LOOKING BACK TO THE EMBRYO: DEFINING TRANSCRIPTIONAL NETWORKS IN ADULT MYOGENESIS
Patrick Seale & Michael A. Rudnicki Nature Reviews Genetics4, No 7, 497 -507 (2003); doi:10.1038/nrg1109
Skeletal muscle has an intrinsic capacity for regeneration following injury or exercise. The presence of adult stem cells in various tissues with myogenic potential provides new opportunities for cell-based therapies to treat muscle disease. Recent studies have shown a conserved transcriptional hierarchy that regulates the myogenic differentiation of both embryonic and adult stem cells. Importantly, the molecules and signalling pathways that induce myogenic determination in the embryo might be manipulated or mimicked to direct the differentiation of adult stem cells either in vivo or ex vivo
В ответ на повреждения мышц специализированные взрослые миогенные предшественники, известные как сателиттные клетки, активируют миогенную программу транскрипции, которая является аналогичной той, что индуцируется во время эмбрионального и плодного развития мышц.
Или MyoD или Myf5 необходимы для детерминации скелетных миогенныех клеток; в отсутствие обоих транскрипционных факторов клетки предшественники приобретают не-мышечную судьбу.
Pax3 и Myf5 функционирют выше MyoD iво время эмбрионального миогенеза. Pax3 необходим для пролиферации, выживания и спецификации стволовых клеток в пресомитной мезодерме.
Shh непосредственно активирует транскрипцию Myf5 посредством специфического Gli1 связывающего сайта epaxial somite enhancer.
Aктивация нескольких сигнальных путей — включая Wnt, Hedgehog, BMP и Notch каскады — и предопределяет баланс между детерминацией, пролиферацией, выживаемостью и дифференцировкой мышечных предшественников в сомитах.
Pax7 необходим для развития сателиттных клеток взрослых мышц, которые фунеционируют во время постнатального роста и репарируют скелетные мышечнце волокна.
MyoD необходим для регенрации взрослых мышц путем обеспечения миогенной дифференцировки сателиттных клеток - производных миобластов.
Активирование или модулирование сигнальных путей, которые участвуют в формировании эмбриональных и плодных мышц, м. представлять собой пригодную терапевтическую стратегию для получения мышечных клеток из взрослых стволовых клеток или in vivo или ex vivo.
(Рис.1.)The embryonic origin of limb and trunk skeletal muscle.
(Рис.2.)The pathways that regulate Myf5 and MyoD expression.
Box 2 | Muscle hypertrophy
Muscle hypertrophy is defined as an increase in cell size with or without the addition of new myonuclei. In response
to overload during exercise, recent experiments show that calcium (Ca2+) signalling is responsible for inducing
hypertrophy127. Increased Ca2+ stimulates the activity of calcineurin,which causes an association with the GATA-2
transcription factor and thereby regulates gene expression128. Importantly, the increased expression of GATA-2 in
muscle,which is induced either by transgenic expression of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) or during
regeneration, results in muscle hypertrophy and a reduced ageing-related decrease in muscle mass129,130.
Furthermore, recent experiments show a role for calcineurin and nuclear factor of activated T cells (NFAT) in
regulating the expression of Myf5 in satellite cells,which indicates that Myf5 might have a role in hypertrophy as
well as proliferation131. The mechanisms that determine fibre size are obviously complex, and involve both satellitecell
fusion and increased protein synthesis. Further experimentation is required to elucidate the molecular
pathways by which muscle-fibre size is controlled.
Детальное понимание механизмов, которые регулируют скелетной дифференцировкой у эмбриональных и плодных предшественников, является важным фундаментом для изучения довольно сходных сетей индукции миогенеза в стволовых клетках взрослых. Эмбриональные скелетные миогенные клетки возникают из сомитных предшественников в ответ на сигнальные молекулы от соседних структур (Рис. 1). Взрослые миогенные клетки, которые активны во время постнатального роста и регенарации мышц, происходят в основном из мышечных сателитных клеток - специализированного клона миогенных клеток, которые возникают во время позднего плодного развития. Известно, что др. популяции стволовых клеток также м. участововать в регенеративном миогенезе.
В последние годы были описаны компартменты стволовых клеток у взрослых, которые находятся в разных тканях, включая и мышцы. Интенсивные исследования в этой области стимулировались терапевтическим потенциалом стволовых клеток у взрослых для лечения дегенеративных болезней, включая мышечные дистрофии. В частности, работы исслед. группы Mavilio’s впервые показали, что небольшой процент клеток из костного мозга участвует в регенерации мышц (1). Это наблюдение открыло возможность систематического выделения миогенных предшественников для больных мышц. LaBarge и др. обнаружили, что клетки костного мозга дают дифференцированные мышечные волокна посредством миогенного компартмента (2).
Разработка эффективной базирующейся на клетках тератии нуждается в детальном понимании онтогенетических механизмов, которые ответственны за клональное и дифференцировку. Разумно предположить, что сигнальные механизмы и транскрипционные факторы, которые активируют миогенез в эмбриональных клетках м. эксплуатироваться для рекрутирования или непосредственной дифференцировки стволовых клеток взрослых во время регенерации. Более того, мышечный клон является можной системой, в которой используются фундаментальные механизмы, которые регулируют детерминацию и дифференцировку стволовых клеток и имеются хорошо известные молекулярные и морфологические маркеры для каждой онтогенетической стадии.
Кроме того, идентификация молекул и сигнальных путей, которые индуцируют миогенез в стволоых клетках взрослых, проливают свет на общие онтогенетические процессы, которые контролируют возобновление стволовых клеток, и дифференцировку в др. клоны, в частности миогенную .
Anatomy of embryonic myogenesis
Большинство эмбриональных скелетных миогенных предшественников, за исключением некоторых черепнолицевых и пищеводных мышц, формируются из сомитов, которыя являются временными конденсатами , которые образуются с обеих строн нервной трубки у эмбрионов птиц и мышей (3–5). Сомиты дифференцируются вдоль дорсо-вентральной, давая дорсально локализованный эпителиальный дермомиотом и вентрально расположенный склеротом (Рис. 1). Дермомиотом дает дермис и скелетные мышцы туловища и конечностей, тогда как склеротом развивается в хрящ и кости позвонка и рёбер. Недавно описан новый сомитный компартмент предшественников сухожилий, который образуется в разультате взаимодействий между миотомом и склеротомом (6). Миогеннеые предшественники в дермомиотоме экспрессируют Pax3, Pax7 и низкие уровни фактора миогенной детерминации Myf5 (7–10). Клетки дермомиотома, экспрессирующие Pax3, поддерживаются как пролиферативная недифференцированная популяция с помощью сигналов, которые секретируются и поверхностой эктодермы (11).
Еpaxial часть миотома, которая дает глубокие мышцы спины, формируется, когда клетки предшественники из dorsal medial lip (DML) распространяются позади дермомиотома, выходят из клеточного цикла, удлинняются и окончательно дифференуируются (12,13)(Рис. 1). Сходный паттерн событий индуцирует ventral lateral lip (VLL), чтобы сформировать вентральную немиграторную hypaxial асть миотома, которая даёт латеральные мышцы туловища. Клетки из VLL подвергаются также эпителиально-мезенхимному переходу, вычленяются из дермомиотома и мигрируют вентрально в области развития презумптинвых мышц конечностей и вентральной стенки тела, диафрагмы и языка.
Myogenic regulatory factors
Мyogenic regulatory factors (MRFs) — MyoD, Myf5, myogenin и Mrf4 (Myf6) — выполняют хорошо известные роли в оркестровке развития и дифференцировки скелетных мышц. MRFs обладают общим гомологичным bHLH доменом, который необходим для связывания и димеризации ДНК с E-protein семейством транскрипцитонных факторов. MRF–E protein гетеродимеры и MRF мономеры соединяются с консенсусными последовательностями E-box, CANNTG, которые обнаруживаются в промоторах большинства мышце-специфических генов. Связывание ДНК и транскрипционная активность этих димеров высоко регулируется несколькими межбелковыми взаимодействиями и внешними сигналами (14,15).
Хотя MRFs имеют общий гомологичный bHLH домен, они имеют ограниченное функциональное перекрывание, благодраря расхождению последовательностей на их N- и C-концах. Эти домены важны для трансактивации, ремоделирования хроматрна и потенциальных межбелковых взаимодействий (14). Интересно, что высоко законсервированная
C-терминальная amphipathic β-спираль выполняет разные функции в MyoD и myogenin (16). В MyoD эта β-спираль важна для инициации транскрипции с обычно молчащих генов, так что она функционирует как домен спецификации. В myogenin этот домен функционирует как общий домен трансактивации, чтобы амплифицировать уровень экспрессии генов, которые уже экспрессировались и , следовательно, имели уже открытую хроматиновую структуру.
Myocyte enhancer family-2 transcription factors
Также как и MRFs, семейство myocyte enhancer factor-2 (Mef2) транскрипционных факторов участвует в активации экспрессии мышце-специфических генов у мышей (17, 18) и у Drosophila (BOX 1). Mef2 белки экспрессируются во многих тканях, но только в развивающихся сердечных, скелетных и гладких мышцах Mef2 ативируют транскрипцию (17). После рождения экспрессия Mef2 подавляется, но она повторно индуцируется во время регенерации склетных мышц.
Семейства Mef2 и MRFs образуют ауторегуляторную петлю, так что экспрессия Myog (myogenin) и Mrf4 (Myf6) зависит от обоих наборов транскрипционных факторов (19,20). Важно, что в MyoD-конвертированных фибробластах, в которых отсутствует продукт гена retinoblastoma (Rb), и в которых активность MyoD подавлена и дифференцировка поздней фазы отсутствует, Mef2 является функционально неактивным (21,22). Эти наблюдаения указывают на то, что MRFs действуют сочетанно с семейством Mef2 в оркестрировании дифференцировки.
Установлено также, что Mef2 функционируют вместе с peroxisome proliferator activated receptor-γ co-activator-1β' (PGC-1β), чтобы управлять экспрессией генов, специфичных для медленных мышц взрослых (23). PGC-1β активируется во время упражнений и является мишенью для передачи сигналов calcineurin, чтобы обеспечить специализацию взрослых мышечных волокон (BOX 2). Роль PGC-1β в качестве регулятора онтогенетических программ медленно сокращающихся мышц представляет новую стратегию транскрипционной регуляции, когда ко-факторы, которые лишены внутренне присущей ДНК-связывающей активности, обеспечивают использование тканеспецифичных транскрипционных факторов, чтобы активировать гены-мишени.
Embryonic function of the MRFs
Мыши, у которых отсутствует и MyoD и Myf5, полностью лишены склетных мышц, это иллюстрирует важную роль MyoD и Myf5 в миогенной спецификации. Получены MyoD–/–;Myf5–/– нокаутные мыши, которые несут LacZ трансген, экспрессируемый под контролем регуляторных элементов MyoD (24). У таких эмбрионов, презумптивные LacZ-экспрессирующие мышечные предшественники приобретают немышечные клеточные , это указывает на то, что или MyoD или Myf5 белок необходим для спецификации мышц. Сходные эксперименты с использованием LacZ репортера, который экспрессируются с Myf5 локуса у Myf5nLacZ мышей, показали, что Myf5 экспрессируется во всех эмбриональных мышцах (25). Небольшие количества LacZ-экспрессирующих клеток найдены в рёбрах Myf5-дефицитных Myf5nLacZ/nLacZ мышей, это указывает на существнную роль Myf5 в миогенной спецификации. Дальнейший анализ MyoD–/– и Myf5–/– мышц показал присутствие отдельных MyoD- и Myf5-зависимых клонов для образования hypaxial и epaxial мышц, соотв. (26,27).
После того как миогнееые клетки были специфицированы, развитие скелетных мышц требует дифференцировки и слияния предшественников для образования мультиядерных и . Мыши, у которых отсутствует myogenin, погибают перинатально из-за тяжелой потери дифференцированных мышечных волокон, при этом они имеют нормальные количества недифференцированных миобластов. Следовательно, миогенеин играет важную роль в дифференцировке скорее, чем в спецификации (28,29). Дефицитные по Mrf4 (Myf6) мыши имеют наборы фенотипов, согласующиеся с его ролью в , слиянии и поддержании миофибрил (30–32) (обзор по MRFs в развитии эмбриональных мышц в REF. 5).
Embryonic activation of the MRFs
Промоторные элементы MRF были слиты с LacZ репортерным геном и внесены в качестве трансгена мышам, чтобы охарактеризовать cis–regulatory области, которые необходимы для экспрессии в эмбрионоальных и взрослых стволовых клетках. У
Myf5nlacZ мышей — у которых LacZ репортер был купирован с эндогенным локусом Myf5 — репортерный ген экспрессировался во всех скелетных мышцах, даже после рождения (33).
Далее в окружении Myf5 был выявлен механизм, обеспечивающий инициацию и регуляцию его экспрессии. Отдельные элементы оказались ответственными за экспрессию epaxial myotome, hypaxial myotome, бранхиальных дуг и кончностей (34–36).
Сигналы от нервной трубки и хорды активируют epaxial миогенез в дорсальном медиальном домене солмитов. Отметим, что отсутствие хорды или дефект дифференцировки нервной трубки и хорды предупреждают epaxial миогенез (37–39). Хорда и донная пластинка продуцируют Sonic hedgehog (Shh), который необходим для экспрессии Myf5 в epaxial мышечных предшественниках (40) (Рис. 2a). Shh не способен активировать транскрипцию MyoD в Myf5–/– сомитах, это указывает на то, что Shh индуцирует миогенез специфически через Myf5. Важно, что передача сигналов Shh активирует экспрессию Myf5 непосредственно через семейство Gli регуляторов транскрипции, a специфические Gli1 связывающие сайты идентифицированы в Myf5 энхансере epaxial сомитов (41) (Рис. 2a).
Chiang и др. показали, что мышу у которых отсуствует Shh, не имеют epaxial мускулатуры в дорсальных областях сомитов (42). Однако, Kruger и др. показали, что экспрессия Myf5 снижена, но не отсутствует в epaxial домене Shh-нулевых мышей (43).Интересно, что эти мыши обнаруживали также потерю hypaxial мускулатуры, это указывает на то, что формирование hypaxial мышц м. зависеть, по ркйней мере частично, от экспрессии Myf5. Исследования на эмбрионоах кур показали, что Shh участвует в пролиферации мышечных клеток и поэтому исчезновение hypaxial мускулатуры у Shh-нулевых мышей м.б. просто результатом уменьшения пролиферации перед дифференцировкой (44).
Сигналы от латеральной пластинки мезодермы и дорсальной эктодермы в комбинации регулируют образование hypaxial мускулатуры. Дорсальная эктодерма продуцирует сигналы, которые стимулируют миогенез и активируют экспрессию MyoD (Рис. 2b), тогда как молекулы, происходящие от латеральной пластинки мезодермы ингибируют миогенез (45–47). Сигналы от дорсальной эктодермы м.б. воспроизведены с помощью Wnt-4,Wnt-6 and Wnt-7a (48). Особенно, Wnt-7a активирует экспрессию MyoD в эксплантатах параксиальной мезодермы, которая в свою очередь ведет к ко-экспрессии и MyoD и Myf5. Soluble Frizzled-related proteins (sFRPs), которые специфически блокируют передачу сигналов Wnt, ингибируют миогенез в эксплантатах сомитной мезодермы или только что сформированных сомитов (49) (Рис. 2b). Более того, инъекции sFRP-трансфицированных клеток в плаценту беременных самок блокирует миогенез (49). Ингибирование миогенеза с помошью sFRPs сопровождается подавлением Noggin (Nog) и Myf5, с отсутствием влияния на экспрессию или Pax3 или mesenchyme homeobox-1
(Mox-1, известного также как Meox1). Это указывает на то, что прерывание передачи сигналов Wnt с помолщью sFRPs м. не менять ранние аспекты клональной спецификации, такие как экспрессиия Pax3, но будет нарушать миогенез, блокируя экспрессию Myf5 и MyoD.
Вone morphogenic proteins (BMPs), включая Bmp-2, Bmp-4 and Bmp-7, м. замещать игибирующую активность латеральной пластинки мезодермы и тем самым предупреждать преждевременную активацию MyoD, поддерживая тем самым экспрессию Pax3
(46,50,51). Это указывает на то, что BMPs м. функционировать, создавая достаточные количества миогенных предшественников перед терминальной дифференцировкой. Более того, noggin, секретируемы антагонист BMP, экспрессируется в DML под контролем сигналов Wnt и облегчает экспрессию MyoD (52,53). Воздействие на развивающиеся сомиты избытком noggin индуцирует преждевременную дифференцировку и предупреждает необходимое увеличение миобластов. Более того, мыши Nog –/– имеют сильное снижение дифференцировки
epaxial частей миотомов (54).
Путь передачи сигналов Notch также негативно регулирует мышечную дифференцировку посредством регуляции экспрессии MyoD. Избыточная экспрессия Notch лиганда
DELTA-1 в сомитах эмбрионов кур ингибирует экспрессию MYOD в миотомах и блокирует дифференцировку и тем самым сохраняется экспрессия PAX3 и MYF5 и формируется миотомная структура (10). Избыточная экспрессиия DELTA-1 в конечностях сходным образом ингибирует дифференцировку, это показывает, что передача сигналов Notch м. участововать во временном контроле дифференцировки склелетных мышц (55). Всё это указывает на то, что экспрессия во времени Shh, Wnts, BMPs и noggin в эмбриональных мышечных полях м. тонко нотролироваться, чтобы гарантировать соответствующую экспансию и дифференцировку миогенных клеток.
Регуляция экспрессии MRF также обеспечивается посредством through Msx1, гомеобоксного транскрипционного фактора, который экспрессируется в латеральном домене дермомиотоме и клетках предшественниках, которые мигрируют в зачатки конечностей (56,57). Эктопический Msx1 подавляет экспрессию MyoD и ингибирует дифференцировку без изменения экспрессии Pax3 (57). Напротив, эктопическая экспрессия Pax3 индуцирует преждевременную активацию экспрессии MyoD без нарушения развития мышц. Более того, ко-экспрессия Pax3 и Msx1 не меняет экспрессии MyoD или развитие скелетных мышц. Далее была установлена физическая ассоциация между Msx1 и Pax3 белками; которая блокирует позитивную активность Pax3 и негативную активность Msx1 (57).
Интересно, что избыточная экспрессиия Msx1 в мышечных трубках, которые произошли из C2C12 линии миобластных клеток, подавляет экспрессию MRF, и, как полагают, запускает де-дифференцировку многоядерных мышечных трубок в одноядерные клетки
(58,59). Отметим, что эти клетки оказываются способными снова вступать в клеточный цикл и повторно дифференцироваться в , , и миогенные клетки. Это указывает на то, что Msx1 функционирует, чтобы гарантировать соответ. экспансию миогенных предшественников до их арместа и дифференцировки.
Следовательно, конкурирующее действие Msx1, BMPs, Notch/Delta пути и noggin,направлено на ограничение экспрессии MRF. Это особенно важно для ингибирования дифференцировки и достижения достаточного количества мышечных предшественников, мигрирующих в миотом и в зачатки конечностей перед дифференцировкой. Количества клеток, которые мигрируют в места миогенеза hypaxial или конечностей мышц, малы по сравнению с массой мышц, которые дифференцируются во время миогенеза, это указывает на то, что эти мышечные предшественники значительно пролифереируют до начала дифференцировки. Интересно, что эти предшественники экспрессируют Myf5, но не MyoD, и эта экспрессия в основном регулируется посредством сигнальных молекул и транскрипционных факторов, таких как Pax3 и Pax7. у птиц Myf5 экспрессируется в пролиферирующих предшественниках, тогда как MyoD экспрессируется в дифференцированных мышцах, это указывает на то, что MyoD м. действовать ниже Myf5, чтобы индуцировать дифференцировку, тогда как Myf5 необходим для пролиферации и поддержания спецификации миогенного клона до дифференцировки (55).
Pax functions upstream of the MRFs
Хотя MyoD и Myf5 предопределяют качественные особенности скелетных миобластов, сомитные предшественники м.б. ‘предетермирнированы’ в миогенный клон до экспрессии MRF.
У эмбрионов paired-box транскрипционный фактор Pax3 экспрессируется в пресомитной мезодерме и ранних эпителиальных сомитах (8,60). У Pax3-дефаицитных splotch мышей мышцы конечностей и диафрагмы не образуются из-за нарушения латеральной миграции и снижения пролиферации в дермомиотоме (61–63). Pax7, паралог Pax3, не экспрессируется в пресомитнрой мезодерме, но индуцируется во время созревания сомитов (7). Интересно, что
Pax7 является несущественным во время эмбрионального миогенеза, однако его активность существенна для формирования постнатальных мышц (64).
В пресомитных эксплантах от splotch эмбрионов, сигналы от нервной трубки и поверхностной эктодермы не способны активировать экспрессиию MyoD (65). Более того, Pax3 необходим для экспрессии MyoD в отсутствие Myf5 во время развития эмбриональных мышц тела, это указывает на то, что и Pax3 и Myf5 функционируют выше MyoD (66). Важно, что эктопическая экспрессия Pax3 в эмбриональных тканях активирует экспрессию MyoD, Myf5 и Myog (57,67). Интересно, что Pax3 не индуцирует экспрессию MyoD в дермомиотоме, это указывает на то, что или специфические ко-активаторы, необходимые для миогенной индукции, или конкурирующие ингибирующие сигналы — такие как BMPs, Delta/Notch и Msx1 — м. предупреждать активацию MyoD. Более того, Pax3 необходим и достаточен для миогенеза в плюрипотентных эмбриональных P19 клеточных культурах (68). Всё это говорит о критической роли Pax3 в миогенной спецификации.
В дальнейших исследованиях был выявлен повышенный уровень апоптоза в сомитах эмбрионов splotch, в областях, которые не экспрессируют Pax7, это указывает на то, что
активность Pax является критической для выживания популяции предшественников (65). Итак, избирательная выживаемость Pax-экспрессирующей популяции предшественников м.б. законсервирована онтогенетическим механизмом для спецификации клонов. Напротив, неспособность активировать миогенную программу м.б. ответственной за наблюдаемую апоптическую реакцию недетерминированных клеток. Необходимо идентифицировать мишени для Pax3 и Pax7 в миогенных стволовых клетках.
Точные функции Pax3 и Pax7 в регуляции миогенеза остаются неясными. Сами по себе Pax3 и Pax7 являются досольно слабыми транскрипционными активаторами, а при некоторых услорвиях функционируют как транскрипционные репрессоры (69). Мыши, которые экспрессируют активированную форму Pax3, и в которых forkhead (FKHR) домен транскрипционной активации слит с Pax3 ДНК-связывающей областью, имеют уродства некоторых, но не всех hypaxial мышц (70). В исследованиях клеточных культур активированный Pax3–FKHR индуцирует экспрессию MyoD, Myog и Six1, который является гомеобокс-содержащим транскрипционным фактором (71).
Изучение P19 эмбриональных карциномных клеток выявило некоторые компоненты, который функционируют выше и ниже Pax3 в миогенной спецификации. В частности, Pax3 регулирует экспрессию Six1 и Eya2 ещё до активации MyoD и миогенеза (68). В свою очередь активация Pax3, также как и Six1 и Gli2, регулируется с помощью Wnt-3a или β-catenin (72,73). Six1 синергично экспрессируется с Eya2, который взаимодействует с Dach2, чтобы активировать экспрессию MyoD и Myog in vivo и in vitro (74–76). Недавно описана тяжелая мышечная гипоплазия и дефицит развития hypaxial мышц у Six1-дефицитных мышей, это чётко указывает на роль Six1 в регуляции эмбрионального миогенеза (77). Динамика экспрессии Pax3, Six1, Eya2 и Dach2, и их взаимодействия др. с др., чтобы активировать мышце-специфические гены, необходимо ещё тщательно проанализировтаь.
Итак, Wnt обусловленная активация пути β-catenin м. активировать экспрессию
Pax3, который в свою очередь регулирует MyoD, Six1 и Eya2, ведущие к экспрессии Myog и обязательной миогенной дифференцировке. Это также указывает на то, что Pax3-обусловленный миогенез нуждается в окружении, в котором Dach2, Eya2 и Six1 м.б. активированы. Это особенно интересно в свете того факта, что хотя Pax3 и м. индуцировать экспрессию MRF в параксиальной мезодерме и в P19 клетках, но Pax3 недостаточен для индукции миогенеза в 10T1/2 фибробластах (67). Идентификация компонентов Pax транскрипционного комплекса во взрослых и эмбриональных миогенных клетках необходима для более полного понимания функции Pax в миогенезе.
Pax3, c-Met and Lbx1 in migration
Экспресиия Pax3 в миграторных предшественниках и тяжелдые дефекты миграции у splotch мышей указывают на роль Pax3 в этом процессе. Вычленение и миграция также зависят от активности c-Met рецептора и его лиганда, hepatocyte growth factor (Hgf). Мыши с отсутствием c-Met или Hgf лишены мышц конечностей (78). Важно, что экспрессия c-Met регулируется с помощью Pax3 (79). Недавние исследования также показали, что Pax3 контролирует экспрессию ladybird (Lbx1), гомеобокс-содержащего транскрипционного фактора, который экспрессируется в мигрирующих предшественниках мышц конечностей (80). Pax3-дефицитные мыши экспрессируют низкие уровни c-Met в зачатках конечности, а Lbx1 (Lbx1h) транскрипты отсутствуют совсем. У c-Met-нулевых мышей, Lbx1 экспрессируется в миграторных предшественниках из VLL, это указывает на то, что Lbx1 м.б.непосредственной мишенью Pax3. Было предположено, что функция Pax3 и Lbx1
увеличивает количество клеток в популяции предшественников мышц конечностей и что они необходимы для миогенной активациии (81).
Lbx1-дефицитные обнаруживают обширную потерю мышц конечностей, это указывает на т, что Lbx1 необходим для латеральной миграции (81–83). Клетки миогенных предшественников вычленяются, но мигрируют аномально, это указывает на то, что Lbx1
м. действовать так, интерпретируя сигналы от почки конечности. Кроме того, не все клетки миогенных предшественников, которые участвуют в миграции на дальние расстояния, затрагиваются потерей Lbx1, это указывает на то, что м.б. молекулярные отличия между типами мышц, специфичными для мышц задних и передних конечностей (84).
Adult myogenesis: muscle satellite cells
Специализированная популяция миогенных стволовых клеток, называемых satellite клетками, как принято считать, дает все постнатальные миогенные предшественники. Однако недавно было установлено, что имеются независимые стволовые клетки у взрослых в мышцах и костном мозге, которые также м. вступать в миогенез в поврежденных и больных мышцах. Сателлитные клетки возникают во время поздней стадии эмбриогенеза у мышей и кур, они высоко активны во время постнатального роста мышечной ткани, так что они обеспечивют большую часть миоядер во взрослых мышцах (85–88). Во взрослых мышцах однако молчащие сателлитные клетки поддерживаются в тесной ассоциации с соседними мышечными волокнами, которые находятся между plasmalemma (мембраной) и базальной lamina (Рис. 3d).
Онтогенетическое происхождение сателлитных клеток в ранних экспериментах с перепел-куры химерами было отнесено к сомитам (89). Однако в недавних исследованиях De Angelis et al. получены доказательства того, что сателлитные клетки м. происходить из клеток, которые ассоциируют с эмбюриональной васкулатурой, включая дорсальную аорту (90). Интересно, что дорсальная аорта колонизируется миграторной популяцией , которые происходят из параксиальной мезодермы (91). Следовательно, присутствие миогенных клеток в эксплантах дорсальной аорты не устраняет возможности непрямого сомитного происхождения сателлитных клеток. Более того, недавно описана гетерогенность популяций сателлитных клеток, которая м. отражать разные онтогенетические источники для этих клонов (92).
MRFs in the satellite-cell lineage
Профиль экспрессии MRF в клоне сателлитных указывает на то, что эти клетки м. обладать общей программой развития с клонами эмбриональных мышц. Молчащие сателлитные клетки не экспрессируют обнаружимые уровни MRF белков или транскриптов (93,94). Однако в ответ на повреждения мышц активированные сателлитные клетки детерминируются в направлении миогенного клона и экспрессируют или MyoD или Myf5 до вступления в клеточный цикл (87,93,95 (Рис. 4)). Ко-экспрессиия MyoD и Myf5 в предшественниках, происходящих из сателлитных клеток, обусловливает их пролифериацию в ответ на действие нескольких ростоых факторов и цитокинов (87,95). Активация нижестоящих MRFs, myogenin и Mrf4, ассоциирует с терминальной дифференцировкой и слиянием клеток миогенных предшественников с новыми или с уже имеющимися волокнами.
Анализ регенерации в MyoD-дефицитных мышцах выявляет существенную роль MyoD в регуляции миогенеза у взрослых. Особенно повышенные количества сателлитных клеток и дефектные регенеративные процессы в мышцах мышей, у которых отсутствует MyoD (MyoD–/–), или MyoD и dystrophin (MyoD–/–;Dmd–/–) , показывают, что MyoD-дефицитные сателиттные клетки м.иметь повышенную склонность к самообнослению скорее, чем к дифференцировке (96). Показано нарушение дифференцировки культивируемых MyoD–/– миобластов, происходящих из сателлитных клеток с сопутствующим увеличением экспрессии Myf5 (97–99). Жизнеспособные Myf5-дефицитные мыши получены недавно, но анализ функции Myf5 во взрослом миогенещзе ещё не осуществлен (100). Недавние исследования, с использованием масиисвов генов выявили профили транскриптов в регенерирующих мышцах и идентифицировали транскрипционный фактор Slug (Snai2) в качестве потенциального гена мишени для MyoD во время регенерации (101). В подтвержюдение этого, Slug-дефицитные мышцы оказались неспособными к регенерации.
Обсуждаются потенциально отличающиеся роли MyoD и Myf5 во время пролиферации и дифференцировки миобластов. Интересно, что пул
LacZ-экспрессирующих epaxial миогенных предшественников снижен в отсутствие Myf5 у Myf5nLacZ/nLacZ эмбрионов, это указывает на то, что функцией Myf5 в миобластах является пролиферация (33). Согласуется с этим и то, что взрослые MyoD–/– миобласты, которые экспрессируют высокие уровни Myf5, пролиферируют быстро, а дифференцируются плохо, тогда как Myf5–/–
миобласы, которые обнаруживаются у новорожденных мышей, имеют пониженный пролиферативный потенциал (l97–99,102). Это м. указывать на то, чтоактивность Myf5 способствует пролиферации миобластов, тогда как MyoD преимущественно мндуцирует арест клеточного цикла и дифференцировку. Интересно, что MyoD активирует миогенную дифференцировку в фибробластах более эффективно, чем это делает Myf5 (R.L. S.Perry,
M.H.P. and M.A.R., неопубл.).
Чтобы идентифицировать гены, которые специфически индуцируются с помощью MyoD, Bergstrom и др. использовали gene-array технологию для выявления транскрипционных профилей MyoD–/–;Myf5–/– фибробластов, которые экспрессируют эстьрадиолом индуцируемую форму MyoD (MyoD-ER)(103). Было установлено, что MyoD регулирует экспрессию нескольких кластеров генов, которые в комбинации управляют дифференцировкой2. Интересно, что путь p38 сигнальной трансдукции специфически регулирует субнабор или кластер генов, которые состоят в основном из мышечных структурных генов. Предполагается. что MyoD м. действовать как репрессор, активатор или регулируемый активатор и что его активность предопределяется частично содержимым промотора.
Self-renewal of satellite cells
Отсутствие экспрессии MRF в сателлитных клетках указывает на то, что они м. представлять собой indicates
that they might represent или
. Недавно выявлена мультипотентная способность сателлитных клеток дифференцироваться в остеогенные или адипогенные типы клеток (104,105). Поддержание количества сателлитных клеток в старых мышцах после повторных циклов дегенераций и регнераций указывает на то. что сателлитные клетки имеют внутренне присущую способность сомо-обновления (86). Показано также, что асимметричное распределение белка Numb в активированных сателлитных клетках, также как и дифференциальная активность Notch участвуют в асимметричных делениях клеток для генерации разных дочерних клеток для самообновления и для дифференцировки (106). Роль Numb в регуляции асимметричных делений хорошо известна у Drosophila и млекопитающих в ЦНС(107–109). В сателлитных клетках активированный Notch-1 способствует пролиферации сомообновляющихся клеток, которые экспрессируют Pax3, но не Numb, Desmin (Des), Myf5 и MyoD; его ингибирование даёт в результате миогенную детерминацию и дифференциацию, на это указывает экспрессия Numb,
Desmin и Myf5, но не Pax3. Сходным образом активация пути Notch в эмбриональном развитии специфически ингибирует экспрессию MyoD, но не оказывает влияния на экспрессию Myf5 или Pax3, которые предупреждают дифференцировку и поддерживают пролиферацию.
Pax7 in satellite-cell development
Развитие клона сателлитных клеток зависит от активности paired-box транскрипционного фактора,Pax7 (64). Белок Pax7 экспрессируется в молчащих и активированных сателлитных клетках (Рис. 3a–c). Анализ Pax7-дефицитных животных показал полное отсутствие сателлитных клеток во всех изученных группах мышц (64). Это указывает на то, что Pax7 м. функционировать, специфицируя сателлитные клетки выше MRFs, по способу, сходному с тем, что у обнаружен для Pax3 в эмбриональных предшествнниках. Эксперименты с использованием Pax3nLacZ трансгенных мышей — в которых LacZ репортерный ген экспрессируется с Pax3 локуса — показали, что Pax3 также м. экспрессироваться в некоторых сателлитных клетках (110). Однако ни эндогенный белок, ни мРНК не выявлены в сателлитных клетках. Несмотря на возможную экспрессию Pax3 в сателлитных клетках, его активности недостаточно для функциональной компенсации потери Pax7 в компартменте сателлитных клеток или для постнатального мышечного роста и регенерации в больширнстве групп мышц.
Нижестоящие генетические пути, которые регулируются белками Pax как в эмбриональных, так и взрослых мышцах остаются в основном неизвестными. Известно, что передача сигналов HGF/c-Met важна для активациии сателлитных клеток (111–113) и м. предполагать, что его участие в спецификации Pax7м. регулировать миграцию и активацию сателлитных клеток в ответ на повреждения посреством c-Met. Это м.б. сходным с функцией Pax3 в активации экспрессии Lbx1, которая важна для миграции предшественников в конечности.
Satellite-cell versus embryonic myogenesis
Хотя очевидно, что сходные транскрипционные пути понтролируют миогенную дифференцировку в эмбриональных и взрослых предшественниках, но имеются и определенные развличия. Напр., MyoD не является абсолютно необходимым для эмбрионального и плодного миогенеза, благодаря компенсаторной функции Myf5 (114). Однако взрослые MyoD–/– мышцы обнаруживают выраженный дефицит регенерации, это указывает на уникальную функцию MyoD во взрослых миобластах (96). Также и Pax7 необходим для онтогенеза сателлитных клеток, тогда как его активность несущественна для формирования эмбриональных и плодных миобластов. Важным свойством гомеостаза взрослых тканей является необходимость в сохраниении и постоянном поддержании стволовых клеток, преимущественно за счёт асимметричных делений. Во время регенеративной реакции активированные сателлитные клетки детерминируются в миобласты или взрослые стволовые клетки, которые будут дваать новые сателлитные клетки. Такой механизм, использующий специфическую транскрипционную программу, не активен в эмбириональных и плодных миобластах.
Adult stem cells participate in muscle repair
Хотя сателлитные клетки выполняют чёткую роль в постнатальном росте и регенерации скелетных мышц, существуют независимые популяции стволовых клеток с миогенным потенциалом, они недавно были выделены скелетных мышц и др. тканей и очищены. Идентификация и характреистика стволовых клеток взрослых с миогенным потенциалом м. б. использовано для терапии миопатий. Быстрая гибель и недостаточная dissemination сателлитных клеток миогенных предшественников после их трансплантации в мышцы указывает на то, что терапия живыми клетками мышц нуждается в том. чтобы они были способными высвыбождать предшественники скелетных мышц из кровообащения (115).
Ferrari et al.(1), Bittner et al.(116) and Gussoni et al.(117) выявили вклад клеток. происходящих из костного мозга, в регенерацию мышц. La Barge et al. показали, что клетки из костного мозга м. формировать сателлитные клетки в скелетных мышцах после упражнений (2). Способность стволовых клеток костного мозга сначала дифференцироваться в сателлитные клетки ведет к возобновлению источника миогенных предшественников.
Такие же миогенные предшественники, что происходят из костного мозга, выявлены в виде популяции стволовых клеток в скелетных мышцах. Неспособность циркулрующих в крови клеток восстанавливать пул стволовых клеток и способствовать регенерации мышц после локального облучения конечностей указывает на то, что стволовые клетки, которые ответственны за регенерацию мышц располагаются в ткани (118,119).
Side-population (SP) клетки из костного мозга, которые отобраны на базе дифференциального исключения краски Hoechst, были обогащены долговременными repopulating стволовых клеток (120,121). Gussoni et al.первыми показали, что изоляты SP клеток из скелетных мышц также обогащtys стволовыми клетками, которые эффективно восстанавливают кровеносную систему облучённых мышей и участвуют в регенеративном миогенезе (117). Более того, мышечные SP клетки обладают способностью формировать сателлитные клетки после внутримышечных или внутивенных трансплантаций (117,122). Др. популяции мышечных клеток, выделены на базе экспрессии маркёров клеточной поверхности, включая CD34 и Sca1, они описаны, как обладающие характеристиками стволовых клеток (123,124). Все эти популяции стволовых клеток однако ещё плоххо изучены. Неясно, играют ли какую-нибудь физиологическую роль они в нормальном развитии и регенерации скелетных мышц. Имеется ли общие, происходящие из мышц, предшественники, дающие как кровяной, так и мышечный клон.
Уже высказывалось предположение, что стволовые клетки у взрослых м. функционировать в качестве предшественников для сателлитных клеток. Согласно нашей гипотезе индукция активности генов Pax в стволовых клетках из склетных мышц взрослых м. способстовать их детерминации в сателлитные клетки (Рис. 4). Наблюдаемая дифференцировка клеток костного мозга в сателлитные клетки после повреждения подтверждает мнение, что популяции стволовых клеток у взрослых функционируют для пополнения пула сателлитных клеток (2).
Conclusions and perspectives
At present, little is known about the signals and growth
factors that act to regulate the myogenic differentiation or
specification of adult stem cells. In Drosophila, the geneexpression
pattern in early development is recapitulated during adult muscle formation (BOX 2). In vertebrates, a
transcriptional hierarchy with Pax3 or Pax7 operating
upstream of the MRFs is conserved in both embryonic
and adult muscle progenitors. It is, therefore, tempting to
speculate that members of the Hedgehog, BMP and Wnt
signalling pathways,which regulate embryonic myogenesis,
might similarly commit adult stem cells to the
myogenic lineage.Taken together, the fundamental transcriptional
programme that builds embryonic and fetal
muscles is reactivated in adult stem cells to produce myogenic
progenitors for tissue repair.However, it remains to
be determined whether myogenic induction in somitic
and adult stem cells is under the influence of the same
signalling molecules.
Important questions still remain about muscle
development. For example, we need to identify the
molecules that mediate the activation of satellite cells
and the induction of the MRFs in adult muscle.
Future research will undoubtedly be aided by emerging
tools and resources.Mass-spectrometry studies
will allow the identification of Pax and MRF transcriptional
complexes, thereby facilitating the characterization
of molecules and signals that regulate their
activities. Furthermore, as transcriptional profiles are
compiled from various cell populations, a tremendous
data resource will be mined to identify the
genetic factors that control stem-cell differentiation.
As new strategies and techniques are developed for
the purification and manipulation of adult stem cells
from various tissues, the molecular cues that determine
the balance between proliferation, self-renewal
and differentiation will be elucidated. Such advances
might eventually bring the use of adult stem cells to
the forefront of regenerative medicine.
