Посещений:
РАЗМЕР КЛЕТОК



Контролирующие механизмы

The Biosynthetic Basis of Cell Size Control
Kurt M. Schmoller, Jan M. Skotheim
Trends in Cell Biol. Volume 25, Issue 12, p793–802, December 2015



Figure 1 The Size or Number of Many Cellular Components Increases with Cell Size. Most proteins and mRNAs increase in direct proportion to cell size so that molecular concentrations are constant in growing cells. Moreover, organelle size often scales with cell size. By contrast, cells of different size often have the same amount of genomic DNA. Recently, it was shown that some proteins, including the cell cycle inhibitor Whi5, are not synthesized in proportion to cell size, to generate size-dependent concentrations and couple growth to division.







Размер клетки предопределяет геометрию всех внутриклеточных компартментов и определяет шкалу биосинтетических процессов [1, 2] (Figure 1). Биосинтез увеличивается в крупных клетках, которые имеют пропорционально больше белка [3-6], всей РНК [3, 7], всей мРНК [8] и мРНК для специфических исследованных генов [7, 9, 10]. Пропорциональное увеличение строительных блоков в крупных клетках, скорее всего, управляет размером органелл, таких как ядро [11, 12], митохондрии [13], центросомы [14], вакуоли [15], ядрышко [16] и митотическое веретено [17-21]. Благодаря своей важной роли в клеточных процессах многие организмы контролируют активно размер клеток путем уравновешивания роста и делений [22-24] и размер клеток мишеней часто модулируется с помощью внешнесредовых условий [23]. Несмотря на фундаментальную важность контроля размера клеток, молекулярные механизмы, лежащие в основе такой регуляции, малоизвестны.
Активный контроль размеров клеток нуждается в генерации зависимых от размера биохимических сигналов. Однако, скорости биохимических реакций обычно предопределяются концентрациями участвующих в реакции молекул и большие количества белка пропорциональны размеру клетки, так что их концентрации не зависят от клеточного роста. Возникает вопрос, как клетки могут генерировать зависимые от размера биохимические сигналы, используя постоянные концентрации белков. Был предположен общий механизм, согласно которому зависимый от размера сигнал генерируется белками, чья концентрация не зависит от размера и локализуются эти белки в виде градиентов с характерной шкалой длин [25-27]. Размер клетки может быть соразмерен в соответствии с длиной градиента в качестве детерминанта. В частности, контроль размера клеток делящихся дрожжей, как полагают, обеспечивается пространственным градиентом Pom1, ингибитора вступления в митоз, локализованного в градиенте между полюсами клетки. По мере роста клеток концентрация Pom1 в середине клетки снижается, так что запускается деление [25, 26]. Однако, недавняя работа поставила под сомнение эту модель, поскольку Pom1 не существенен для контроля размера[28] , а новая модель была основана на увеличении локальной концентрации Cdr2, киназы, активирующей вступление в митоз [29]. Важно, что механизмы контроля размера, базирующиеся на геометрии, требуют соответствующей геометрии и поэтому вряд ли используются в клетках животных, которые имеют довольно нерегулярную форму. Более того, геометрические механизмы вряд ли работают хорошо в почти сферических почкующихся дрожжах, где характерный масштаб длины составляет от объема на одну треть мощности (characteristic lengths scale as the volume to the one-third power). Второй общий механизм по созданию зависимых от размера сигналов базируется на локализации белков, чьи количества пропорциональны размеру клетки, но которые находятся в компартментах, чей объем не пропорционален размеру клетки. Это дает зависимую от размера локальную концентрацию, которая может быть использована для запуска клеточного перехода.

Differential Cell Size Dependence of Protein Synthesis Controls Budding Yeast Size


Поскольку геометрические базирующиеся на градиенте механизмы вряд ли приложимы к почкующимся дрожжам, базирующиеся на компартментализации механизмы являются жизнеспособной альтернативой. В целом такие механизмы базируются на генерации локальной зависимой от размера концентрации белка, чье количество пропорционально размеру клетки в компартменте, чей объем увеличивается более медленно, чем объем клетки. Следует отметить, что мы обычно используем слова клеточные размер, объем и общее содержание белка взаимозаменяемо из-за небольшой величины различий, связанных с ходом клеточного цикла у почкующихся дрожжей [30].
У почкующихся дрожжей продолжительность G1 фазы, между клеточным делением и репликацией ДНК, строго зависит от клеточного размера, тогда как продолжительность фаз S/G2/M очень слабо зависит от размера клетки [23, 31-35]. Анализ межклеточной изменчивости по продолжительности G1 показал, что различия в размере клеток при рождении объясняют приблизительно половину изменчивости G1, тогда как молекулярные шумы объясняют вторую половину [34]. Переходу G1/S способствует G1 циклин Cln3 в комплексе с циклин-зависимой киназой Cdk1 и с помощью Bck2 посредством пока неизвестного механизма (cln3Δ bck2Δ клетки нежизнеспособны) [36-38]. Мы сконцентрируемся на механизме, посредством которого Cln3 клеточного цикла путь способствует делению.
Хотя средний размер клеток в популяции чувствителен к дозе CLN3, концентрация Cln3 белка в G1 не изменяется ощутимо по мере роста клетки [35, 39]. Возникает вопрос, как этот предполагаемый спусковой белок может инициировать клеточный цикл зависимым от размера способом. Первоначально было предположено, что локализация Cln3's в ядре должна генерировать зависимый от размера сигнал. Если соотношение объемов ядра и цитоплазмы снижается по мере клеточного роста, то это будет приводить к концентрации Cln3 белка в ядре [40]. Однако, размер ядра в почкующихся дрожжах, как и многих др. органелл, увеличивается в пряпой пропорции с размером клетки, так что концентрация в ядре Cln3 будет оставаться постоянной [11]. Затем было предположено, что сам геном, который имеет фиксированную длину в ходе G1, может служить в качестве компартмента, чтобы концентрировать Cln3. В этой модели прочное связывание Cln3 должно приводить к зависимому от размера увеличению его локальной концентрации на сайтах мишенях в регионах промоторов генов, экспрессирующихся во время перехода G1/S. Т.о., геном д. служить в качестве управителя для подсчета количества молекул Cln3, которое прямо пропорционально размеру клетки [41]. Однако, концентрация клеточной ДНК на sewas, как недавно было установлено, не влияет на ход G1, независимо от концентрации Cln3 и его первичной мишени Whi5 [35]. Др. модель предполагает, что Cln3 сохраняется в эндоплазматическом ретикулуме и затем высвобождается после зависимого от роста накопления его шаперона Ydj1 [42, 43]. Однако, мы не имеем пока доказательств, подтверждающих быструю транслокацию в середине G1 дикого типа (WT) Cln3, а мутантные аллели, видимые за счет флюоресценции не обнаруживают такого поведения [35]. Т.о., несмотря на привлекательность механизмов, базирующихся на компартментализации, они неспособны объяснить зависимое от размера прохождение через G1 у почкующихся дрожжей.
Благодаря значительным усилиям, сконцентрированным на том, как постоянная концентрация Cln3 может быть преобразована в зависимый от размера сигнал, это оказалось не единственным способом того, как рост управляет делением. Биохимический механизм для измерения количества скорее, чем концентрации, необходим только, если все регуляторные белки G1/S существуют в постоянной концентрации в течение G1, предположение которое не было протестировано. Когда это предположение было проверено [35], оказалось, что большинство регуляторов, включая Cln3, поддерживаются в постоянной концентрации во время G1. Однако, рост разбавляет Whi5, который является нижестоящей мишенью для Cln3 и ингибитором хода клеточного цикла [44-46]. Эта находка привела к новой модели контроля размера. Поскольку очень мало Whi5 синтезируется во время G1 [35, 47], то клеточный рост д. быть связан с делением благодаря разбавлению этого ингибитора клеточного цикла [35].
Механизмы разведения ингибитора д. означать потребность в росте для деления, но не обязательно приводить к требованию дифференциального роста для рожденных крупными и рожденных мелкими клеток, который влияет на контроль размера клетки. Дополнительный механизм д. гарантировать, что рожденные маленькими дочерние клетки д. расти больше в G1, чем рожденные крупными дочерние клетки. Этот дополнительный механизм также работает посредством Whi5, т.к. было установлено, что более крупные клетки рождаются с низкой концентрацией Whi5 [35]. Поскольку вступление в клеточный цикл зависит от концентрации Whi5, то крупные клетки рождаются с более низкой концентрацией и нуждаются в меньшем росте во время G1, чем родившиеся мелкими клетки. Заметим, что более детальная версия модели разбавления ингибитора является стохастической моделью, которая объясняет существенную межклеточную изменчивость продолжительности G1. Стохастическая версия модели разведения Whi5 предсказывает скорость, с которой клетки вступают в цикл деления, которая является понижающей функцией в зависимости от их Whi5 концентрации [35].
Такая потребность в дифференциальном росте для клеток, родившихся крупными и мелкими проистекает из различных концентраций Whi5 при рождении, ставит др. вопрос. Почему рожденные крупными и малыми клетки оказываются с приблизительно одним и тем же количеством молекул Whi5? Whi5 является стабильным белком, экспрессирующимся почти исключительно во время фаз S/G2/M клеточного цикла. В резком контрасте с др. белками, подобными Cln3, чей синтез пропорционален клеточному размеру, скорость синтеза Whi5 в основном не зависит от размера клетки [35]. Поскольку продолжительность S/G2/M зависит только очень слабо от размера клетки [31, 33, 35] это приводит к тому, что крупные и малые материнские клетки продуцируют грубо одинаковые количества Whi5, которые затем наследуются дочерними клетками. Т.о., на своем наиболее фундаментальном уровне контроль размера почкующихся дрожжей является результатом зависимости дифференциального размера от синтеза активатора клеточного цикла Cln3, который масштабирован с соответствии с размером клетки, а ингибитор Whi5 нет (Figure 2A) .

Differential Cell Size Dependence of Histone and DNA Concentrations Controls the Frog Mid-Blastula Transition (MBT)


Поскольку количество молекул обычно пропорционально размеру клетки, способность клеток нарушить эту пропорциональность для специфических сигнальных молекул позволяет им создавать зависимый от размера клетки сигнал. Важно, что этот подход предлагает вполне пригодный механизм для клеток, воспринимать свой размер, не базирующийся на клеточной геометрии, которая чрезвычайно сложна для многих клеток эукариот. Сходный механизм контроля MBT в раннем развитии лягушек (Figure 2B).
Во время раннего развития эмбрионы лягушек подвергаются специфическому количеству быстрых синхронных делений перед началом скоординированного набора событий, включая транскрипцию зигот, подвижность клеток и удлинение клеточного цикла, которые коллективно известны как MBT [48, 49]. Во время этого периода клетки не растут, так что каждый цикл клеточного деления уменьшает размер клеток наполовину. Давняя модель предполагала, чтобы корректно отобразить время MBT, клетки д. ощущать снижение соотношения объема цитоплазмы к содержанию ДНК [50]. В этой модели ингибитор транскрипции при постоянной концентрации д. быть оттитрован за счет экспоненциально увеличивающейся концентрации ДНК.
Недавно было установлено, что гистоны H3 и H4 являются ингибирующим фактором, титруемым против увеличения количества ДНК до тех пор, пока не будет достигнут определенный порог, чтобы запустить MBT [51]. По существу, клетки ощущают соотношение гистонов к ДНК и генерируют зависимый от размера сигнал благодаря тому факту, что концентрация ДНК обратным образом пропорциональна размеру клетки во время быстрых pre-MBT делений без роста клеток. Т.о., скорее всего, как и у дрожжей дифференциальная зависимость от размера синтеза активатора и ингибитора связывает размер клетки со специфическим клеточным переходом.

Differential Size Dependence of Biosynthesis


Как было подчеркнуто двумя нашими примерами выше, клетки способны увязывать свой размер с переходом путем создания определенных зависимостей от размера клетки для синтеза регуляторных молекул. Хорошо известно, что клеточные компоненты, включая органеллы и молекулы, продуцируются пропорционально размеру клетки, мы не знаем, почему это является общим случаем. Пожалуй, не удивительно, мы знаем даже меньше о более исключительных случаях, при которых синтез клеточных компонентов не пропорционален. Хотя много было изучено о пропускных (checkpoint) механизмах, гарантирующих, что геном реплицируется точно с каждым раундом клеточного деления независимо от размера клетки, кажется маловероятным, что такие checkpoints, или механизмы обратной связи ответственны за независимый от размера синтез белка. В случае Whi5, добавление дополнительной копии WHI5 гена удваивает скорость его синтеза, это опять остается независимым от размера клетки [35]. Зависимые от размера концентрации белка не базируются на механизмах обратной связи, это согласуется с общим наблюдением, что существует немного компенсаций дозы генов у диплоидных гемизиготных [52] и анеуплоидных [53] дрожжевых клеток.

Size-Dependent Biosynthesis


Переходя от принципа, являющегося более общим феноменом, мы д. начать наше обсуждение с того, что известно о том, как клетки способны поддерживать большинство белков в постоянной концентрации. Мы здесь заинтересованы лишь понять, как клеточный размер влияет на биосинтез при постоянных внешнесредовых условиях. Наиболее сложным вопросом является, как доступность питательных веществ и метаболизм регулируют биосинтез, клеточный рост, всё это в не зоны нашего внимания и рассматривается в др. местах [23, 54-58].
Первой ступенью экспрессии гена является транскрипция. для увеличения количества белка необходимо увеличение количества мРНК по мере увеличения клеточного размера у делящихся дрожжей [7], млекопитающих [9, 10] и нематод [9], то в клетках концентрации мРНК остаются приблизительно постоянными. Более крупные клетки имеют больше мРНК из-за увеличения результата транскрипции [59] поскольку скорость оборота мРНК в основном не зависит от размера клеток [7, 9]. Эти наблюдения вызывают вопрос, как размер клеток увеличивает транскрипцию, несмотря на постоянную концентрацию большинства белков и постоянное количество ДНК матриц вне фазы.
Единственным возможным объяснением как размер клетки способствует транскрипции является то, что общая мощность транскрипции определяется транскрипционным аппаратом скорее, чем концентрацией [9, 60]. Это может возникать в том случае, если аппарат транскрипции в основном связан с ДНК, а не диффундирует свободно в нуклеоплазме; т.е. транскрипционный аппарат насыщен. Способность клеток к биосинтезу д. затем увеличиваться пропорционально размеру клетки просто из-за того, что более крупные клетки имеют пропорционально большие количества аппаратов транскрипции. Однако, в конечном счете геном сам по себе становится насыщенным, это согласуется с наблюдением, что мутантные дрожжевые клетки, дефицитные в отношении клеточных делений, достигают плато в транскрипции, если доводятся искусственно до крупных размеров [7]. По существу, модель ограничения аппарата требует, чтобы скорость транскрипции определялась пока неизвестным фактором, чье количество пропорционально клеточному размеру. Поскольку качественные характеристики ограничения аппарата неизвестны, одним из кандидатов может быть РНК полимераза. Не только РНК полимераза II усиливает транскрипцию по мере увеличения размера клетки у млекопитающих [9] , но это делает и ряд полимераз, связанных с ДНК у дрожжей [7].
Идея, что скорость транскрипции ограничивается аппаратом скорее, чем матрицей, далее была подтверждена тем фактом, что концентрации белка и мРНК не зависят от плоидности для большинства генов. Скорость геномной транскрипции также ограничивается аппаратом было подтверждено наблюдением, что концентрации белков не зависят от плоидности для большинства генов [61, 62]. Поскольку плоидность оказывает большой эффект на средний размер клетки (напр., диплоиды приблизительно вдвое крупнее, чем гаплоиды у данного вида), плоидность не влияет на общую концентрацию РНК или относительные уровни мРНК для большинства генов [61, 63, 64]. Что концентрация мРНК не зависит от плоидности согласуется с ограничением за счет аппарата транскрипции скорее, чем генетической матрицы. Однако, эффект плоидности на размер клетки осложняет интерпретацию. Критической проверкой этой модели является сравнение гаплоидных и диплоидных клеток. Для клеток одного и того же размера, диплоиды обладают одним и тем же количеством аппаратов транскрипции вдвое большим, чем геномная матрица, так что скорость транскрипции на геном составляет половину, хотя тотальня скорость транскрипции остается той же самой (Figure 3A) . В соответствии с этой моделью, эксперименты показали, что синтез белка Cln3 был тем же самым в гаплоидных и диплоидных клетках [35]. Более того, серия элегантных экспериментов со слиянием клеток у млекопитающих показала, что в двух разного размера клетках млекопитающих слитых вместе, транскрипция одного GFP аллеля пропорциональна количеству цитоплазмы в зависимости (divided) от количества копий генома [9].
Определение масштаба синтеза белка в соответствии с размером клетки требует, чтобы помимо транскрипции также трансляция увеличивалась пропорционально размеру клетки. Единственным объяснением зависимого от размера увеличения трансляции д. быть увеличение количества рибосом пропорционально размеры клетки, подобно большинству белков. В соотв. с этой картиной синтез рРНК и рибосомального белка д. увеличиваться с размером клетки [9, 65], а концентрация многих рибосомальных белков не зависит от размера клетки (D. Chandler-Brown, personal communication). Т.о.. если концентрации мРНК и рибосом не зависят от размера клетки, то синтез белка на единицу объема также д. быть независим от размера клетки, так что общая транслляция в клетке прямо пропорциональна её объему. Мнение, что скорость синтеза белка является главным определяющим скорости роста клеток, в дальнейшем было подтверждено тем, что скорость роста почти пропорциональна размеру клетки (т.e., почти экспоненциальный рост на уровне одиночной клетки). Пока это противоречиво, особенно в случае делящихся дрожжей [66], довольно ясно, что бактерии, почкующиеся дрожжи и клетки животных увеличивают скорость роста с увеличением размера тела [65, 67-72]. Мы отмечаем, что размер клетки не единственный детерминант скорости роста. т.к. одинакового размера клетки обнаруживают существенные вариации в скорости роста, это, как полагают, обусловлено вариацией в содержании митохондрий в некоторых случаях [34, 69, 73, 74]. Помимо эффекта от размера клетки, изменения в условиях питания также влияют на скорость глобального синтеза белка. Однако относительные скорости синтеза разных белков обычно сохраняются [58]. Это согласуется со средней скоростью синтеза, определяемой глобальным ограничивающим биосинтез аппаратом, который увеличивается с размером клетки и при хороших условиях питания, при этом обнаруживаются относительные различия между генами, определяемые специфическими регуляторными факторами.

Breakdown of Scaling and its Biological Consequences


Поскольку механизмы, описанные выше, показывают, как крупные клетки могут поддерживать постоянные концентрации молекул, то возникает вопрос, как клетки могут продуцировать зависимые от размера биохимические сигналы, такие, как те, что запускают деления. ЦУ почкующихся дрожжей ингибитор клеточного цикла Whi5 продуцируется в клетках независимо от размера, так что более крупные клетки имеют низкие концентрации и вступают в клеточный цикл после короткого периода клеточного роста.
В добавление к его необычному независимому от размера синтезу, Whi5 также уклоняется в своей реакции на изменение клеточной плоидности. Базируясь на модели ограничения аппарата деления, следует ожидать, что белок будет вести себя подобно активатору клеточного цикла Cln3, который продуцируется в пропорции с клеточным размером у гаплоидных и диплоидных клеток (Figure 3A). Важно, что гаплоидные и диплоидные клетки, которые имеют одинаковые размеры, продуцируют Cln3 с той же самой скоростью [35]. Однако, этого не происходит в случае Whi5 [35]. Диплоидные клетки продуцируют Whi5 примерно вдвое по сравнению с размер-независимой скорость гаплоидов, даже когда они имеют тот же самый размер и, следовательно, можно ожидать присутствие одного и того же количества ограничивающих биосинтетических аппаратов (machinery) (Figure 3B). Гемизиготные WHI5/whi5- диплоиды синтезируют Whi5 с той же самой скоростью, что и гаплоиды, подтверждая, что синтез Whi5 предопределяется количеством копий генов, но не зависит от плоидности и размера клеток. Более того, это строго подтверждает, что независимость от размера клетки синтеза Whi5 является внутренне присущим свойством самого гена и не базируется на механизмах обратной связи, отслеживающих концентрации Whi5.
Поскольку сегодня ясно, что независимый от размера синтез Whi5 имеет очень большое значение для контроля за размером клеток, однако, мы пока не знаем лежащие в основе молекулярные механизмы. Более того, мы также не знаем, насколько распространено это поведение по геному, не знаем, могут ли зависимые от размера концентрации возникать исключительно на основе механизмов синтеза. Сегодня легко можно представить дифференциальную зависимость от размера скорость деградации белка или мРНК, особенно если компоненты аппарата деградации не продуцируются пропорционально размеру клеток. Безусловно, многие биологические процессы масштабируются в отношении соотношения поверхности к объему, подобно синтезу мембран, или масштабируются в отношении длины генома, подобно синтезу ДНК, они могут быть более эффективными, если более мелкие клетки имеют высокие концентрации этих энзимов. Кроме того, можно также ожидать, что белки, которые тесно связаны с ДНК, такие как гистоны или транскрипционные факторы высокого сродства, будут поддерживаться в постоянном количестве, не в концентрации, чтобы соответствовать постоянному содержанию ДНК.

Concluding Remarks


The establishment of the Whi5-dilution model represents a conceptual breakthrough in the field of cell size control because it shows how growth can impact any part of a regulatory network. Size-dependent Whi5 sits at the center of the budding yeast G1 control network whereas the size-independent Cln3 is upstream. Thus, unlike other biological signals, which originate at upstream components like receptors, growth can differentially affect the concentration of any signaling molecule to impact pathway activity (Figure 4).
Here we have focused on how cell size controls division via the cell cycle control network. However, the specific architecture of the cell cycle control network is unlikely to be required for size-dependent cell cycle progression. All that is required would be the differential size dependency of the synthesis of proteins promoting and inhibiting network activity. Thus, differential size dependencies of regulatory protein synthesis can be used to encode cell size into the activity of any regulatory network.
Size-dependent protein synthesis can also be used to differentially coordinate organelle and cell size. In general, organelle size is determined by cell size through its influence on organelle subunit amounts. If, as proposed, organelle synthesis depletes a cellular pool of diffusible subunits, steady-state organelle size would be set by the total amount of these subunits [2]. The observation that organelle size typically is proportional to cell size is likely to result from the fact that most protein amounts, including organelle subunits, are proportional to cell size. However, while most protein amounts scale with cell size some do not, and this could be harnessed to differentially regulate organelle size. For example, it was recently shown that Caenorhabditis elegans embryos might be subject to this type of regulation. Larger and smaller embryos inherit a similar amount of a nucleolar protein, which is likely to account for the loss of proportionality between cell and nucleolar size [16]. This work highlights the potential for the differential scaling of protein synthesis to regulate complex cellular processes such as building organelles.
Despite the emerging understanding that differential protein synthesis has important biological functions including allowing the cell to generate a size-dependent biochemical signal, we do not understand the molecular mechanisms underlying the different size dependencies of protein synthesis (see Outstanding Questions). Further studies identifying these mechanisms will be likely to require quantitative cell biology approaches. While many biological signals are switch-like and can easily be discerned without quantification, other signals are not. In particular, signals reflecting continuous variables such as cell growth rate or cell size would be expected to change only twofold through a division cycle. Understanding such continuous processes requires careful quantitative analysis because such signals will appear nearly constant when examined by eye. For example, the basis of budding yeast cell size control could not have been identified without these methods. Two particular techniques stand out as essential: (i) the semiautomated segmentation, tracking, and analysis of single cells [75]; and (ii) the sufficiently accurate measurement of fluorescent protein concentration dynamics in single cells [35]. Given these two capabilities, single-cell analysis then allows natural cell-to-cell variation to be harnessed to distinguish between regulatory mechanisms. We anticipate that further studies will reveal the molecular mechanisms underlying size-dependent protein synthesis and reveal the extent to which cells use this differential size dependency to link diverse cellular functions with cell size and growth.