Внимание к бластоцисту мыши привлечено по нескольким причинам. Во-первых, формирование бластоциста, которое происходит в течение первых немногих дней после оплодотворения, проходит ряд последовательных событий, которые морфологиески очень сходны у мыши и человека. Дефекты преимплантационного периода могут приводить к потере беременности и привычным выкидышам, затрагивающими 5% пар [1]. Поэтому мыши представляют собой прекрасную модель для репродуктивной биологии. Во-вторых, бластоцист является источником ES клеток, известных своей способностью продуцировать неограниченные количества как самих себя, так как обладают способностью формировать ткани и органы, и поэтому бластоцист является важным инструментом исследования стволовых клеток. В-третьих, улучшенные методы изучения экспрессии генов в одиночных клетках, получения прижизненных изображений и конфокальной микроскопии позволяют получать доступ ко всем клеткам эмбриона во время преимплантационного периода. Всё это вместе с разнообразными инструментами генетических манипуляций и культивирование in vitro преимплантационных стадий, все эти подходы делают возможным точное понимание пространственно-временных ролей генов и сигнальных путей в формировании бластоциста.
The importance of timing
Чтобы понять современные модели молекулярных механизмов формирования бластоцистов, важно прежде всего прояснить терминологию, используемую собственно для описания стади преимплантационного эмбриона. У мышей эмбрионы желаемых стадий развития продуцируются с помощью вывереных по времени спариваний. Предполагается, что мыши спариваются приблизительно в полночь [это день эмбриогенеза (E) E0.0], если обнаруживается плотная пробка внутри влагалища на следующее утро. Т.о., приплод эмбрионов на определенной ст. развития, такой как зигота, морула и бластоцист (see Glossary), может быть определен в известный момент времени (Figure 1). Безусловно, эти стадии развития базируются на важных морфологических признаках и, следовательно, являются довольно широкими и могут включать эмбрионов, подвергшихся разным онтогенетическим событиям. Кроме того, деления дробления асинхронны, как внутри, так и между эмбрионами помёта, а мутации, а также генетический фон [2] могут менять время развития. Следовательно, сегодня стандартом определения стадии развития эмбриона является срок в днях с момента оплодотворения и количества клеток (напр., E3.5 и ~32 клетки). Поэтому важно сравнивать экспериментальных и контрольных эмбрионов в отношении количества клеток и по времени после оплодотворения.
Developmental milestones before implantation. Cell fates are color-coded according to the key at the bottom of the figure, and E refers to the number of days after fertilization, which occurs at embryonic (E) day E0.0. Zygotic genome activation occurs at the two cell stage, concurrent with degradation of the maternally provided transcriptome. Cell polarization and compaction occur at the late eight cell stage. TE and ICM cell fates emerge during the 8 to 16 cell transition, and then the blastocoel forms by cavitation, starting between E3.0 and E3.25. During blastocyst expansion, the TE exists as a polarized epithelium, while ICM cells are nonpolar. As the ICM matures, EPI and PE cell fates emerge in the absence of an apparent spatial pattern. Eventually, EPI and PE cells occupy discrete layers within the ICM. Implantation occurs around E4.5, after the embryo hatches from the zona pellucida (grey ring encircling the cleavage stage embryos). Abbreviations: EPI, epiblast ICM; inner cell mass; PE, primitive endoderm; TE, trophectoderm.
The first two cell fate decisions in development
Во время третьего дня после оплодотворения целью эмбриона является становление трех клонов: плодного [эпибласт (EPI)] и двух внеэмбриональных [трофэктодерма (TE) и примитивная энтодерма (PE)] (Figure 2A) .
Эти три клона, EPI, TE и PE, д. вносить вклад в плод, плаценту и желточный мешок, соотв. (Figure 2B), и они образуются с помощью двух решений по выбору клеточной судьбы. Первое решение по выбору судьбы отделяет TE от внутренней клеточной массы (ICM), оно принимается приблизительно на ст. 16 клеток (E3.0) (Figure 1). Второй выбор клеточных судеб разделяет ICM на EPI и PE типы клеток, начинается приблизительно на ст. 64 клеток (E3.5-E3.75). Клетки EPI являются предшественниками ES клеток, и поэтому выяснение молекулярных механизмов, с помощью которых устанавливаются и поддерживаются EPI может указать нам на источники плюрипотентности. Однако, очень важно понять, что ES клетки не присутствуют в эмбрионе на каждой из стадий, а вырастают из EPI клеток в ходе нескоьких дней в культуре. Более того, предшественники ES клеток не устанавливаются окончательно вплоть до ст. E4.5 [3], это дольно поздняя ст. развития бластоциста. Следовательно, механизмы поддержания экспрессии генов плюрипотентности в ES клетках не обязательно идентичен механизмам, с помощью которых экспрессия генов рлюрипотентности впервые устанавливается в эмбрионе. Эти наблюдения подчеркивают важность понимания механизмов регуляции генов у эмбрионов и понимания происхождения линий стволовых клеток из бластоциста [4, 5].
Хотя разные пути и механизмы регулируют первые два решения по выбору клеточных судеб, общая тема объединяет оба решения. Для обоих выборов существует первый раунд передачи клеточных сигналов, которые выбирают клеточные судьбы (TE в противовес ICM, или EPI в противовес PE), и затем эти клеточные судьбы закрепляются с помощью клон-специфических транскрипционных факторов.
The first cell fate decision: establishment of TE and ICM cell types before blastocyst formation
Первый выбор клеточных судеб - это приобретение клеточных судеб TE и ICM примерно на ст. 16 клеток, до образования бластоциста, когда впервые образуются популяции внутренних и внешних клеток. До ст. 16 клеток, бластомеры эквивалентны в терминах полярности, положения и степени межклеточных контактов. Однако, на ст. 16 клеток, одна или две клетки оказываются внутри эмбриона и таким образом возникают две популяции, каждая с отличительными свойствами. Клетки внутри оказываются неполяризованными и образуют контакты с клетками на всех своих сторонах, тогда как внешние клетки поляризуются вдоль радиальной оси эмбриона и лишены клеточных контактов на своей наружной поверхности. Поскольку поляризация клеток является одним из самых ранних распознаваемых отличий между двумя популяциями, механизмы, регулирующие поляризацию бластомеров, изучаются активно [6-10]. Кроме того, полярность клеток, как было установлено, регулирует активность пути передачи сигналов HIPPO [11-15], а передача сигналов HIPPO устанавливает паттерн экспрессии транскрипционных факторов, которые позднее будут закреплять судьбы TE и ICM после образования бластоциста (Figure 3A) .
Путь передачи сигналов HIPPO хорошо известен в регуляции межклеточных взаимодействий в разных онтогенетических и гомеостатических контекстах [16, 17]. У преимплантационных эмбрионов мыши путь передачи сигналов HIPPO негативно регулирует активность транскрипционного комплекса, который включает YAP, WWTR1 и TEAD4 [9, 11, 12, 14,18-20]. Поскольку передача сигналов HIPPO репрессирована во внешних клетках [11-13,18], комплекс YAP/WWTR1/TEAD4, как полагают, активен во внешних клетках, где он способствует экспрессии TE генов, включая Cdx2 и Gata3 [18, 21,22], и репрессирует экспрессию ICM гена Sox2 пред образованием бластоциста [23] (Figure 3A). Важно, что CDX2 и SOX2 не регулируют экспрессию др. др. [21, 23], и что Gata3 нулевые эмбрионы выживают после ст. бластоциста [24]. Следовательно, TE и ICM гены независимо регулируются с помощью пути HIPPO пред образованием бластоциста. Безусловно, др. гены плюрипотентности, такие как те, что кодируют OCT4 и NANOG, экспрессируются повсеместно вплоть до ст. после образования бластоциста и не испытывают влияния со стороны передачи сигналов HIPPO перед образованием бластоциста [19, 20, 25-27]. Следовательно, CDX2 и SOX2 являются самыми ранними маркерами судеб, которые являются индикаторами передачи сигналов HIPPO перед образованием бластоциста.
Механизмы, которые продуцируют пространственное ограничение пути передачи сигналов HIPPO, были изучены. Неожиданно оказалось, что мышиные ортологи HIPPO Mst1/2 не регулируют активность YAP/WWTR1/TEAD4 или выбор судеб TE/ICM во время преимплантационных стадий [19]. Вместо этого, большинство вышестоящих компонентов пути HIPPO, как было установлено, участвующие в спецификации TE/ICM, являются белками, кодируемыми семейством angiomotin (Amot) и Nf2 генами [11, 12, 19]. AMOT белки, как полагают, действуют как переключатели пути HIPPO, включая путь в неполяризованных внутренних клетках и выключая в поляризованных внешних клетках, посредством дифференциального привлечения и активации LATS киназ [11-13, 19], которые непосредственно регулируют активацию комплекса YAP/WWTR1/TEAD4 [18]. Интересно, что члены пути HIPPO также спосоствуют приобретению судьбы ICM после образования бластоциста.
Недавно была предположена альтернативная роль TEAD4 [28], исходя из наблюдения, что Tead4 не обязателен для формирования бластоциста и экспрессии CDX2 в эмбрионах, культивируемых в условиях гипоксии. Это привело к предпложению, что TEAD4 регулирует экспрессию Cdx2 косвенно за счет поддержания жизнеспособноси клеток в условиях оксидативного стресса, таких как normoxia. Однако, TEAD4 может регулировать экспрессию Cdx2 непосредственно [22, 29]. Поэтому также возможно, что в условиях гипоксии Tead4 паралоги восстанавливают потерянную функцию Tead4, но эта гипотеза пока не подверждена. Кроме того, потеря Tead4 может быть восстановлена с помощью передачи сигналов NOTCH, которая, как было установлено, действует синергично с передачей сигналов HIPPO [29]. Это стало сюрпризом, поскольку эмбрионы полностью лишены эффектора передачи сигналов NOTCH, RBPJ обычно отсутствует в преимплантационном фенотипе [30]. Однако, дефекты в развитии TE обнаруживаются, когда компоненты пути NOTCH были проверены на генетическом фоне, сенсибилизированном с помощью мутаций пути HIPPO [29]. Т.о., передача сигналов NOTCH, по-видимому, усиливает дифференциальные сигналы, генерируемые с помощью пути HIPPO. Эти наблюдения согласуются с программами генетической избыточности, которые гарантируют силу онтогенетической программы и подчеркивают необходимость оценки роли не только индивидуальных генов, но и также взаимодействующих генов и путей.
Помимо HIPPO-обеспечиваеомй регуляции экспрессии TE и ICM генов, и др. механизмы разграничения TE/ICM клеточных судеб тоже могут играть роль. Напр., было предположено, что Cdx2 по-разному распределен в клетках с помощью ориентированных клеточных делений и что CDX2 затем направляет клетки во внешнее положениеn [31, 32]. Однако, ориентированные клеточные деления, как было установлено, не коррелируют с выбором клеточных судеб TE/ICM у ранних эмбрионов [33]. Более того, хотя избыточная экспрессия Cdx2 достаточна, чтобы изменить позицию клеток [32], экспрессия эндогенного Cdx2 является следствием скорее, чем причиной позиции клеток в бластоцисте [34-36]. Эти наблюдения поэтому подтверждают идею, что регуляторы клеточных судеб обычно действуют ниже становления клеточной позиции и дифференциальное наследование Cdx2 д. помогать закреплению судьбы внешних клеток, которая уже установлена с помощью зависимой от полярности передачи сигналов HIPPO.
The first cell fate decision: maintenance of TE and ICM cell types after blastocyst formation
После образования бластоциста, судьбы TE и ICM затем поддерживаются с помощью клон-специфичных транскрипционных факторов. В TE, CDX2 выполняет две важные роли, обе появляются после образования бластоциста (после E3.5) (Figure 3B). Одной из ролей CDX2 является способствование экспрессии TE генов в TE, таких как Eomes [27, 35]. Др. роль CDX2 связана с репрессией экспрессии ICM генов в TE, таких как Oct4 и Nanog [27]. Следовательно, в TE, CDX2 транскрипционно способствует экспрессии TE генов и репрессирует экспрессию ICM генов после образования бластоциста.
Было изучено, могут ли ICM гены реципрокно репрессировать экспрессию TE генов в ICM. Любопытно, хотя экспрессия Sox2 локализуеся в ICM четко перед Oct4 aи Nanog (E3.0 в противовес E3.5-E4.0) [23, 37], Sox2 не является необходимым для ограничения экспрессии TE генов в TE [23]. В одном сообщении было подтверждено, что NANOG репрессирует Cdx2 в ICM, поскольку незначительно повышенные уровни CDX2 были обнаружены в ICM у Nanog нулевых бластоцистов [38]. Однако, этот фенотип не обнаружен в др. исследованиях [39, 40]. Напротив, существует согласие, что OCT4 репрессирует экспрессию множественных TE в ICM [21, 41]. Удивительно, что потребность в Oct4 не абсолютна, поскольку TE гены отсутствуют в в некоторых клетках Oct4 нулевых бластоцистов [21, 41,42]. Хотя ICM является сместью EPI и PE типов клеток на этой стадии, OCT4 функционирует в обоих типах клеток на этой стадии [42, 43]. Поскольку TE гены лишь частично дерепрессированы в клетках ICM у Oct4 нулевых эмбрионов, это указывает на то, что OCT4 д. регулировать экспрессию TE генов косвенно в ICM. Эта гипотеза соголасуется с наблюдением, что OCT4 регулирует экспрессию TE генов косвенно в линии ES клеток [44].
The second cell fate decision: establishment of EPI and PE cell types at the mid-blastocyst stage
Подобно первому выбору клеточных судеб, второй выбор судьбы также инициируется с помощью передачи сигналов. Во время решения о втором выборе судьбы клетрок передача сигналов FGF4/MAPK выбирает судьбы PE и EPI клеток, способствуя экспрессии PE генов и репрессии экспрессии EPI генов внутри первоночально гомогенной ICM [45-48]. Во время образования бластоциста (E3.5), ICM клетки совместно экспрессируют Oct4, Nanog, Sox2 и Gata6 [23, 37, 42, 45]. Вскоре после этого передача сигналов FGF4/MAPK в некоторых клетках ICM приводит к репрессии Nanog и Sox2, также как и к усилению экспрессии Gata6 в PE клетках [23, 45-48]. Напротив, экспрессия OCT4 поддерживается в EPI и PE клетках на равных уровнях [37, 49],и его экспрессия не зависит от передачи сигналов FGF4/MAPK [48]. Приблизительно в то время, когда PE и EPI клетки приобретают различающиеся профили экспрессии генов, дополнительные PE гены экспрессируются de novo в PE клетках, включая Sox17, Gata4 и Pdgfra [50-53]. Следовательно, примерно на ст. 64 клеток (E3.75) ICM содержит смесь EPI и PE клеток, расположенных в виде паттерна соль и перец.
Учитывая важность передачи сигналов FGF4/MAPK во время второго выбора клеточных судеб, время и локализация экспрессии компонентов пути передачи сигналов FGF была изучена. Исследования показали, что первоначально транскрипты, кодирующие FGF4 лиганд и его рецептор FGFR2, присутствуют в виде комплементарного паттерна в ICM клетках, начиная со стадии 32 клеток (Figure 4A) [37,54]. Перд образование бластоциста GATA6 и NANOGвсё ещё экспрессируются повсеместно и независимым от FGF4 способом [46, 47]. Т.о., регулируемая экспрессия компонентов пути FGF является самой ранней и наиболее высоко стоящей, молекулярные различия между клетками ICM всё же были идентифицированы. Эти наблюдения ставят несколько вопросов о механизмах, с помощью которых передача сигналов FGF4/MAPK регулирует второй выбор судеб клеток.
Первым возникает вопрос, как может FGF лиганд, который д. быть способен к передаче сигналов на расстояние нескольких клеточных диаметров, устанавливать гетерогенную экспрессию генов среди клеток, находящихся в тесной близи? Согласно одной модели предполагается, что ограниченная экспрессия рецептора [37], кодируемого с помощью Fgfr2, ограничивает, какие клетки будут воспринимать сигнал и адаптировать PE судьбу. Однако, высокие дозы экзогенно добавляемого FGF4 оказываются достаточными, чтобы превратить все клетки ICM в PE клетки [47], а значит все клетки способны отвечать на FGF4. Это наблюдение подтверждает, что количество экспрессируемого Fgf4 в ICM д. быть также ограниченным. Это предположение подтверждается наблюдением, что промежуточные дозы экзогеного Fgf4 могут воссоздавать рисунок соли и перца для EPI и PE клеток в Fgf4 нулевых бластоцистах [55].
Возникает и второй вопрос: как устанавливается первоначально гетерогенная экспрессия Fgf4 и Fgfr2 в ранней ICM? Пока нет доказательств роли передачи сигналов NOTCH в механизме типа латерального ингибирования на этой стадии [29]. Вместо этого были предложены др. модели. Согласно одной модели стадия, на которой формируются новые ICM клетки, может влиять на выбор клеточных судеб и/или экспрессию FGFR2 [51, 56, 57]. Однако, имеются доказательтва, что происхождение ICM клеток не влияет на выбор ICM судеб [45, 47]. Согласно альтернативной модели паттерн экспрессии лиганда и рецептора первоначально случаен [54, 58]. Различия в уровнях экспрессии FGF4 лиганда и его рецептора могут затем поддерживаться за счет feed-forward механизма. Напр., экспрессия NANOG, и SOX2 ограничены EPI клетками с помощью передачи сигналов FGF4, где они помогают поддерживать экспресси Fgf4 в EPI клетках после ст. E3.75 (Figure 4B) [23, 39, 42, 45, 47, 48]. Эта модель согласуется с сообщениями о пластичности ICM клеток [59, 60].
The second cell fate decision: transcription factor maintenance of EPI and PE cell types
Во время второго выбора клеточных судеб транскрипционные факторы поддерживают клеточные судьбы EPI и PE. Однако, вплоть до недавнего времени не было понятно, действуют ли транскрипционные факторы выше или ниже передачи сигналов FGF4/MAPK, чтобы способствовать выбору судьбы PE клеток. Некоторые модели согласуются с наблюдениями, что передача сигналов FGF4/MAPK необходима и достаточна, чтобы индуцировать выбор судьбы PE клеток за счет судьбы клеток EPI. Напр., передача сигналов FGF4/MAPK д. усиливать экспрессию Gata6, а GATA6 д. репрессировать экспрессию Nanog в PE клетках. Напротив, передача сигналов FGF4/MAPK д. репрессировать экспрессию Nanog и, если NANOG обычно репрессирует экспрессию Gata6, тогда Gata6 д. усиливать свою активность в PE клетках. Эти модели могут быть оценены путем проверки эпистатического взаимоотношения между передачей сигналов FGF4/MAPK и Gata6 и Nanog мутантами.
Анализ с использованием нулевых аллелей показал, что передача сигналов FGF4/MAPK действует на вершине иерархии PE генов (Figure 4Bi), где она сначала увеличивает экспрессию Gata6 в PE клетках, а GATA6, в свою очередь, репрессирует экспрессию Nanog в PE клетках [61,62]. Очевидно, что GATA6, подобно NANOG, экспрессируюется повсеместно прежде чем стать активно экспрессирующимся в PE клетках, пока неясно, что управляет инициальной экспрессией Gata6 в моруле [39, 46]. Удивительно, GATA6 также, по-видимому, репрессирует Nanog в TE клетках [61], показывая, что GATA6 активен во многих типах клеток бластоциста. Напротив, NANOG репрессирует экспрессию Gata6 в EPI клетках [39]. Важно, однако, что Gata6 единственный известный PE ген, эктопически экспрессирующийся в EPI клетках Nanog нулевых эмбрионов. Др. PE гены, включая Gata4, Sox17 и др., обнаруживают заметно сниженную экспрессию у Nanog нулевых эмбрионов, благодаря уменьшению спососбтвующего PE сигнала Fgf4 [39, 40]. Эти наблюдения и др. подтверждают, что GATA6 способствует экспрессии PE генов и параллельно репрессирует EPI, стоящие ниже FGF4/MAPK (Figure 4Bi).
Роль EPI генов, включая Oct4, Nanog и Sox2, в поддержании решения второго выбора судеб клеток также была оценена. Ни один из этих генов, по-видимому, не нужен для инициальной экспрессии др. др. [23, 39, 42, 63, 64]. Однако поскольку все три гена помогают экспрессии в EPI Fgf4[23, 39, 41, 42, 65], все три транскрипционных фактора способствую также экспрессии PE генов неавтономным способом [23, 39, 40, 42, 43]. Кроме того, OCT4 способствует экспрессии PE генов клеточно автономно [42, 43]. Следовательно, OCT4 обладает двумя активностями ICM: способствует экспрессии EPI и PE генов. Это наблюдаение ставит вопрос, как транскрипционная активность OCT4 регулируется, т.к. OCT4 может регулировать экспрессию PE- и EPI-специфические гены мишени в соотв. типу клеток образом. Привлекательной моделью является то, что транскрипционная активность OCT4 регулируется c помощью специфичных для типа клеток SOX факторов (Figure 4Bii). Эта модель подтверждается наблюдением, что SOX2 и SOX17 управляет OCT4, чтобы связывать регуляторные регионы плюрипотентности или PE гены, соотв. [66].
The second cell fate decision: the latest stages
На ст. позднего бластоциста (E4.0-E4.5), EPI и PE клетки рассортировываются на разные слои, при этом PE клетки оказываются под EPI. Как только PE клетки достигают своего окончательного положения в гипобласте, индуцируется экспрессия Sox7 [67]. Два механизма, как известно, регулируют процесс клеточной сортировки. Во первых, PE клетки экспрессируют молекулы, которые облегчают эту сортировку, включая ламинин и DAB2 [68, 69, 70]. Экспрессия этих молекул зависит от Oct4 и Sox2, а дефекты сортировки клеток обнаруживаются в отсутствие любого из транскрипционных факторов [23, 42]. Во-вторых, PE клетки, которые не рассортировываются правильно подвергаются апаптозу [52], демонстрируя, что механизм находится в том месте, чтобы гарантировать, что EPI и PE клетки солализуются в соотв. месте непосредственно перед имплантацией.
Несколько сигнальных путей, как полагают, поддерживают клон ICM в позднем бластоцисте, включая LIF/IL6/JAK/STAT и BMP пути [71-73]. Интересно, что некоторые рано экспрессирующиеся PE гены. такие как Sox17, Pdgfra и Sox7, нен существенны вплоть до постимплантационного периода [46, 67, 74]. Следовательно, даже если этигены оббладают рано локализованной экспрессией в PE клетк по отнрошению др. кдр. в бластоцисте. После образовани я бластоциста путь HIPPO продолжает функционировать. Потеря члена пути HIPPO Nf2 приводит к избытку TE генов внутри ICM на поздней ст. бластоциста [19]. Кроме того, потеря Lats пиводит к потере экспрессии ICM генов и даже к потере ICM клеток на ст. позднего бластоциста [12, 25]. Эти наблюдаения подтверждают, что передача сигналов HIPPO поддерживает выживаемость или расположение ICM клеток по мере созревания бластоциста. Однако механизм потери клетки неизвестен.
Оказадось более трудным определить, действительно ли гены, которые необходимы для ранней спецификации клеточных судеб, необходимы также и позднее, поскольку сохранение белковых продуктов делетированных генов может маскировать фенотип потери функции. В одном случае делеция Oct4 в позднем бластоцисте была достигнута c помощью Cre/lox системы [43]. Интересно, что поздняя делеция Oct4 не нарушает судьбу PE клеток в позднем бластоцисте. Эти наблюдения подтверждают, что Oct4 не нужен для поддержания позднее судьбы PE клеток и что описанные дефекты PE у поздних Oct4 нулевых бластоцистоыв [41, 42] обусловлены нарушением более ранних потребностей в Oct4. Следовательно, инактивация генов во времени может быть использована для уточнения, когда гены активны в развитии. Однако успешная инактивация генов во времени осуществима только при использовании соотв. Cre линий, и информативно только, если элиминация белка мишени подтвеждается динамикой делеции гена.
Maternal determinants do not regulate mouse development
Давно интересующий вопрос касается степени, с которой развитие млекопитающих регулируется c помощью цитоплазматических детерминант, которые, как известно, диктуют эмбриону формирование паттерна у некоторых модельных организмов. Напр., эмбрионы мух и лягушек наследуют информацию от матери о том, где их голова и хвост д. находиться, которая продуцирует яйца с пирожденной асимметрией. Хотя гены с материнским эффектом важны для млекопитающих [75], не известны матерью продуцируемые белки, влияющие на выбор клеточных судеб у эмбрионов мыши. очевидно, что большинство материнских транскриптов, также как и большинство материнских деградируют очень рано в развитии, за много дней до приобретения клеточных судеб. Более того, паттерны клеточных делений, которые предшествуют становлению EPI клонов, могут быть очень вариабельны среди эмбрионов [76]. Поэтом у трудно определить, что пространстывенное распределение матерью заложенных факторов могут управлять выбором клеточных судеб в качестве цитоплазматических детерминантов. c
Роль материнского OCT4, и SOX2 в раннем выборе клеточных судеб было тщательно исследовано, используя нулевые аллели. Независимые исследованияя подтвердили, что даже если уровни материнских OCT4 и SOX2 умеренно высоки в ооцитах, материнские OCT4 SOX2 несущественны для развития [23, 42, 63,77]. Напротив, CDX2 не обнаруживается в ооцитах [78, 79], а уровень материнского Cdx2, определяемый в ооцитах в 10 ниже, чем уровень, определяемый в ES клетках, где Cdx2 не играет роли [80, 81]. Не удивительно, что делеция только материнского Cdx2 не нарушала развития и делеция материнского и зиготического Cdx2 фенокопировала делецию зиготического Cdx2 [23, 81]. Однако др. исследование недавно установило роль материнского Cdx2 [82]. Основы расхождений неясны, поскольку обе группы проверяли сходные количества эмбрионов и использовали один и тот тот же Cre драйвер, чтобы делетировать экспрессию Cdx2 в ооците. Различия между группами, включают культуральные условия, использование Cdx2 аллеля и возможно генерический фон. Следовательно, Cdx2 нулевой фенотип может испытывать влияние в результате взаимодействия с пока еще неидентифицированными генетическими факторами. Эта гипотеза согласуется с недавними наблюдениями, что активность Cdx2 зависит от генетического фона в ES клетках [83]. Независимо от этого обе группы сообщили, что у эмбрионов, лишенных как материнского, так и зиготического Cdx2, распределениее клеточных судеб было сходным с таковым у эмбрионов, лишенных зиготического Cdx2, это указывает на то, что материнский Cdx2 не важен для выбора клеточных судеб у ранних эмбрионов.
Forging ahead
Although technological advances in gene expression analysis and imaging have provided new insight into the genetic regulation of cell fate specification in the mouse early embryo, many mysteries are still unsolved (Box 1). Several of the challenges intrinsic to working with preimplantation embryos might be mitigated by emerging technology. For example, the small cell number of the blastocyst makes it difficult to identify transcription factor binding sites in the three cell types of the blastocyst. One solution involves using recently developed methods for sorting and pooling the three cell types from the blastocyst [84]. Another challenge is that genetic redundancy may mask the essential roles of genes, and breeding double and triple mutants is not considered to be time- or cost-effective. However, emerging genome-editing technology may simplify the process of introducing multiple mutant alleles in the zygote [85]. Another challenge is that gene discovery is sometimes slower in mice than in other model organisms that are better suited to forward genetic techniques. However, advances in genome-sequencing technology make forward genetic approaches more feasible in the mouse. Finally, it is becoming apparent that both development and disease are governed by the interaction of multiple genes and pathways of individually small effect, and thus the real mechanisms that regulate development might be distorted by the reductionist approach of null alleles and two or three gene outputs. Single cell gene expression analyses have facilitated systems views of how not only single genes but also pathways, modulate developmental processes [3, 42, 54]. Moreover, unique features of preimplantation embryos have allowed advances in techniques for live-imaging of gene expression changes during development [86].
