Известно, что у эукариот при разрушении теломеразы теломеры укорачиваются и клетки перестают делиться после нескольких десятков делений [9]. Hayflick наблюдал, что нармальные соматические клетки человека обладают ограниченной репликативной способностью (see [4] [5] [10] for review). Клетки могут преодолеть предел старения или M1, когда они трансформируются каким-либо из онкогенов, таким как SV40 T-Ag или HPV E6/E7. Такие трансформированные клетки продолжают делитьтся пока не достигнут второго блока пролиферации, названного crisis (M2). Теломеры прогрессивно укорачиваются в течение всего процесса репликативного клеточного старения ('aging'), предполагается, что теломеры действуют как митотические часы ('mitotic clock')[11]. Эта гипотеза подтвержадется наблюдением, что мноuие соматические ткани не содержат обнаружимых теломер, тогда как большинство иммортализованных или опухолевых клеток имеют их. Канцерогенные клетки, прошедшие М1 и избежавшие кризиса теряют контроль над клеточными циклами, имеют нестабильный геном и формируют метастазы in vivo, и обычно имеют довольно стабильные, хотя и разной длины теломеры(Fig. 1) [3].

Рис. 1 Когда клетки человека пролиферируют в культуре, то наступает пролиферативная блокада. Некоторые клетки находятся в pRb/p16-зависимом аресте клеточного цикла (M0), который останавливает пролиферацию после десяти или меньшего числа удвоений клеток. Независимо от M0 ареста клетки затем подвергаются p53-зависимому аресту (M1) после 40–50 делений. Клетки, которые проходят M1 подвергаются финальному блоку после дополнительных 30–40 делений(M2). Эти пролиферативные критические точки могут быть преодолены с помощью ряда вирусных онкогенов E7, T Ag, E6, которые инактивируют pRb/p16 и/или p53, и с помощью стабилизации теломер или теломеразой (TERT) или ALT. Figure 1 As human cells proliferate in culture, telomere lengths shorten and the cells are subject to a succession of proliferative blockades. Some cells exhibit a pRb/p16-dependent cell cycle arrest (M0) that stops proliferation in culture after ten or fewer cell doublings. Whether cells exhibit an M0 arrest or not, they are subject to a later p53-dependent arrest (M1) after 40–50 cell doublings. Cells that bypass M1 are then subject to a final block to immortality following an additional 30–40 doublings (M2). These proliferative checkpoints can be bypassed by a number of viral oncogenes E7, T Ag, E6 that inactivate pRb/p16 and/or p53, and by telomere stabilization by either telomerase (TERT) or ALT.

Повреждение компонентов или теломеразы или самой теломеры меняет регуляцию длины теломер, что ведет к важной концепции, что гомеостаз длины теломер связан с регулирующим доступом теломераз к теломерам [35] [36] [37] [38] [39]. Присутствие теломераз в клетке не гаранитирует ее доступ к теломере.

Гомеостаз теломер регулируется, по крайней мере частично, теломер-связывающими белками: обильными Rap1p в почкующихся дрожжах, Taz1p в делящихся дрожжах и TRF1 и TRF2 у человека, все они специфически связываются с повторами дуплексной теломерной ДНК [40] [41] [42] [43•]. Теломеры удлинняются в ответ на увеличение числа Rap1p молекул и других структурных признаков комплекса, присутствующего на конце хромосомы ([35] [36] [37] [44]; CD Smith, J Prescott, EH Blackburn, unpublished data). Кроме того, мутантные теломерные повторяющиеся последовательности редуцируют сродство Rap1p к теломере и могут дерегулировать процесс поддержания длины теломер ([35] [37] [44]; CD Smith, J Prescott, EH Blackburn, unpublished data). Такие мутации не нарушают уровень теломеразной активности in vitro (T Boswell-Fulton, J Prescott, EH Blackburn, unpublished data). Сходным образом, мутации TRF1 , которые нарушают его связывание с теломерой, ведут к удлиннению теломер [42]. Присутствие TRF1 на теломерной ДНК может регулироваться в клетках с помощью Tankyrase (TRF1-interacting ankyrin-related ADP ribose polymerase), недавно идентифицированного энзима, который добавляет poly(ADP–ribose) как к себе, так и к TRF1 in vitro,снижая тем самым сродство TRF1 к теломерной ДНК [45]. Такая модификация может служить сигналом для удлиннения теломер.

---

ORIGINAL RESEARCH PAPER Bailey, S. M. et al. Strand-specific postreplicative processing of mammalian. Science 293, 2462-2465 (2001) | Article | PubMed | ISI |

Линейные хромосомы несут уютно пристроившиеся нуклеопротеиновые шапочки (cap), которые предупреждают деградацию хромосомных концов и защищают от несоответствующей рекомбинаии. В клетках млекопитающих эти шапочки - теломеры - представлены повторяющимися G-rich последовательностями, связанными с рядом белков, включая Ku70, Ku80, каталитическую субъединицу DNA-dependent protein kinase (DNA-PKcs) и telomeric-repeat binding factor 2 (TRF2). Goodwin и др. обсуждают, как процессинг теломер связан с их способом репликации.


Two TCCs in HTC75 cells. The tel-G probe (which detects leading-strand telomeres) was hybridized and photographed, then the probe removed by denaturation and the tel-C probe hybridized and photographed. Yellow arrowheads indicate the point of fusion. Image courtesy of Michael Cornforth, University of Texas. (Cen, centromere.)

Для изучения механизма capping авт. использовали негативные мутанты TRF2 (TRF2BM), у которых удалены эндогенные TRF2 из теломер. Они экспрессировали TRF2BM в течение 5 дней в HTC75 клетках fibrosarcoma человека и нашли, что 44 из 154 митотических клеток обнаруживают конец-в-конец слияния хромосом. Эти слияния - подогнанные telomeric chromatid concatenates (TCCs) - образуются за счет участия одной из сестринских хроматид от каждей сливающейся хромосомы (Рис.), указывая тем самым, что TRF2 capping, м. происходить после репликации теломер.

Шапочка должна не только отделитьтся, чтобы произошла репликация, но и должна также повторно сформироваться после этого. Репликация приводит к генерации двух новых теломер - одна продуцируется с помощью синтеза leading-нити ДНК, др. с помощью синтеза lagging-нити.

Goodwin и др., используя хромосом ориентированную флюоресцентную in situ гибридизацию, которая дает различные гибиридизационные паттерны в зависисмости от типа слияния - слияния lagging-lagging, lagging-leading или leading-leading нитей. Они нашли что у TRF2BM в 133 из 135 случаев, TCCs продуцировалось в результате слияний между leading-strand теломер.

Почему? Goodwin и др. полагают, что это м.б. обусловлено тем, что концы генерируются с помощью двух способов репликации - leading нити заканчиваются тупо, т.к. имеют абсолютную потребность в TRF2 и DNA-PKcs чтобы fashion 3' выступал до образования t-петли на хромосомном конце. Lagging-strand теломеры, с др. стороны, уже имеют 3' выступ после репликации. Возможны и др отличия в способе образования двух типов теломер.