Specialized mesenchymal cells
СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ КЛЕТКИ

Association of mesenchymal cells and immunoglobulins with differentiating epithelial cells

Antonin Bukovsky, Michael R Caudle, Jeffrey A Keenan, Nirmala B Upadhyaya, Stuart E Van Meter, Jay Wimalasena, Robert F Elder
BMC Developmental Biology 2001 1: 11

Мезенхимные клетки или ассоциируют с эпителиальными базальными мембранами  [pericytes и периваскулярные monocyte-derived cells (MDC)] или располагаются внутри эпителия  (MDC и T cells).
Специализированные мезенхимные клетки, т.наз.  fibroblast-derived vascular pericytes, monocyte-derived cells (MDC), и лимфоциты участвуют в пролиферации, дифференцировке и старении ткань-специфичных клеток различных эпителиальных, паренхимных и мышечных тканей.  Роль мезенхимных клеток в гомеостазе нормальных тканей (и опухолей) изучена слабо. Природа взаимодействий мезенхимных клеток с эпителиальными зависит от типа ткани, напр., печень, головной мозг и мышцы с долго живущими дифференцированными клетками, с одной стороны,  эпидермис,  ectocervix и влагалище, где клетки растут и гибнут с довольно быстрой скоростью. Или это м. зависеть от защитного ("стоп эффекта") или поддерживающего/стимулирующего дифференцирровку клеток в суицидное состояние (апоптоз) с помощью мезенхимных клеток в данном эпителии.  Взаимоотношения мезенхимных и эпителиальных клеток ткане-специфичны и устанавливаются во время критического периода развития, который совпадает с концом иммунной адаптации. Специализированные мезенхимные клетки , такие как перициты, MDC и T лимфоциты м. существенно влиять на дифференцировку и старение эпителиальных клеток. Предполагается, что дифференцировка эпителиальных клеток м. нуждаться с определенных цитокинах, высвобождаемых Т клетками и  DC подвершихся апоптозу.
Апоптоз индуцируется с помощью  p53, который ингибирует рост клеток и активирует и репрессирует транскрипцию генов. Proapoptotic функция p53, по-видимому, регулируется с помощью ras прото-онкогена. Клетки трансформированные мутантным ras имеют дефекты пути передачи сигналов, регулирующих функцию p53 и нарушения экспрессии апоптического (bax) или анти-апоптического белка (bcl-2).
У людей в ectocervix, взаимодействия между клетками мезенхимного происхождения и эпителиального происхождения меняются от базального (незрелого) слоя, где располагаются стволовые клетки, к наиболее наружным слоям, где эпителиальные клетки наиболее старые и высоко дифференцированы. Изучали эпитопы мезенхимных клеток и их продукты (иммуноголобулины) в м ногослойном эпителии  ectocervix матки.


(Рис.1.)  |  Peroxidase immunohistochemistry (IHC; brown color)of stratified epithelium of uterine ectocervix as indicated above columns and in the inset.


(Рис.2.)  |  Dendritic cell (DC) precursors secrete HLA-DR among parabasal cells (arrows) and differentiate into mature DC (arrowheads).


(Рис.3.)  | Dual color IHC (HLA-DR peroxidase/CD8 FITC) viewed in dark field visible light (A) and dark field fluorescence (B).


(Рис.4.)  | Dual color IHC (HLA-DR peroxidase/CD8 FITC) viewed in dark field visible light (A), incident fluorescence (B) and dark field fluorescence (C).


(Рис.5.)  |  Peroxidase IHC as indicated above columns.


(Рис.6.)  | Presumptive interactions in the "complete mesenchymal-epithelial network" (stratified epithelium of ectocervix).


(Рис.7.)  |  Schematic drawing of the basic "tissue control unit," which consists of monocyte-derived cells (M), vascular pericytes (P), and autonomic innervation (AI, dashed arrow), and the involvement of other components of the tissue control system (solid arrows).

Mesenchymal cells

Многослойный маточный ectocervix состоит из 4-х слоев эпителиальных клеток (Рис. 1A). Базальный слой (b) образуется одиночным радом базальных или стволовых клеток. Парабазальный (pb) слой образуется несколькими слоями парабазальных (молодых) эпителиальных клеток. Промежуточный слой (im) состоит из нескольких слоев зрелых эпителиальных клеток.  Поверхносный слой (s) образуется несколькими слоями старых клеток. Эти 4 морфологически отличающиеся слоя подразделеются тремя границами (interfaces) - b/pb, pb/im, и im/s интерфесом. Парабазальный и промежуточные слои м.б. подразделены на нижний, средний и верхний слои, поверхностный слой на нижний и верхний слои.
Мезенхимные клетки присутствуют в  lamina propria , а некоторые проникают между эпителиальными клетками. Окрашивание на  CD14 (Рис. 1A) выявляет маленькие примитивные MDC в lamina propria, но не внутри эпителия.  На Рис. 1B видна ассоциация CD14 клеток с базальной мембраной, а их выпячивания среди базальных эпителиальных клеток. Известно, что CD14, липосахаридный рецептор, сам участвует в стимуляции клеточной пролиферации. Сходная ассоциация CD14 примитивных MDC клеток с пролиферирующими Ki67 эпителиальными клетками обнаруживается в раковых опухолях яичника. В ectocervix, окраска на Ki67 (вставка, Рис. 1A) показывает, что этот маркер пролиферации экспрессируется в ядрах  парабазальных клеток по соседству с b/pb разделом, т.е.  Ki-67 все еще экспрессируется в постмитотических клетках, покинувших базальный слой и начавших дифференцировку.
Рис. 1C показывает окрашивание на Thy-1 гликопротеин, Thy-1 differentiation protein,  в фибробластах и перицитах, ассоциированных с микрососудами (microvasculature) (стрелки) по соседству с базальной мембраной. adjacent to the basement membrane. Thy-1 окрашивание (Рис. 1D) показывает, что перициты секретируют межклеточные пузырьки, которые мигрируют среди клеток базального эпителия к b/pb разделу, где они спадаются в пустые структуры ("spikes"). Рис. 1E, и 1F, показывает, что (MHC) class I молекулы не экспрессируются базальными эпителиальными клетками, но строго экспрессируются всем парабазальным слоем, включая нижние парабазальные клетки. Следовательно, мишенями для Thy-1 пузырьков являются скорее всего парабазальные клетки, соседствующие с  b/pb границей, т.е. эпителиальные клетки, экспрессирующие MHC class I и вступающие в дифференцировку.
На поверхности пузырьков экспрессируется Thy-1, внутри них субстания, не обнаруживающая Thy-1 окрашивания. Это м.б. т.наз. "targeted delivery," с помощью которого определенные факторы роста (содержимое пузырьков) доставляются путем хемотаксиса к определенным тип/стадия специфичным клеткам-мишеням, экспрессирующим рецептры для лиганда Thy-1. Однако, рецептор для Thy-1 пока не идентифицирован.
Белок дифференцировки Thy-1 имеет одиночный Ig домен и представляет собой наиболее примитивный и родоначальный член сверхсемейства иммуноглобулинов (Ig).
Предполагается, что участие Ig-родственных молекул в тканевых взаимодействиях является более примитивным, чем вовлечение их в иммунную систему и что иммунные функции, осуществляемые наборами молекул обеспечивают тканевые взаимодействия.
Молекулы MHC class I и class II и др. члены сверхсемейства Ig .
Рис. 2A показывает, что большие количества молекул HLA-DR секретируются предшественниками дендритных клеток (dendritic cells (DC)), находящихся среди эпителиальных клеток в среднем парабазальном слое (стрелки). Эта сайт-специфическая секреция  HLA-DR особенно наглядна при сравнении DC предшественников с неактивными MDC в lamina propria (Ip) или зрелыми DC в промежуточных эпителиальных слоях  (головки стрелок).
T клетки, экспрессирующие CD8, который является др. членом сверхсемейства Ig , накапливаются в lamina propria, проникают в эпителий и мигрируют через парабазальный слой  (стрелка. Рис. 2B), экспрессирующий MHC class I (Рис. 1E), в направлении pb/im границы (штриховая линия ). T клетки, вступающие в низние промежуточные влои, обнаруживают фрагментацию (головки стрелок). T клетки не обнаруживаются в средних промежуточных слоях или в поверхностном эпителии.
CD68 эпитоп MDC, mucin-подобные молекулы, относящиеся к семейству ассоциированных с лизосомами мембранных белков, экспрессируются MDC в lamina propria (Рис. 2C). Однако, внутри эпителия CD68 появляется во время трансформации предшественников DC в зрелые DC, в верхнем парабазальных слоях  (стрелка). Зрелые DC (черные голвки стрелок) секретируют CD68 среди промежуточных эпителиальных клеток и CD68 mucin-подобные молекулы сопровождают старение эпителиальных клеток (белые головки стрелок), включая поверхностные слои.
Окрашивание на CD1a,  Ig-родственную молекулу, характерную для клеток Langerhans', не выявляется в lamina propria (Рис. 2D). Предшественники дендритных клеток (стрелки) и зрелые DC (черные головки стрелок) окрашиваются. Зрелые DC , достигшие средних промежуточных слоев, обнаруживают фрагментацию  (белые головки стрелок) подобно T клеткам в нижних промежуточных слоях.

Immunoglobulins

Естественные аутоантитела присутствуют в крови нормальных здоровых индивидов и они почти исключительно IgM антитела, хотя некоторые IgG и IgA также выявляются. По сравнению с  IgG, молекулы IgM появляются раньше в фило- и онтогенезе.
Окрашивание эктоцервикального эпителия на IgM показано на Рис. 2E. Базальный и нижний парабазальные слои не  окрашиваются, но связывание IgM увеличивается в направлении pb/im интерфейса (#1, Рис. 2E). В промежуточных слоях, сходное увеличениесвязывания IgM обнаруживается в направлении im/s границы (#2). В поверхностных слоях наиболее выраженное окрашиваниеобнаруживается на поверхности эпителия (#3). Следовательно, обнаруживается усиление сродства к IgM в направлении верхних клеток в parabasal, intermediate и surface слоях (белые головки стрелок).
IgG не связывается с  basal, parabasal или intermediate клетками, но обнаруживает связывание со всем поверхностным слоем (головка стрелки, Рис. 2F). Следовательно, естественные аутоантитела  обнаруживают стадио-специфическое связывание с эпителиальными клетками. Сходное связывание обнаруживается в эпидермисе.

Dual color immunohistochemistry experiments

Базальный и парабазальные слои нормального эктоцервикального эпителия обнарживают присутствие T cells и MDC. Помимо взаимодействия с эпителиальными клетками эти мезенхимные клетки м. взаимодействовать др. с др.  Двойное иммуногистохимическое окрашивание на HLA-DR и CD8 эпитопы ( Рис. 3A и Рис. 3B ) показывает, что MDC взаимодействуют с эпителиальными клетками, соседствующими с базальной мембраной  (открытая белая стрелка) и мигрируют из lamina propria в эпителий (белые головки стрелок). Видна и миграция T клеток через базальную мембрану (желтые головки стрелок).
T клетки, проникнув в эпителий накапливаются в базальном слое, а некоторые из них вступают в парабазальный слой с помощью  MDC (сплошная белая стрелка). Под pb/im границей (штриховая линия) T клетки ассоциируют с дифференцировкой зрелых DC (сплошная желтая стрелка). T клетки, проходящие pb/im границу ,обнаруживают экспрессию HLA-DR (открытая короткая желтая стрелка). В нижних промежуточных слоях T клетки уменьшаются в размерах (открытые длинная желтая стрелка). Следовательно, MDC и T клетки постоянно мигрируют в эпителий, взаимодействуя сами с собой в парабазальном слое и обнаруживая драматические изменения в pb/im интерфейсе.
Ниже интерфейса (Рис. 4). T клетки помогают дифференцировке DC (белые головки стрелок) и обнаруживают необычную удлиненую форму, сопровождаемую экспрессией HLA-DR (белые стрелки). Выше интерфейса, зрелые DC (желтая головка стрелки) способствуют фрагментации T клеток (желтые стрелки). Следовательно, переход парабазальных эпителиальных клеток в промежуточные на  pb/im границе сопровождается трансформацией предшественников  DC в зрелые DC с помощью активированных (HLA-DR) T клеток. T клетки, вступая в промежуточные слои обнаруживают потерю экспрессии HLA-DR и предопределяются к гибели с апоптической фрагментацией при помощи зрелых DC.

Apoptosis-associated proteins in ectocervical epithelium

На Рис. 5A , и 5B показан фрагментация  T клеток (головки стрелок) в нижних промежуточных слоях. Рис. 5C демонстрирует отсуствие Т клеток в поверхностном эпителии. Фрагментация зрелых  DC происходит дальше от pb/im границы, в срединных промежуточных слоях (Рис. 5D и 5E). Дендритные клетки отсутствуют в поверхностном эпитиелииe (Рис. 5F).
Апоптическая гибель сопровождается экспрессией p53 и ras белков. Головки стрелок на Рис. 5G показывают окрашивание на p53 в фрагментах клеток на pb/im границе, а штриховой квадрат и Рис. 5H во фрагментах клеток средних промежуточных слоев, p53 экспрессия обнаруживается такэже в эпителиальных клетках, подвергшихся апоптозу на поверхности (Рис. 5I). Окрашивание на ras (Рис. 5J,K,L) обнаруживает сходные признаки.
Итак, апоптозу подвергаются Т клетки и зрелые DC среди дифференцирующихся эпителиальных клеток, апоптоз которых обнаруживается только на поверхности.

Complete and restricted mesenchymal-epithelial network

Очевидно мезенхимно-эпителиальные взаимодействия должны учитывать и межэпителиальные взаимодействия между и внутри эпителиальных слоев. Некоторые из подобных взаимодействий, подобно уменьшению контактной ингибиции, м. рассматриваться как нижестоящие инициаторы тканевой регенерации.
Предполагается. что активация базальных (стволовых) клеток в направлении пролиферации не является спонтанным процессом в результате ослабления контактной ингибици, а нуждается в использовании т.наз. базовой "Tissue Control Unit" (TCU)  Системы Тканевого Контроля. TCU ассоциирует с микроваскулатурой и состоит из трех элементов: периваскулярных MDC, перицитов и аутономной иннервации. Выпячивания MDC среди базальных эпителиальных клеток (Рис.1B) указывают на то. что они м.б. использованы для распознавания потребностей эпителия в регенерации.  Периваскулярные MDC взаимодействуют с перицитами, которые сопровождаются автономной иннервацией. Иннервация участвует в регуляции количества ткани, возможно посредством регуляции активности перицитов,т.е. добавляются мезенхимно-нейральные взимодействия  к  мезенхимно-эпителиальных сети.
Дифференцировка эпителиальных клеток, сопровождаемая мезенхимными клетками, которые взаимодействуют и сами с собой и дифференцируются и подвергаются апоптической фрагментации внутри эпителия и путем связывания IgM и IgG. Такая ситуация м.б. обозначена "complete mesenchymal-epithelial network" (Рис. 6 ).
Помимо тканевой регенерации TCU как полагают, регулирует дифференцировку эндотелиальных клеток, участвующих в самонаведении тканевого комиттирования Т клеток и MDC (Рис. 7). Последние, как полагают, несут эпигенетически закодированный "stop effect", который стимулирует дифференцировку взрослых тканей до определенной стадии, но предупреждает углубленную дифференцировку и старение. Такая  "restricted mesenchymal-epithelial network" все еще делает возможной регенерацию, но гарантирует сохранение тканевыми клетками оптимальной стадии дифференцировки.
Эпигенетическое программирование "stop effect", по-видимому, зависит от степени дифференцировки тканевых клеток во время критического периода развития, такого ка окночание иммунной адаптации. Проще, если дифференцировка тканевых клеток супрессирована, то незрелые клетки будут персистировать у взрослых (мышечная дистрофия), а если она ускорена, то будет происходить преждевременное старение  (дегенеративные болезни).
Полученные данные указывают на сущестование филогенетически и онтогенетически развитой иерархией мезенхимных клеток (MDC, pericytes, T cells) , а иммуноглобулины (IgM, IgG) сопровождают дифференцировку эпителиальных клеток от незрелого к зрелому и старому фенотипу. 
Выявляемый комплекс взаимодействий  (Рис. 6 ) не связан только с иммунностью, но включает и базовые взаимодействия, которые стимулируют дифференцировку мезенхимных и эпителиальных клеток. Использование элементов, связанных с иммунной системой (MDC, T клеток и B клеток) в регуляции дифференцировки эпителия представляет базовый механизм иммунной физиологии toward self, from which the immune surveillance toward nonself has evolved. Accordingly, when required, the intraepithelial mesenchymal cells regulating tissue differentiation may be converted into effectors of immunity against infected epithelial cells.