Перенос информации между двумя половинами ЦНС осущестявляется посредством комиссур, образуемых нейронами, которые проецируют аксоны поперек срединной линии. Др. нейроны вытягиваяют свои аксоны, которые никогда не пересекают срединной линии; они проецируются на своей собственной (ipsilateral) стороне ЦНС. Специализированные клетки срединной линии играют критическую роль в регуляции наведения как пересекающих, так и не пересекающих аксонов в вентральной части срединной линии развивающегося спинного мозга у позвоночных и в вентральном нервном тяже у Drosophila. Напр., эти клетки секретируют аттрактивные сигналы, которые ведут комиссуральные аксоны на длинные расстояния к срединной линии ЦНС. Более того, коротко-действующие взаимодействия между сигналами наведения присутствуют на поверхности клеток срединной линии, а их рецепторы экспрессируются на поврехности ищущих путь аксонов, что позволяет комиссуральным аксонам пересекать срединную линию только один раз и препятствует ипсилатерально экспрессирующимся аксонам подходить к срединной линии. Молекулярный состав поверхности комиссуральных аксонов динамически меняется, когда они пересекают срединную линию. Такие аксоны становятся чувствительными к отталкивающим (repulsive) сигналам ведения срединной линии, которые они до этого игнорировали, находясь на ипсилатеральной стороне от срединной линии. Одновременно с этим комиссуральные аксоны теряют чувствительность к аттрактивным сигналам , которые первоначально привлекали их к срединной линии. Т.о., эта система ведения препятствует задержке комиссуральных аксонов в пределах срединной линии и позволяет им проникать на контралатеральную сторону ЦНС. Известно, что рецепторы являются modular; эктодомены предопределяют распознавание лиганда, а цитоплазматические домены специфицируют реакцию аксона на данный сигнал наведения.
(Рис.1.) | Axon trajectories in the
vicinity of the midline. A: Schematic three-dimensional
representation of commissural axon trajectories in the developing
vertebrate spinal cord. Commissural neurons located in dorsal regions of
the spinal cord project axons along a circumferential/transverse path to
the ventral midline/floor plate. After crossing the ventral midline, these
axons turn at right angles to project in the longitudinal direction
alongside the floor plate. Ipsilateral refers to the side of the
midline from which these axons arise and contralateral refers to
the side of the midline to which these axons project. B: Schematic
"open-book" representation of commissural axon
trajectories in the spinal cord. In this view, the floor plate occupies
the midline and the roof plate occupies the lateral edges. Commissural
axons extend in the transverse plane towards (1), into (2), and across the
floor plate (3), and subsequently turn rostrally into the longitudinal
plane (4). Axons emanating from only one side of the dorsolateral spinal
cord are depicted in A and B. C: In the Drosophila ventral
nerve cord, commissural neurons (c) extend axons across the midline
through either the anterior commissure (AC) or the posterior commissure
(PC). After crossing through the midline, these axons turn orthogonally
and project parallel to the midline within longitudinally-oriented tracts
or longitudinal connectives. Ipsilaterally-projecting neurons (i) extend
axons in the longitudinal direction parallel to the midline and never
cross the midline. Specialized midline cells separate the right and left
sides of the nerve cord.
(Рис.2.) | Structures of selected
midline-/commissural axon-associated proteins. The reader is directed to
Table 1 for the localization of these proteins in the developing CNS, as well as
for their functional role(s) in midline guidance.
(Рис.3.) | Distribution of selected
midline- or commissural neuron/axon-associated molecules in the developing
vertebrate spinal cord and Drosophila ventral nerve cord. A:
Open-book view of the vertebrate spinal cord emphasizing the axon-segment
specific expression of several cell surface receptors. Strikingly, TAG-1
is expressed on only those segments of commissural axons (red) that are
extending to the floor plate, NrCAM is expressed at high levels on only
those portions of commissural axons (black bar) that are contained within
the floor plate, while the expression of L1 and EphB1 is restricted to
crossed segments of commissural axons (black). In contrast, Axonin-1, DCC,
NgCAM, Neuropilin-2, and GAD65 are expressed along the entire length of
commissural axons. The expression of Robo proteins on these axons has not
yet been reported. Roof plate cells express BMP6, BMP7, Gdf7, B-class
ephrins, VEMA, Neuropilin-2, Slits, and AnnexinIV. Commissural neurons or
their progenitors express the transcription factors MATH1, NGN1, Dbx1,
PAX-3, PAX-7, LH2A, LH2B, and Lim1. Floor plate cells express netrins,
NrCAM, Slits, B-class ephrins, F-spondin, Gli2, VEMA, AnnexinIV,
Neuropilin-2, and BMP-6. B: In the Drosophila ventral nerve
cord, Derailed is expressed on only those segments of commissural axons
(blue) passing through the midline via the anterior commissure (AC), while
significant levels of Robos, Dek, DPTP10D, and DLAR are detected on only
those axons (commissural and ipsilateral) projecting within the
longitudinal tracts (red). High levels of Frazzled are expressed on axons
extending through the AC (blue) and PC (green), as well as those traveling
within the longitudinal tracts. Midline cells express Netrins, Slit, and
Commissureless. See text for relevant references and Table 1
for abbreviations.
(Рис.4.) | Most commissural axons
aberrantly accumulate at the ventral midline, adjacent to a low level of
ventricular zone-associated Netrin-1 expression, in Gli2 homozygous
mutant mouse embryos. Cross-sectional schematic views depicting the
developing spinal cord of wild-type and Gli2-/- mutant
mice. In both views, commissural axons are red and Netrin1
expression is represented by purple shading. Left: In wild-type
embryos, dorsal and ventral classes of commissural axons are guided to the
floor plate (FP). The combined expression of Netrin1 in the FP and
the ventricular zone (vz) presumably gives rise to a ventral
(high)-to-dorsal (low) Netrin 1 protein gradient (plus marks). Commissural
axons appropriately turn (yellow arrows) into the longitudinal plane after
crossing through the floor plate. Right: In Gli2 homozygous
mutant embryos, a gradient of Netrin1 expression established exclusively
by cells of the vz is sufficient to guide commissural axons to the ventral
midline. Upon reaching the ventral midline, most commissural axons cluster
within, and remain confined to, the position formerly occupied by the
floor plate, where they exhibit disorganized projections (red and yellow
lines). Reprinted with permission
from Matise MP, Lustig M, Sakurai T, Grumet M, Joyner AL.
Ventral midline cells are required for the local control of commissural
axon guidance in the mouse spinal cord. Development 126:3649-3659.
Copyright 1999 The Company of Biologists Limited.
(Рис.5.) | Most commissural axons fail
to reach the floor plate in Netrin-1 homozygous mutant mouse
embryos. Transverse sections of wild-type and Netrin-1 homozygous
mutant spinal cords labeled with an antibody against TAG-1. Left:
In wild-type embryos, TAG-1-positive commissural axons (C axon) grow in a
directed manner to the floor plate. Right: In mutant embryos, C
axon growth within the spinal cord is disorganized and many commissural
axons fail to reach the floor plate. Reprinted from Cell, 87, Serafini T, Colamarino, SA,
Leonardo ED, Wang H, Beddington R, Skarnes WC, Tessier-Lavigne M, Netrin-1
is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate
nervous system, 1001-1014.
(Рис.6.) | Commissural axons lose
responsiveness to chemoattractants after crossing through the floor plate.
A and C: Schematic diagrams depicting two different manipulations
performed on open-book explants of E13 rat hindbrain. B and D: Fluorescent
micrographs representing the behavior of DiI labeled commissural axons in
the experimentally-manipulated explants depicted in A and C, respectively,
that were cultured for 2 days. A: A portion of the ventral spinal
cord including the floor plate (hatched region in top diagram) was removed
from an open-book explant of the developing hindbrain and the remaining
pieces of the explant were abutted (bottom diagram). B: DiI-labeled
commissural axons that enter the contralateral side of the midline without
encountering a floor plate are attracted to an ectopic floor plate explant
(eFP). Asterisks indicate DiI injection sites. C: A portion of the
ventral spinal cord excluding the floor plate was removed from an
open-book explant of the developing hindbrain (hatched region in top
diagram) and the remaining pieces of the explant were juxtaposed (bottom
diagram). D: DiI-labeled commissural axons that cross through the
floor plate (FP) grow strictly in the transverse direction on the
contralateral side of the midline and are not attracted to an eFP. Scale
bar = 250 μm. Reprinted with permission from
Shirasaki R, Katsumata R, Murakami F.
Change in chemoattractant responsiveness of developing axons at an
intermediate target. Science 279: 105-107.
(Рис.7.) | Schematic representations of
midline guidance phenotypes observed in the developing ventral nerve cord
of several Drosophila mutants. The wild-type ventral nerve cord
consists of longitudinal connectives on either side of the midline
separated by a pair of commissures (the AC and PC) in each segment. In
comm LOF and robo GOF++ mutants, no axons cross the midline as
indicated by the absence of the AC and PC in each segment. In robo
LOF and comm GOF+ mutants, many axons inappropriately cross and
recross the midline. This is reflected by the appearance of thick
commissures and thin longitudinal connectives. In slit LOF and
comm GOF+++ mutants, there exists a single longitudinal tract at
the midline. LOF refers to loss-of-function and GOF refers to
gain-of-function. The number of plus signs following GOF indicates the
relative dosage of the overexpressed transgene.
(Рис.8.) | Midline crossing defects in
DPTP10D DPTP69D double mutant Drosophila embryos. Lineage
tracing was performed by using DiI to label all the progeny of identified
neuroblasts (NBs) in the Drosophila ventral nerve cord. Individual
neuroectodermal cells were labeled at stage 8 and the embryos were allowed
to develop until stage 17. DiI-labeled NBs arising from the injected cells
were then identified based on their positions, and the cell bodies and
axons of the NB progeny were visualized by confocal microscopy. Each large
panel consists of a confocal z-series on the left and a diagram of the
clone in relation to morphological landmarks on the right (the ventral
nerve cord is depicted on the left side and the body wall musculature is
represented on the right side). The NB 2-5 lineage generates 15-22 cells
by stage 17, of which 8-16 are intersegmental interneurons. Top: In
wild-type embryos, 4-8 intersegmental interneurons from the NB 2-5 lineage
extend axons anteriorly toward the brain on both the contralateral (for up
to 10 segments) and ipsilateral (for up to about 5 segments) sides of the
midline, and a single motorneuron from this lineage projects an axon via
the ISNd that innervates muscles 15-17. Bottom: In DPTP10D
DPTP69D double mutant embryos, contralateral interneurons cross the
midline and project anteriorly as in wild-type embryos. Strikingly,
however, after traveling for only about 2 segments, these axons recross
the midline and project posteriorly within the ipsilateral longitudinal
connective. Ipsilateral interneurons grow anteriorly for only a short
distance and then stop without crossing segmental boundaries. The
motorneuron fails to exit the CNS. Reprinted with permission from Sun Q, Bahir S, Schmid A, Chia W,
Zinn K.
Receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance across the midline
of the Drosophila embryo. Development 127:801-812.
(Рис.9.) | Anterior commissure-specific
expression of Drl in the embryonic Drosophila ventral nerve cord.
a: In a wild-type embryonic ventral nerve cord, anti-HRP labels all
axons contained within the AC and the PC, as well as those traveling
within the longitudinal connectives. b: Anti-Drl selectively labels
those axons contained within the AC. c: Merge of the images
presented in a and b.Reprinted
with permission from Nature, Bonkowsky JL, Yoshikawa S, O'Keefe DD,
Scully AL, Thomas JB.
Axon routing across the midline controlled by the Drosophila Derailed
receptor. 402:540-544.
ORIGINAL RESEARCH PAPER Hutson, L. D. & Chien, C.-B. Pathfinding and error correction by retinal axons: the role of astray/robo2. Neuron33, 205-217 (2002) | | |
Plump, A. S. et al. Slit1 and Slit2 cooperate to prevent premature midline crossing of retinal axons in the mouse visual system. Neuron33, 219-232 (2002) | |
Bagri, A. et al. Slit proteins prevent midline crossing and determine the dorsoventral position of major axonal pathways in the mammalian forebrain. Neuron33, 233-248 (2002) | | FURTHER READING Richards, L. J. Surrounded by Slit -- how forebrain commissural axons can be led astray. Neuron33, 153-155 (2002) | |
Рецепторы Roundabout () и их лиганд участвуют в ведении аксонов в развивающейся нервной системеDrosophila. Помимо предохранения ростовых конусов от повторного пересечения срединной линии в обратном направлении, эти молекулы контролируют также насколько далеко аксоны отталкиваются от срединной линии после ее пересечения. Гомологи Slit и Robo идентифицированы в исследованиях in vitro у позвоночных, которые показали, что они контролируют отталкивание аксонов и ветвление.
Hutson и Chien изучали роль гомолога Robo2, Astray, в ведении аксонов в зрительном перекресте рыбок данио. Они установили, что Astray необходим как для предупреждения ошибок в пересечении срединной линии, так и для коррекции, если они все-таки случаются. Даже на генетическом фоне bel мутации, когда аксоны резко поворачивают обратно перед достижением хиазмы и проецируются ипсилатерально, аксоны направляются неправильно, если ген Astray инактивирован. Итак, в отличие от Robos у Drosophila , Astray действует на обеих сторонах срединной линии.
Plump et al. показали, что ; двойные нокаутные мыши образуют эктопическую зрительную хиазму впереди от настоящей хиазмы. Slit1 и Slit2 экспрессируются в комплементарных доменах, которые служат путями, выбранными аксонами retinal ganglion cell (RGC) в вентральном диэнцефалоне, так что они м. служить каналами для RGC аксонов, для нахождения ими правильной точки пересечения путем создания коридора с отталкивающими 'стенками'. Когда ростовые конусы приближаются лишком близко к доменам экспрессии Slit, то они отталкиваются обратно на свой путь. Интересно, что эктопическая хиазма всегда образуется в одном и том же положении у Slit1;Slit2 мутантов, указывая, что и др. сигналы также участвуют в ограничении движения аксонов RGC.
Bagri et al. установили, что белки Slit важны также для ведения аксонов и в др. проекциях переднего мозга, включая corticofugal, cortico-cortical (callosal) и thalamocortical тракты. Одиночные Slit1 мутантные мыши не обнаруживают видимых дефектов в ведении аксонов, но у Slit2 мутантов, некоторые аксоны в этих трактах обнаруживают аномалии перемещения в вентральных путях. у Slit1;Slit2 мутантов фенотип еще более тяжелый, некоторые ростовые конусы поворачивают в направлении срединной линии. Это указывает на то, что одной из функций белков Slit является поддержание дорсальных траекторий для определенных проекций в передний мозг. Эффект не распространяется на проекции, возникающие в переднем мозге — 5-hydroxytryptaminergic проекции от raphe nuclei и dopaminergic проекции от substantia nigra/ventral tegmental области, где также наблюдается неправильное ведение аксонов у Slit2 и Slit1;Slit2 мутантов. Установлено, что Slits действуют через рецепторы Robo в переднем мозге, т.к. и экспрессируются в кортикальной пластинке и дорсальном талямусе в то время. когда эти проекции исходят из этих регионов.
Эти результаты указывают на то, что функции Slits и Robos в отталкивании аксонов законсервированы в ходе эволюции. Существует одно ключевое отличие между мухами и позвоночными, это то, что у позвоночных изученные аксоны, связаны с Slit и Robo по всему ходу их путешествия, тогда как у Drosophila Slit/Robo взаимодействия используются только однажды, когда ростовые конусы пересекают срединную линию. Предварительные исследования in vitro показали, что спинальные комиссуральные аксоны у позвоночных, подобно своим аналогам у Drosophila меняют свою чувствительность к Slits в ответ на пересечение срединной линии. Тройные мутанты Slit1, -2 и -3 необходимы, чтобы определить, верно ли это и для in vivo.
У позвоночных и беспозвоночных ведущий край аксона, т. наз. "growth cone", перемещается на значительные расстояния с высочайшей точностью. Ростовой конус ведет аксон, действуя как совершенный сенсор, который воспринимает и соответственно отвечает на различные средовые сигналы наведения. Эти сигналы существуют или в диффузионной форме или в формах, ассоциированных с поверхностью клеток и отвечают, соответственно, за нахождение путей на длинное и короткое расстояние. Рецепторы клеточной поверхности, располагающиеся на ростовых конусах и ассоциированных с ними аксонах, интерпретируют эти сигналы как позитивные/аттрактивные или негативные/репульсивные силы. Т.о., дальнодействующие репульсивные наводящие сигналы, обозначаемые как хемореплелленты (chemorepellents), скорее всего заставляют ростовые конусы "отодвигаться " от препятствия, тогда как дально-действующие аттрактивные сигналы (chemoattractants) должны "притягивать" аксоны на большом расстоянии. С др. стороны, контакт-зависимые аттрактивные и репульсивные сигналы контролируют направленность роста аксонов на коротких расстояниях. Совместно, все четыре силы наведения формируют полностью траекторию пути данного аксона.
Сложные траектории аксонов м.б. подразделены на серии коротких сегментов. Встает вопрос, как аксоны перемещаются на этих последовательных участках. Т.наз. "промежуточные мишени" или "точки выбора" маркируют конец одного сегмента и начало следующего. Большинство промежуточных мишеней представляет собой небольшие группы специализированных указательных (guidepost) клеток, которые предоставляют ростовым конусам информацию, необходимую для направления перемещения аксона водль следующего сегмента его траекотории. В соответствии с их ролью, наблюдаются резкие изменения в морфологии ростовых конусов и направлении аксонального роста, когда аксон перемещается в непосредственной близости к (или, в некоторых случаях, после непосредственного контакта с ними) промежуточным мишеням. Более того нахождение аксонами пути тяжело нарушается в отсутствие этих промежуточных мишеней.
Срединная линия развивающейся нервной системой является важной точкой выбора для аксонов. Большинство аксонов проходит значительные расстояния в направлении срединной линии и достигнув должен решить пересекать ее или нет. Кроме того ростовые конусы/аксоны д. решить расти далее в ростральном или каудальном направлении параллельно срединной линии. (Рис. 1). Оба класса аксонов ограждены от срединной линии, когда начинают расти в продольном направлении. Собственно ведение аксонов в этой области обеспечивается способностью ростовых конусов правильно интегрировать разнообразные внеклеточные сигналы наведения.
Представляем результаты недавних исследований по идентификации различных эволюционно законсервированных сигналов наведения и их рецепторов (Табл. 1; Рис. 2, 3).
Table 1. Selected Midline- or Commissural
Neuron/Axon-Associated Moleculesa
Name
Organism
Localization
Role in midline guidance
Netrin-1
Rat, mouse, chick
Floor plate (mRNA and protein)
Required for commissural axon guidance to
the floor plate
Required for commissural axon guidance to
the floor plate
Frazzled
Fly
Commissural and longitudinal axon tracts
(protein)
Required for proper formation of
commissural and longitudinal axon tracts
UNC-40
Nematode
Sensory and motor neurons/axons that
project toward the ventral midline (protein)
Required for ventrally-directed guidance
of axons that orient toward sources of UNC-6
UNC5H1 UNC5H2 UNC5H3/RCM
Rat, mouse
Differentiating neurons in the ventral
spinal cord (mRNA)
Unknown
UNC5H3/RCM
UNC-5
Nematode
Sensory and motor axons that project away
from the ventral midline (protein)
Required for dorsally-directed guidance of
axons that orient away from sources of UNC-6
TAG-1
Rat, mouse
Commissural neurons (mRNA), uncrossed
segments of commissural axons (protein)
Unknown
Axonin-1
Chick
Commissural axons (protein)
Injection of anti- or soluble Axonin-1
into chick embryos prevents many commissural axons from
entering the floor plate
NrCAM
Mouse, chick
Concentrated in floor plate and ventral
commissure (protein)
Injection of anti-NrCAM into chick embryos
prevents many commissural axons from entering the floor
plate
L1
Rat, mouse
Commissural neurons (mRNA), crossed
segments of commissural axons (protein)
Unknown
NgCAM
Chick
Commissural axons (protein)
Injection of anti-NgCAM into chick embryos
promotes defasciculation of commissural axons; injection of both
anti-NgCAM and anti-NrCAM blocks extension of commissural axons
along the longitudinal axis
dRobo-1, dRobo-2, dRobo-3
Fly
High levels on longitudinal axon tracts
and ipsilaterally-projecting axons, low levels on commissural axon
tracts (protein)
Repulsive guidance receptors that function
as gatekeepers to prevent ipsilaterally-projecting axons from
crossing, and commissural axons from recrossing, the midline
rRobo-1, rRobo-2
Rat
Commissural neurons (mRNA)
Unknown
Sax-3
Nematode
Interneurons and motor neurons/axons that
project to the ventral midline (protein)
Component of a repellent guidance system
that regulates midline crossing of a variety of axonal
populations
dSlit
Fly
Midline glia (mRNA), midline glia and
commissural axons (protein)
Midline repellent that prevents
ipsilaterally-projecting axons from crossing, and crossed
commissural axons from recrossing, the midline
rSlit-1, rSlit-2, rSlit-3
Rat, chick
Floor plate, roof plate (mRNA)
rSlit-2 selectively repels commissural
axons which have passed through the floor plate in vitro
Commissureless
Fly
Midline cells (mRNA), midline cells and
commissural axons (protein)
Required for commissural axons to cross
the midline
Nidogen
Nematode
Body wall basement membranes (protein)
Required for axons to switch from
circumferential to longitudinal migration; regulates positioning of
longitudinal nerves
VEMA
Rat
Floor plate, roof plate (mRNA and
protein)
Unknown
DPTP10D
Fly
High levels on longitudinal axon tracts,
low levels on commissural axon tracts (protein)
In double mutants lacking both DPTP10D and
DPTP69D many longitudinal axons abnormally cross the midline
DPTP69D
Fly
Commissural and longitudinal axon tracts
(protein)
See DPTP10D
DLAR
Fly
High levels on longitudinal axon tracts,
low levels on commissural axon tracts (protein)
Unknown
Derailed
Fly
Axon segments contained within the
anterior commissure (protein)
Controls commissure choice displayed by
midline-crossing axons
B-class ephrins
Mouse
Floor plate, roof plate (mRNA and
protein)
Promote the collapse of EphB1-bearing
commissural growth cones, in vitro
EphB1
Mouse
Commissural neurons (mRNA) crossed
segments of commissural axons (protein)
Unknown (see B-class ephrins)
Dek
Fly
High levels on longitudinal axon tracts,
low levels on commissural axon tracts (protein)
Unknown
Neuropilin-2
Mouse
Floor plate, roof plate, commissural
neurons (mRNA and protein)
Required for normal commissural axon
pathfinding during and after midline crossing
Semaphorin-3B
Mouse
Floor plate (mRNA)
Selectively repels commissural axons which
have passed through the floor plate in vitro
Soluble F-Spondin injected into chick
embryos prevents many commissural axons from crossing through
the floor plate
GAD-65
Rat
Commissural axons (protein)
Unknown
Annexin IV
Mouse
Floor plate, roof plate (protein)
Unknown
BMP-7
Rat, mouse
Roof plate (mRNA)
Diffusible repellent for commissural axons
that induces the collapse of their growth cones in vitro
BMP-6
Rat, mouse
Roof plate and floor plate (mRNA)
Weak diffusible repellent for commissural
axon in vitro
Gdf-7
Rat, mouse
Roof plate (mRNA)
Unknown
UNC-129
Nematode
Dorsal body wall muscles (protein)
Required to guide motor axons along
dorsoventral axis
Gli2
Mouse
Ventral and intermediate regions of the
spinal cord (mRNA)
Required for induction of the floor plate
and immediately adjacent interneurons
Math1 Ngn1
Mouse
Commissural neurons (mRNA and protein)
Unknown; expression defines progenitors of
dorsal commissural neurons
Dbx1
Mouse
Commissural neurons (mRNA and protein)
Unknown; expression defines both ventral
and dorsal commissural neuron populations
Pax-3 Pax-7
Mouse
Commissural neurons (mRNA and protein)
In double mutants lacking both Pax-3 and
Pax-7 the ventral commissure underlying the floor plate is greatly
reduced
Lim 1 LH2A LH2B
Mouse
Commissural neurons (mRNA and protein)
Unknown; expression defines subpopulations
of dorsal commissural neurons
LH2B
a The
role (or proposed role) of these proteins in midline guidance is discussed
in the text. Fly refers to Drosophila and nematode refers to C.
elegans. Abbreviations: UNC, uncoordinated; DCC, deleted in colorectal
cancer; TAG-1, transiently expressed axonal surface glycoprotein-1; NgCAM,
neuron-glia cell adhesion molecule; NrCAM, NgCAM-related CAM; Robo,
roundabout; Sax, sensory axon defect; VEMA, VEntral Midline Antigen; DPTP,
Drosophila protein tyrosine phosphatase; Dek, Drosophila Eph
kinase; GAD-65, glutamic acid decarboxylase (65 kD isoform); BMP, bone
morphogenetic protein; Gdf-7, BMP family member; Math 1, Mammalian atonal
homolog 1; Ngn 1, Neurogenin 1; Dbx 1, developing brain homeobox 1; Pax,
paired-box-containing gene; Lim1, LH2A and LH2B, Lim
homeodomain-containing genes. The reader is referred to the text for
relevant references.
В развивающейся ЦНС многочисленные промежуточные нейроны (interneurons) (нейроны, которые соединяются с др. нейронами) проецируют аксоны вдоль траекторий, которые или перпендикулярны или параллельны срединной линии. Комиссуральные interneurons у позвоночных локализуются в дорсолатеральных частях обеих сторон синного мозга, их аксоны проецируются вдоль окружностных (circumferentia) путей по направлению к донной пластинке, это небольшие группы специализированных цилиндрических эпендимных клеток, которые пронизывают толщь спинного мозга в вентральной части срединной линии. Самые ранние комиссуральные проекции "pioneer", идут вдоль латеральных краев спинного мозга, пока не достигнут донной пластинки. Более поздние проекции ("follower"аксоны) первоначально идут вдоль тех же самых путей. Однако, эти аксоны отворачиватт от латеральных краев спинного мозга после достижения позиции, занимаемой развиваюдщимися моторными нейронами и затем следуют более прямыми вентромедиальными маршрутами к донной пластинке. После достижения срединной линии комиссуральные аксоны пересекают наиболее вентральну треть донной пластинки. На контралатеральном крае донной пластинки большинство из этих аксонов поворачивает ортогонально и растет, по крайней мере на короткое расстояние (~ 100 μm;), внутри продольно ориентированных вентральнух фуникул (funiculus (пучков аксонов)). Пересекшие комиссуральные аксоны распространяются исключительно в ростральном направлении у грызунов и в обоих направлениях у эмбрионов кур. Комиссуральные аксоны, по-видимому, игнорируют сигналы наведения, расположенные на ипислатеральной стороне спинного мозга, они отвечают на сигналы контралатеральной стороны, т.к. они никогда не обнаруживают рост в продольных плоскостях перед пересечением срединной линии.
Вторая рано развивашаяся популяция дорсо-латерально расположенных спинальных нейронов, известная как ассационные интернейроны, также первоначально распространяет аксоны вдоль circumferential/transverse путей в направлении донной пластинки. Однако, эти аксоны осуществляют поворот под прямым углом и распространяются параллельно донной пластинке вдоль ипсилатерально проецирующихся фуникул прежде, чем они достигнут срединной линии. Наиболее вентрально расположенные, ипсилатрально проецирующиеся интернейроны обнаружены в спинном мозге эмбрионов кур и мышей. Так, Primitive Longitudinal (PL) нейроны развиваются в области, расположенной между донной пластинкой и двигательными нейронами у ранних эмбрионов кур. Эти уникальные нейроны распространяют аксоны, которые являются первыми на ипсилатеральных продольно-направленных путях внутри вентральных фуникул до достижения комиссуральных аксонов. В развивающемся спинном мозге мышей паттерны экспрессии некоторых трнаскрипционных факторов определяю локализацию специфических популяций интернейронов.
Так, охарактеризована небольшая популяция интернейронов, которая экспрессирует гомеодомен-содержащий белок EN-1. У трансгенных мышей, экспрессирующих tau-β-galactosidase под контролем EN1 регуляторных последовательностей, EN-1-позитивные аксоны обнаруживались первыми в ипсилатеральных проекциях вентральной части спинного мозга. В отличие от PL клеток кур, эти аксоны первоначально распространялись в вентральном направлени и прежде чем повернуть рострально на короткое расстояние в развивающихся вентролатеральных фуникулах.
Формирование паттерна аксонов в вентральном нервном тяже Drosophila имеет некоторое сходство с позвоночными. Большинство нейронов, находящихся в вентральном нервном тяже являюися интернейронами, которе первоначально распространяют свои аксоны в направлении срединнрйо линии. Внутри каждого нейромера или сегмента вентрального нервного тяжа (нервный тяж представлен 15 довольно сходными сегментами) большинство из этих нейронов (напр., RP1, SP1) проецируют аксоны поперек срединной линии. Однако, в отличие от позвоночных, комиссуральные аксоны мух пересекают срединную линию или через передние или задние комиссуры (AC или PC). Эти поперечно ориентированные тракты волокон соединяют две стороны WYC и занимают разные рострально-каудальные положения внутри данного нейромера.(Рис. 1C). После пересечения срединной линии комиссуральные аксоны поворачивают ортогонально и проецируются в продольных пучках(connectives).Эти продольно ориентированные пучки волокон располагаются симметрично по сторонам от срединной линии и идут по всей длине ЦНС (Рис. 1C). Комиссуральные аксоны у Drosophila также никогда не персекают повторно срединной линии. Продольные пучки помимо пересекших аксонов содержат ипсилатерально проецирующиеся аксоны от идентифицируемых нейронов (напр., pCC, vMP2) (Рис.1C). Траектории этих аксонов напоминают те, которые встречаются у позвоночных. Совместно большие количества
contralaterally- и ipsilaterally-проецирующихся аксонов создают
бросающиеся в глаза ортогональные расположения аксонов, которые представляют вентральный нервный тяж у Drosophila (Рис.1C).
Известно, что донная пластинка является критическим источником информации klkz ведения комиссуральных аксонов. У Danforth's Short-tail (Sd) мутантов мыши комиссуральные аксоны собственно идут к срединной линии в каудальных сегментах спинного мозга, в которых отсутствует донная пластинка. Однако, эти аксоны или неспособны пересекать срединную линию или пересекают ее, но неспособны сворачивать в продольную плоскость. Sd мыши с отсутствием хорды и обладают дефектами дифференцировки двигательных нейроновa.
Точность нахождения пути комиссуральными аксонами оценивалась в спинном мозге мышей без Gli2, zinc-finger транскроипционного фактора, который действует ниже Sonic Hedgehog сигнального пути. Gli2 эмбрионы обнаруживают избирательную потерю донной пластинки и небольшой популяции непосредственно соседствующих интернейронов [клетки ventral intermediate region (VIR)]. После проецирования в направлении вентральной части срединной линии большинство комиссуральных аксонов накапливается в области, обычно занимаемой донной пластинкой (Рис. 4). Очень немногие аксоны, которым удается пересечь донную пластинку поворачивают в соответствующую продльную плоскость и проецирюутся и в ростральном и каудальном направлении. Большинство популяций комиссуральных аксонов обнаруживает сходные дефекты наведения у Gli2 мутантных мышей. Более того, регуляторные последовательности гомеобокс-содержащего гена Dbx1, использованы для таргетинга tau-lacZ в специфическую популяцию вентрально локализованных комиссуральных нейронов/аксонов у трансгенных мышей (
TgDbx1/TLZ), чтобы определить, зависит ли нахождение пути этими аксонами от присутствия донной пластинки. У потомков от скрещивания TgDbx1/TLZ и Gli2 мутантных мышей, β-gal экспрессия выявляет дефекты, которые очень напоминают, выявляемые окрашиванием DiI. Все это указывает на то. что донная пластинка (и возможно VIR) клетки важные регуляторы локальных событий ведения вблизи срединной линии.Данные по дефектным донным пластинкам у эмбрионов кур, Xenopus, и рыбок данио подтверждают этот вывод.
Установлено, что клетки донной пластинки обеспечивают комиссуральным нейронам трофическую поддержку. Эта поддержка начинается в то время, когда комиссуральные аксоны контактируют с донной пластинкой и сохраняется в течение периода, когда эти аксоны распространяются вдоль этой структуры. Следовательно, только те аксоны, которые находятся вблизи донной пластинки получают трофическую поддержку en passant [in passing] будут выживать, это гарантирует точность комиссуральных проекций in vivo.
Анализ гибели клеток у мутантных мышей с отсуствем донной пластинки Sd и
Gli2 д. подтвердить гипотезу en passant.
Итак, короткоз-действующие, преимущественно контакт-зависимые, взаимодействия между комиссуральными ростовыми конусами и донной пластинкой
(и/или VIR) клетками регулирует проведение commissural аксонов через срединную линию. Многие популяции ипсилатерально проецирующихся интернейронов идут в продольной плоскости параллельно донной пластинке. Возможно, что донная пластинка не играет существенной роли в контроле наведения ipsilaterally-проецирующихся аксонов. Действительно, ipsilaterally-проецирующиеся дорсальные ассоциации интернейронов идут вдоль своих обычных траекторий у Gli2 мутантных мышей.
Специализированные клетки располагаются в срединной линии вентрального нервного тяжа у Drosophila, физически разделяя левую и правую половины ЦНС. Среди кажущихся гомогенными клеток донной пластинки выявляются клитки разных типов, включая три пары глии срединной линии, а также рнейроны MP1 и VUM у Drosophila .
Анализ мутантов с нарушениями клеток срединной линии выявил существенную роль этих клеток для образования вентрального нервного тяжа у Drosophila. Напр., у single-minded (sim) мутантов, клетки срединной линии неспособны дифференцироваться и погибают. Следовательно, комиссуры не образуются и продольные пучки спадаются в одиночный слитый тракт по срединной линии. Это напоминает аберантное накопление комиссуральных аксонов в вентральной срединной линии в спинном мозге Gli2 мутантных мышей (Рис. 4).
Как contralaterally- так и ipsilaterally-проецирующиеся интернейроны в спинном мозге позвоночных первоначально распространяют аксоны в направлении срединной линии. Соответственно, хемоаттрактаны, продуцируемые срединной линией, являются прекрасными кандидатами на роль регуляторов дально-действующих событий нахождения пути. Выделены ассоциированные с мембранами ламинин-подобные белки Netrin-1 и Netrin-2 благодаря их способности (подобно донной пластинке) обеспечивать рост и реориентацию комиссуральных аксонов in vitro. Было установлено, что COS (имморатализованная линия клеток обезьян) клетки, трансфицированные Netrin-1 или Netrin-2 кДНК секретируют соответ. белки в среду, которые и привлекают комиссуральные аксоны in vitro. Рекомбинантные формы обоих белков регулируют комиссуральный рост in vitro, но только мРНК netrin-1 обнаруживается в донной пластинке кур (netrin-2 экспрессируется в вентральных двух третях спинного мозга, исключая донную пластинку).
Установлено, что Netrin-1 функционирует как продуцируемый донной пластинкой хемоаттрактант, который направляет комиссуральные аксоны in vivo. Напр., Netrin-1 связывается с рецепторами клеточной поверхности, обозначаемыми как DCC (Deleted in Colorectal Cancer), которые экспрессируются на комиссуральных аксонах и их ростовых конусах. DCC принадлежат семейству трансмембранных белков, которые обладают 4 immunoglobulin (Ig) доменами и 6 fibronectin type III (FNIII)повторами. В соответсвии с дозой Netrin-1 способствует росту комиссуральных аксонов, Netrin-1 связывает DCC с диссоциационной константой (Kd)10-8 M. Антитела против DCC блокируют Netrin-1-зависимый рост аксонов in vitro. Инактивация netrin-1 или DCC у мышей ведет к дефектам нахождения правильного пути, что не позволяет большинству аксонов достичь донной пластинки (Рис. 5). Экспланты донной пластинки от Netrin-1-дефицитных мышей неспособны обеспечивать рост комиссуральных аксонов in vitro
(но сохраняется их способность реориентировать эти аксоны). Подтверждена и роль Netrin-1 в регулировке ведения ипислатерально-проецирующихся аксонов. Рецепторы Netrin-1, DCC (и возможно UNC5H1), экспрессируются в En-1-позитивных аксонах in vivo, а первоначальные вентральные проекции распространяемые EN-1 интернейронами дизорганизованы и образуют неправильные пучки у Netrin-1-дефицитных мышей.
Т.к. комиссуральные ростовые конусы/аксоны отвечают на пространственно ограниченные источныики diffusible Netrin-1 (и Netrin-2) in vitro, то м. предположить существование дорсовентрального градиента белка Netrin-1, который регулирует их направленный рост in vivo. Однако, существенная фркация рекомбинантного Netrin-1 (и Netrin-2)остается ассоциированной с поверхностью COS клеток, трансфицированных соотв. кДНК. Иммуногистохимическое исследование не выявило вентрально (высокий) -> дорсального (низкий) градиента белка Netrin-1 в спинном мозге эмбрионов кур. Скорее Netrin-1 локализуется на латеральных краях спинного мозга вдоль путей, с помощью которых рано развивающиеся комиссуральные аксоны достигают вентральной срединной линии. Следовательно, Netrin-1 м. скорее всего функционирует как haptotactic (substrate-anchored), в противоположность chemotactic, сигнал наведения in vivo. Следует иметь в виду, что у Gli2-нокаутных мышей комиссуральные аксоны проецируются нормально в вентральную срединную линию в отсуствие структуры (дрнной пластинки), которая является наиболее богатым источником Netrin-1. Объяснить этот кажущийся парадокс м. тем, что вентрально (high) дорсальный (low) градиент мРНК netrin-1, возникающий в вентрикулярнрой зоне, персистирует в спинном мозге и у Gli2-дефицитных мышей. Это указывает на то, что дорсовентральный градиент Netrin-1 м., фактически, вести комиссуральные аксоны к вентральной срединной линии даже в отсуствие донной пластинки.
Хотя Netrin-1 скорее всего играет главную роль в регуляции нахождения circumferential путей комиссуральными аксонами позвоночных, но несколько наблюдений подтверждает существование дополнительных сигналов наведения. Напр., некоторые комиссуральные аксоны тянутся к донной пластинке у Netrin-1-дефицитных мышей, a эксплантанты донной пластинки от этих мышейсохраняют с вою способность реориентировать комиссуральные ростовые конусы/аксоны in vitro. Аnti-DCC антитела не устраняют
Netrin-зависимый поворот кимиссуральных ростовых конусов in vitro. Гомологи Netrin являются хорошими кандидатами на роль сигналов ведения, которые м. практически компенсировать отсутствие Netrin-1 у нокаутных мышей и которые м. регулировать нахождение путей комиссуральными аксонами посредством механизмов DCC-независимой передачи сигналов. Выявлены кДНК клоны, кодирующие 3 дополнительных Netrins у мышей и
Netrin-G1, новый glycosyl phosphatidylinositol (GPI)-linked Netrin, которые не экспрессируются в вентральной срединной линии развивающиегося спинного мозга, но мышиный Netrin-4 избирательно экспрессируется в латеральных краях донной пластинки.
Следовательно, Netrin-4 хорошо расположен для выполнения роли дально-действующего хемоаттрактанта для субпопуляции комиссуральных аксонов у netrin-1
нокаутных мышей. Напротив, т. наз. Netrin-synergizing activity (NSA),
которая способна усиливать вызываемый Netrin рост комиссуральных аксонов in
vitro м. модулировать функцию Netrin-1-независимой системы наведения у мутантных мышей. NSA скорее всего представлена резистентными к денатурации щелочными белками ~25-35kD, которые еще не идентифицированы.
Коллективные эффекты множественных позитивных и негативных сигналов наведения скорее всего оформляют окончательную траекторию данного класса аксонов, поэтому м. ожидать, что отталкивающие силы также вносят важный вклад, по крайней мере , на инициальной стадии нахождения путей комиссуральными аксонами. Напр., диффундирующие репульсивные сигналы ведения, локализующиеся в дорсальных областях эмбрионального спинного мозга, м. обеспечивать отталкивание комиссуральных ростовых конусок/аксонов от границы, чтобы гаранитировать их рост в вентральном направлении к срединной линии.
Верхняя (roof) пластинака - это маленькая треугольной формы структура, которая представлена примитивными глиальными клетками, расположеными на дорсальной срединной линии эмбрионального спинного мозга. Эта структура считалась барьером для роста аксонов в развивающейся ЦНС. Верхняя пластинка экспрессирует высокие уровни нескольких хондроитин и кератин сульфат протеогликанов, которые способны ингибировать рост нейритов in vitro. Показано, что roof пластинка способна отклонаять и реориентировать чувствительные к Netrin-1 комиссуральные аксоны из экчсплантантов спинного мозга крыс ст. E11. Способность эксплантантов верхней пластинки отклонять комиссуральные аксоны на расстоянии 100 μm указывает на то, что эта отталкивающая активность связана с диффундирующими молекулами, секретируемыми клетками верхней пластинки. Эта реплелентная активность ограничена верхней пластинкой и специфична для комиссуральных аксонов. Показано, что BMP7, член TGFβ семейства сигнальных молекул воспроизводит отталкивающую активность верхней (roof) пластинки. мРНК BMP6,
BMP7, и Gdf7 (член отдельнрой группы BMPs) экспрессируются внутри верхней пластинки в то время. когда комиссральные аксоны начинают свой направленный вентрально рост, но лишь рекомбинантный BMP7 обнаруживает отталкивание и реориентацию комиссуральных аксонов в изолированных эксплантах верхней пластинки. BMP7 является основным компленнтом отталкивающей активности верхней пластинки. Эксплантанты верхней пластинки, лишенные BMP7 обнаруживают заметное снижение способности отклонять рост аксонов in vitro. BMP7 вызывает коллапс культивруемых комиссуральных ростовых конусов.
Дефекты нахождения комиссуральными аксонами правильных путей обнаруживаются у BMP7 нокаутных мышей.
Итак, floor plate и roof plate выполняют комплементарыные роли в находдении путей ранними комиссуральными аксонами. Необходимо отметить, что родственные BMP белки известны как регуляторы ведения аксонов у беспозвоночных. Ген unc-129 кодирует члена сверхсемейства TGF-β, который необходим для педения первых двигательных аксонов вдоль дорсовентральной оси у C. elegans. Ген unc-129 экспрессируется в дорсальных, но не вентральных рядах мышц стенки тела.
Т.о., члены семейства TGF-β м. играть эволюционно законсервированную роль в контроле ведения circumferentially-проецирующихся аксонов в развивающейся ЦНС.
BMPs обычно взаимодействуют с гетеромерными serine/threonine kinase рецепторами, чтя активация ведет к транслокации в ядро белков SMAD, которые затем регулируют транскрипцию генов-мишеней. Однако, быстрое спадение ростовых конусов не согласуется с транскрипционными каскадами, обеспечивающими отталкивающие эффекты BMP7 у грызунов и у C. elegans, SMAD мутантны не обнаруживаю дефектов в нахождении путей, сходных с таковыми у unc-129 мутантов. Т.о., и BMP7 и UNC-129 м. активировать нестандарныет сигнальные пути, когда они фунционируют в качестве сигналов наведениядля circumferentially проецирующихся аксонов у млекопитающихся и червей, соотв.
Netrins также необходимы для ведения комиссуральных аксонов в развивающейся ЦНС Drosophila. Netrin-A и netrin-B экспрессируются клетками срединной линии во время инициальных стадий формирования комиссур в вентральном нервном тяже. Делеции обоих генов вызывают истончение комиссур, а также случайные разрывы в продольных пучках. Netrin-A и netrin-B выполняют, по-видимому, перекрывающиеся роли в срединной линии. Каждый из белков м. восстанавливать нормальный фенотип у мух с делециями обоих генов. Рan-neural эктопическая экспрессия Netrin-A или Netrin-B ведет к дефектам комиссуральных и продольных аксональных трактов, которые напоминают таковые у двойных мутантов.
Следовательно, точное пространственное распределние Netrin-A и Netrin-B,а не просто их присутствие, необходимо собственно для образования комиссуральных (и некоторых продольных) трактов. Однако, следует помнить, что многие комиссуры формируются нормально у мух с отсутствием обоих Netrins. Следовательно, Netrin-независимые сигналы наведения способны вести комиссуральные аксоны в направлениии срединной линии ЦНС у Drosophila. Хорошими кандидатами являются schizo и weniger гены, каждый из которыхнеобходим собственно для образования комиссур у мух.
Drosophila DCC ортолог, Frazzled, экспрессируется на высоких уровнях в комиссуральных и продольных трактах аксонов в вентральном нервном тяже, это подтверждает эволюционно-законсервированную роль Netrins в ведении к срединной линии. Фенотип frazzled нулевых мутантов напоминает таковой двойных нетриновых мутантов. Следовательно, Frazzled функционирует как предполагаемый рецептор Netrin у мух. Однако, имеются указания и на альтернативный Frazzled-зависимый механизм наведения, которы м. опрерировать в ЦНС Drosophila. Известно, что существенная фракция нетринов колокализуется с Frazzled на аксонах в дорсальных областях ЦНС, вдали от места синтеза Netrin synthesis в срединной линии. Дорсальное скопление Netrin не обнаруживается в отсутствии Frazzled, a эктопические Netrin белки обнаруживаются на поврехности аксонов, в которых индуцирована экспрессия Frazzled. Следовательно, Frazzled м.б. способным захватывать и локализовать Netrins в специфических сайтах ЦНС. Это наблюдение согласуется с возможность, что Frazzled косвенно регулирует наведение популяции специфических аксонов путем захвата и предоставления Netrin в разных точках вдоль их траектории. Это подтверждается тем, что dMP2 аксоны распространяются слишком далеко латерально и неспособны поворачивать кзади у мух без netrins и frazzled. Кроме того, dMP2 аксоны отвечают аттрактивно на эктопические области, генерирующие белок Netrin в результате неправильной эекспрессии внеклеточного домена Frazzled. Следовательно, их аксоны отвечают на захваченный Netrin. Новый "capture/relocation" механизм, выявляемый в этих исследованиях, облегчает эффективное и широко распространенное использование (и посторное использованиеe) сигналов наведения, некоторые из которых м.б. избирательно синтезированы клетками срединной линии.
Netrins и их рецепторы идентифицированы при скрининге локомоторных мутантов у нематод с несокординированными (uncoordinated (unc)) движениями, обусловленными дефектами ведения комиссуральных и моторных нейронов вдоль дорсовентральной оси тела. Взаимодействия между продуктами трех генов, unc-5, unc-6, и unc-40, регулируют circumferential ведение ростовых конусов/аксонов (и миграцию клеток) вдоль стенки тела C. elegans. Ортолог Netrin позвоночных, UNC-6, необходим для событий и дорсального и вентрального наведения, а ортолог позвоночного DCC, UNC-40, необходим для вентрального (и в меньшей степени для дорсального) наведения,
а новый член Ig-сверхчемейства, UNC-5, необходим исключительно для дорсально-направленного ведения аксонов. UNC-40 и UNC-5 способны действовать клеточно автономно для ориентации ростовых конусов соотв. или в направлении или прочь от источника UNC-6. Эктопическая экспрессия UNC-5 в нейронах, которые обычно экспрессируют только UNC-40 и которые привлекаются UNC-6, вызывает переориентацию роста аксонов, из-за репульсивной реакции на UNC-6. Недавно выделено 8 генов, чьи продукты необходимы для UNC-5-направляемого роста аксонов.
Важной находкой у C. elegans является то, что UNC-6 м. функционировать как привлекающий, так и отталкивающий сигнал. Сходная бифункциональность приписывается Netrin-1; комиссуральные аксоны привлекаются к источнику Netrin-1 и in vitro и in vivo, тогда как trochlear двигательные аксоны, которые растут дорсально от донной пластинки отталкиваются Netrin-1 in vitro. Однако, отсутствие дефектов в ведении trochlear двигательных аксонов у мутантных Netrin-1 мышей указывает на то, что Netrin-1 м. и не функционировать как главный хеморепеллент для этих аксонов in vivo. Тем не менее, гомологи UNC-5 у позвоночных являются хорошими кандидатами на роль рецепторов, опосредующих репеллентую активность Netrin-1. Два крысиных гомолога UNC-5, UNC5H1 и UNC5H2, связываются с Netrin-1 и экспрессируются во множественных классах нейронов в вентральных областях развивающейся ЦНС.
Вентральная срединная линия ЦНС пред ставляет собой точку бинарного выбора для ищущих путь аксонов. После достижения срединной линии, каждый аксон д. решить пересекать ее или не пересекать. Различные коротко-действующие механизмы контролируют пересечение срединной линии. Дополнительные контакт-зависимые взаимодействия гаранитируют, что комиссуральны аксоны осущесвят переход от окужностного к продольному росту только после пресечения срединной линии и препятсвуют обратному ходу.
Дефекты у Sd и Gli2-дефицитных (Рис. 4) мышей строго подтверждают, что для собственно пересечения срединной линии необходимы контакт-завимые взаимодействия между комиссуральными ростовыми конусами/аксонами и клетками донной пластинки. Выявлены прямые взаимодействия между двумя молекулами клеточной адгезии сверхсемейства Ig (или IgCAMs), axonin-1 на комиссуральных аксонах, и NrCAM на клетках донной пластинки, обычно делающими донную пластинку проницаемой для комиссуральных ростовых конусов. Растворимый axonin-1 или антитела, специфичные или к
axonin-1 или NrCAM, повторно инъецировали эмбрионам кур во время поиска путей крмиссуральными аксонами. Выявлено, что свыше 50% комиссуральных аксонов (по спавнению с контролем) неспособны пересекать донную пластинку и проецируются в прдольном направлении на ипсилатеральной стороне срединной линии. С др. стороны, инъекции антител против NgCAM, гомолога L1 кур, экспрессирующегося на пересекающих и непересекающих сегментах комиссуральных аксонов, способствуют defasciculation комиссуральных аксонов, но не вызывают дефектов наведения.
По=видимому, достигнув срединной линии комиссуральные аксоны д. выбрать, распространяться ли вдоль NrCAM-выстланного пути пересечения донной пластинки или вдоль продольно-ориентированрого тракта NgCAM на ипсилатеральной стороне донной пластинки. Комиссуральные аксоны, выбрают NgCAM путь только, если
NrCAM маршрут недоступен. Показано, что in vitro комиссуральные аксоны растут одинаково хорошо на NrCAM и NgCAM субстратах, но они предпочитают расти на смешанном NrCAM/NgCAM субстрате. Итак, открываются две возможности: 1)
комиссуральные аксоны растут поперек срединной линии, т.к. NrCAM более предпочтительный субстрат, чем NgCAM или 2) благодаря своему взаимодействию с axonin-1, NrCAM играет более активную роль в инструктировании аксонов. Последнее предположение находит подтверждение.
Показано, что комиссуральные ростовые конусы/аксоны, исходящие из эксплентантов дорсальных частей спинного мозга неспособны вступать в ко-культивируемые эксплантанты донной пластинки в присвтствии реагентов (anti-axonin-1, anti-NrCAM, или soluble axonin-1), которые накладжываются на гетерофилтьные axonin-1/NrCAM взаимодействия.
Сходные эксперименты показали. что комиссуральные ростовые конусы не только не способны вступать в эксплантанты донной пластинки, но и спадаются в присутствии anti-axonin-1 антител. Все это указывает на то, что позитивыне взаимодействия между axonin-1 и NrCAM не только способствуют вствуплению комиссуральных ростовых конусов/аксонов в донную пластинку. но и делают эти аксоны нечувствительынми к collapse-inducing activity (CIA), которая демаскируется с помощью пертурбаций антител.
Ассоциированная со средней линией ингибирующая активность комиссуральноых ростовых конусов идентифицирована у эмбрионов кузнечиков, а продуцируемые донной пластинкой эфрины В-класса способствуют коллапсу комиссуральных ростовых конусов in vitro.
Более того, Slit функционирует как репеллент срдинной линии для комиссуральных аксонов у Drosophila и, возможно, в спинном мозге позвоночных.
F-spondin, белок внеклеточного матрикса, который обнаруживается на высоком уровне в донной пластинке эмбрионов крыс, продуцируется и секретируется клетками донной пластинки. Идентифицирован куриный гомолог F-spondin и растворимые fusion белки, имеющие thrombospondin type I repeat (TSR)-содержащий домен этого белка, они соединяются и способствуют росту комиссуральных аксонов in vitro. Повторные инъекции TSR fusion белков в центральный канал эмбрионов кур не позволяли большинству комиссуральных аксонов пересекать срединную линию. Поэтому аксоны поворачивали ортогонально к ипсилатеральному краю (или внутри) донной пластинки. Очевидно, что позитивные взаимодействия между F-spondin и еще неидентифицированными рецепорами необходимы для пересеения срединной линии спинного мозга эмбрионов кур.
Предложнео два молекулярных механизма для объяснения острого изменения направления роста (напр., поперечного на продольный) комиссуральных аксонов после пересечения ими срелдинной линии. В одной модели, пересекшие комиссуральные аксоны поворачивают ортогонально и растут в продольном направлении, чтобы сохранять максимальный контакт с донной пластинкой, которая представляю собой более предпочтительный субстрат, чем сосеждне области спинного мозга (Рис. 1A,
B). Фактически, преимущественная экспрессия ряда IgCAMs в донной пластинке подтверждает такой механизм избирательной адгезии. Однако, эта модель неспособна объяснить некоторые аспекты наведения. Напр., комиссуральные аксоны осуществляют ортогональный поворот только после пересечения срединной линии (Рис 1A,
B). М. предположить, что комиссуральные ростовые конусы отвечают на поворачивающие сигналы, избирательно локализованные на контралатеральной стороне донной пластинки. Однако, из-за билатеральной симметрии спинного мозга следует ожидать, что комиссуральные ростовые конусы встречают сигналы поворота на обоих краях донной пластинки. наблюдается также, что комиссуральные аксоны не пересекают донную пластинку повторно, что не согласуется с моделью предпочтительного субстрата.
Др. модель достаточно хорошо объясняет сложное поведение наведения, постулируя что контакт с донной пластинкой меняет чувствительность ростовых конусов к билатерально расположенным средовым сигналам наведения. Механистически это м.б. объяснено модификацией молекулярного состава поверхности комиисуральных ростовых конусов после пересечения срединной линии.
Временная экспрессия различных IgCAMs на различных сегментах комиссуральных аксонов подтверждает altered-responsiveness модель. Так, комиссуральные аксоны, тянущиеся в направлении вентральной срединной линии спинного мозга грызунов экспрессируют TAG-1, но не L1, тогда как аксоналные сегменты на контралатеральной стороне донной пластинки (представляющие смесь пересекших сегментов комиссуральных аксонов и ипсилатерально проецирующиеся аксонов) экспрессируют L1, но не TAG-1 (Рис. 3A). В соответствии с этим механизмом постулируется, что переключение в экспрессии от TAG-1 к L1, преимущественно запускается контактом с донной пластинкой, оно задерживает поворот в ростральную сторону пока ростальные аксоны не пересекут донную пластинку.
NrCAM, др. ассоциированный с аксонами IgCAM, экспрессируется на низком уровне комиссуральными аксонами и когда они распространяются в направлении донной пластинки на ипсилатеральной стороне и когда они поецируются в продольном направлении на котралатеральной стороне донной пластинки у эмбрионов кур и мышей. В резком контрасте, к этим сегментам комиссуральных аксонов находтся сегменты внутри вентралных комиссур (VC; коротких аксональных трактов, пересекающих базальную треть донной пластинки; Рис.3A), экспрессирующие высокие уровни NrCAM. Это указывает на то, что контакт с донной пластинкой индуцирует высокие уровни NrCAM на сегментах комиссуральных аксонов, содержащихся внутри VC. Анализ мышей, дефицитных по L1 выявляет драматические нарушения в формировании комиссуральных трактов в головном мозге.
Анализ Sd и Gli2-дефицитных эмбрионов подтверждает роль донной пластинки в регуляции по крайней мере некоторых из этих сегмент-специфических паттернов экспрессии аксонов. Напр., in Sdмышей комиссуральные аксоны, которые не сталкиваются с донной платинкой в более каудальных областях спинного мозга, продолжают экспрессировать TAG-1,хотя они аномально распространяются или вне или внутрь контралатеральных областей спинного мозга. С др. стороны, TAG-1 экспрессия подавляется, так только комиссуральные аксоны достигают вентральной срединной линии в более ростральной, содержащей донну пластинку области у этих же мышей. В соответствии с этими наблюданиями немногие комиссуральные аксоны, которые поворачивают в ростральном направлении после прохождения через область, обычно занимаемую донной пластинкой у Gli2-нокаутных мышей, продолжают экспрессировать TAG-1.
Только эти комиссуральные аксоны, которые сталкиваются с донной пластинкой, т.к. они происходят из эксплантантов спинного мозга крыс ст. E13, in vitro, подавляют экспрессию TAG-1. более того, в противоположность высокому уровню экспрессии NrCAM на аксонах, находящихся внутри VC у мышей дикого типа, низкие уровни NrCAM выявляются в вентральной срединной линии у Gli2-дефицитных мышей с отсутствием донной пластинки. Все это указывает на роль in vivo донной пластинки (и/или VIR клеток) в модуляции сегмент-специфичной экспрессии TAG-1 и NrCAM на комиссуральных аксонах.
Трудно определить, регулируют ли контакты с донной пластинкой экспрессию L1 на комиссуральных аксонах. L1 экспрессируется только на тех сегментах комиссуральных аксонов, которые проходят через донную пластинку in vitro, очевидно, что L1 непосредсвенно экспрессируется на кимиссуральных аксонах, пересекащих срединную линию у Gli2-дефицитных мышей. Важно установить независимые от донной пластинки механизмы, которые м. модулировать уровни L1 на комиссураьных аксонах. Разумно предположить наличие контакта между комиссуральными аксонами и др. клетками, с которыми они сталкиваются на пути к донной пластинке, а также между аксонами. В спинном мозге Gli2 мутантных мышей гекоторые комиссуральные аксоны сворачивают на продольное положение в отсутствие (и внутри области, обычно занимаемой) донной пластинки. Это указывает на то, что предварительные контакты с донной пластинкой не обязательны для осуществления поворота комиссуральными аксонами in vivo. Однако, т.к. огромное большинство аксонов неспособно совершать переход к продольо направленному росту в спинном мозге этих эмбрионов, то скоре всего клетки вентральной срединной линии все-таки играюи основную роль в регуляции ориентации пересекших сегментов комиссуральных аксонов.
Данный системный подход был использован, чтобы показать, что комиссуральные ростовые конусы/аксоны, прошедшие через донную пластинку теряют свою чувствительность к эктопической донной пластинке или источнику Netrin-1 (Рис. 6). Это согласуется с моделью изменения чувствительности (altered-responsiveness model), что контакт с донной пластинкой подавляет экспрессию рецепторов Netrin-1, DCC, на комиссуральных ростовых конусах/аксонах. Однако, т.к. DCC экспрессируются ка на пересекающих, так и непересекающих сегментах аксонов in vivo и т.к. распределение DCC на культивируемых комиссуральных аксонах не изучено непосредственно, то не существует эмпирического подтверждения этой модели. В этом отношении известно, что metalloprotease inhibitor, IC-3, увеличивает уровень DCC в спинальных комиссуральных аксонахи , следовательно, усиливает Netrin-1-обеспечиваемый рост in vitro. Это открывает возможность, что эксплантанты спинной/задний мозг с комиссуральными аксонами будут обладать эндогенной активность metalloprotease, которая будет обеспечивать протеолитическую деградацию и функциональную инактивацию DCC. Такого типа механизм м.б. объяснить изменение чувствитеьности комиссуральных аксонов к Netrin-1 после контакта с донной пластинкой. Факт, что комиссуральные ростовые конусы/аксоны накапливаются в вентральной срединной линии Gli2-нокаутных мышей, рядом с высокими уровнями Netrin-1 ассоциированными с вентрикулярной зоной, согласуется с тем. что эти аксоны остаются чувствительныи к Netrin-1 в отсутствие донной пластинки.
Согласно altered-responsiveness модели наведения комиссуральные аксоны м. обладать и избыточной чувствительностью к репеллентам срединной линии после пересечения донной пластинки. Т.наз. "post-crossing" (комиссуральные) аксоны, которые выходили из донной пластинки, соединенной с эксплантатом половинки спинного мозга, но не "precrossing" аксоны, выходящие из эксплантата, не связанного с донной пластинкой, отталкивались изолированной донной пластинкой и тканью вентральной части спинного мозга. Следовательно, post-crossing, но не precrossing аксоны отталкиваются рекомбинантными формами известных ингибиторов сигналов наведения Slit-2, SEMA 3B (Semaphorin) и SEMA 3F (см. Табл). Паттерны пространственно-временной экспрессии Slit-2, SEMA 3B и SEMA 3F в спинном мозге эмбрионов мыши подтверждают, что Slit-2 и SEMA 3B являются хорошми кандидатами на роль отталкивающих факторов в донной пластинке, тогда как SEMA 3F м. отвечать за ингибирующую активность, ассоциированную с вентральной частью спинного мозга. Мыши, дефицитные по NPN-2, рецептору высокго сродства для SEMA 3B и SEMA 3F, обнаруживают дефекты в нахождении пути, это согласуется с предположением, что комиссуральные аксоны сталкиваются и с репульсивными сигналами ведения в донной пластинке и в вентральной части спинного мозга после пересечения срединной линии. Роль NPN-2 в обеспечении этой функции трудно согласовать с наблюдением, что белок NPN-2 экспрессируется как на пересекших, так и непересекших сегментах комиссуральных аксонов in vivo и in vitro. Возможно, что гомолог Robo у позвоночных (Табл. 1, Рис. 2, 3) или др. ассоцированные с аксонами рецепторы обеспечивают Slit-2-зависимое отталкивание in vitro или in vivo.Все эти данные указывают на то, что комиссуральные аксоны не только теряют чувствительность к хемоаттрактантам, но и становятся более чувствительными к хеморепелентам после пересечения ими срединной линии в спинном мозге позвоночных.
Пары рецептор-лиганд, которые обеспечивают репульсивное ведение аксонов посредством коротко-действующих взаимодействий дополняют altered-responsiveness-based систему ведения. Eph (erythropoietin-producing hepatocellular) receptor protein tyrosine kinases (RPTKs) представлены большим классом RPTKs и характеризуются внеклеточным доменом, содержащим уникальный богатый цистеином мотив и два повтора fibronectin type III. Известно, по крайней мере, 14 Eph рецепторов и 8 мембран-ассоциировнных лигандов, называемых ephrins. Eph рецепторы подразделяются на 2 субкласса: EphA рецепторы, которые преимущественно взаимодействуют с эфриновыми лигандами класса А и EphB рецепторы, которые преимущественно взаимодействуют с эфриновыми лигандами класса B. Т.к. оба типа эфринов ассоциированы с клеточной поверхностью, то эфриновые лиганды класса А связаны с мембранами посредством glycosyl phosphatidylinositol (GPI) связи, тогда как эфриновые лиганды класса В обладают трансмембраными доменами. Способность эфринов класса В обеспечивать контакт-зависимое отталкивание в ряде нейральных систем делает их наиболее вероятными высоко локальными реплеллентными сигналами срединной линии.
Три В класса эфринов экспрессируются в донной пластинке, а EphB1 экспрессируется в многочисленных популяциях комиссуральных и ипсилатерально-проецирующихся интернейронов в развивающемся спи нном мозге мышей. Подтверждено, что B-класса эфрины экспрессируются в латеральных краях донной пластинки и показано, что белок EphB1 специфически экспрессируется на пересекших сегментах комиссуральных аксонов. Связь EphB1 с пересекшими сегментами аксонов очень напоминает ту, которая обнаружена для L1в развивающемся спинном мозге грызунов и согласуется с тем, что у Drosophila Eph рецепторы, обозначаемые как Dek, селективно экспрессируются с продольно-проецирующимися аксонами в развивающемся нервном тяже (Рис. 3В). Эфрины В класса вызывают коллапскомиссуральных ростовых конусов in vitro, это подтверждаетс существование базирующейся на Eph/ephrin репеллентной системы ведения, которая опрерирует посредством механизма изменения чувствительности (altered-responsiveness mechanism).
Установлено, что пересекшие сегменты комиссуральных аксонов идут в тесной близи к донной пластинке лишь очень короткое расстояние. Эти аксоны растут прочь от срединной линии в более дорсальные районы спинного мозга, где они совершают поворот в ростральном направлении в продольной плоскости вдольдорсального домена экспрессии эфрина класса B. Следовательно, эфрины B-класса м. демаркировать барьеры роста комиссуральных аксонов вдоль донной пластинки (для коротких расстояний),так же как и в более дорсальных регионах спиннго мозга, где они м. действовать, специфицируя дорсовентральное положение продольных трактов комиссуральных аксонов. На C. elegans подтверждена позитивная роль компонента базальных мембран Nidogen в предопределении положения продольно-проецирующихся нервов в разных позициях вдоль дорсовентральной оси. В связи со специфическим механизмом Eph-ephrin обеспечиваемых событий ведения в спинном мозге необходимо учитывать, что регулируемое, зависимое от металлопротеиназы расщепление эфринов класса А быстро превращает первоначальное связывание рецепторов А класса и лигандов в репульсивное взаимодействие. Учитывая присутствие законсервированного мотива распознавания metalloprotease в эфринах В класса, м. предположить, что инициальные аттрактивные взаимодействия между EphB1 и эфринами В класса объясняют рост вдоль контралатерального края донной пластинки, а последующее расщепление и репульсивное ведение объясняют рост прочь от этой структуры в дорсальную часть спинного мозга.
Изучение образования комиссур в головном мозге подтверждает роль B-class Eph
рецепторов и эфринов в контроле пересечения срединной линии. Напр., мыши, дефицитные по EphB2 или EphB2 и EphB3 обнаруживают дефекты в основном месте пересечения срединной линии в переднем мозге и inner ear efferents (IEE) волокна выбирают несоответствующие пути и оказываются на срединной линии заднего мозга. У личинок Xenopus показано, что преждевременная экспрессия эфринов В-класса в зрительном перекресте ведет к неправильному ходу ретинальных аксонов, экспрессирующих Eph.
Поиск мутаций у Drosophila с немногими или очень многочисленными аксонами, пересекающими срединную линию позволил выделить три гена, контролирующих этот процесс. У мутантов commissureless (comm) ЦНС лишена практически всех комиссуральных трактов и содержит только два продольных пучка по бокам от срединной линии (Рис. 7).
Комиссуральные ростовые конусы/ аксоны собственно ориентированы, но никогда не пересекают срединную линию у этих мутантов. Продукт гена comm, Comm, по-видимому, непосредственно необходим для пересечения срединной линии, т.к дифференцировка ассоциированной со средней линией глии и нейронов не изменена. Comm это новый тип трансмембранного белка, который инициально локализуется в клетках срединной линии и затем, по-видимому, передается (с помощью неизвестного механизма) комиссуральным аксонам, когда они пересекают срединную линию. Первичная структура Comm не содержит мотивов, которые присуствуют внутри др. белков, обеспечивающих вдение аксонов. Comm строго ассоциирован с мембранами, а anti-Comm антитела сторого метят внутриклеточные органеллы (напр., Golgi complex и эндосомы) и лишь едва метят клеточную поврехность. Возможно Comm функционирует как внеклеточный сигнал ведения и лишь временно находится на поврехности клеток, прежде чем будет удален с помощью эндоцитоза. Это подтверждается наличием из 4-х остатков мотива, YXX (тирозин с двумя случайными аминокислотами и гидрофобной аминокислотой), в цитоплазматическом домене Comm . Это место обеспечивает ассоциацию различных белков с Adaptin/Clathrin комплексами, которые затем обеспечивают его быстрый жндоцитоз. Дикого типа Comm, но не укороченная мутантная форма, в которой отсутствует YXX последовательности, подвергается быстрому эндоцитозу в мышечных клетках эмбрионов Drosophila.
У мутантов robo вернтральный нервный тяж содержит утолщенные комиссуры, которые отражают события избыточного пересечения срединной линии. Аксоны, которые обычно являются первыми иписилатеральными проекциями (напр., pCC, vMP2) теперь пересекают срединную линию, тогда как контралатерально-проецирующиеся аксоны (напр., SP1) возвращаются обратно через срединную линию много раз. Белок, кодируемый robo (Robo) является новым членом уникального семейства IgCAMs.
мРНК robo широко экспрессируется многими или большинством разививающихся нейронов, но белок Robo экспрессируется регионально специфическим для аксональных сегментов образом у эмбрионов дикого типа. Аксоны, распространяющиеся в направлении или пересекающие срединную линию экспрессипруют очень низкие уровни Robo, тогда как пересекшие сегменты комиссуральных аксонов и ипсилатерально-проецирующихся аксонов экспрессирую высокие уровни Robo (Рис. 3B).
Установлено, что Comm и Robo действуют совместно, контролируя пересечение среди нной линии. Двойные мутанты comm; robo обнаруживают robo
фенотип (избыточность пересечения срединной линии). В отсуствие Robo, Comm более не нужен аксонам для пересечения срединной линии. Эктопическая экспрессия Comm в любом мемтсе ЦНС вызывает существенное снижение уровня белка Roboи последующеее аберрантное пересечение срединной линии и повторные пересечения. Избыточные уровни Comm ведут к более тяжелым robo-подобным фенотипам. Следовательно, Comm м. действовать локально, поддерживая низкие уровени Robo в комиссуральных аксонах. Т.о., Rob, по-видимому, функционирует как "привратник" который контролирует события пересечения срединной линии; ростовые конусы/аксоны, экспрессирующие высокие уровни Robo неспособны пересекать срединную линию. Поэтому высокие уровни экспрессии Roboипсилатерально-проецирующимися аксонами и пересекшими сегментами комиссуральных аксонов, лишены возможности пересекать срединную линию.
Механизм, с помощью которого Comm регулирует уровни Robo неизвестен. предполагается, что в срединной линии Comm переносится с клеток срединной линии на поверхность ростовых конусов. Возможно, что Comm подвергается быстрому эндоцитозу после перенесения на комиссуральные аксоны, Comm и Robo м.б. cointernalized; удаление Robo с клеточной поверхности будет касаться только тех сегментов комиссуральных аксонов, которые контактируют с клетками срединной линии, экспрессирующими Comm, нечувствительными к репеллентному Robo лиганду.
Анализ comm и robo сторого подтверждает altered-responsiveness модель проведения через срединную линию в ЦНС Drosophila. Однако, нахождение пути аксонами м. осуществляться нормально несмортя на неправильное решение ростового конуса в срединной линии у мутантов comm и robo. Напр., RP3 и V двигательные аксоны, которые лишены возможности пересекать срединную линию у мутантов
comm следуют зеркальными траекториями и иннервируют соотв. мышцы на ипсилатеральной стороне. Напротив, RP2 и aCC двигательные аксоны, которые аномально пересекают срединную линию у мутантов robo затем идут зеркальными путями и соединяются с соотв. синаптическими мишенями на контралатеральной стороне. Очевидно, что ростовые конусы не nthzs.n своей способности отвечать нормально на сигналы ведения, встречаемые на дальнейших отрезках своей траектории.
Предполагается, что Slit является кандидатом на роль ассоциированного со срединной линией репульсивного лиганда для Robo.
Фенотип потери функции slit характеризуется слиянием продольных пучков и их коллапсом в срединную линию ЦНС. Первичным аксональным дефектом slit мутаций является неспособность комиссуральных аксонов покидать срединную линию. Это характерно для репеллентов срединной линии.
Получены доказательства, подтверждающие роль Slit как репульсивного лиганда Robo. Показано, что самый сильный фенотип избыточной функции Comm "collapsed-midline" фенотип воспроизводится мутантами slit. Мухи с одиночной мутантной копией
robo и slit обнаруживают robo-подобный фенотип. Это подтвержает, что Robo и Slit это рецептор и лиганд.
Дополнительным кандидатом нароль рецептора для Slit является Robo2, близкий родственник
Robo, который экспрессируется в нейронах развивающейся ЦНС. В этом случае фенотип robo/robo2 двойных мутантов д. напоминать фенотип одиночного мутанта slit.
Slit это большой белок внеклеточного матрикса, который секретируется глией срединной линии и ассоциирует с посерхностью аксонов. В соответствии с его ролью ингибирущего проведение сигнала установлено, что комиссуральные аксоны избегают эктопически экспрессировать Slit в ЦНС Drosophila. Однако, обнаружение у Drosophila мутации karussell, при которой аксоны неподходящие ">circle" вблизи срединной линии, это указывает на то, что множественные репульсивные системы наведения оперируют в срединной линии.
C. elegans Robo ортолог, sax-3, дает фенотип.сходный с таковым у robo мух. Одиночный slit ген идентифицирован у нематод, его роль в наведении аксонов исследуется. У рыбок данио astray мутанты характеризуются различными дефектами нахождения путей, в том числе и повторные пересечения срединной линии ретинальными аксонами. Этот фенотип указывает на то, что astray м. представлять собой дефект гомолога robo у рыбок данио. Идентифицирован ген, отвечающий за фенотип astray как ортолог robo-2 и выделены кДНК трех Robos у этих рыбок. Установлено, что ростовые конусы astray имеют аномальную морфологию, повышенную тенденцию покидать зрительные пути и неспособны корректировать инициальные ошибки в нахождении пути.
Гомологи Robo и Slit у млекопитающих также идентифицированы и также участвуют в регуляции проведения аксонов через срединную линию. Два гомолога Robo (Robo-1 and Robo-2) у грызунов экспрессируются спинальными комиссуральными нейронами. Однако, селективная экспрессия белков Robo-1 и Robo-2 на пересекших сегментах комиссуральных аксонов не выявлена (Рис. 3A). Выявлена связь Slit-2 с поверхнгостью клеток, экспрессирующих Robo у млекопитающих и отталкивание спинальных двигательных нейронов in vitro. Slit-2 избирательно отталкивает комиссуральные аксоны, которые прошли через донную пластинку in vitro. Т.о., Robo-Slit репульсивная система ведения у млекопитающих по механизму сходна с той, что оперирует у Drosophila,, рыбок данио (и возможно червей. Но следует отметить, что геном C.
elegans не содержит ортолога Comm и что гомолог Comm у позвоночных еще не идентифицирован.
Receptor-linked tyrosine phosphatases (RPTPs) также регулируют перечечение срединной линии в вентральном нервном тяже Drosophila. RPTPs регулируют дефосорилирование тирозина в ростовых конусах и т.о. обращают реакции, катализируемые тирозин киназами. В соответствии с их потенциальной ролью как репеллентных рецепторов было продемонстрировано, что у Drosophila RPTPs, DLAR и DPTP10D, подобно Robo, избирательно локализуются на продольных аксональных трактах в вентральном нервном тяже эмбрионов( Рис. 3B). Более того, большинство продольно растущих аксонов посторно пересекают срединную линию у мух с отсутствием DPTP10D и др. нейрального RPTP, DPTP69D, (Рис. 8). Показано, что самые внутренние (или наиболее медиальные) продольные тракты, которые содержат аксоны, которые аномально повторно пересекают срединную линию у мутантов robo не затрагиваювтся у двойных RPTP мутантов. Скорее всего, наиболее латерально расположенные аксонпересекают и повторно пересекают срединную линию у мух без комбинации RPTPs. Обнаружение, что DPTP10D и DPTP69D генетически взаимодействуют с robo, slit и comm, прямо подтверждает возможность этих двух RPTPs регулировать Robo/Slit репульсивные сигналы в срединной линии, возможно за счет модуляции фосфорилирования тирозинов, вызываемых репульсивными
Robo/Slit взаимодействиями. Это согласуется с фармакологическим подавлением тирозин киназной активноси у эмбрионов кузнечиков, вызывающее аберантное повторное пересечение срединной линии.
Новая RPTK, известная как Derailed (Drl) экспрессируется уникальным набором интернейронов и моторными нейронами, которые избирательно распространяют аксоны через AC. Белок Drl выявляется только на тех сегментах аксонов, которые активно проецируются в и вдоль AC. В отсутствие Drl, эти аксоны часто проецируютс аберрантно в PC, a неправильная экспрессия Drl заставляет аксоны, которые обычно проецируются в PC пересекать срединнубю линию через AC. Все это вместе с обнаружением лиганда для Drl в непосредственной близи к PC, указывает на то, что Drl действует как репеллентный рецептор ведения, который диктует выбор комиссур рядом аксонов, пересекающиз срединную линию. Возможно гомолог Drl, обозначенный как RYK, экспрессируется в разивающейся ЦНС крыс, поэтому м. предполагать, что уникальная RPTK играет также существенную роль и в регуляции ведения аксонов в развивающейся ЦНС позвоночных. Однако, не выявлено дефектов в нахождении путей у RYK null мышей. Но обнаруживаются черепно-лицевые аномалии у этих мышей. Известно, что RYK существует в комплексе с EphB2 и EphB3, это предполагает участие RYK в Eph рецепторами-обеспечиваемой передаче синалов.
Итак, комиссуральные ростовые конусы меняют свою чувствительность к аттрактивным и репульсивными сигналам посре пресечения ими срединной линии у позвоночных и беспозвоночных. В спинном мозге позвоночных, напр., комиссуральные ростовые конусы первые привлекаются хемоаттрактантами донной пластинки; затем эти ростовые конусы, по-видимоу, теряют чувствительность к позитивно-действующим сигналам наведения и повышают одновременно чувствительность к репульсивным сигналам после пересечения срединной линии. Эти процессы предупреждают возвращение комиссуральных аксонов и направлют их к соотв. мишеням. Реакция ростовых конусов на данный сигнал наведения предопределяется внутренним состоянием нейрона и реакция регулируется системой вторичных messenger. Привлечение и отталкивание кодируются с помощью цитоплазматических доменов специфических guidance рецепторов.
Культивируемые спинальные нейроны Xenopus обнаруживают хемоаттрактивную реакцию на пульсативное воздействие Netrin-1 in vitro. Эта позитивная реакция превращается в репульсивную реакуию в присутствии конкурентноспособного аналога цАМФ (Rp-cAMPS) или ингибитора протеин киназы А (KT5720). Следовательно, один и тот же ростовой конус м. давать противополодные ответы, повороты, на Netrin-1 в заисимости от уровня цитозольного цАМФ. Аdenosine receptor, A2b, индуцирует продукцию цАМФ после соединения с Netrin-1 in vitro. Было предположено, что это взаимодействие м. представлять собой одно из критических сигнальных событий, которые регулируют привлечение ростовых конусов к Netrin-1.
Независимо от природы реакция, вызываемая с помощью Netrin-1 (напр.,
attractive или repulsive)в DCC, по-видимому, играет критическую роль в обеспечении событий нижестоящей передачи сигналов. Т.о., и attractive и repulsive реакции на
Netrin-1 в ростовом конусе устраняются в присутствии блокирующих антител против DCC.
Присутствие внеклеточного кальция абсолютно необходимо как для attraction , так и repulsion. Эти важные находки указывают на то, что реакция нахождения пути ростовым конусом на специфические сигналы наведения м.б. не предетерминирована. Скорее, качество ("sign") ответа будет критичесаки зависеть от состояния цитозольной активности цАМФ, которое в свою очередь м. зависеть от полного набора средовых сигналов, которые воспринимает ростовой конус в данной точке своей траектории.
Напр., т.к. laminin способен конвертировать Netrin-1-индуцированное притягивание ростового конуса в отталкивание в результате снижения цитозольного уровня цАМФ in
vitro, а известно, что ростовые конусы перемещаются в регионах ЦНС, которые коэкспрессируют laminin и Netrin-1, но м. б. направлены м в области, где экспрессируется только Netrin-1. Механизм этого типа несомненно участвет в собственно размещении аксональных трактов в молекулярно сложных областях развивающейся ЦНС.
Предпринята попытка показать, что экзогенная экспрессия UNC-5 в спинальных нейронах Xenopus превращает аттрактивную реакуию их ростовых конусо/аксонов на Netrin-1 в репульсивную реакцию. Репульсивная реакция аксонов, экспрессирующих UNC-5 устраняется в присутствии блокирующих функцию антител против DCC. Далее было показано. что лигандом индуцированное взаимодействие между цитоплазматическими доменами UNC-5 и DCC лежит в основе превращения индуцированной Netrin-1 аттракции в отталкивание.
Это указывает на то, что UNC-5 белки ишрают эволюционно законсервированную роль в обеспеении репульсивных событий, которые нуждаютс в DCC. Когда химерный рецептор, состоящий из эктодомена DCC и цитоплазматического домена UNC-5 экспрессируется в нейронах Xenopus, то соотв. ростовые конусы также приобретают репульсивную реакцию на Netrin-1. Следовательно, отталкивание скорее всего кодируется цитоплазматическим доменом UNC-5.
У Drosophila химерные рецепторы, состоящие из внеклеточного домена Frazzled (Fra)и внутриклеточного домена Robo (Fra-Robo) или наоборот (Robo-Fra), экспрессируются во всех нейронах эмбрионов дрозофилы. Аксоны, экспрессирующие высокие уровни Fra-Robo отталкивались клетками срединной линии, экспрессирующими Netrin и были неспособны пересекатьсрединную линию. Аксоны же, экспрессирующие высокие уровни Robo-Fra привлекались клетками срединной линии, экспрессирующими Slit и большинство из них пересекали срединную линии в неподходящих местах. Значит цитоплазматические домены Robo и Fra кодируют оттакливание и привлечение, соответ. Следовательно, guidance рецепторы (по крайней мере UNC-5, Robo
и Fra) являются modular; цитоплазматические домены детерминируют природу реакции на данный сигнал наведения, тогда как эктодомены предопределяют специфичность связывания лиганда. Однако, следует подчеркнуть, что киназный домен EphB2 несущественнен для образования комиссуральных трактов в головном мозге мышей. Пока данные сигналы наседения не удается классифицировать ка исключительно аттрактивные или репульсивные.
Донная пластинка являюется ключевым источником информации наведения для нахождения правильного пути комиссуральными аксонами. Большое число белков, которые преимущественно экспрессируются в донной пластинке( Табл.1), кажутся прекрасными кандидатами на роль сигналов наведения, однако функции большинства из этих белков в контексте проведения через срединную линию, невыяснены. VEMA (for VEntral Midline Antigen) является особенно интересным примером белка, ассоциированного с донной пластинкой, чья функция неясна. VEMA выявляется преимущественно в донной пластинке ЦНС разивающихся крыс. Это ассоциированный с мембранами белок в 28 kD предположительно с одним трансмембранным доменом вблизи его N-конца. VEMA мРНК специфически локализуется в донной пластинке крыс. Он экспрессируется в донно и верхней пластинке в разивающемся спинном мозге мышей и селективно экспрессируется в guidepost клетках, которые контролируют нахождение пути аксонами клеток ретинальных ганглиев в оптическом перекресте (chiasm). В соответствии с отсутствием или низкими уровнями VEMA на клеточной поверхности, первичная структура VEMA не содержит каких-либо мотивов, которые м.б. указывать на очевидную роль этого белка в обеспечении контакт-зависимых взаимодействий, которые регулируют ведение аксонов. Тем не менее, VEMA содержит несколько определенно сортирующимх мотивов, которые, как полагают, облегчают быстрое удаление различных белков с клеточной поверхности. Это согласуется с преимущественно внутриклеточной локализацией белка VEMA. Возможно, что VEMA м. направляться и действовать на клеточной поверхности, где он м. временно находиться перед тем как будет удален с помощью жндоцитоза. Белок Comm, ассоциированный с клетками срединной линии, также преимуществаенно ассоциирует с внутриклеточными мембранами и содержит мотив internalization, последовательности которого присутствуют и в VEMA.
Геном C. elegans содержит предположительно ортолог VEMA. Установлено, что VEMA скорее всего экспрессируется в субпопуляции рано развивающихся нейронов, которые первыми распространяют свои аксоны в вентральный нервный тяж. Экспрессия VEMA во множественных промежуточных мишенях в разивающейся ЦНС позвоночных и в нейронах, которые первыми образуют ранние аксональные тракты к червей, указывает на то, что VEMA м. играть эволюционно законсервированную роль в регуляции аксоногенеза и/или нахождении пути аксонами.
Невелик субнабор генов/белков экспрессируются как в донной, так и верхней пластинке. Сюда входят Slit-1, Slit-2, Slit-3 , NPN-2, B-class ephrins, Annexin IV ,
BMP-6 и VEMA. Каждый из этих белков м. играть важную роль в регуляции нахождения путей аксонами. Действительно, Slits, Neuropilin-2,B-class ephrins и BMPs обеспечивают репульсивное наведение аксонов в некоторых нейральных стстемах. Хотя функции Annexin IV и VEMA еще неизвестны, очень вероятно, что их экспрессия в вентральной и дорсальной срединных линиях м. указывать на важную роль в ведении аксонов.
В связм с гетерогенностью комиссуральных нейронов было установлено, что basic-helix-loop белки, Math1 и Ngn1 а также paired-box
domain-содержащие гены Pax-3 и Pax-7 экспрессируются в перекрывающихся популяциях предшественников дорсальных комиссуральных нейронов, тогда как гомеобокс-содержащий ген Dbx1 экспрессируется в популяциях вентральных и дорсальных предшественников. Регуляторные элементы от каждого из этих генов обнаруживают способность управлять экспрессие репортерного гена в нейрональных популяциях, которые всегда дают аксоны, пересекаюдщие донную пластинку у трансгенных мышей. Более того, некоторые классы комиссуральных нейронов, которые скорее всего возникают из MATH1 и Ngn1-позитивных популяций предшественников, м.б. отличены по экспрессии LIM гомеодоменовых генов LH2A и LH2Bи возможно Lim1.
Известно, что верхняя пластинка контролирует спецификацию популяции предшественников дорсальных комиссуральных нейронов, о путях их миграции и дифференцировке известно мало. Локализовано несколько комиссуральных ассоциированных с наведением аксонов рецепторов в разивающемся спинном мозге грызунов, выявлена также молекулярная гетрогенность среди комиссуральных нейронов. Перекрывающиеся паттерны экспрессии DCC и TAG-1 белков прдопредеяют дорсо-медиальные популяции комиссуральных нейронов, тогда как распределение Robo-2, Neuropilin-2, EphB1 и L1 мРНК, по-видимому, маркирует множественные,частично перекрывающиеся субнаборы комиссуральных нейронов в более латеральных областях спинного мозга. В дополнение, 65-kD изоформа glutamic acid
decarboxylase (GAD65) , как установлено, является специфическим маркером рано развивающейся и вентрально локализованной популяции комиссуральных аксонов в развивающемся спинном мозге крыс.
Важно скоррелировать траектории специфических популяций иписилатерально- и контралатерально-проецирующихся интернейронов с паттернами экспрессии (мРНК и белка) специфических регуляторных генов, guidance рецепторами, или нейротрансмиттерами у мышей дикого типа.
Экспрессия некоторых рецепторов клеточной поверхности пространственно разделена вдоль аксонов, которые проходят вблизи срединной линии (Рис. 3). Тонкий пространственный контроль экспрессии рецепторов создает мощный механизм, с помощью которого ищущие путь ростовые конусы м. реагировать в ограниченных точках вдоль их траектории, с симметрично распределенными сигналами наведения. Имеются указания, что аксоны контактируют со специализированными клетками срединной линии скорее всего для регуляции сегмент-специфической экспрессии различных guidance рецепторов. Пространственная регуляция экспрессии аксональных рецепторов плохо охарактеризована и м.б видо-специфичной. Напр., "TAG-1-L1 switch", выявленный в спинном мозге грызунов, указывает на то, что TAG-1 и L1 присутствуют в определенных, неперекрывающихся сегментах одного и того же аксона. Однако, это не подтверждено непосредственно. переключение TAG-1 на L1, по-видимоу, не происходит у эмбрионов кур и TAG-1 продолжает экспрессироваться в пересекающих сегментах комиссуральных аксонов в разивающемся спинном мозге человека.
Установлено, что белки, которые продуцируются клетками срединной линии, затме м. появиться на поверхности комиссуральных ростовых конусов/аксонов. Напр., Comm, Slit и Netrins обнаруживаются в пересекших сегментах комиссуральных аксонов в вентральном нервном тяже Drosophila. Кроме того, экспрессия Tg4 трансгена, который обычно ограничен клетками донной пластинки спинного мозна мыши, начинают обнаруживаться на комиссуральных аксонах примерно в то время, когда они пересекают вентральную срединную линию. Это подтверждает интимную связь между клетками срединной линии и комиссуральными аксонами. Напр., в предложенной выше модели перенос Comm на комиссуральные аксоны облегчает подавление активности Robo, что в свою очередь способствует пересечению срединной линии. Учитывая, что удаление Robo м. происходить одновременно с самыми перыми контактами комиссуральных ростовых конусов/аксонов с клетками срединной линии, предполагается, что перенос Comm и последующая cointernalization Comm и Robo комплекса м., фактически, представлять собой наиболее эффективный путь наблюдаемой быстрой модуляции уровней рецепторов; Comm-независимый механизм не согласуется по временным рамкам с пересечением срединной линии, т.к. скорее всего он связан с сигналами от тел клеток комиисуральных нейронов к аксонам.
Необходимо дальнейшее выяснение механизмов, которые регулируют перенос белков на комиссуральные аксоны.
После пересечения донной пластинки комиссуральны аксоны меняют направление роста. Ни клеточные, ни молекулярные механизмы, лежащие в основе этого решения о смене направления роста, неизвестны. Предполагается, что локальные контакт-зависимые взаимодействия м. объяснить наблюдаемую полярность проекций после пересечения. Напр., из небольшого количества комиссуральных аксонов, которое распространяется продольно в области, первоначально занимаемой донной пластинкой у Gli2 гомозиготных мышей, существенная фракция несоответственно направляется в каудальном направлении. Это указывает на то, что донная пластинка и/или VIR клетки регулируют направление роста комиссуральных аксонов на контралатеральной стороне от срединной линии. Недавно in vitro установлено, что локальные направлющие сигналы направляют в ростральную сторону проекции допаминэргических аксонов в среднем мозге крыс. Ошибки ростро-каудального направления роста выявлены в спинном мозгу NPN-2-дефицитных мышей. Они м.б. просто вторичным следствием axons остановки аксонов в донной пластинке. Следует также отметить, что vab-8 ген контролирует направленный каудально рост аксонов у C. elegans и кодирует множественные внутриклеточные кинезин-подобные белки.
М. полагать, что гомолог vab-8 или очень близкий ген у млекопитающих регулирует полярность пересекших срединную линию комиссуральных проекций.
В спинном мозге рыбок данио комиссуральные аксоны, перейдя срединную линию, затем следуют по диагональной траектории кпереди и дорсально. Достигнув дорсальной части спиннго мозга эти аксоны поворачивают и растут вдоль продольного тракта волокон.
Перепроверака роста подобных аксонов у развивающихся мышей и кур показала, что пересекшие комиссуральные аксоны идут по сложной траектории, которая очень напоминает ту, что наблюдается в спинном мозге рыб.
Reprinted with permission
from Matise MP, Lustig M, Sakurai T, Grumet M, Joyner AL.
Ventral midline cells are required for the local control of commissural
axon guidance in the mouse spinal cord. Development 126:3649-3659.
Copyright 1999 The Company of Biologists Limited. 
)
)
)
)
)
)
)
)
(тирозин с двумя случайными аминокислотами и гидрофобной аминокислотой), в цитоплазматическом домене Comm . Это место обеспечивает ассоциацию различных белков с Adaptin/Clathrin комплексами, которые затем обеспечивают его быстрый жндоцитоз. Дикого типа Comm, но не укороченная мутантная форма, в которой отсутствует YXX