CARDIOGENESIS: ROLES of SRF, NKX2-5, and GATA-4
Кардиогнез: Генетический Контроль

MOLECULAR REGULATION of CARDIAC MYOFIBRILLOGENESIS: ROLES of SERUM RESPONSE FACTOR, NKX2-5, and GATA-4
R.J. Schwartz, J. Sepulveda, N.S. Belaguli
Myofibrillogenesis. - Boston etc., 2002. - (Cardiov. Mol. Morphogenes.). P. 103-127
SRF and MADS BOX PROTEINS


Serum Response Factor (SRF) - это в 67 кДа ДНК связывающий белок. Мономеры SRF гомодимеризуются и симметрично контактируют ДНК связывающими сайтами с консенсусными последовательностями СС(A/T)6GG. SRF является членом древнейшего семейства ДНК связывающих белков с высоко законсервированным доменом ДНК связывания/димеризации в 90 аминокислот, называемого MADS box. SRF, фактор транскрипции дрожжей VCV1 и ARG80, а также некоторые белки растений, такие как Deficiens, все содержат древний законсервированный эвjлюционного MADS box с одинаковой связывающей специфичностью. SRF-родственные бклки (RSRF/MEF-2) образуют подсемейство MADS box семейства. MEF-2 факторы содержат MADS box и рядом MEF-2 box. MEF-2 белки связываются с MEF-2 сайтами, CTA(A/T)4TAG, которые обнаруживаются в регуляторных областях как немышечных, так и мышце-специфических генов. MADS box белки выполняют важные биологические функции, такие как спецификация типа спаривания у дрожжей, гомеотические активности у растений, спецификация глоточных мышц у C.elegans, pulmonary развитие у дрозофилы и образование мезодермальных структур у позвоночных.

SRF EMBRYONIC EXPRESSION


У позвоночных экспрессия SRF ограничена тканями мезодермального и нейроэктодермального происхождения. Во время эмбриогенеза кур и в ходе гаструляции сторого локализованная экспрессия мРНК SRF обнаруживается в виде асимметричного паттерна в Гензеновском узелке, вдоль первичной полоски, в нейральной борозде, латеральных пластинказх мезодермы, перикардиальной спланхнической мезодерме, миокарде и миотомных частях сомитов. SRF экспрессируется на высоких уровнях в симметрично расщепленном полумесяце, занимающем крайнее переднее и латеральное положение в эмбрионе, это положение подобно распределению популяции клеток кардиальных предшественников, выявляемому в экспериментах картирования судьбы клеток. Инициальный паттерн экспрессии разрешается в полный полумесяц, обнаруживая изменения, согласующиеся с морфогенезом линейной и S-образной сердечной трубки. У мышей наивысшие уровни экспрессии мРНК SRF выявлены во взрослых скелетных и сердечных мышцах. Во время эмбрионального развития мышей транскрипты SRF обнаруживаются в гладкомышечном слое (media) сосудов, миокарде сердца и миотомах сомитов. Нокаут SRF у мышей вызывает тяжелый блок образования мезодермы во время эмбриогенеза. Эти ранние SRF-дефицитные эмбрионы обнаруживают тяжелые дефекты гаструляции, которые летальны. Плохо образуются слоит эктодермальных и энтодермальных клеток, которые неспособны сформировать первичную полоску и обнаужимые количества мезодермы и неспособны экспрессировать очень ранние маркеры Bra(T), Bmp 2/4 и Shh.

SIGNALING VIA MEMBERS OF THE TGF-β FAMILY IF IMPORTANT FOR MESODERM FORMATION AMD HEART DEVELOPMENT


Bmps участвуют в установлении ранних онтогенетических путей, ведущих к кардиальной мезодерме у высших позвоночных. ВМР-4 нокаутные мыши обнаруживают мало или не обнаруживают дифференцировки мезродермы и не экспрессируют мезодермальный маркер Brachyury (T)/ а разрушение ВМР сигналов ведет к прямой нейральной индукции. Мутанты с отсутствием BMP-2 имеют дизорганизованное сердце, неспособное к петлеобразованию (looping морфогенезу). Более того существенная часть ВМР-2 нулевых мутантных эмбрионов не экспрессирует Nkx2-5, самый ранний маркер кардиального клона. Эктопическое воздействие ВМР-2, -4, и -7 к областям эмбрионов кур, которые обычно не специфицируются, чтобы стать сердечной тканью, начинают обнаруживать чувствительность к действию Nkx2-5 и GATA-4. Воздействие noggin, антогониста BMPs, полностью ингибирует дифференцировку прекардиальной мезодермы. Одной обратобки BMPs эктопических областей недостаточно, необходимо действие и FGF-4 для поддержания кардиогенеза. Лишь их комбинированое действие индуцирует появление Nkx2-5 и SRF в наивной мезодерме.

SRF, AN OBLIGATORY MYOGENIC TRANSCRIPTION FACTOR


Регуляторные области ряда мышце-специфических генов, таких как скелетный, кардиальный и гладкомышечный α-актин, содержат множественные SREs, которые необходимы для промоторной активности и зависят от активности SRF. Мутации, которые предупреждают связывание SRF, нарушают экспрессию с-fos. Высокие же уровни экспрессии SRF и увеличение массы SRF совпадают с экспрессией кардиального, скелетного и гладкомышечного α-актина. раннего маркера терминальной исчерченности и гладкомышечной дифференцировки. SRF трансактивирует также транскрипцию α-актинового гена в условиях блокады миогенной дифференцировки. Экспрессия SRF действительно супрессирована в реплицирующихся миобластах, но уровни мРНК и белка SRF увеличваются примерно в 40 раз во время прогрессии от культуры реплицирующихся первичных миобластов к нереплицирующимся мышечным трубкам. Уровни SRF белка предшествуют индукции скелетного α-актина и экспрессии гладкомышечного α-актина во время миогенной дифференцировки. SRF доминантно-негативная мутация (SRFpm1) с тремя точковыми мутациями в ДНК связывающем домене, конвертирует щелочные аминоксилоты в нейтрально-заряженные аминокислоты в положении аа143 аргинана на изолейцин, в положении аа145 лизина на аланин и аа146 лизина на глицин. Эта мутация сохраняет свойство димеризации и блокирует активацию транскрипции склетного α-актиновго гена. Стабильные трансфекции Sol 8 и С2С12 миогенных клеточных линий SRFpm1 не влияют на способность этих клеток реплицироваться, но ингибируют слияние миобластов и пострепликативную миогенную дифференцировку. Все это ясно указывает на ткане-специфический паттерн активности гена SRF и облигаторную его роль во время дифференцировки поперечнополосатых и гладких мышц.

SRF ALTERNATIVE SPLICING


Первичная SRF РНК мыши подвергается альтернативнуому сплайсингу по 5 экзону, делетируется примернотреть С-терминального домена активации, описываемого как SRFΔ5. Среди различных типов мышц висцеральные гладкие мышцы имели очень низкое соотношение SRFΔ5/SRF дикого типа. Повышенные уровни SRFΔ5 хорошо коррелируют со снижением активности генов контрактильности гладких мышц внутри эластичной аортальной дуги, это указывает на важную биологическую роль дифференциальной экспрессии SRFΔ5 варианта по сравнению с SRF дикого типа. SRFΔ5 формируют компетентные к связыванию ДНК гомодимеры и гетеродимеры. SRFΔ5 действует как естественно возникшая доминантно-негативная регуляторная мутация, которая блокирует SRF-зависимые активности скелетного, кардиального и гладкомышечного α=актина, SM22α и люциферазы, слитой с промотором SRF. Это указывает на то. что отсутствие экзона 5 м.б. преодолено привлечением транскрипционных факторов , таких как ATF6, который взаимодействует с вне-экзон 5 областями домена активации транскрипции. SRFΔ5 сплайс-изоформа м. выполнять важную регуляторную роль по модулированию дифференцировки экспрессии генов контрактильных белков. Транскрипты SRFΔ5 обнаруживалиь в эмбриональных стволоых клетках, индуцированных к дифференцировке в детерминированные кардиальные миоциты.

MADS BOX, A NOVEL DNA BINDING MOTIF


SRF является ключевым регулятором экспрессии непосредственно ранних генов, которые часто участвуют в митогенезе и терминальной дифференцировке. является ключевым регулятором экспрессии непосредственно ранних генов служит как разносторонний белок, который соединяется с распознающими его самйтами во множественных промоторах, и служит в качестве docking поверхности для свзывания многих различных дополнительных белков, которые отвечают за специфическую функциональную способность промтора. Кристаллическая структура SRF сути связывания ДНК объясняет инклюзивное связывание ко-акцессорных факторов с одиночным SRЕ. Суперскрученная спираль, образуемая MADS box α1 спиралью (аа153-аа179), расположена параллель и на вершине узкой большой борозды ДНК, контактируя с фосфатной связью на SRЕ полу-сайте. Кроме того, неструктуированное N-терминальное расширение от α1 спирали (аа132-аа152) осуществляет критические базовые контакты в минорной борозде. Димеризация MADS box происходит выше α1 спирали с помощью структур, состоящих из двух β-листков в мономере, которые взаимодействуют с такой же точной единицей партнера. Вторая αII спираль на С-терминальном конце MADS box, сложена выше этих β-слоев, заканыивает эту стратифицированную структуру. Белки, касающиеся первой или второй α-спирали в MADS box, м. играть важную роль детерминации активности генов, управляющих ростом или дифференцировкой клеток.

SRF ACCESSORY PROTEIN INTERACTIONS


Большинство SRF акцессорных белков являются ко-регуляторами с-fos индукции и действуют как конечные точки каскадов сигнальной трансдукции, часто ведущих к митогенезу. Напр., Ets-родственны четвертичного комплекса фактор, Elk-1, взаимодействует с SRF, связываясь с с-fos SRE и с SRЕ кооперативным способом. Фосфорилирование Elk-1 с помощью митоген чувствительной JNK и ERK групп mitogen-activated protein (MAP)киназы вызывает увеличение связывания ДНК, формирование четвертичного комплекса и активация транскрипции. Активированныq Elk-1 касается α-II спирали в MADS box. Напротив, ограниченный мезодермой paired homeobox protein Phox-1/MHOX/Prx-1 связывает SRF конкурентным способом с Elk-1, ингибируя образование четвертичного комплекса и индукцию с-foc с поиощью митогенов. Однако, в клетках HeLa Phox-1 наделен serum-responsive транскрипционной активностью в сайте связывания SRF в модели синергичной кооперации, нуждающейся в стабилизации комплексов SRF-Phox-1 с помощью Inr связывающего белка, TFII-I. Интересно, что Phox-1 стимулирует транскрипционную активность SRF в некоторых мышце-специфических промоторах, возможно стабилизируя связывание SRF с SREs низкого сродства.
В противоположность гену с-fos, который содержит в совоем промоторе одиночный сайт связывания с высоким сродством к SRF, многие мышце-специфические гены, включая скелетныцй, кардиальный, SM α-actin, SM MHC и SM22, содержат два или более SRЕ низкого сродства, которые связывают SRF кооперативным способом. Точная роль Prx-1/Phox-1 и его родственника Prx-2/58 в миогенезе неясна, т.к. они неспособны активировать α-cardiac актин в кооперации с SRF, тогда как они способствуют транскрипции гладкомышечного актина и мышечной креатин киназы. Возможно, что эти гомеобоксные гены играют сложную роль или в индукции или в репрессии определенных SRЕ-чувствительных генов, в зависимости от клеточных и сигнальных условий.

TINMAN AND NKX2-5/CSX HOMEODOMAIN GENES EXPRESSED IN THE HEART




THE NKX CODE


Существование, по крайней мере, 9 членов семейства Nkx-2, их перекрываение ДНК связывающей специфичности и частичное перекрывание паттернов экспрессии открывают возможности действия Nkx кода. Определенные комбинации Nkx генов функционально активны в области и следовательно специфицируют онтогенетическую судьбу этой области. Во время раннего формирования сердца Nkx2-3, 2-5, 2-7 и 2-8 экспрессируются в частично перекрывающихся доменах латеральной пластинки мезодермы и глоточной энтодермы. Однако, после процессе looping экспрессруются Nkx2-3, 2-5, 2-6 и 2-8 в определенных, частично перекрывающихся доменах сердечной трубки. В глоточной области экспрессируются Nkx2-3 и 3-5 в широких, частично перекрывающихся доменах внутри эктодермы и энтодермы в первую очередь. Напротив экспрессия Nkx2-1 и Nkx2.8 пространственно более ограничена, транскрипты обнаруживаются в местах, в которых располагаются зачатки щитовидной железы, тимуса, паращитовидных желез и легких. Эти данные согласуются с т.наз. моделью "The Nkx code", согласно которой члены Nkx выполняют уникальные ограниченные во времени и простраенстве функции в развивающемся эмбиональном сердце и глоточной области. Возможно, что положение и качественные особенности этих органных рудиментов детерминируются с помощь комбинаторики экспрессии Nkx генов.

DOWNSTREAM TARGETS OF NKX2-5


Nk гомеодомен в 60 аминокислот, представлен тремя α-спиралями. Nkx2-5 связывается как мономер с ДНК мишеняи, возможно используя спираль распознавания (helix III), которая идет через АТ-богатую большую борозду ДНК связывающего сайта. И Nkx2-1, называемый также thyroid transcription factor, и Nkx2-5 предпочитают последовательности, содержащие 5'TNAAGTG-3', названные NKEs. Однако Nkx2 факторы связываются со слабым сродством и со вторым субнабором последовательностей, содержащих 5'-TTAATT-3' мотив, распознаваемый Нох белками. Тирозин 54, обычно расположенный на внешней поверхности третьей спирали в несвязанном состоянии, становится расположенным так, что осуществляет критический контакт с 5'AAG 3' стрежневой последовательностью сайта связывания, т.к. спираль удлинняется после связывания ДНК. NKEs присутствуют в качестве множественных сайтов в легочном Clara cell-specific (mCC10) белке. Nkx2-1 и Nkx2-5 связываются с одними и теми же NKEs, необходимыми для активности промотора гена mCC10. Учитывая обилие и довольно низкую специфичность NKEs, м. предположить, что тканевая и онтогенетическая специфичность усиливается за счет взаимодействий связанных с ДНК Nkx2 факторов с др. белками.
SREs промотора кардиального α-актина служат и как высокого сродства (SRE2 и SRE3) и как промежуточной силы связывания мишенями (SRE1 и SRE4) для Nkx2-5. Два NKE сайта в проксимальной области промотора атриального натрийуретического фактора (ANF) управляют высокими уровнями активности кардиально-специфического промотора. NKE в ANF состоит из двух, почти-консенсусных NK2 связывающих сайтов, каждый из которых свособен связывать очищенный Nkx2-5. NKE достаточен для обеспечиения кардио-клеточно-специфической активности минимальному ТАТА-содержащему промотору и необхоим для активации ANF промотора с помощью Nkx2-5 в гетерологических клетках. В первичной культуре кардиомиоцитов NKE вносит вклад в актиность промотора ANF камера- и стадио-специфическим образом, указывая тем самым, что Nkx2-5 и/или др. родственные кардиальные белки м. играть роль в спецификации сердечных камер. Пказано, что два NKE промоторных сайта управляют экспрессией D-mef ответ на tinman.
Nkx2-5 служит как среденй степени активаор транскрипции при трансфекции. Делеция С-терминаьного ингибирующего домена Nkx2-5 стимулирует транскрипционную активность более, чем в 50 раз. И ингибирующий домен и высоко заряженный активационный домен Nkx2-5 обогащены аланином и пролином. Это указывает на то, что потенциальные гидрофобные взаимодействия между ингибирудщим и активационным доменами м. блокировать доступ факторам инициации транскрипции к высоко заряженной половинке. Возможно, что взаимодействия с др. ко-акцессорными факторами м. вызывать конформационные изменения Nkx2-5 белка, делая их более эффективными транскрипционными активаторами. Фактически Nkx2-5. по-видимому, не работает в изоляции, а формирует комбинаторные связывающие комплексы с др. транскрипионными факторами, такими как SRF.

INTERACTIONS BETWEEN SRF AND NKX2-5


Временная трансфекция Nkx2-5 и SRF приводит к почти 20-кратной активации промотора кардиального α-актина в фибробластах, тогда как стабильная трансфекция обоих факторов вызывает экспрессию эндогенного гена кардиального α-актина. Показано, что связывание ДНК с множественными SREs является самым характерным признаком Nkx2-5 и что вместе Nkx2-5 и SRF обусловливают сильную активацию промтора α-кардиального актина в 10Т1/2 фибробластах. Максимальная транскрипционная активность нуждается во множественных интактных вышестоящих SREs. Делеционные мутанты, удаляющие 3 из 4 SREs вызывают 70% снижение общей котрансфекционной активности. Проксимальный SRE1 играет, по-видимому, центральную роль в регуляции SRF/Nkx2-5-зависимой активности промотора. Когда Nkx2-5 связывающая активность блокирована точковой мутацией в третьей спирали гомеодомена, SRF все еще способен рекрутировать мутантный Nkx2-5 в промотор кардиального α-актина. Установлено, что Nkx2-5 м. связывать SRF в отсутствие ДНК в виде растворимого белкового комплекса, выделяемого из ядер кардиальных миоцитов. Кроме того, Nkx2-5 и SRF комплексы м. обнаруживаться как ко-ассоциированные связаные комплексы на проксимальном SRE1.
Рекрутирование Nkx2-5 на SRE зависит от SRF ДНК связывающей активности и м.б. блокировано доминантной негативной мутацией SRFpm1, который димеризуется с дикого типа SRF мономером, но не м. сам связаться с ДНК. Кроме того Nkx2-5 и SRF взаимодействуют непосредственно в отсутствие SRE. Короткий в 30 аминокислот пептид (аа142 - аа171), который соответствует basic области SRF в αI спирали MADS box, достаточен, чтобы обеспечить межбелковые контакты с Nkx2-5. N-terminus/helix I и helix II области гомеодомена Nkx2-5 взаимодействуют с MADS box. Важность взаимодействия Nkx2-5 и SRF демонстрируюется в экспреиментах по котрансфекции, в которых они трансактивируют промоторы, состоящие или из SRF или Nkx2-5 связывающих сайтов. Тот факт, что Phox-1/SRF и Nkx2-5/SRF взаимодействия нуждаются в N-терминальной arm/helix 1/helix 2 области гомеодомена позволяет предположить, что N-конец и helix 3 ответственны дла взаимодействие между гомеодоменом и ДНК. Helix 1/2?j-видимоу, обеспечивает межбелковые взаимодействия НОХ генов среди самих себя и с др. белковыми факторами, которые м.б. необходимы для регуляции специфичности их действия как активаторов, коактиваторов или репрессоров.
При соотв. внеклеточных сигналах в бэкграунде HeLa клеток формирование SRF/Phox-1/Elk-1 четвертичного комплекса на с-fos SRE м. трансактивировать с-fos промотор. Напротив Phox-1 и Elk-1 не м. активировать кардиальный α-актиновый промотор. Возможно во время раннего кардиогенезе paired-подобные гомеодоменовые гены, такие как Prx-1/Phox-1/MHox или Prx-2/S8 из непродуктивного ингибирующего комплекса с SRF на SREs α-актиновго промотора. Высокий уровень экспрессии S8 в эндокардиальных подушках коррелирует с областями сердца, которые не экспрессируют Nkx2-5, α-актиновых генов и др. контрактильных генов. Т.о., SRF/MHox комплекс м. служить репрессивной роли, блокируя контрактильную активность в областях сердца, которые будут давать перегородки и клапаны. Возможно Nkx2-5 м. действительно конкурировать посредством своего SRF-интерактивных субдоменов, с Phox-1 для связывания SRF MADS box . Исходом взаимодействия Nkx2-5 и SRF м.б. просто устранение Phox-1 или Elk-1 из комплекса и как результат активация кардиального фактинового промотора в кардиальных миоцитах. Напротив Nkx2-5/SRF комплексы, которые актививруются в нереплицирующихся кардиальных миоцитах м. служить для репрессии с-fos промотора посредством образования непродуктивных комплексов на своем SRE. Соглауется с этой идеей то, что Nkx2-5 блокирует индуцированную сывороткой экспрессию минимального с-fos содержащего SRE промотор.

GATA FACTORS




GATA-4 AND NKX2-5 INTERACTIONS


Nkx2-5 и GATA-4 способны коактивировать ANF промотор путем связывания с их соседними ДНК связывающими сайтами. Связывание и Nkx2-5 и GATA-4 необходимо для синергичной коактивации. Физические и функциональные взаимодействия между Nkx2-5 и GATA-4 вызывают драматическую активацию транскрипции мишеней-промоторов, которые содержат только NKEs. Т.к. эти два фактора коэкспрессируются в прекардиальной мезодерме, то возможно, что взаимодействие их играет существенную роль в регуляции транскрипционной активности вовремя раннего кардиогенеза.
Ко-трансфекция CV1 фибробластов Nkx2-5 и GATA-4 вызывает резкую активацию (в 500 раз выше базового уровня) кардио-специфических промоторов, если использовался промотор с тримерным Nkx связывающим сайтом А20, по сравнению с 15- 20-кратной активацией с кардиальным α-актиновым промотором. Синергичные уровни активауии м.б. умножены при отсутствии ингибирующих последовательностей в А20 минимальном промоторе в противопложность более сложных промоторов кардального α-актина и αMHC. Возможно также, что высокий уровень активации м. просто отражать увеличение сродства Nkx2-5 к А20 сайту по сравнению с примсутствующими NKE сайтами низкого сродства в промторах α-актина и αMHC.
Установлено, что, по крайней мере. гомеобокст Nkx2-5 и второй цинковый палец GATA4 необходимы для эффективной транскрипционной коактивации посредством Nkx2-5 связывающего сайта. Мутанты, содержащие только второй цинковый палец GATA4 и его С-терминальное расширение достаточны для 200-кратной коактивации с Nkx2-5. C др. стороны, N-термиальный активационный домен Nkx2-5 ответственен за большую чать транскрипционной активности. Изолированный гомеодомен все еще способе кооперироваться с GATA4, чтобы вызвать среденей степени активацию в А20(3) сайте. Напротив SRF неспособен синергично активировать тот же самый промотор у укороченных Nkx2-5 мутантов, содержащих только гомеобокс. Различия м.б. связаны с различиями в функции активационных доменов SRF и GATA4? при образовании комплексов с Nkx2-5 гомеодоменом. Подтверждено, что минимальными взаимодействующими доменами являются С-терминальный цирнковый пальчтк GATA4 и гомодомен Nkx2-5.
Показано, что GATA4 м. вызывать конформационные изменения в Nkx2-5, что ведет к негативным ограничениям целостности за счет ингибирующего С-терминального домена Nkx2-5. предолжена модель, согласно которой активация Nkx2-5 осуществляется посредством взаимодействия гомеодомена с GATA4, который затем вызывает изменения в физической упорядоченности (ordering) Nkx2-5. Взаимодействие гомеодомена со вторым цинковым пальцем GATA4 вызывает смещение ингибирующего С-терминального домена Nkx2-5? что ведет к дальнейшему усилению ДНК-связывающей активности и открывает N-терминальный активационный домен. Эффект этого взаимодействия м.б. сходным с влиянием Extradenticle и Pbx1 на ДНК связывающую активность и транскрипционную активность engrailed и Нох белков.
Atrial natriuretic factor(ANF) также активируется синергично с Nkx2-5 и GATA4 посредством их связывания с отдельными ДНК элементами. При этом GATA-5, но не -6 м. замещать GATA-4 во взаимодействии с Nkx2-5.
Биологическое значение GATA/Nkx2-5 взаимодействия выясняется при изучении рыбок данио, показавшего, что кардиогенные поля соответствуют зоне перекрывания большого переднего поля экспрессии GATA-4 и задней области экспрессии Nkx2-5 в латеральной пластинке мезодермы. При этом задняя половина поля Nkx2-5, соседствующая с хордой, не содержит кардиальных предшественников и задние Nkx2-5 экспрессирующие клетки не вносят вклада в образование сердца, даже после устранения обычной кардиогенной области. Клетки, которые м. приобретать судьбу кардиальных клеток после повреждения нормальных предшественников, находятся вблизи прехордальной пластинки, но кпереди от Nkx2-5 экспрессирующего домена, в передней области поля экспрессии GATA-4. Обычно они дают головную мезенхиму. Все это подтверждает предположение о необходимости взаимодействия между GATA-4 и Nkx2-5 для запуска развития сердца.

GATA-4 INTERACTS WITH SRF


N/r/ Nkx2-5 взамиодействует и с GATA-4 и с SRF, то разумно предположить взаимодействие и между SRF и GATA-4. И действительно, в экспреиментах по ко-трансфекции было показано, что SRF и GATA-4 значительно усиливают транскрипцию мышце-специфических и посемемстных SRE-зависимых промоторов. Два транскрипционных домена были картированы на N-конце GATA-4. они эффектыивны, если слиты с гетерологическим ДНК связывающим доменом. С-конец также необходим для транскрипционной активации GATA-4. Однако, этот домен транскрипционно инертен по отношению к гетерологическому ДНК связывающему домену, указывая на его непрямое участие. становлено, что SRF, который связывает СВР/р300, м. облегчать доступ GATA-4 к трансацетилирующим активностям путем взаимодействия с и изменения конформации GATA-4.
Делеция N-терминальных активационных доменов GATA-4 между аа1-аа74 и между аа130 и аа177 не влияет на способность GATA-4 коактивировать с SRF, указывая тем самым, что активационный домен SRF м. компенсировать отсутсвие активационных доменов у GATA-4. Делеция второго N-терминального активационного домена и первого цинкового пальчика GATA-4 увеличивает способность GATA-4 синергично взаимодействовать с SRF, указывая на то, что эти домены участвуют во взаимодействии SRF и GATA-4. Это взаимодействие м.б. обеспечено за счет связывания др. белков с этими доменами GATA-4, которые м. предотвращать эффективное взаимодействие SRF со вторым цинковым пальцем GATA-4. Коактиваторные белки со множественными цинковыми пальчиками, такие как FOG-1 и FOG-2 модулируют транскрипционную активность GATA-1 и GATA-4 за счет взаимодействия с первым цинковым пальчиком. Сходным образом GATA белок у дрозофйилы, pannier, взаимодействует с белком с цинковым пальчикоа, называемым U-shaped (Ush), который негативно регулирует транскрипционную активность pannier в направлении экспрессии пронейральных основных HLH белков, achete и scute.
C-терминальные активационные домены SRF и GATA-4 необходимы для ко-активации кардиального α-актинового промотора, т.к. делеция С-терминального активационного домена SRF или GATA-4 устраняет ко-активацию. Коактивация α-актинового промотора с помощью SRF и GATA-4 обеспечивается посредством SRE1. Коактивация кардиального α-актинового промотора сильно зависит от от связывания SRF с SRE1. Коактивация, по-видимому, не зависит GATA-4 связывания ДНК. Т.к. GATA факторы, как известно, связываются с дивергентными GATA сайтами, то анализировали потенциал GATA сайтов в промоторе кардиального α-актина, чтобы исключить прямое связывание ДНК GATA-4 в контексте целой плазмиды. Ни один из этих сатов не связывается GATA-4. SRE1 скелетного α-актина, клонированый выше с-fos минимального промотора, оказался достаточным для обеспечения синергичной активации с помощью SRF и GATA-4. Все это демонстрирует отсутствие функцональных скрытых GATA сайтов в люциферазном векторе и демонстрирует, что GATA-4 рекрутируется на кардиальный α-актиновый промотор с помощью SRF независимо от GATA-4 связывания ДНК. Это подтверждается способостью GATA-1 активировать транскрипцию независимо от связывания ДНК.
Активация транскрипции генов, зависящих от GATA связывающего сайта, таких как cTnC, ANF, BNP и тропонин I, нуждается в N-терминальных активационных доменах GATA-4. GATA-5 и GATA-6 обнаруживают существенную гомологию в N-терминальных активационных доменах, и они способны активировать эти гены и замещать GATA-4. Интересно. что GATA сайт-независимая коактивация NKE-управляемого репортернго гена с помощью Nkx2-5 и GATA-4, не зависит от N- и С-терминальных активационных доменов GATA-4. Напротив, синергичная активация промотора ANF, который содержит связывающие сайты для GATA-4 и Nkx2-5, с помощью комбинации GATA-4 и Nkx2-5 нуждается и N- и в С-терминальных активационных доменах GATA-4. однако, С-терминальный активационный домен GATA-4 важен для коактивации промотора ФТА с помощью GATA-4 и -6. Эти результаты указывают на то. что дифференциальная утилизация GATA-4 активационных доменов м. зависеть от содержимого промотора и др. интерактивных белков. В пользу этой гипотезы говорит то, что транскрипционная активность GATA-1 и -4 зависит и от промотора-мишени и от их взаимодействия с кофакторами FOG-1 и FOG-2.
GATA-4 синергично активирует различные мышце-специфические промоторы, которые экспрессируются в дифференцированных типах мышц. GATA-5 и -6, которые имеют собственные, но перекрывающиеся паттерны экспрессии с GATA-4, способны взаимодействовать с SRF и замещать GATA-4 в экспериментах коактивации.Это указывает на то, что спаривание SRF с разными GATA факторами м. обеспечивать специфичность мышечных субтипов (таких как кардиальный-скелетный-гладкомышечный).Дополнительная степень специфичности мышесных субтипов м. обеспечиваться взаимодействием SRF-GATA-комплекса с ткане-специфическими факторами, такими как Nkx2-5 и MyoD. Установлено, что кардиальный ткане-специфический гомеобелок, Nkx2-5, комбинаторно взаимодействует с SRF и GATA-4, чтобы строго активировать промотор α-актина. Помимо кардиального и гладкомышечного промоторов, скелетный α-актиновый промотор и повсеместный с-fos промотор, которые обычно активированы во время кардиальной гипертрофии, также коактивируются с помощью SRF и GATA-4.
Взаимодействие между SRF и GATA-4 нуждается в законсервированных ДНК связывающих доменах в обоих белках. Минимально необходимыми являются С-терминальный цинковый пальчик GATA-4 и область аа142-171 (N-терминальная половина спирали 1) MADS box. Эта область SRF также минимально необхоима для взаимодействия с Nkx2-5 и включает N-терминалное расширение MADS box, которое закручивается вокруг ДНК и взаимодействует с минорной бороздой SRE.
SRF увеличивает скорость сборки преиниационных комплексов в промоторах-мишенях, частично путем взаимодействия с Rap74 субъединицей TFIIF. Пока моло что известно, как GATA-4 активирует транскрипцию . Предполагается, что SRF и GATA-4 взаимодействие взывает увеличение транскрипционной активности, это связано со способностью SRF рекрутировать кофактор и протеин ацетилазу СВР/р300 и SRC-1. GATA-1 также связывает СВР/р300 и подвергается конформационным изменениям после ацетилировния с помощью СВР и р300, что коррелирует с его активацией. Возможно, что синергичная активация происходит в результате кооперативного рекрутирования голоэнзима с помощью SRF( через TFIIF) и СВР/р300 с помощью SRF-GATA-4 комплекса.
Известно. что GATA белки взаимодействуют со многими транскрипционными факторами, но впервые продеменстирировано взаимодействие GATA белка с MADS белка. MEF-2C, член семейства MADS box, активирует экспрессию некоторых мышце-специфических генов или непосредственно за счет свфзывания с регуляторными областями генов-мишеней или косвенно за счет взаимодействия с др.мышце-специфическими факторами, такими как MyoD и Myogenin. Взаимное рекрутирование SRF и GATA-4 в промоторы независимо от связывания ДНК или SRF или GATA-4, аналогично перекрестному рекрутированию SRF или MEF-2C и миогенных bHLH белков.


Сайт создан в системе uCoz