Точковые мутации в кодирующих областях генов обычно осуществляют свои эффекты, нарушая одиночные аминокислоты в кодируемом белке. Однако многие гены болезней человека связаны с экзонными мутациями, затрагивающими сплайсинг пре-мРНК. Сходным образом, полиморфизмы одиночных нуклеотидов кодирующих областей м. вызывать фенотипическую изменчивость, влияяе на правильнось и эффективность сплайсинга.
Чтобы создать правильно зрелую мРНК экзоны д.б. идентифицированы и соединены вместе точно и эффективно с помощью процесса, нуждающегося в координированном действии пяти малых small nuclear (sn)RNAs (U1, U2 и U4–U6) и более 60
полипептидов. Неправильное распознавание экзон-интрон границ или неспособность удалять интроны создает аберрантные мРНК, которые или нестабильны или кодируют дефектные или повреждающие белковые изоформы.
Парадоксально, но у высших эукариот, потребность в аккуратном сплайсинге сопровождается соединениями экзонов-интронов, которые предопределяются слбо законсервированными интронными cis-элементами: 5' splice site, 3' splice site и branch сайтом (Рис.1a). Эти элементы необходимы, но являются недостаточным средством, чтобы предопределить границы между экзонами и интронами. Последовательности, которые соответствуют консенсусам сигналов сплайс-сайтов, столь же хорошо или даже лучше естественных сплайс-сайтов являются очень распространенными в интронах и они предопределяют набор , которые существенно численно превосходят генуинные экзоны, но которые обычно не включаются в зрелые мРНК.
Продукция нескольких изоформ с одного и того же транскрипта с помощью различного типа альтернативных сплайсингов (Рис. 1b) очень распространенное событие в клетках млекопитающих и делает уже трудно преодостижимой цель провильной идентификации сплайс-сайтов. Альтернативный сплайсинг ответственен за существенную сложность протеома, это частично подтверждает неожиданную находку, что геном человека м. состоять только из 31,000–39,000 генов. Т.к. одиночный первичный транскрипт имеет несколько областей, каждая из которых подвергается альтернативному сплайсингу, то возникающие в результате комбинаторные эффекты выбора разных сплайс-сайтов м.б. очень выраженными, а гены кодирующие от десятков до сотен разных изоформ являются обычными. Наиболее поразительным примером сложности альтернативного сплайсинга м. служитьодиночная пре-мРНК для Drosophila melanogaster рецепторного гена наводящего аксоны , Down syndrome cell-adhesion molecule
(Dscam), который м. давать потенциально 38,016 различных зрелых транскриптов. Даже если только часть этих изоформ продуцируется in vivo, это комбинированное использование альтернативных экзонов представляет неслыханный источник разнообразия, особенно если учесть, что весь геном Drosophila состоит всего лишь из ~ 14,000 генов.
Превалирование альтернативного сплайсинга намного выше, чем предполагалось раньше. Недавний анализ рекоструированных мРНК с хромосомы 22 показал, что ~60% представлено двумя или более транскриптами. Это значения явно занижено.
Необходимость регулировать альтернативный сплайсинг вносит дополнительные потребности в сигналах, которые должны модулировать сплайсинг во время развития и с соответствии с типом клеток и эта сложнасть не м.б. обеспечена классическими сплайс-сигналами (Рис. 1a). Механизмы, ответственные за распознавание и функцию этих экзонных сигналов, выяснены и накапливаются доказательства того, что их нарушения м.б. существенными для этиологии некоторых генетических болезней.
Exon splicing signals: enhancers and
silencers
Описаны некоторые примеры интронных и экзонных cis-элементов, которые важны для правильной идентификации сплайс-сайтов и которые отличны от классических сплайс-сигналов. Эти элементы м. дейстовать путем стимулирования (как это делают энхансеры) или репрессии (как это делают сайленсеры)сплайсинга. Exonic splicing enhancers (ESEs), в частности, по-видимому, сильно превалируют и м. присутствовать в большинстве, если не во всех экзонах, включая конституитивные.
Enhancers.
Экзонные энхансеры служат, как полагают, как сайты связывания для специфических serine/arginine-rich (SR) белков. Эти белки являются частью растущего семейства структурно родственных и высоко законсервированных сплайсинг факторов, которые характеризуются присутствием 1–2 РНК-распознающих мотивов (RRM) и отличающимися С-терминальными доменами, которые сильно обогащены Arg/Ser дипептидами(RS domain). RRMs обеспечивают сиквенс-специфическое связывание с РНК и тем самым предопределяют субстратную специфичность, тогда как RS домен, по-видимому, учствует в основном в межбелковых взаимодействиях. SR белки, которые связываются с с ESEs м. способстовать путем непосредственной поставки сплайсинг кухни (machinery) посредством своих RS доменов и/или с помощью антогонизирующего действия соседних сайленсерных элементов (Рис. 2).
Эти две модели улучшения сплайсинга не обязательно взаимоисключающие, т.к. они отражают разные потребности в контексте разных экзонов. Эта идея подтверждается наблюдаением, что ESE-зависимый сплайсинг нуждается в RS домене в SR белках для сплайсинга некоторых субстратов, это указывает на то, что RS-доменом-опопсредованые межбелковые взаимодействия м.б. существенными для сплайсинга. Потребность в сплайсинг-факторе (U2 auxiliary factor),или непосредственно через
RS–RS домен взаимодействия или косвенно через , по-видимому, важна, особенно в тех случаях, при которых распознавание слабых пиримидиновых трактов является скорость-лимитирующей ступенью в реакции сплайсинга (Рис. 2a). В др. случаях, RS домен SR белка, как было показано, несущественен, а RRMs существенны для обеспечения сплайсинга in vitro в complementation assays. Этот результат указывает на то, что или SR белок без RS домена сохраняет некоторую способность к межбелковым взаимодействиям или, что в некоторых ситуациях связывание ESE per se достаточно для конкуренции с негативными регулторными факторами и, следовательно, подтверждается антогонизм модели энхансерной функции (Рис. 2b). Наконец, эти два способа SR protein/ESE-зависимой функции м. некоторое время работать одновременно. Напр., эффективный сплайсинг immunoglobulin M (IgM) пре-мРНК, которая имеет как энхансер, так и сайленсер в 3' экзоне, нуждвется в SR белке с его RS доменом. Это указывает на то, что сеть взаимодействий с сплайсинг фактором U2AF и/или с др. факторами, м.б. необходимой для стабилизации связывания SR белка с ESE, которое д. усиливать способность противодействовать нижестоящему сайленсеру.
Ранние исследования фокусировались на богатых пуринами элементах экзонов и большинство естественных энхансеров, которые были обнаружены, имели высокое содержание пуринов. Хотя такой состав определенно отражает действительное предпочтение некоторыми сплайс-факторами мест, богатых пуринами (Табл. 1), он возможно отражает также тот факт, что композиционно простые последовательности легче выявлять, чем более сложные. Высокое содержание пуринов само по себе недостаточно, чтобы определять ESE, как точные последовательности элемента, который м. содржать разбросанные пиримидины, что также важно. Фактически, лишь немногие из некоторых тестированных синтетических последовательностей одиноковой длины и содержания пуринов, м. усиливать сплайсинг IgM пре-мРНК in vitro.
Кроме того, некоторые скоординированные мутации в кардиальном минигене troponin T не меняют пуринового содержимого, но м. нарушать энхансерную активность. Более того, элиминирование участков, богатых пуринами, в диспергированных ESE элементах IgM или в птичьей саркомы и лейкозного вируса (avian sarcoma and leukosis virus
(ASLV))пре-мРНК не устраняет энхансерной активности in vitro.
Отсутствие хорошо определяемых консенсустных последовательностей для богатых пуринами энхансеров указывает на то, что эти факторы участвуют в распознавании degenerate энхансерных последовательностей. Очевидно, что размах энхансерных последовательностей, которые м. распознаваться сплайсинг-факторами значителен (Табл. 1). Функциональные SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) эксперименты(Box 1) проведенные in vitro также подтвердили существование нескольких типов ESE, которые включают как богатые пуринами и небогатые ими последовательности и открыт новый большой класс элементов adenosine–cytosine-rich elements (ACEs). Комбинирование SELEX подхода с S100 complementation assay, выявило несколько последовательностей мотивов, которые м. дейстовать как энхансеры и которые распознаются специфическими SR белками. Короткие (6–8-нуклеотидов), degenerate и частично перекрывающиеся ESE мотивы найдены с использование этого подхода (Box 1)и эта инфрмация была использована чтобы предсказать с помощью компьютера появление энхансеров в экзонах.
SR белков субстратная специфичность часто не соответствует оптимуму (самому высокому сродству) связывающих сайтов для этих белков (Табл. 1). Это наблюдение м. отражать тот факт, что данные о связывании обычно получают в высоко очищенных in vitro системах, которые не полностью отражают условия сплайсинга. Напр., последовательности с оптимальными сайтами связывания для SR белка м. перекрываться последовательностями, которые действуют как связывающие сайты для др. факторов, которые позитивно или негативно влияют на сплайсинг. Более того, очень высокое связывающее сродство не обязательно обеспечиват лучшую функциональность, которая м.б. объяснить, почему некоторые из связывающих последовательностей, которые выходят как 'победители' в обычном SELEX assay (базирующемся на отборе по связыванию) не работают, когда тестируются как энхансеры сплайсинга in vitro.
Когда используются программ ESE-prediction для анализа экзонных последовательностей, то предполагаемые ESEs часто обнаруживаются в виде кластеров, а мотивы стремятся собраться в областях, известных как натуральные энхансеры. Многие длинные, более слабо изученные, натуральные энхансерные последовательности м., следовательно, состоять из кластеров нескольких перекрывающихся мотивов, которые распознаются разными белками. Это м. объяснить вырожденность в активности SR белков, кажущееся отсутствие четко идентифицируемых последовательностей и потребность в нескольких мутациях, чтобы инактивировать эти дисперсные элементы.
Silencers.
Exonic splicing silencers (ESSs) менее охарактеризованы, чем ESEs, но они, по-видимому, превалируют. Примерно треть случайно отобранных коротких последовательностей в ДНК фрагментах человека обнаруживает ингибирующую активность сплайсинга in vivo, если они вставлены в середину экзона минигене из трех экзонов. Это указывает на то, что некоторые экзоны м. поддерживаться в генерализованном 'молчащем' состоянии, которое м.б. нейтрализровано только с помощью комбинации строгих фланкирующих сплайс-сигналов (что является, хорошим примером консенсусных сигналов) и/или эффективных энхансерных элементов. Большинство описанных сайленсеров является интронными элементами, но некоторые ESS элементы также обнаружены. Механизм их действия все еще до конца не выяснен. Silencers, по-видимому, работают путем взаимодействия с негативными регуляторами, которые часто приндалежат к гетерогенному ядерному рибонуклеопротеиновому (hnRNP)семейству
— классу различных РНК-связывающих белков, которые ассоциируют с синтезируемой пре-мРНК. Подобно SR proteins, hnRNP белки имеют модулярную структуру, которая состоит из одного или нескольких РНК-связывающих доменов, ассоциированных со вспомогательным доменом, который часто вовлечен в межбелковые взаимодействия. В частности, hnRNP I белок (лучше известный как polypyrimidine-tract-binding protein (PTB)) и белки hnRNP A/B и hnRNP H семейств являются хорошо охарактеризованными медиаторами молчания (silencing).
Прямая конкуренция ингиибрующих факторов за перекрывающиеся сайты связывания энхансеров, которая распознается по стимулирующим факторам, м. вести к молчанию, если энхансерный элемент является решающим (Рис.3a). Альтернативно, связывание PTB или hnRNP A1 с некоторыми сайтами вокруг или внутри молчащего экзона, сопровождается димеризацией связанных PTB белков, и м. вызывать
loop out имеющих к делу частей пре-мРНК, что делает их непригодными для сплайсинга (Рис. 3b). Др. предполагаемый механизм silencing использует hnRNP A1 связывание первоначально с сайтом высокого сродства в экзоне, а затем закладывает основу (nucleating) кооперативной сборки ингибиторного hnRNP комплекса, который покрывает пре-мРНК. Полимеризайия hnRNP A1 взаимодействует непосредственно с ирнициальными ступенями сборки spliceosome или продиводействует действию соседних энхансеров
(Рис. 3c).
Решение включать ли экзон отражает внутренне присущую силу фланкирующих сплайс-сайтов и комбинационные эффекты позитивных и негативных элементов. Сложность и утонченность этой модуляции наиболее очевидна, когда используется в альтернативном сплайсинге. Однако, даже на вид простое решение, такое как включение , вероятно нуждается сложном общении между некоторыми cis-действующими элементами и trans-действующими факторами. Мутации, которые нарушают только один из немногих критических элементов в данном экзоне м., следовательно, заметно влиять на путь сплайсинга и степень включения экзона.
Splicing signals and point mutations
Сигналы сплайсинга яволябются часто мишенями при генетических болезнях и раке. Подсчитано, что по райней мере 15% точковых мутаций, которые вызывают генетические заболевания у человека вызываны дефектами сплайсинга РНК, ~16,000 точковых мутаций в настоящее время находится в . Большинство сплайс-мутаций, которые рассмотрены, непосредственно затрагивают стандартные консенсусы сплайсинг сигналов (Рис. 1a)и обычно ведут к пропуску соседних экзонов. Менее часто такие мутации создают эктопические сплайс-сайты или активируют , меняя при этом весь паттерн сплайсинга мутантного транскрипта. В настоящее время, большинство баз данных содержат аннотации данных. которые в первую очередь или исключительно происходят из анализа геномной ДНК, а эффекты мутаций на мРНК или на кодируемый белок обычно предсказываются исходя из первичных последовательностей скорее, чем экспериментального определения экспрессии РНК и паттерна сплайсинга. Следовательно, точковые мутации, которые появляются в интронах и которые затрагивают классические консенсусы сигнальных сплайс-сайтов м. рассматривать как сплайс-мутации, тоогда как точковые мутации в кодирующих областях, которые не создают эктопических консенсунсных последовательностей сплайс-сайтов, обычно рсс матриваются как миссенс, нонсенс или молчащие мутации.
Нонсеннс мутации, как полагают, продуцируют укороченные белки, тогда как миссенс мутации, как предполагают, меняют тип аминокислот, которые важны для структуры и функции белка. Трансляционо молчащие мутации обычно классифицируются как аллельные полимофизмы и рассматриваются как нейтральные. Эти предполжения правильны в некоторых случаях, но кодгда они не подтверждаются характеристикой на уровне мРНК, то они м.б. вводить в заблуждение, т.к. мутации, которые затрагивают последовательности, которые важны для модуляции сплайсинга, скорее всего будут иметь выраженный эффект на транслируемый продукт. Напр., если миссенс мутация затронет ESE и вызовет пропуск экзона, то мутантный белок вместо того чтобы иметь одиночную аминокислотную замену будет нести большую внутреннюю делецию или, если не поддерживается открытая рамка считывания (ORF), то будет целиком отличный и возможно укороченный С-терминальный домен. Во всяком случае, не следует высказывать предположения о функциональном значении аминокислоты, которая кодируется кодоном дикого типа. Кроме того, premature termination codons(PTCs), если он возникает в резулдьтате нонсенс или frameshift мутаций или как результат мутаций, индуцирующих пропуск экзона, которые в свою очередь вызывают с двиг рамки считывания, обычно запускают нонсенс-обусловленный распад мРНК (nonsense mRNA decay (NMD, Box 2).Этот механизм надзора за мРНК ведет к уменьшению количества PTC-harbouring мРНК и соотв. укороченных белков.
В самом деле, растет число доказетельств того, что часто происходит неправильная классификация мутаций и что в целом количество сплайс-мутаций недооценено. Многие работы коррелируют специфические точковые мутации в кодирующих областях с пропуском экзонов. В двух недавних исследованиях, некоторые мутации зародышевой линии в neurofibromatosis type 1 (NF1) гене и ataxia telangiectasia mutated (ATM)гене систематически анализируются на уровне ДНК и РНК у neurofibromatosis type 1 и ataxia telangiectasia пациентов, которые обладают этими мутациями.
У~50% таких пациентов(26 из 52 и 30 из 62, соотв.), болезнь обучловлена мутациями, которые вызывают наршение сплайсинга, или вызывая пропуск экзонов или активируя новые скрытые сплайс-сайты. Из этих мутаций, 13 и 11% (7 из 52 and 7 изf 62, соотв.)
были ошибочно классифицированы как мутации сдвига рамки считывания, миссенс или нонсенс, когда анализ ограничивался геномными последовательностями.
Nonsense-associated altered splicing
Некоторые сообщения о точковых мутациях, которые связаны с пропуском экзонов внесены в PTC. Этот феномен известен как nonsense-associated altered
splicing (NAS, Box3), а роль распознавания рамки считывания в этом процессе чрезвычайно интересна. Присутствие PTC обусловливает аберрантный сплайсинг или пропуск экзона следствие случайного нарушения cis-элементов, которые важны для сплайсинга ?
Nuclear scanning.
По крайней мере в некоторых случаях, распознавание трансляционной рамки считывания, по-видимому, ведет к NAS. Нонсенс мутация в экзоне 51 fibrillin 1 (FBN1) гена связана с пропуском экзонов и вызывает Marfan syndrome. Все три нонсенс кодона, но не synonymous кодон, вызывают пропуск экзона, а паттерн сплайсинга в основном восстанавливается, если PTCs устраняется израмки введением мутации выше сдвига рамки считывания. Сходным образом, у транскрипты мышиного parvovirus, PTCs ингибирует сплайсинг frame-dependent, но не translation-dependent способом, т.к. мутации места старта трансляции не всегда ревертируют NAS. Кроме того, транскрипты генов T-cell receptor β (TRB) или immunoglobulin μ тяжелой цепи (IGHM) накапливаются в сайте транскрипции только если они дают убежище PTCs, это указывает на то, что рамка считывания мРНК м. оказывать внутриядерные эффекты. Предложенное объяснение этих наблюдений - это существование системы надзора за ядерными мРНК, отличны от NMD и непосредственно затрагивают процесс сплайсинга. "jn предполагаемый процесс должен как-нибудь верифицировать интегральность ORFи, если необходимо, управлять splicing machinery, чтобы пропускать обиженный (offending) экзон (Box 3a). Эта модель ядерного сканирования постулирует, что в ядре м. существовать translation-like machinery, вообще состоящая из функциональных ядерных рибосом, которая возможно объяснит наблюдения, что многие мРНК, которые подвергаются NMD все еще, по-видмому, ассоцированы с ядром. Хотя существование ядерного ORF 'scanner' остается противоречивым, тем не менее присутствие трансляцию инициирующих факторов, таких как eIF4E и ,и заряженных tRNAs в ядре, в комбинации с доказательствами, указывающими на то, что трансляция купирована с транскрипцией в ядрах как млекопитающих, так и клеток слизистой плесни, подтверждает это необычное мнение.
Спорно, что механизм, который способствует пропуску PTC-содержащих экзонов, м. придавать селективные преимущества тем, что позволит образоваться белку с резидуальной функцией, вместо того чтобы полностью инактивировать его. Эта ситуация просматривается в случае Duchenne muscular dystrophy (DMD) и ,
Becker muscular dystrophy (BMD) ее более ослабленного варианта, которые вызываются мутациями гена дистрофина (DMD). В большинстве описанных DMD мутаций элиминируется один или более внутренних экзонов или нарушается собственно сплайсинг. В целом, менее тяжелые BMD фенотипы коррелируют с поддержанием рамки считывания. Сходным образом, пропуск PTC-содержащих внутренних экзонов, который сохраняет DMD ORF, иногда ведет к BMD. Однако, продукция частично функционального белка, который возникает в результате пропуска конституитивного экзона, не является частым событием. Более часто измененный сплайсинг вызывает сдвиг рамки, кторый в свою очередь запускает NMD. Если рамка считывания поддерживается или если PTC, которые вносятся с помощью рамки считывания, распознается как нормальный терминальный кодон, благодаря его положению, то функция надзора NMD должна быть pre-empted, так что увеличиваются шансы доминантно-негативного фенотипа.
Некоторые др. наблюдения говорят, что NAS возможно не играет столь генеральной роли в надзоре за мРНК. Во-первых, неясно, насколько распространен NAS, т.к. большинство PTCs не вызывают пропуска экзонов, а вместо этого извлекают NMD.
В дополнение, в большинстве случаев, при которых сплайсинг нарушен, экзон, который вовлекается, по-видимому, слабо предопределен. Напр., молчащая мутация в экзоне 51 FBN1, в др. положениях по сравнению с ранее описанными PTC, также вызывает пропуск экзона и Marfan syndrome, как и ранее упомянутые PTCs в мышиных parvovirus транскриптах появляются в одном положении, близко к ESE, которые указывают на экзон-специфичность эффектов скорее, чем на зависимость от нонсенс мутаций. Более того, как NAS-запускаемые, так и не запускаемые натуральные PTCs сосуществуют внутри одного и того же экзона человека NF1 и hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) генов, которые указывают на то, что присутствие PTC per se не достаточно для индукции пропуска экзона.
An indirect nonsense-mediated mRNA decay effect?
Сообщения об активации многих альтернативно сплайсированных продуктов, в которых PTC-содержащие экзоны пропускаются, должны исключать косвенные эффекты NMD скорее, чем допускать их существование как незвисимое следствие PTC (Box 3b). В некоторых случаях, корреляция между PTCs и пропуском экзона, как было установлено, является артефактом reverse-transcription (RT)-PCR методе детекции. Из-за присутствия PTC мРНК, которая несет мутантный экзон, находится NMD деградируется. Следовательно, фоновые уровни видос мРНК с пропущенными экзонами, которые обычно остаются не обнаруженными из-за конкуренции за широко распространенные тикого типа мРНК, м. теперь более эффективно амплифицироваться с помощью RT-PCR.
Альтернативно, повышенные уровни exon-skipped мРНК м. возникать независимо, как результат NMD в комбинации с с регуляцией транскрипционной петли обратной связи (Box 3b). Если ген обычно ауторегулируется с помощью петли обратной связи, генерируя тем самым постоянный уровень транскриптов, то присутствие PTC должно вести к усилению транскрипции из-за распада мРНК и снижения уровня кодируемого белка. Как следствие, любой альтернативно сплайсированный транскрипт, который больше не дает прибежища PTC будет активироваться. Мишентью обратной связи м.б. само событие сплайсинга, котрое должно теориетически активироваться с помощью специфического лимитирующего фактора (ов), действующего in trans.
От NMD-зависящий trans-действующий механизм должен также объяснять почему, пародаксально, PTC м. ингибировать удаление вышестоящего интрона, даже через считывание, находится ли PTC в рамке, д.требовать, чтобы интрон первым был сплайсирован, это указывает на то, что инициальное распознавание PTC м.б. post-splicing событием.
Thecisconnection.
Другое объямнение для NAS то, что PTCs случайно вовлекаются в нарушение сплайсинга, а наблюдаемые эффекты вызываются нарушениями cis-элементов, которые важны для правильного сплайсинга (Box 3c,d). Складывание РНК м.б. важным в ходе сплайсинга, как эо иллюстрируется для транскриптов гена фибронектина (FN1), которые необходимы для коррекции вторичных структур для сплайсинга альтернативных экзонов. Изменения вторичной структуры транскипта гена Fanconi anaemia complementation group C (FANCC) , как полагают, объясняют пропуск экзона 6 — которые ассоциирует с нонсенс мутацией в самом экзоне 6 — и с нонсенс и миссенс мутациями в экзоне 5. Строгая корреляция между пропуском и назрушением вторичной структуры РНК с помощью носенс и миссенс мутаций продемонстрирована и для HPRT1 экзонов 2, 4 и 8 и для FBN1 экзона 51.
Напротив, cis-элементы, которые затрагиваются нонсенс мутациями м.б. энхансерами спласинга. Предполагается и роль разрушения ESE при пропуске экзонов, ассоциированных с PTC, а в некоторых случаях, получены прямые доказательства этого механизма. Так, E1211X нонсенс мутация в экзоне 27 DMD вносит урацил в богатый пуринами элемент внутри экзона. Дикого типа, но не мутантный, элемент способен обеспечивать in vitro сплайсин в гетерологическом контексте, это указывает на то, что причиной пропуска экзонов м.б. разрушение ESE. Сходным образом, E1694Xнонсенс мутация в экзоне 18 гена breast cancer susceptibility (BRCA1) вызывает пропуск экзона. Анализ последовательностей экзона 18, используя ESE-score матрицы, (Box 1), показал, что E1694X нонсенс мутация устраняет предполагаемый ESE, который распознается с помощью SR белка SF2/ASF.Более того, мутационный анализ показал, что включение этого экзона коррелирует с поддержанием high-score ESE мотива, независимо от природы мутации (нонсенс или миссенс). Анализ ESE мотива, проведенный более чем 50 др. мутаций, которые вызывают пропуск экзона в различных генах болезней человека, то более половины из замен одиночных оснований редуцировали или элиминировали один ESE high-score мотив. Эти данные указывают на то, что взаимодействие с функцией экзонных cis-элементов, которые участвуют в сплайсинге, м.б. общим механизмом для неподходящего пропуска экзона.
Определенный ответ о механизмах, которые ответственны за NAS , не получен. т.к. пропуск экзонов в некоторых случаях м. давать преимущества, то возможно, что специфические механизмы вовлекаются, чтобы эксплотировать NMD, когда появление носенс кодонов является весьма вероятным событием. Напр., в TRB генах, запрграммированные перестройки ДНК, которые сводят вместе вариабельные и константные регионы, вносят PTCs примернов в 2/3 случаев рекомбинации. Однако, наиболее доступные доказательства указывают на то, что корреляция между паттернами альтерации сплайсинга и присутствием PTCs в основном совпадают. Большинство таких мутаций скорее всего затрагивают или вторичные структуры, которые существенн для правильного спласинга, или интеграцию ESE (Box 3c,d). Ясно, что оба эти механизма не зависят от рамки считывания и д.б. приложимы одинаково к носенс, миссенс и молчащим мутациям.
Missense or silent mutations and exon
skipping
Пропуски экзонов, которые ассоциирует с точковыми мутациями иными, чем типа нонсенс, часто наблюдаются (Табл. 2). Тот факт, что даже мутаци, которые предсказываются как транскрипционно молчащие, вызывают пропуск экзонов, особенно важен, т.к. эти мутации м. действовать на уровне РНК (исключая возможность слабых жффектов на эффективность трансляции благодаря преференции кодонав), Эти мутации, вероятно, меняют cis-элементы, которые важны для правильного сплайсинга. Более того, очень возможно, что такие мутации не доучтены,т.к. они м. б. направильно отнесены к нейтральному полиморфизму, и поэтому не были удостоены дальнейшей характеризации. Частое появление как миссенс, так и молчащих мутаций, которые вызывают пропуск экзонов, в дополнение к многочисленным примерам NAS, указывают на возможность существования одного механизма, как причины дефекта сплайсинга, независимо от типа мутаций в экзоне. Наличие общего механизма не согласуется с NAS моделями, согласно которым, рамка считывания находится под надзором перед сплайсингом (Box
3). Более того, данный механизм сплайсинга подтверждается анализом спектра мутаций в специфических генах. Напр., в базе данных по человеку TP53 (кодирующий p53) tumour-ассоциированные точковые мутации ( , которая содержит более 15,000 данных, имеется множество аллелей, для которых только мутация является синонимом одного (715 случаев), и тотального количества молчащих мутаций, это лишь слегка ниже числа нонсенс мутаций (5.6 против 8.2% всех точковых мутаций в экзонах). Более того, нуклеотиды, в которых появляются нонсен с молчащие мутации появляются с одинаковой частотой, это указывает на то, что один и тот же механизм отвечает за эффекты большинства этих TP53 мутаций.
О механизме вызывания пропуска экзонов молчащими мутациями говорят исследования проксимальной spinal muscular atrophy (SMA),детского нейродегенератисного заболевания, вызываемого потерей обеих функциональных копий гена survival of motor neuron 1 (SMN1). Почти идентичные паралоги гена SMN1, SMN2, присутствуют как у нормальных, так и затронутых индивидов, но хотя эти два гена потенциально кодируют неотличиные белки, только SMN2 частично функционален. Критическое, трансляционно молчащее, единственное отличие нуклеотид C -> T между SMN1 и SMN2 в положении +6 экзона 7 (C6T) делает очень неэффективным включение экзона 7 в SMN2 мРНК (Рис.
4a). Этот низкий уровень включения экзона вызывает продукцию SMN белка, который неотличим от кодируемого с помощью SMN1. Однако, преимущественно SMN2-сплайированная мРНК возникает в результате пропуска экзона 7 и дает аберрантный белок, SMNΔ7, нестабильный и, по-видимому, неактивный. Полная длина SMN2-производного SMN белка, следовательно, присутствует в ограниченном количестве, особеннов моторных нейронах, и лишь частично восполняет дефект SMN1, давая SMA фенотип и отвечая за роль disease-modifier SMN2.
Анализ экзона 7 в SMN генах показал, что предполагаемый ESE разрушен у SMN2. Показано, что включение экзона 7 в SMN1 зависит от SR белка SF2/ASF, непосредственно контактирующего с его ESE мотивом. В частности, супрессорная мутация во втором сайте нарушенного SMN2 ESE мотива, которая прекрасно восстанавливает эту вещь под SF2/ASF консенсусный мотив (Box 1 figure), полностью восстанавливая включение экзона 7. Этот результат подчеркивает важность развития комптютерныхинструментов, которые смогут аккуратно предсказать ESE или ESS элементы, исходя из консенсуса распознаваемых последовательностей для разных сплайсинг-факторов, которые позволят нейтральные полиморфизмы отличать от мутаций, которые ведут к нарушению сплайсинга.
Хотя мутации потери функции скорее всего блее часты, чем мутации с избыточной функцией, эффекты процессинга пре-мРНК более распространены, чем мутации с избыточной функцией, влияние на процессинг пре-мРНК м. также оказывать мутации, которые создают или усиливают ESEs, ESSs или вторичные структуры РНК, которые оказывают позитивные или негативные эффекты на сплайсинг. Напр.,FTDP17 (frontotemporal dementia и parkinsonism
ассоциированные с хромосомой 17). Это аутосомно-доминантное заболевание, которое связано с Alzheimer disease и вызывается мутациями в гене microtubule-associated protein tau (MAPT).
MAPT кодирует свыше шести онтогенетически регулируемых ассоциированных с микротрубочками изоформ белка, которые варьируют по числу мотивов связывания с микротрубочками. MAPT мутации, которые ассоциируют с FTDP17, стремятся образовать кластеры в или около альтернативного экзона 10, который кодирует один из мотивов связывания микротрубочек и который м.б. альтернативно сплайсирован, давая изоформы, которые содержат 3 или 4 повтора (3R-tau и 4R-tau изоформы, соотв.). В то время как некоторые мутации непосредственно затрагивают функцию домена связывания микротрбочек, большинство мутаций увеличивает соотношение 4R-tau к 3R-tau, путем включения экзона 10, что, очевидно, ведет к образованию в нейрональных или глиальных клетках филаментозных tau агрегатов, которые отвечают за патологию болезни. Эффект этих мутаций связан с несколькими механизмами. Имеется кластер экзонных и интронных мутаций, которые нарушают образование stem–loop структуры РНК на 3' конце экзона 10. Эта вторичная структура обычно модулирует альтернативный сплайсинг путем ограничения доступа к нижестоящему 5' сплайс-сайту для U1 snRNP (Рис. 4b). Др. cis-элементы участвуют в тонком регулировании включения экзона 10. Накопление изоформ, содержащих этот экзон, м. возникать и в результате мутаций, которые или усиливают множественность частей ESE на5'конце экзона или ослабляют ESS непосредственно ниже (Рис. 4b). Кроме тогоn, небольшая in-frame делеция, которая устраняет ESE и вызывает конституитивный пропуск экзона, также описана у FTDP17 пациентов. Итак, грубая регуляция собственно соотнрошения 3R-tau к 4R-tau очень важна для нормального развития нервной системы и даже легкие вариации в эффективности включения экзона 10 м. вести к занчительно патологии. Многие экзонные точковые мутации, которые затрагивают MAPT, делают экзон 10 трансляционно молчащим (Рис. 4b; Табл. 2), и это делает возможным, что существование др. полиморфных аллелей, которые не вызывают обнаружимого фенотипа, но предрасполагают или делают резистентным к болезни.
Evolutionary and human genetics implications
Молчащие мутации м.б. очень информативными, не только когда они присутствуют и дают обнаружимый дефект сплайсинга, но и когда они отсутствуют. Их отсутствие м., фактически, отражать против молчащих мутаций в определенных областях кодирующих последовательностей гена. Если сравнивать кодирующие последовательности гомологичных генов из разных млекопитающих, то м. сделать предположение, что отбор не работает против молчащих мутаций (у млекопитающих, как полагают, не является важным для селекции, благодрая малым размерам популяции и ограниченному числу поколений). Однако, филогенетический анализ BRCA1 показывает поразительно низкую степень в небольшом субрегионе гена, который захватывает экзоны 10 и 11, которая не м.б. объяснена с помощью codon-usage bias или др. современных моделей. Негативный отбор против молчащих мутаций м., следовательно, работать. Возможно, это связано с потребностями регуляции сплайсинга. В подтверждение этого мнения, эта область BRCA1 подвергалась альтернативному сплайсингу и производили сранение двух предполагаемых ESE мотовов. Было установлено, что один или более функциональных элементов м.б. необходим для модуляции использоваия различных сайтов сплайсинга в этой области гена. Более того, синонимная дивергенция между видами млекопитающих является в целом выше в конституитивных, чем альтернативных экзонах, что, возможно, отражеет более сильное селективное давление для поддержания регуляторных элементов, которые необходимы для альтернативного сплайсинга. В общем, присутствие элементов критических последовательностей, которые отвечают за точность сплайсинга в кодирующих областях гена, указывает на дальнейшее влияние на эволюцию последовательностей экзонов в дополнение к селективному давлению, вызываемому codon-usage bias, а также структурой и функцией белка.
Т.к. миссенс и молчащие мутации м. затрагивать сплайсинг пре-мРНК, то coding single-nucleotide полиморфизм() м. ожидать будет делать те же самое. Единственное отличие в том, по определению, что SNPs происходят >1% частотой в популяции. Недавние систематические обследования cSNPs в 106 генах человека позволили определить их частоту равной 1 на 346 bp (~ 50:50 synonymous:nonsynonymous bpvtytybq), что предсказывает в целом ~ 400,000 cSNPs на весь геном. Плотность cSNPs на геном человека ~ 1 на 1.08 kb. Учитывая среднюю длину экзона у человека ~ 145 bp) и тот факт, что SNP картирование все еще не закончено, разумно предположить, что приблизительно кадлый второй экзон м. содержать один или боелее cSNPs. Миссенс cSNPs предложены для объяснения существенной доли вариабельности болезни и нарушения функции гена в целом. Однако, т.к. индивидуальные экзоны м. содержать несколько позитивных и негативных cis-элементов, то любой cSNP в последовательностях, которыйе важны для модуляции сплайсинга, м. слабо влиять на эффективность и тканевую или стадио-зависимую специфичность альтернативного сплайсинга. Такие эффекты д. вносить свой вклад в фенотипическую изменчивость, в варьирующую мутаций в др. месте этого гена и в клеточно-специфические различия экспрессии генов. Более того, пошаговое накопление cSNPs м. играть рольв в эволюции новых генных функций путем влияния на степень или аккуратность событий сплайсинга
Perspectives
Правильная классификация мутаций в терминах их действительного механизма инактивации гена, важна для понимания структурно-функциональных взаимоотношений в соотв. белке, для оценки фенотипического риска предрасположенности у индивидов к семейным заболеваниям и для разработки новых терапевтических вмешательств.
Будут разработаны методы для исправления дефектов сплайсинга, которые вызываются определенными мутациями. Антисмысловые стратегии используются для предупреждения использования несоответствующих мест сплайсинга или для восстановления конкурентной способности мест сплайсинга, которые ослаблены мутациями. Хотя лекаратва, которое могло бы селективно модулировать активность сплайсинг machinery еще не получены, начало положено идентификацией соединений, которые м. до некоторой степени способствовать включению экзоне 7 в SMN2 (Рис.4a). Сходные подходы возможны и для лечения др. генетических болезней, вызыванных специфическими молчащими или миссенс аллелями, вызывающими пропуск экзонов.
