Protein–DNA Interaction: Major Groove Recognition Determinants | |
|---|---|
|
Взаимодействия белок-нуклеиновые кислоты играют критическую роль в центральных биологических процессах Известно, что наиболее распространенным связывающим элементом в белке является α спираль и первичный сайт связывания на ДНК в большой борозде. Главное правило связывания α спирали с большой бороздой известно, но неизвестен общий код (один-к-одному соотвествие) для распознавания. ) (Рис.1.) | Helix binding to the major groove of DNA. Two views (90° apart) of a helix–turn–helix (HTH) motif are shown. Reproduced from Matthews, (1988). ) (Рис.2.) | Docking of α helix in the major groove, the accessible area in the major groove is highlighted in red. .. ) (Рис.3.) | Docking of the α helices in the major groove. The recognition helix of the i + 3 superfamily is shown in yellow and that of the i + 4 superfamily in red. Reproduced from Pabo and Nekludova (2000). .. ) (Рис.4.) | (a) The ??? folding of Cys2His2 zinc finger motif. Reproduced from Wolfe et al. (1999). (b) Binding of the zinc finger in the major groove of DNA... ) (Рис.5.) | Interactions in Zif268 zinc finger–DNA complex. (a) Cartoon representation of the complex. (b). Schematic illustration of the contacts between the fingers and the DNA bases. Arrows indicate hydrogen-bonding interactions and circles represent van der Waals contacts. (c) Side-chains forming hydrogen-bonding interaction to G•C base pairs. Reproduced from Pavletich and Pabo (1991); Wolfe et al. Aughey, G. N. and Southall, T. D. (2016), Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. WIREs Dev Biol, 5: 25-37. doi:10.1002/wdev.205 (http://wires.wiley.com/remdoi.cgi?doi=10.1002/wdev.205) Взаимодействия белков с хроматином является фундаментальным для нескольких важных клеточных процессов. Во время развития орнанизма гены д. тонко регулироваться во времени и пространстве. Это достигается посредством действия хроматин-связывающих белков, таких как транскрипционные факторы, модификаторы гистонов, ремодельеры нуклеосом и ламины. Более того, взаимодействия белок-ДНК важны и у взрослых, у которых их пертурбации приводят к нарушению гомеостаза, нарушению регуляции метаболизма и болезням, таким как рак. Понимание природы таких взаимодействий имеет первостепенную важность во всех областях молекулярных биологических исследований. В последнее время DNA adenine methyltransferase identification (DamID) возник как один из наиболее всесторонних и исерпывающих методов, делающий возможным профилирование взаимодействий белок-ДНК на уровне генома. Метод DamID был использован для картирования разных хроматин-связывающих белков у нескольких модельных организмов и он обнаруживает потенциал для постоянной адаптации и применения в области биологии генома. |
Нуклеиновые кислоты и белки являются двумя наиболее важными биомолекулами в любом живом организме, первые несут генетическую информацию, а последние исполняют и регулируют жизненно важные процессы. Взаимодействия белок-нуклеиновые кислоты играют поэтому критическую роль в центральных биологических процессах, от механизмов репликации, транскрипции и рекомбинации до ферментативных событий утилизации нуклеиновых кислот как субстратов. По этой причине биохимические и структурные основы процесса белок-ДНК распознавания является предметом интенсивного исследования. Рентгеновская кристаллография вместе с NMR и многими др. химическими и физическими методами используются для анализа взаимодействия белка с ДНК. В конце 1970s техника footprinting была применена для выявления специфичености связывания белок-ДНК. Первое рентгеновское кристаллографическое исследование комплекса белок-ДНК было описано в 1984, и около 10 структур было выявлено к концу 1980s. Последняя декада 20 столетия обнаружила взрывной рост структур высокго разрешения комплексов белок-ДНК. Свыше 240 структур комплексов белок-ДНК было выявлено, из них примерно 220 получены с помощью рентгеновской кристаллографии и около 20 с помощью высоко-разрешающих NMR исследований. Взаимодействия белок-ДНК в этих комплексах хорошо документированы для индивидуальных структур и послужили предметом для литературных обзоров (Steitz, 1990; Luisi, 1995; Sundaralingam and Burkhart, 1997; Luscombe et al., 2000). Структуры комплексов белок-ДНК доступны в Nucleic Acid Database ( NDB;) и в Protein Data Bank (PDB;). See also: Cell macromolecules; Protein–ligand interaction: molecular basis; Macromolecular structure determination: comparison of crystallography and NMR; Primary protein and nucleic acid three-dimensional structure databases
В соответствии со своими функциями комплексы ДНК-белок м.б. сгруппированы в несколько классов, включая полимеразы, транскрипционные факторы, нуклеазы и др. энзимы и структурные белки. Первая группа представляет взаимодействия ДНК/РНК полимераз, где белок использует ДНК в качестве матрицы, а индивидуальные нуклеотиды в качестве субстрата для синтеза ДНК или РНК полимеров. Вторая большая группа содержит белки для генной регуляции, большинство из которых являются транскрипционными факторами. Эти белки распознают специфические сайты ДНК и являются обычно высоко чувствительными к ДНК последовательностям. Третий класс является взаимодействием нуклеаз, включая эндонуклеазы и экзонуклеазы. Энзимы находят место разрыва ДНК и гидролизуют P–O связи. ДНК рекомбиназа также обладает сходной функцией. Кроме того многие белки участвуют в др. процессах, подобных модификации оснований ДНК, а хромосомные белки обеспечивают скелет для хроматина. См. также в els: RNA polymerase II holoenzyme and transcription factors; Nucleases; Motor proteins in DNA metabolism: structures and mechanisms
Еще прежде того, как работы по структуре стали возможны, были начаты исследования центрального вопроса взаимодействия белок-ДНК – как последовательности ДНК распознаются белком. Была предложена гипотеза, согласно которой происходит взаимодействие между аминокислотными боковыми цепочеками белка и основаниями нуклеиновых кислот nucleic acid bases (Sundaralingam, 1975). Было предсказано, что м. существовать набор возможно специфических взаимодействий с помощью водородных мостиков между основаниями нуклеиновых кислот и белками, включая атомы как основной цепи, так и боковых цепей, особенно боковых цепочек аргинина, аспарагина и глютамина для специфических контактов с большинством оснований ДНК и особенно с гуанинами в большой и малой бороздах (Sundaralingam, 1975). Эти аспекты обсуждались также Seeman et al. (1976), которые кроме того показали, что м.б. возможным дискриминация всех потенциальных пар оснований (C•G,G•C, A•U и U•A) и идентифицировали специфические последовательности с помощью проверки их мест с водородными мостиками в большой борозде. В результате исследований структуры ДНК-связывающих белков Matthews и др. предположили, что cro репрессорный белок (α helix) соединяется с большой бороздой ДНК (Ohlendorf et al., 1982). Правильность этой гипотезы была подтверждена и соединение α helix к большой борозде теперь известно как наиболее распространенный паттерн распознавания при взаимодействиях белок-ДНК (Figure 1). See also: белок-ДНК interactions; Nucleic acids: general properties
Многие ранние предсказания нашли подтверждение в белок-ДНК структурах, выявленных позднее. Однако, даже при наличии обильной структурной информации оказалось непростым делом понять общий код распознавания (Matthews, 1988) типа один-к-одному соответствия аминокислот и оснований нуклеиновых кислот. Даже учитывая комбинацию аминокислот остается неясным, какого типа структурный мотив должен быть адаптирован: т.е., как белок складывается. Более того, даже внутри одного и того же вторичного структурного элемента, viz. α спирали, данный тип аминокислоты распознает разные нуклеотидные основания с ращзными ориентациями или позициями в α спирали. Напр., 4 глютаминовых остатка в распознающей спирали белка-репрессора 434 образуют водородные мостики с аденином, гуанином, тимином и остовом ДНК, соответственно. Тем не менее исследования белок-ДНК комплексов предоставили важную детальную стереохимическую информацию, указывающую на то, как ДНК последовательности считываются и умело используются. Было продемонстрировано, что взаимодействия осуществляются посредством водородных связей между белком, ДНК, а также молекулами воды и с помощью контактов van der Waals. В белках идентифицировано варьирующее, но ограниченное количество структурных типов ДНК-связывающих элемнтов. Эти элементы распознавания ДНК обладают во многих случаях преформированными доменами, но в др. случаях они складываются только после соединения с ДНК. Предпочтительным местом связывания на молекуле ДНК является обычно большая борозда, часто фосфат-сахарный остов также вносит вклад в контакт. Повторяющаяся тема белок-ДНК взаимодействия - это деформация молекулы ДНК из канонической В-ДНК формы; в частности, изгибания или перегибы в сайте распознавания с изменениями ширины и глубины борозды. См также : Protein motifs for DNA binding; Water: structure and properties; DNA-binding enzymes: structural themes; DNA structure: A-,B- and Z-DNA helix families
DNA Bending Изгибы ДНК играют выраженную роль в распознавании последовательностей нуклеиновых кислот. Предполагается, что это один из двух основных источников спецификации последовательностей при взаимодействиях белка с нуклеиновыми кислотами (Steitz, 1990). В дополнение к непосредственным взаимодействиям с помощью водородных мостиков и сил van der Waals, которые обеспечивают структурную комплементарность в месте взаимодействия белок-ДНК, зависимая от последовательностей изгибаемость дуплексной ДНК выявляет избирательность последовательностей посредством способности принимать определенную конформацию, необходимую для связывания белка с самой низкой затратой свободной энергии. Перегибы ДНК происходят в подавляющем большинстве комплексов белок-ДНК. Степень изгибов варьирует от незначительных изгибов в некоторых случаях до почти 180° U-перегиба в др. Эти деформации часто ассоциируют с изменениями в ширине и глубине борозды, а также с изменениями сахорно-фосфатного остова, с некоторыми часто наблюдаемыми признаками A-ДНК. В целом изгибы в ДНК м.б. сгруппированы в три категории. Первый тип является локальным изменением, в котором искривление происходит в одном месте. Второй является локальными изменениями в виде последовательных ступеней, которые колективно изгибают спираль. В третьем типе хотя и имеются некоторые серьезные локальные изменения (distortions) такие как перегибы, их комбинация сводит все на нет и путь спирали остается линейным. См. также: DNA structure changes coupled to protein binding; SRY and DNA-bending proteins.
Хотя изгибание ДНК м.б. индуцировано связыванием с белком, однако во многих случаях оно прирожденное свойство дуплекса ДНК, которое зависит от последовательностей и является биологически важным. Имеются многочисленные сообщения о локальных поворотах в широком круге биологических систем, тех, которые скорее всего ассоциированы с регуляторными элементами/областями транскрипции как у прокариот, так и эукариот. Прекрасным примером сиквенс-зависимого искривления является изгибание, ассоциированное с адениновыми трактами (A-tracts), где кластеры от 4 до 6 последовательных адениновых оснований, повторяющиеся с шагом спирали, как известно генерируют поврот ДНК. Изгибание с помощью A-tracts открыто благодаря его аномально низкой электрофоретической подвижности и было установлено, что каждый набор A-tracts генерирует изгиб спирали ДНК на 18°. Удивительно, но точная причина и детали A-tract кривизны остаются неизвестными и продолжают находиться в фокусе обширных исследований. См. также: DNA topology: fundamentals A/T-rich Sequences and Groove-binding Drugs Рентгеновская кристаллография и др. биофизические инструменты подтверждают, что конформации ДНК м.б. сиквенс-специфическими. Т.к. нет очевидных правил для взаимоотношений между последовательностями ДНК и ее конформацией, то богатая A/T область привлекла специальное внимание. В уже известных структурах комплексов белок-ДНК часто обнаруживаются существенные перегибы в последовательностях, богатых A/T-rich, особенно в большинстве случаев связывания с минорной бороздой, где структура ДНК часто является существенно измененной. Структурно, как было отмечено, A/T-богатые последовательности имеют более узкую минорную борозду, чем последовательности, богатые G/C. Считается, что это облегчает связывание одиночного естественно возникшего противоопухолевого лекарства, такого как netropsin и distamysin A, в минорной борозде. Подчеркивая свою флексибельность минорная боразда из A/T- (или I/C)-богатой области, обнаруживает также существенное расширение в случае в случае бок-о-бок двойного связывания лекарства distamysin A. Эти естественно возникшие лекарства обладают выраженной токсичностью, т.к. они или непосредственно блокируют сайт связывания белка в минорной борозде или делают жесткой двойную спираль, чтобы предупредить изгибание и тем самым снизить сродство к распознающему белку.
Существенные успехи достигнуты в последние годы по разработке сиквенс-специфических ДНЕ-связывающих лекарств. Показано, что полиамиды, которые содержат N-methylimidazole (Im) и N-methylpyrrole (Py) аминокислоты соединяются с последовательностями минорной борозды ДНК со сродством, сравнимым с или даже более высоким, чем сродство большинства клеточных белков. Работы Лаб. P. B. Dervan’s продемонстрировали, что специфичность ДНК-связывания этими соединениями возникает в результате поперечных связей Py и Im аминокислот внутри полиамидных лекарств. Установлено, что G-C пары м.б найдены Im/Py парами в полиамиде, а C-G пары выявляются с помощью Py/Im пар. Добавление др. ароматической кислоты, N-methyl-3-hydroxypyrrole (Hp) позволяет осуществлять дискриминацию A•T и T•A пар; при этом Hp/Py пары находят T•A пары оснований, тогда как Py/Hp пары находят A•T. Таким способом возможно синтезировать полиамид со специфической комбинацией Im, Py и Hp , чтобы распознавать данную последовательность ДНК. Показано, что такие лиганды м. блокировать ДНК-связывающую актиность определенных транскрипционных факторов и in vivo и in vitro. Footprinting to Detect Interaction Footprinting является одним из наиболее широ используемых методов для получения детальной информации об индивидуальных нуклеотидах в комплексах белок-ДНК, даже внутри живой клетки. В таком эксперименте химические соединения или энзимы используются для модификации или переваривания молекул ДНК. Когда сиквенс-специфические белки соединяются с ДНК, то они м. защищать сайты связывания от модификаций или переваривания. За этим м. наблюдать с помощью электорофореза в денатурированном геле, где незащищенная ДНК расщепляется более или менее случайно. В результате появляются ‘ladder’ дисков, а сайты, защиденные белками не имеют соответ. дисков и выглядят подобно следам (footprints) в паттерне дисков. Footprints, следовательно, идентифицируют специфические нуклеозиды в сайтах связывания белок-ДНК. Обычно используемые зондирующие реагенты обсуждаются ниже. См. также: белок-ДНК interactions: techniques used Enzymatic probes Deoxyribonuclease I (DNAase I) наиболее экстенсивно используемый footprinting реагент, т.к. она не обнаруживает очевидной сиквенс-специфичности и она режет довольно случайно вдоль длины молекуля ДНК. В экспериментах DNAase I footprinting связанные белки защищают фосфодиэфирный остов ДНК от гидролиза, катализируемого DNAase I. Др. нуклеазы также часто используются в экспериментах footprinting, включая micrococcal nuclease (MNase), exonuclease III (Exo III) и nuclease P1. DNA methylases (DNA MTase) также используется для модифицирования оснований ДНК (метилирование цитозина) за исключением защищенных сайтов, связанными белками, а ДНК постепенно расщепляется в местах метилирования за счет или рестрикционных энзимов, чуствительных к метилированию, или химических соединений. Chemical probes Dimethyl sulfate (DMS) наиболее мощный и широко используемый химический зонд для изучения footprinting. DMS легко метилирует N7 позицию гуанина (aа также N3 позицию аденозина в 5 раз с меньшей эффективностью). Лежащий в основе принцип в том, что нуклеотиды, участвующие в белок-ДНК взаимодействиях, защищены от метилирования. Модифицированная ДНК затем обрабатывается теплом и щелочью, которые вызывают расщепление ДНК специфически по модифицированным гуанинам, давая ‘G-ladder’ с отпечатками в сайтах связывания. Др. химические нуклеазы, такие как phenanthroline-copper, methidium-propyl EDTA и ferrous EDTA, также пригодны в качестве реагентов для footprinting. Лекарства, соединяющиеся с минорной бороздой, такж м.б. использоваться для проверки белок-ДНК взаимодействия. Кроме того, многие химические зонды используются для исследований областей однонитчатых ДНК. Physical probes DNA photofootprinting с помощью УФЛ (UV) был одним из первых разработанных для footprinting методом. После обработки УФЛ образуются пиримидиновые димеры между соседними пиримидинами одной нити двойной спирали. Образование таких фотодимеров возможно при расплетании и перегибах ДНК. Подобные деформации предупреждаются или модифицируются в присутствии связывающих белков, которые ведут к модулированию величины повреждений УФЛ. Разработаны специфические реакции (энзиматические и химические), которые разрывают остов ДНК в местах образования фосфодимеров, чтобы вызывать отпечатки связываемых сайтов. . Docking of ? Helices and Major Groove Interactions Т.к. структурная информация о белок-ДНК взаимодействиях быстро накапливается, то становится необходимой структурная классификация, которая позволяла бы упрощать разные способы связывания и идентифицировать общие свойства. Взаимодействия белок-нуклеиновые кислоты рассмотрены в обзорах Steitz in 1990, а первая детальная таксономия ДНК-связывающих мотивов приведена Harrison (1991). Затем была получена документация с более полной и точной классификацией Luisi (1995), Sundaralingam and Burkhart (1997) и Luscombe et al. (2000). См. также: Protein motifs for DNA binding
Класс белков с α спиралью, соединяющейся с большой бороздой ДНК, оказался самым большим по числу членов. Он включает helix–turn–helix (HTH) белки, zinc-связывающие белки, leucine zipper белки и некоторые энзимы у прокариот и эукариот. Характерным для белков этого класса является взаимодействие между большой бороздой ДНК и одной или более α спиралей белка. С точки зрения белок-ДНК взаимодействия существенные резличия между разными белками такого типа, при котором эта спираль поддерживается с помощью др. частей вторичной структуры белка. Простой геометрический анализ показывает, что α спираль д. лежать под углом к оси спирали ДНК (Рис. 4). Обычно единица распознавания α спирали имеет в среднем три витка или более, давая длину примерно в 16 ? (5.4 ?/turn ? 3 turns). Если α helix параллельна спирали двойной ДНК (Рис. 2a), то эта длина не м.б. совместима с внутренностью большой борозды B-ДНК, которая имеет ширину в 11–12 ?. Если α helix наклонена, то она м.б. совместима с большой бороздой (Рис. 2b), а более длинные спирали м. даже вставляться одним концом в большую борозду, а другой конец будет торчать. Напр., распознающая спираль в белке с лейциновыми застежками, MAX, имеет примерно 6 витков в спирали. Интересно, что средняя длина α helices в глобулярных белках состоит примерно из 10 остатков, соответствующих трем виткам. Это вызывает некоторые интересные соображения об эволюции этих комплексов. Каждая спираль распознавания идентифицирует около трех пар оснований ДНК, которые равны длине генетического кодона: трем нуклеотидам во взаимодействии кодон-антикодон. Это м. указывать на то, что эволюция выбрала наилучшую длину α спиралей (три витка) для собственно распознавания генетического кода (трех нуклеотидов). См. также: Leucine zipper; Evolution of the genetic code
Pabo and Nekludova (2000) анализировали характер укладки (docking arrangements) α спиралей в большой борозде на основании пространственных взаимоотношений между остатками белка и основаниями ДНК. Было установлено, что подавляющее число белков, которые соединяют спирали с большой бороздой ДНК, м.б. сгруппированы в два сверхсемейства, характеризующихся разными паттернами критического взаимодействия остатков, которые лежат вдоль гребня на поверхности α спиралей. Первая группа (Рис. 3), соответствующая широкому рангу белков, классифицируется по критическим остаткам i, i + 4 и i + 8 , которые определяют гребень; т.е, если первый остаток α спирали входит в контакт с основанием ДНК, то он является i, второй остаток, входящий в контакт с ДНК будет i + 4, а третий будет i + 8. Каждый белок этой группы становится в док (docks) несколько отличным способом, который обеспечивает соответ. паттерн присоединения почти всех спиралей распознавания в этих комбплексах. Второе сверхсемейство характеризуется последовательным патерном присоединения почти всех спиралей распознавания в своих комплексах. Второе сверхсемейство состоит из Cys2His2 zinc finger белков (Рис. 3), чьи петли распознавания становятся в док разными способами. Остатки, определяющие спираль, являются i, i + 3, i + 6 гребнем, который приблизительно располагается в локальной дирекции большой борозды. Оси α спиралей, как полагают, имеют совсем др. ориентацию, в среденем 6.5° к плоскости оснований ДНК в i + 4 семействе и 36° в i + 3 семействе.
Взаимодействия между белком и ДНК включают электростатическое притягивание, соедниение водородными мостиками и и контакты van der Waals. Электростатическая сила является одним из доминирующих факторов, но о ней меньше всего известно. Это м.б. из-за того, что не существуют подходящих способов помимо теоретических расчетов для измерения этого типа взаимодействия. Анализ показывает, что взаимодействующие стороны (interfaces) между белком и ДНК сильно обогащены позитивными зарядами и почти лишены негативных зарядов. Позитивно заряженный лизин и аргинин отвечают за 41%, а негативно заряженные aspartic и glutamic кислоты представляют в среднем только 4% области interface (Nadassy et al., 1999). С др. стороны, негативно заряженные остатки фосфатов ДНК представляют около 43% области поверхности, которая контактирует с белками. Негативные заряды позволяют позитивным зарядам аргинина и лизина приблизиться к фосфатам и образовать солевые (salt) мостики с ними. См. также: белок-ДНК interactions: energetics
Доминирующие, как это м.б., ведь электростатические силы не являются сиквенс-специфическими, т.к. негативные заряды фосфатных групп ДНК случайно распределены вдоль длины молекулы. Две др. силы ответственны за сиквенс-специфичность. Как видно во всех комплексах белок-ДНК interface является геометрически комплементарным между белком и молекулой ДНК, что гарантирует оптимальный van der Waals контакт. Т.к. форма взаимодействующих поверхностей молекулы ДНК является сиквенс-зависимой, то она и служит в качестве дискриминирующего фактора для распознавания белка. Взаимодействие с помощью водородных связей, по-видимому, является основной силой, заставляющей белки считывать последовательности ДНК. Было показано, что 90% водородных мостиков между белком и нуклеиновыми кислотами имеют донорскую группу на белке и акцепторную группу на ДНК (Nadassy et al., 1999). NH группы основной цепи белка и заряженые боковые цепочки аргинина и лизина являются основными донорами водородных мостиков, в этом часто участвуют и боковые цепточки аспарагина и глютамина. Co стороны ДНК phosphate oxygens, гуанин N7 и O6, и аденин N7 являются чаще всего акцепторными группами в большой борозде. Гуанин обеспечивает почти 50% водородных мостиков, а донорами обычно являются лизин или аргинин. Аденин (N7 и N6) почти исключительно распознается с помощью аспарагинов и глютаминов. N4 цитозина и O4 тимина иногда также вносят вклад во взаимодействия с помощью водородных мостиков, правда тимин в значительно меньшей степени. Помимо непосредственных водородных связей молекуля воды часто видны присоединенными к белок-ДНК interfaces. Эти взаимодействия дают громадное разнообразие различных способов взаимодействия в белок-ДНК interfaces, гарантируя, что распознавание будет высоко специфичным и объясняя, почему не существует универсального кода для белок-ДНК взаимодействий (Matthews, 1988). См. также: белок-ДНК complexes: nonspecific; белок-ДНК complexes: specific Zinc Finger Positioning in the Major Groove Мы будем использовать белки с цинковыми пальчиками в качестве примера для иллюстрации некторых общих заключений о позиционировании α спирали в большой борозде ДНК. Цинк-координирующие белки являются наиболее распространенными ДНК-связывающими транскрипционными факторами у эукариот. Мотив распознавания характеризуется tetrahedral координацией одного или двух ионов цинка с помощью законсервированных цистеинового (Cys) и гистидинового (His) остатков. Цинк-связывающие белки м. б. подразделены на подгруппы, базируясь на координирующих протеиновых остатках: Cys2His2Zn1, Cys4Zn1, Cys3His1Zn1 и Cys6Zn2. Те что в Cys2His2 подгруппе обычно обозначаются как zinc finger белки, а др. обобщенно называются zinc-связывающими белками. Белки с цинковыми пальчиками впервые выявлены у Xenopus laevis в качестве транскрипционного фактора IIIA (TFIIIA) (Miller et al., 1985). С момента его открытия были обнаружены вариации его первоначальной формы. Эти белки вскоре стали фундаментом цинк-координирующего класса и их взаимодействия с ДНК изучали наиболее активно среди комплексов белок-ДНК.
Белки цинковые пальчики обычно содержат несколько пальчиков, которые образуют тандемные контаты вдоль молекулы ДНК. Каждый пльчик складывается в компактный typically contain several fingers that make tandem contacts along the DNA. Each finger ??? домен с одним ионом цинка, который располагается (sandwiched) между дву-нитчатыми антипараллельными ? листками и α спиралью. Ион цинка tetrahedrally скоординирован между двумя цистеинами на одном конце антипараллельного ? листка и двумя гистидинами на С-конце α спирали (Pavletich and Pabo, 1991) (Рис. 4). Координация цинка эффективно стабилизирует пальчики помимо полузаконсервированной гидрофобной сердцевины, которую фланкируют цинк-связывающие сайты. См. также: Proteins: fundamental chemical properties
Только α спираль домена цинкового палдьчика взаимодействует с ДНК. Рентгеновская кристаллическая структура Zif268, порции в 90 аминокислот раннего транскрипционного фактора мыши служит в качестве прототипа семейства цинковых пальчиков (Pavletich and Pabo, 1991). Этот белок содержит три цинковых пальчика с одной стороны α спирали, располагающаейся в большой борозде ДНК под углом примерно в 45° к плоскости пар оснований, а последовательное присоединение пальчикоа приводит к закручиванию белка вокруг ДНК (Рис. 5a). Каждый пальчик связывается с областью ДНК из трех пар оснований отдельно от их соседей, но контактирует, накладываясь на четвертое основание (Рис. 5b). Контакты с основаниями обеспчиваются белковыми остатками ?1, +3 и +6 (по этой числовой схеме, позиция ?1 означает, что остаток непосредственно предшествует α спирали, первым остатком является +1, и нет остатка под номером 0) с первичной нитью ДНК (5?-GCGTGGGCGT-3?) и остатком 2 на комплементарной нити ДНК (Рис. 5b). Т.к. большинство из этих контактов обеспечивается водородными мостиками, но ван- дер-Вальсовские взаимодействия также важны. Кроме того, контакты фосфатов также вносят вклад в последние взаимодействия. phosphate contacts also contribute to the latter interaction. Необходимо подчеркнуть, что хотя фингер-мотив является структурно законсервированным в белках цинковых пальчиков, индивидуальные взаимодействия не нуждаются ни в присутствии каждого пальчика, ни в том, чтобы остатки были абсолютно законсервированы в пальчиках. Анализ известных структур (Wolfe et al., 1999) показал, что белки цинковых пальчиков м.б. подразделены на два временных подраздела с (a) каноническими пальчиками, имюещими один и тот же паттерн контакта с основаниями что и у Zif268, и (b) нестандартные пальчики с разными паттернами контактов с основаниями (напр.,. TFIIIA пальчики 1, 2 и 5).
Конформация ДНК очень сходна с таковой у B-формы, с большой бороздой более глубокой и широкой, чем в норме, что, по-видимому, и представляет отличительную конформацию. Этот конформационный признак обнаруживается во всех комплексах цинковые пальчики-ДНК, а также в большинстве др. белок-ДНК комплексов.
Т.к. домены цинковых пальчиков соединяются с последовательностями ДНК с очень высоким сродством и специфичностью, то возникает идея ‘mix and match’ пальчики для новых сайтов, учитывая большое количество известных белков цинкове пальчики, которые распознают разнообразие разных сайтов. Первоначально разработка базировалась на рациональном анализе взаимодействий в известных структурах, но этот подход столкнулся с ограниченными успехами. Использование фагов, молекулярно биологический подход открыли альтернативный метод отбора новых пальчиков для специфических последовательностей ДНК. Были разработаны разные протоколы отбора и в результате получили информацию о лучших композициях пальчиков для распознавания данной последовательности ДНК. Однако, последовательности ДНК, богатые пиримидинами, создают проблемы, т.к. цинковые пальчики в основном взаимодействуют с пуриновыми основаниями (Рис. 5b). Фактически, ъхотя одно основание в паре является пурином, а др. пиримидином, но большинство белок-ДНК взаимодействий использует пуриновые основания. Тем не менее постоянно делались попытки искусственно создать общие сиквенс-специфические zinc finger–DNA binding белки. Успех м.б. вскоре достигнут, тогда откроется возможность подбирать белки к специфическим последовательностям ДНК, ассоциированными с любым необходимым геном и тогда м.б. возможно регулировать экспрессию генов, используя искусcтвенно созданные транскрипционные факторы. См. также: Phage display technologies Originally published: April 2001 |
