточных делениях, благодаря функции поддержания метилаз, действующих на полуметилированные ДНК во время репликации. ( Leonhardt et al 1992). Эпигенетические модификации могут, следовательно, размножаться с ДНК делящихся клеток независимо от меняющегося состава транс-действующих факторов. Это свойство делает метилирование ДНК удобным механизмом для создания наследуемых паттернов экспрессии генов в клеточных клонах во время развития. Важность метилирования ДНК во время эмбриогенеза продемонстрирована с помощью целенаправленного разрушения гена метилтрансферазы ДНК мыши с помощью гомологичной рекомбинации( Li et al 1992).
Метилирование дНК играет важную роль в регуляции ткане-специфичной экспрессии генов во время дифференцировки склетных мышц( Yisraeli et al 1986). Различные делеционные мутации в актиновом промоторе предупреждают деметилирование и экспрессию, указывая тем самым, что удаление метиловых групп находится под цис-действующим контролем и может быть обязательным для транскрипционной активации во время дифференцировки мышц ( Paroush et al 1990).
В данной работе(Grieshammer et al., 1995)представлен детальный анализ CpG метилирования ДНК регуляторных элементов в myosin light chain MLC 1/3 гена , как во время эмбрионального развития, так и в различных типах волокон взрослых мышц у трансгенных мышей (chloramphenicol acetyl transferase CAT репортерный ген под контролем MLC регулятоных последовательностей). У трансгенных эмбрионов мыши экспрессия мышцеспецифичного репортерного гена градирована в разивающихся аксиальных мышцах вдоль ростро-каудальной оси и в клеточных культурах из этих мышц. Показано, что поддержание позиционных различий экспрессии трансгена MLC-CAT не может быть объяснено различиями в транкрипционной компетентности соответствующих мышц. Скорее паттерн экспрессии трансгена отражает степень CpG деметилирования как MLC1 промотора, так и MLC энхансера . Селективное метилирование участвует в поддержании скорее, чем возникновении транкрипционных различий в развивающихся мышцах. Градиент в экспрессии трансгена MLC-CAT в сегментированных аксиальных мышцах вдоль передне-задней оси эмбрионов( Donoghue et al 1991a; Grieshammer et al 1992) указывает на то, что ДНК регуляторные элементы могут представлять собой мишени для региональных регуляторов, которые создают позиционно ограниченные паттерны экспрессии трансгенов во время раннего развития мышц. У взрослых ростро-каудальный градиент экспрессии трансгена сохраняется только в сегментированных аксиальных мышцах межреберных и межпозвонковых, тогда как мышцы головы и латеральные мышцы туловища и передних конечностей обнаруживают высокие уровни экспрессии трансгена независимо от положения.( Donoghue et al 1991a Grieshammer et al 1992).
Региональные различия в экспрессии MLC-CAT трансгена сохраняются в склетных клеточных клонах, происходящих из латеральных мышц трансгенных животных и коррелируют с состоянием метилирования В данном исследоваении установлена беспрецендентная корреляция между метилированием элемента нижестоящего энхансера и регуляцией ткане-специфической экспрессии гена. Предположение, что эпигенетические модификации дистальных (удаленных)регуляторных элементов могут контролировать транскрипцию, подтверждено исследованиями U Grieshammer M J McGrew and N Rosenthal Интересно, что CpG метилирование не влияет на связывание ядерных факторов с сердцевиной MLC энхансера.
Механизм обуславливаемой метилированием ингибиции экспрессии MLC-CAT трансгена наиболее вероятно связан с изменением локальной конфигурации хроматина ( Cedar and Razin 1990 Bird 1992) с последующей модификацией взаимодействий регуляторных белков с ДНК. Согласно данному исследованию регуляторные последовательности, включенные в трансген MLC-CAT представляют собой мишень для ряда факторов, которые навязывают новые паттерны метилирования, когда они изолированы из контекста эндогенного локуса . Паттерн градированой экспрессии трансгена MLC-CAT в сегментированных межкостальных и межпозвонковых мышцах возникает рано в развивающихся миотомных мышечных массах и не обнаруживается в мышцах стенки тела или мускулатуре конечностей. ( Grieshammer et al 1992 ). Очевидно, что различия в экспрессии трансгена отражают различия в их эмбриональном происхождении . В развивающихся сомитах множественные миогенные клоны возникают во время эмбриогенеза, которые можно отличить по их локализации в сомитах ( Ordahl and LeDouarin 1992), по их миграторному поведению и по их зависимости от аксиальных структур , таких как нервная трубка и хорда для миогенной дифференцировки ( Rong et al 1992 Pourquie et al 1993). Формирование мышц конечностей зависит от функции Pax3, тогда как аксиальные лицевые и мышцы стенки тела не зависят ( Bober et al 1994). Следовательно, различные регуляторные пути могут отвечать за формирование специфических миогенных клонов.
Данное исследование указывает на то, что эти различия могут жестко поддерживаться в результате создания четко определенных эпигенетических модификаций, контролирующих региональную регуляцию генов. Так, паттерн метилирования энхансерного элемента MLC, расположенного дистально от стартовой точки транскрипции, непосредственно отражает ростро-каудальный градиент экспрессии трансгена MLC-CAT в межреберных мышцах. Экспрессия и соответствующее метилирование трансгена MLC-CAT , следовательно, выступает как маркер возникающих различных миогенных клонов . Остается определить маркирует ли изменчивость в метилировании эндогенного локуса также различия, дающие различные группы мышц.
Во время развития млекопитающих геном подвергается глобальным изменениям в уровнях метилирования ( Monk et al 1987 Chaillet et al 1991 Kafri et al 1992), которые постепенно модифицируют индивидуальные локусы. Возникновение ткане-специфичных паттернов метилирования происходит до детерминации ( before concomitant) ). Кажется, что деметилирование у млекопитающих нижестоящего энхансерного элемента MLC может быть обязательным условием для инициации транскрипции с MLC1 промотора . Эта модель подтверждается работой, где было показано, интроный энхансер необходим и достаточен для ткане-специфичного деметилирования и активации иммуноглобулинового гена ( Lichtenstein et al 1994).
Маловероятно, что метилирование является первичным детерминантом позиционно-ограниченной экспрессии трансгена MLC CAT в развивающемся миотоме. Относительно униформное метилирование энхансерных последовательностей трансгена MLC в эмбриональных сомитах из разных аксиальных уровней подтверждает, что изменчивость в метилировании энхансера MLC в неонатальных мышцах возникает позднее. Уровни экспрессии генов в разных мышцах могут поддерживаться локальными конфигурациями хроматина, отражающими селективное CpG метилирование регуляторных последовательностей. Должны существовать региональные регуляторы ,непосредственно устанавливающие паттерн дифференциального метилирования используя субнаборы CpG динуклеотидов, которые еще не проанализированы. Такие сайты должны выступать как инициальные маркеры финального градированного паттерна метилирования , который устанавливается на поздних стадиях развития. Этот механизм аналогичен модели геномного импринтинга, при котором хромосомные маркеры импринтируемых аллелей необходимы после оплодотворения , но до инактивации гена ( Latham et al 1994). Могут быть обнаружены сходные молекулярные пути обеспечения позиционной информацией развивающиеся мышцы у эмбрионов позвоночных.
В клетках млекопитающих примерно 3-5% цитозиновых остатков геномной ДНК присутствует как 5-метилцитозин. Эта модификация цитозина происходит после репликации ДНК и катализируется ДНК метилтрансферазой ( 1) с использованием S-аденозил-метионина в качестве донора метила. 1 из клеток млекопитающих клонирована, ее функция поддерживатьстрого определенный паттерн метилирования, характерный для каждого типа дифференцированных клеток.
3 другие Dnmt (Dnmt 2, Dnmt 3а и 3b) также клонированы. Две последние, по-видимому, функционируют как de novo метилазы, т.к. они могут метилировать полуметилированную и неметилированную ДНК с одинаковой эффективностью. Экспрессия 3b существенно увеличивается в опухолях. 2, по-видимому, метилирует интегрированные ретровирусные последовательности. Некоторые полагают, что 2 не нужна для поддержания метилирования вирусной ДНК и de novo метилирования. Идентифицирована и специфическая деметилаза, которая использует CpG ДНК в качестве субстрата.
Примерно 70-80% 5-метилцитозиновых остатков обнаруживается в CpG последовательностях. Эти последовательности обнаруживаются с высокой частотой в геноме и обозначаются как CpG островки. CpG островки - это области ДНК более 200 п.н. с G+C содержанием более 0.5 (ожидаемое/наблюдаемое присутствие CpG >0.6). Было установлено, что большинство CpG островков, ассоциированных с генами неметилировано в зародышевой линии и они часто располагаются в промоторных областях генов. Эти промоторы порядка 1 т.п.н., метилирование островков CpG внутри них может эффективно и наследственно заключать гены в состоянии "off". Неметилированные CpG островки ассоциированы с генами домашнего хозяйства, тогда как островки большинства ткане-специфичных генов метилированы.
Метилирование ДНК участвует в эмбриональном развитии. Геномный импринтинг также связан с метилированием ДНК, с инактивацией специфических генов на Х хромосое. Предполагается, что метилирование ДНК участвует и в процессах старения
Метилирование CpG островков часто приравнивается к транскрипционной неактивности и имеются доказательства этого для островков, локализованных в промоторах генов. Также метилирование является очевидно частью механизма перманентного молчания гена, включая и те, что инактивируются в Х хромосоме.
Метилирование ДНК и регуляция экспресси генов
Так как 5-метилцитозин проникает в большую борозду спиральной ДНК он, возможо, тем самым модифицирует взаимодействие цитозина со связывающимися транскрипционными факторами. Показано, что in vitro специфические транкрипционные факторы связываются с меньшим сродством с метилилированными мишенями.
Другим возможным механизмом м.б. регуляция посредством белков, которые связываются преимущественно с метилированными промоторами и тем самым предотвращают связывание с транскрипционными факторами. Идентифицированы 2 белка, связывающиеся сиквенс-специфически с метилированной ДНК, MDBP-1 и MDBP-2.
Идентифицирован еще один класс белков, связывающихся с метилированными CpG (MeCPs), которые действуют, по-видимому, как репрессоры транскрипции. Известны 2 члена этого семейства 1 и 2, первый нуждается в 12 метил-CpGы для преимущественного связывания с метилированной ДНК, второй является распространенным хромосомным белком, который нуждается в одиночных метилированных CpG сайтах для связывания ДНК. Оба репрессируют транскрипцию.
MeCPs2 ко-преципитируется вместе с гистоновой деацетилазой, это указывает на наличие связи между метилированием ДНК и структурой хроматина. Известно, что экспресия гена может зависеть от химической модификации гистонов с последующим изменением структуры хроматина. Хроматин в клетках млекопитающих состоит из серии нуклеосом с компактной их конфигурацией. Нуклеосомы состоят из 146 п.н. ДНК, обернутых вокруг белкового октамера, содержащего по 2 молекулы каждого из гистонов Н2А, Н2В Н3 и Н4. В месте транскрипции структура хроматина становится более "открытой" и доступной факторам транскрипции, а ДНК чувствительной к расщеплению нуклеазой. Ацетилирование гистонов предшествует транскрипции и обусловливает деконденсацию хроматина, чтобы обеспечить связывание транскрипционных факторов с ДНК. гистоновая ацетилтрансфераза и гистоновая деацеилаза играют важную роль в этом процессе. Ацетилирование гистонов ассоциирует с активной транскрипцией. Очевидно ацетилирование ε-групп лизиновых остатков снижает позитивный заряд гистонов и снижает их связывающее сродство с ДНК, что способствует "открытию" хроматина. В пользу этого свидетельствует и ингибитор гистоновой деацетилазы, trichostatin A (TSA) может активировать транскрипцию некоторых генов.
Предполагается, что метилированные неактивные гены содержат содержат недоацетилированные гистоны, тогда как неметилированные активные гены преимущественно ассоцированы с высоко ацетилированными гистонами. Участки, где метилированные гены связывают МеСР2, в свою очередь рекрутируют гистоновую деацетилазу в резултате происходит супрессия транскрипции. TSA может активировать некоторые гены, которые метилированы, но не все метилированные гены, это указывает на то, что взаимодействие между метилированной ДНК, 2 и гистоновой деацетилазой сложное и возможно связано с вовлечением других факторов. Частичное деметилирование некоторых генов с помощью ингибитора 5-AZA-CdR взаимодействует синергично с TSA при активировании метилированных генов, которые нечувствительны к одному лишь TSA.
Парадокс метилирования
Но не все CpG островки и сайты метилирования локализованы в промоторах; неоторые ткане-специфичные и импринтированные гены имеют CpG островки, расположенные на удалении от сайта инициации транскрипции, а многие гены имеют множественные промоторы. Примером гена с внутренним CpG островком может служить ген человека АРОЕ, в экзоне 4 которого CpG островок в 940 п.н., такими же я вляются гены р16, MYOD1 и РАХ6. Интересно, что гены домашнего хозяйства редко имеют нижерасположенные CpG островки, тогда как эта ситуация обнаруживатеся в 49% генов с более ограниченным паттерном экспрессии. Величина островков в таких генах меньше ( в среднем 935 п.н. по сравнению с 1-35) и совсем маленькие островки (200-600 п.н.) ассоциированы с генами с ограниченным паттерном эксрессии. Эти CpG осровки могут представлять собoй ткане- и стадиоспецифические промоторы, другая возможность, что они выполняют кодирующие функции, которые не могут быть потеряны при мутировании.
Метилирование обусловливает перманентную супрессию активности CpG островков в промоторах. Примерами такой постоянной супрессии являются: промоторы Х-сцепленных генов; промоторы импринтированных генов; внутригеномные паразиты; гены супрессоров опухолей (р16, RB1, VHL и др); гены репарации ДНК (напр., MLH1).
    Доказательтсва:
  1. Геномное молчание инактивированных промоторов;
  2. Молчащие гены редко спонтанно реактивируются;
  3. Метилирование регулируется онтогенетически;
  4. Для деметилирования необходимо прохождение через зародышевую линию;
  5. Трансфекция инактивированных аллелей не приводит к их экспрессии;
  6. Метилированные промоторы связывают МеСР1 и МеСр2;
  7. МеСР2 обеспечивает связь с гистоновой деацетилазой;
  8. In vitro метилирование подавляет экспрессию репортерных генов;
  9. Промотор м.б. реактивирован с помощью 5-AZA-CdR.
Белки, связанные с метилированной ДНК обусловливают также активность гистоновой деацетилазы, указывая тем самым, что они индуцируют конфигурацию супрессированного хроматина в сайте инициации транскрипции. Показано, что метилирования 1-2 островков в промоторе достаточно для строгой супрессии активности промотора. Метилирование 7% CpG сайтов может эффективно обусловливать молчание гена. С другой стороны метилирование CpG островков ниже активного промотора не блокирует формирования транскриптов. Гены млекопитающих отличаются в этом отношении от генов грибов.
Высказывается предположение, что функциональные копии повторяющихся элементов Alus (подходят под определение CpG островков) могут приводить к нарушению функции гена и дальнейшей транспозиции, что метилирование ДНК в этом случае может супрессировать активность промоторов этих многочисленных элементов. Так метилирование элемента в интроне 6 гена ТР53 человека происходит во всех изученных типах клеток.
Используется метилирование для контроля активности паразитических промоторов, метилирование de novo CpG-богатых областей должно блокировать инициацию чужеродных транскриптов, позволяя в то же самое время транскрипции с активного промотора.
Метилирование CpG островков ниже точки инициации транскрипции не блокирует элонгации в клетках млекопитающих. Этот парадокс может быть разрешен, если предположить, что транскрипция через CpG островки способствует метилированию de novo. Во многих случаях степень метилирования CpG островков коррелирует с повышенным, чем с пониженным уровнем экспрессии генов. Прекрасным примером является ген Igf2r мыши, где транскрипция смысловой нити материнского гена понуждает CpG островок в области 2 к метилированию de novo и таким образом к молчанию его способности действовать как промотор для антисмысловой нити. Эта ситуация обратная на отцовском аллеле - здесь область 2 неметилирована и выступает как промотор, управляющий транскрипцией в противоположном направлении через вышестоящий CpG осровок, что ведет к его de novo метилированию и молчанию. Инактивированый Igf2r промотор неспособен метилировать de novo область 2.
Показано, что промотор рецептора эстрогена и Igf2 промторы Р2-Р4 становятся метилированными de novo в эпители колона у старых индивидов. Интересно, что оба этих островка являются нижестоящими по отношению к другим промоторам. В случае Igf2 уровень метилирования de novo Р2-Р4 осровков был наивысшим в печени, где экспрессия, управляемая вышестоящим промотором, также была наивысшей. Имеются многочисленные примеры опухолевых клеток, где метилирование де ново коррелирует с повышенной экспрессией определенных последовательностей. Например, при хронической миелогенной лейкеми человека транслоцированный ABL промотор, который оказывается расположенным ниже сильного BCR промотора, обнаруживает де ново метилирование, которое увеличивается со степенью экспрессии. В экзоне 2 гена р16 и в экзоне 5 гена РАХ6 гиперметилирование островков коррелирует со степенью экспрессии.
Ясно, что одной транскрипции недостаточно для индукции метилирования де ново CpG островков в генах домашнего хозяйства. Также α-глобиновый ген 2, в котором вся кодирующая область является CpG осровком, не метилируется в экспрессирующих его эритроидных клетках. Эти отличия м.б. связаны с близостью к стартовой точке транскрипции или с транскрипцией в несоответствующем клеточном содержимом. Связанное с транскрипциеф метилирование м.б. обусловлено прохождениемтранскрипционного комплекса или с временным образованием одиночной нити ДНК, которая как известно прекрасный субстрат для метилирования де ново.
Аномальное метилирование CpG островков в промоторах генов супрессоров опухолей, таких как кодирующих ретинобластому, Von-Hippel Lindau и р16, может вносить свой вклад в функциональную инактивацию.

Метилирование ДНК и опухоли
(Momparler, Bovenzi, 2000)

Общий уровень 5-метилцитозина в опухолевых клетках часто ниже, чем в норме. Но фактически во время туморогенеза имеется увеличение специфичесого метилирования генов, регулирующих рост.
5-Метилцитозин и мутации
5-метилцитозин может подвергаться спонтанному деаминированию с образованием тимина со значительно большей скоростью, чем деаминирование цитозина в урацил. Если деаминирование 5-метилцитозина не репарируется, то возникают С->Т транзиционные мутации. Подобные мутации наблюдаются в р53 гене супрессора опухоли. Этот феномен более сложен и может быть связан с вовлечением добавочных событий. Напр., бензопирен преимущественно формирует adducts в метилированных CpG сайтах р53 гена, которые являются горячими точками для мутаирования.
Аберрантное метилирование ДНК связанных с опухолями генов
Клетка млекопитающих со временем удвоения в 24 ч может дать массу в 1 кг (1012 клеток) в течение 40 дней. Поэтому она содержит множество генов, которые супрессируют этот потенциал роста. Анализ семейных случаев ретинобластомы (Rb) позволил предположить, что оба аллеля Rb тумор-супрессирующего гена инактивируются, чтобы дать злокачественный фенотип. Обнаружение, что многие гены супрессоры опухолей могут быть инактиврованы аберрантным метилированием CpG островков промоторной области, показало, что это эпигенетическое событие играет важную роль в туморогенезе. Предполагается, что биаллельное метилирование или метилирование в комбинации с мутацией или делецией может приводить к инактивированию гена супрессора опухоли.
Возможно, что ДНК метилтрансфераза может делать ошибки при метилировании CpG островков в формирующейся нити ДНК, давая неметилированный CpG в параллельной нити. Возможно, что аномальноеметилирование м.б. обусловлено удалением CpG связывающих белков, защищающих эти сайты от метилирования.
Супрессоры опухолей и другие связанные с опухолями гены гиперметилированы у человека.(табл.1) 
Гены, молчащие при аберрантном метилирование ДНК и активируемые 5-AZA-CdR
 в опухолевых линиях клеток человека
______________________________________________________________________
Gene                                       Activation 5-AZA-CdR
______________________________________________________________________
Tumor suppressor
  p15 INK4b (cyclin kinase inhibitor)                 +
  p16 INK4A (cyclin kinase inhibitor)                 +
  p73 (p53 homology)                                  +
  ARF/INK4A (regulate level p53)                      +
  Wilms tumor                                         +
  von Hoppel Lindau (VHL)                             +
  Retinoic acid receptor-β (RARβ)           +
  Estrogen receptor                                   +
  Androgen receptor                                   +
  Mammary-derived growth inhibitor                    +
  Hypermethylated in cancer (HIC1)                   nd
  Retinoblastoma                                     nd
Invasion/metastases suppressor
  E-cadherin                                          +
  Tissue inhibitor metalloproteinase-3 (TIMP-3)       +
  mts-1                                               +
  CD-44                                               +
DNA repair/detoxify carcinogens
  Methylguanin methjyltransferase                     +
  hMLH1 (mismatch DNA repair)                         +
  Glutathione- S-transferase                         nd
  BRCA-1                                             nd
Angiogenesis inhibitor
  Thrombospondin-1 (TSP-1)                            +
  TIMP-3                                              +
Tumor antigen
  MAGE-1                                              +
______________________________________________________________________
nd, not done

р16 кодирует конституитивно экспрессирующуюся
В различных типах опухолей аномальное или случайное метилирование CpG островков обнаруживается в промоторных регионах многих ассоциированных с канцером генах, приводя к подавлению их экспрессии. Вовлечение в этот процесс генов, супрессирующих опухоли, супрессирующих метастазирование, ангиогенез и репарацию ДНК указывает на то, что этот эпигенетический процесс играет важную роль в туморогенезе. Ингибитор метилирования ДНК, 5- AZA-CdR, реактивирует экспрессию большинства из этих генов в опухолевой линии клеток человека.
Лечение опухолей ингибиторами метилирования ДНК
5-AZA-CdR является мощным и специфическим ингибитором ДНК метилтрансферазы. Инактивирование ДНК метилтрансферазы связано с необратимым образованием ковалентных мостиков между этим ферментом и аналогом. Антисмысловая ДНК метилтрансферазы обнаруживает in vitro противоопухолевцю активность и некоторый потенциал по реверсии злокачественного фенотипа. Эти антисмысловые олигонуклеотиды ингибируют рост опухолей в модельных животных. 5- AZA-CdR ингибирует кишечные новообразования у мышей. 5-AZA-CdR является S-фаза специфическим агентом с коротким периодом полу-жизни, фармакологическая актинвость его является дозово-зависимой. При клинической 5-AZA-CdR терапии интенсивные дозы в короткие интервалы дают оптимальный эффект. Он оказался более мощным антилейкемическим агентом, чем цитозин арабинозид. Первые клинические испытания показали, что 5-AZA-CdR вызывает полную ремиссию у пациентов с острой лейкемией in relapse. Существенно снижается ДНК метилирование лейкемичных blasts. 5-AZA-CdR обнаруживает клиническую акивность и у пациентов с хронической миэлоидной лейкемией при blast crisis и у пациентов с миэлодиспластическим синдромом, прелейкемией. 5-AZA-CdR обнаруживает противоопухолевую активность против опухоли груди шт мшекщю В предварительных исследованиях пациентов с опухолями головы и шеи и пациентов с опухолями простаты 5-AZA-CdR обнаруживал от минимального до среднего уровня антиопухолевую активность, обусловленное использованием субоптимальных доз. Использование интенсивных доз 5-AZA-CdR у пациентов с IV стадией nonsmall cell lung опухолью давало противоопухолевый эффект, включая одного пациента, прожившего более 6 лет ( эти пациенты обычно живут очень недолго). Клиническая противоопухолевая активность 5-AZA-CdR сложна для оценки.
Гематопоэтическая токсичность является основным побочным эффектом 5-AZA-CdR, который ограничивает дозы. Он м.б. преодолен с помощью генной терапии, те.е. введения гена резистентности к лекарству, цитидин деаминазы, в гематопоэтические клетки для защиты их от токсичности 5-AZA-CdR.

A.Rottach, H. Leonhardt, and F. Spada
DNA Methylation-Mediated Epigenetic Control
J. of Cellular Biochemistry V. 108, P. 43-51, 2009
Во время дифференцировки и развития клетки подвергаются драматическим морфологическим и функциональным изменениям без каких-либо изменений в последовательностях ДНК. Лежащие в основе изменения паттернов генной экспрессии устанавливаются и поддерживаются с помощью эпигенетических процессов. Первоначальная механистическая информация была получена путем наблюдений за состояниями генной активности и репрессии, коррелирующих с уровнем метилирования ДНК в их промоторных регионах. Метилирование ДНК является пострепликативной модификацией, которая происходит исключительной в С5 позиции остатков цитозина (5mC) и преимущественно в контексте CpG динуклеотидов в клетках позвоночных. Три главные ДНК метилтрансферазы (Dnmt1, 3a и 3b) устанавливают специфические паттерны метилирования ДНК во время дифференцировки и поддерживают их в течение многих клеточных делений. Метилирование CpG распознается с помощью, по крайней мере, трех семейств белков, которые в свою очередь рекрутируют гистон модифицирующие и хроматин ремоделирующие энзимы и тем самым транслируют метилирование ДНК в репрессивные хроматиновые структуры. Т. о., многочисленные модификации гистонов оказываются связанными различными способами с метилированными ДНК.

Fig. 1. Schematic representation of the mimmrtin DNA methyltransferase family. All Dnmts have a similar catalytic domain that features highly conserved motifs (1-Х) also found in prokaryotic DNA (cytosme-S) methyltransferases. the Dnmts differ, however, in their regulatory region. Dnmtl contains the PCNA binding domain (PBD). the pericentric hetcrochromatin targeting sequence (tS). aCXXC-type лпе finger motif (ZnF). and two bromo adjacent homology domains (BAH), the start codonof the long (AtGJ JS and short (АТСЦ) isoforms as well as the seven lysine-glycine repeat linker (KG,) are indicated, the regulatory domains of Dnmt3a and 3b comprise a PWWP domain named after a conserved Pro-Trp-trp-Pro motif and a plant homeodomain (PHD).

Fig. 2. The three classes of mCpO binding proteins (MBPs). The ability to recognize methylated CpG site* is mediated by different modules, the methyl-CpG binding domain (MBD). the SET-and Ring-associated (SRAJ domain, or zinc finger (ZnF) motifs. MBD proteins are shaded in yellow. In addition to the MBD, MBD1. MBD2, and MeCP2 contain a trans-repressor domain (TRD). The MBDlu isoform is shown. Amino acid repeats (GR and E) are depicted in orange. Uhrfl and the very similar Uhrf2 (shaded in blue) recognize methylated ONA via the SRA domain and contain, in addition, an Ubiquitm-like (Ubl) motif, a Tudor domain, a plant-and homeodomain (PHD), and a Ring finger. The third class ot MBPs (Kaiso, Kaiso-likr. and ZBTB38) is characterized by several zinc fingei motifs. Binding to methylated ONA is mediated by a C2H2 zinc finger motif (yellow). The broad complex, tramtrack. and bnc a brae (BTB/POZ) domain is depicted in gray.

Fig. 3. Molecular links between ONA methylation. histone modification and chromatin structure. A: MBD1 binds methylated DNA via the MBD domain and recruits the lysine methyltransferase SetOBl to enforce silencing. 8: Replication-coupled maintenance of DNA methylation and histone modification. PCNA serves as a loading platform for Dnmtl and Uhrfl. Uhrfl recognizes hemimethylated CpG sites via the SRA domain, interacts witti Dnmtl and thus allows maintenance of genomic methylation. Interacting chromatin modifying enrymes such as HDAC1, HDAC2 (deacetylation), G9a (dimethylation of H3K9), or Suv39hl (trimethylation of H3K9) enforce gene silencing by removing permissive acetyl-groups or introducing repressive lysine methylation on histones. C: Kaiso binds pairs of methylated CpG sites via the лпе finger motif. Interaction with the NCoR repressive complex and HDAC3 (deacetylation) promotes repression of transcription. D: De novo methylation requires the ОМА methylatransferases Dnmt3a and 3b 0nmt3L serves as a regulatory factor and via its piant homeodomain (PHD) mediates the interaction with unmcthylated histone H3 lysine 4 (H3K4) generated by LSD1. E: Binding of HP1 mediates long-term silencing of chromatin regions. A positive feedback loop is created by HP1 recruiting Suv39H1 that trimethylates H3K9 generating additional binding sites for HPl.


Сайт создан в системе uCoz