5-Prime | Nonribosomal Peptide Synthesis
The Scientist Volume 17 | Issue 6 | 12 | Mar. 24, 2003
The Scientist Volume 17 | Issue 6 | 12 | Mar. 24, 2003
Весь номер Chemical Reviews (vol. 97, no. 7, 1997) посвящен NRPS и родственным процессам, polyketide synthesis. (Polyketides это ансамбли из жирных кислот и они включают такие антибиотики rifamycin и erythromycin, и иммуносепрессант FK506.). См. также H.D. Mootz et al., "Ways of assembling complex natural products on modular nonribosomal peptide synthetases," Chembiochem, 3:490-504, 2002.
Что это? Как говорит название nonribosomal peptide synthesis (NRPS) генерирует полипептиды без рибосом. Образующиеся в результате пептиды обычно короткие олигомеры от двух до 48 остатков, которые не закодированы в геноме.
Если рибосомальная трансляция стандартным набором из 20 L-аминокислот,то нерибосомальные пептиды м. содержать необычные строительные блоки, включая D-аминокислоты, метилированные варианты стандартных аминокислот и непротеиногенные, гидроксилированные и гликозилированные остатки; сейчаст известно более 300 предшественников. Иногда пептидные продукты являются hetero-cyclized, а пептидный остов м.б. разветвлен.
How are the peptides made? Нерибосомальные пептиды создаются на массивных, line-like синтетазах. Эти энзимы являются модулярными (modular), т.е. представлены серией функциональных единиц, которые м. связывать голые аминокислоты, активируя их как thioester и присоединяя их к растущей пептидной цепточке. При линейных NRPSs, последовательности модулей действуют как матрицы, которые и предопределяют конечные последовательности пептидов. Но существуют также и повторяющиеся и нелинейные конфигурации NRPS, которые генерируют более сложные структуры.
How are the peptides made? Нерибосомальные пептиды создаются на массивных, line-like синтетазах. Эти энзимы являются модулярными (modular), т.е. представлены серией функциональных единиц, которые м. связывать голые аминокислоты, активируя их как thioester и присоединяя их к растущей пептидной цепточке. При линейных NRPSs, последовательности модулей действуют как матрицы, которые и предопределяют конечные последовательности пептидов. Но существуют также и повторяющиеся и нелинейные конфигурации NRPS, которые генерируют более сложные структуры.
Большинство NRP's модификаций являются преформированными во время синтеза или за счет сборки линейных компонентов, или внешними белками. Др. модификации м.б. добавлены после синтез. Некоторые синтетазы являются мультимерными комплексами, тогда как др. являются одиночными, массивными белками. Каждый модуль состоит примерно из 1,000-1,200 аминокислот, это делает энзимы ненормальными: одиночный в 15,281-остатков (1.7 MDa) белок, напр., синтезирует cyclosporin,иммуносупрессант в 11-остатков длиной.
Why is this important? NRPS продуцирует несколько фармакологически важных соединений, включай циклоспорин и антибиотики penicillin и vancomycin. Если исследователям удастся выяснить у peptide synthetase's "генетическиий код," то они смогут манипулировать им, чтобы продуцировать новые соединения с лекарственными свойствами.
How do you know when it's NRPS that creates the protein? Рибосомные пептиды м. подвергаться экстенсивной посттрансляционной модификации, тогда как присутствие необычных остатков или структур недостаточно, чтобы задействовать NRPS в генез молекул. Доказательства против NRPS: геномные последовательности способны продуцировать пептидные последовательности. Доказательства за: присутствие signature modular peptide synthetase gene segments.
Why is this important? NRPS продуцирует несколько фармакологически важных соединений, включай циклоспорин и антибиотики penicillin и vancomycin. Если исследователям удастся выяснить у peptide synthetase's "генетическиий код," то они смогут манипулировать им, чтобы продуцировать новые соединения с лекарственными свойствами.
How do you know when it's NRPS that creates the protein? Рибосомные пептиды м. подвергаться экстенсивной посттрансляционной модификации, тогда как присутствие необычных остатков или структур недостаточно, чтобы задействовать NRPS в генез молекул. Доказательства против NRPS: геномные последовательности способны продуцировать пептидные последовательности. Доказательства за: присутствие signature modular peptide synthetase gene segments.
The Strange World of LPXTGase Nicole Johnston (johnstnj@mcmaster.ca)
The Scientist Volume 17 | Issue 6 | 30 | Mar. 24, 2003
The Scientist Volume 17 | Issue 6 | 30 | Mar. 24, 2003
Researchers think they've found the first enzyme made by NRPS, and that it could be the product of several genes
References
1. S.G. Lee et al., "Characterization of a unique glycosylated anchor endopeptidase that cleaves the LPXTG sequence motif of cell surface proteins of Gram-positive bacteria," J Biol Chem, 277:46912-22, 2002.
2. D.E. Cane et al., "Harnessing the biosynthetic code: combinations, permutations, and mutations," Science, 282:63-8, 1998.
3. D. Schwarzer, M.A. Marahiel, "Multimodular biocatalysts for natural product assembly," Naturwissenschaften, 88:93-101, 2001.
4. A. Wiest et al., "Identification of peptaibols from Trichoderma virens and cloning of a peptaibol synthetase," J Biol Chem, 277:20862-8, 2002.
1. S.G. Lee et al., "Characterization of a unique glycosylated anchor endopeptidase that cleaves the LPXTG sequence motif of cell surface proteins of Gram-positive bacteria," J Biol Chem, 277:46912-22, 2002.
2. D.E. Cane et al., "Harnessing the biosynthetic code: combinations, permutations, and mutations," Science, 282:63-8, 1998.
3. D. Schwarzer, M.A. Marahiel, "Multimodular biocatalysts for natural product assembly," Naturwissenschaften, 88:93-101, 2001.
4. A. Wiest et al., "Identification of peptaibols from Trichoderma virens and cloning of a peptaibol synthetase," J Biol Chem, 277:20862-8, 2002.
Courtesy of Vincent A. Fischetti
Созданная компьютером линейная (ribbon) модель последовательностей С-терминального конца M белка содержит LPXTG мотив (красный цвет). Эта область обнаруживается также во всех поверхностных белках, закрепленных С-концами, из грам-положительных бактерий.
Предполагаемый энзим собирается из множественных пептидов, каждый из которых продукт отдельного гена. Предполагается, что из 60 аминокислот в последовательности, только 40 соответствуют стандартному репертуару; др. являются новыми по структуре и возможно собираются не на рибосомах, а с помощью обширных, громоздких мегапротеиновых комплексов. Предполагается, что полный энзим является существенным для жизни бактерий и что идентифицированный ингибитор м. выстлать дорогу к новому мощному классу антибиотиков широкого спектра.
Терминальные LPXTG последовательности поверхностных белков грам-положительных бактерий, которые отщепляются, когда белки проникают сквозь клеточную пергородку, чтобы прикрепиться к клеточной поверхности. LPXTG последовательности, по-видимому, обеспечивают общий механизм закрепления на клеточной поверхности. Группа из Rockefeller University в составе Vincent Fischetti, Sung Lee и Vijaykumar Pancholi скринировала клеточные экстракты стрептококков, чтобы выявить энзим, который отщепляет LPXTG мотив. Такой энзим был выделен из стрептококков и стафилококков и назван LPXTGase. Предполагается, что это первый энзим, продуцируемый в результате nonribosomal peptide synthesis и что он м.б. продуктом нескольких генов.
Nonribosomal peptide synthesis (NRPS) (и сходный родственный синтез polyketide) происходит в основном у актиномицетов, бацилл и филаментозных грибов. NRPS синтетазы состоят из серий активных сайтов, называемых модулями. Каждый модуль осуществляет катализ и модификацию прикрепленной растущей пептидной цепи. Продуцируемые малые (2-20) аминокислотные пептиды включают: антибиотики penicillin, erythromycin и vancomycin, иммуносупрессант cyclosporin и противоопухолевые агенты, каждый из которых необычен по структуре. Они собираются в цитоплазме с помощью мегапротеинов, называемых нерибосомными синтетазами пептидов (nonribosomal peptide synthetases).
HALLMARKS OF NRPS Впервые описанный в 1960s, NRPS, как известно, продуцирует только короткие пептиды. Последовательность LPXTGase сильно glycosylated, это необходимо для ее активности, она содержит очень необычные аминокислотные последовательности, не содержащие ароматические аминокислоты. Энзим богат аланином и 30% его аминокислот необычны, согдается впечатлние, что выпадают из обычной реальности аминокислот, дающих пептиды и энзимы. Присутствие таких аминокислот является характерным для NRPS, поэтому было предположено, что это первый энзим, который не продуцируется на рибосомах и он м.б. общим для грам-позитивных бактерий.
Однако, это, по-видимому, необычная NRPS система,т.к. обычно молекулы, ею продуцируемые, содержат максимум 20 аминокислот. Этот же энзим состоит из 60 аминокислотs, так что он образуется новым способом.
Микробиолог Olaf Schneewind, University of Chicago согласен с важностью находки: "I think [they're] right in claiming that this is the first example that NRPS could lead to an enzyme".
Но согласны не все. "The work presented is interesting in that the anchor endopeptidase seems to represent a unique protein with so many unusual modifications and 'unnatural' amino acid residues, so that one would think that it could be made nonribosomally," говорит Marahiel. "All nonribosomal peptides known to date are in the range of 2 to 48 residues, and no such peptide was shown to have catalytic activity and the size shown for the LPXTG endopeptidase."
На 3rd European Conference on Marine Natural Products в Munich, исследователи демонстрировали пептиды,названные polytheonamide и заявляли, что они продуцируются в результате NRPS. Marahiel продолжает, что пептид столь сильно модифицирован с необычными аминокислотными остатками, которые метилированы и N-terminal blocked, а также является D-изомером. Однако, кодирующий ген для этого предполагаемого NRPS пептида все еще неизвестен.
Более того, Marahiel заявляет, что имеется несколько примеров рибосомально синтезируемых пептидов, которые очень сильно модифицируются после трансляции. Напр., lantibiotics, такие как epidermin, nisin и cinnamycin, которые м. содержать до 47 остатков. Marahiel предполагает, возможно, что столь необычные продукты м.б результатом некоего созидательного инженеринга у некоторой части организмов. "One may think about a possible combination of ribosomal and nonribosomal machines to generate such diversity of structure and function," заявляет он.
Биохимик Hans von Doehren, Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Technical University, Berlin, также невполне убежден, что эта эндопептидаза является продуктом NRPS. Он полагает, что с помощью методов mass spectrometry м. будет получить более надежные доказаетльства. "To make a sequence-defined peptide of 50 or more residues, the cost of DNA [required physical space] is very high," заявляет Doehren. Напр., ген, кодирующий энзим, который продуцирует peptaibol, антибиотик из 18 аминокислот, является длиной 80 kb. Представить себе соотв. энзим, создающий пептид в 60 остатков, нелегко. "Very unlikely, but not impossible," заявляет он.
|
Courtesy of Vincent A. Fischetti |
 |
 Vincent A. Fischetti and Sung Lee  | |
|
MULTISTEP ASSEMBLY "We cannot only look at it in terms of one gene, one enzyme," объясняет Fischetti. Он полагает, что продукция LXPTGase нуждается, по крайней мере, в одном из этих комплесных энзимов для своей сборки, а др. предназначены для действий, которые ответственны за модификации энзимов. others being called into action that are responsible for the enzyme's modifications. Конечный результат является результатом многоступенчатого конвейера сборки. "It is not a single step from ribosome to enzyme. In this case, it is ribosome to enzyme[s] and that enzyme[s] then assembles the final polypeptide," заявляет он.
Однако, ни законсервированных NRPS генов, ни необычных NRPS пептидов не обнаружено у стрептококков. "When you look at the streptococcal genome, you don't find them," добавляет Fischetti. Такое отсутствие явных геномных NRPS signature и необычно большие размеры стрептококкового энзима позволяют думать о множественных генах и энзимах.
"It's fairly obvious that the only way [this enzyme] could be produced is by being formed by a more complex mechanism," продолжает Fischetti. "You don't see these very large NRPS proteins which can be 1 mb in size. They're huge. To allow for several amino acids to be placed in sequence, you need different modules and domains with amino acid transfer being performed in these monster molecules. To produce the LPXTGase, such a protein would have to be three times the size [of known synthetases]. That's too huge and you don't see anything [in streptococci] to that effect."
Но von Doehren не исключает, что столь большие NRPS пептиды м. б. созданы одиночной синтетазой. "Peptide synthetases making repeated sequences may make peptides with more than 1000 residues, such as the gamma-D-glutamyl capsule of some bacilli," объясняет он. Но в случае LPXTGase, таких повторяющихся последовательносей не обнаружено.
The Rockefeller группа открыла также ингибитор энзима с помощью ультрафильтрации клетоных экстрактов, который был замаскирован в присутствии энзима благодаря своему взаимодействию с его активностью. Еще не названная молекула ингибитора, которая м. устранять активность LPXTGase, указывает на потенциально перспективный новый класс антибиотиков. Fischetti утверждает: "It kills all the Gram-positive bacteria that we've tested, including Bacillus anthracis, and kills most of the Gram-negative bacteria as well."
Если предположение Fischetti's верно, то д. сущестовать и др. сходные энзимы.