Andrew J.Copp1, Nicholas D. E.Greene & Jennifer N. Murdoch
Nature Reviews Genetics V.4. № 10. P.784-793 (2003)
Перевод И.Г. Лильп (lilp@mail.ru)
Более 80 мутантных генов у мышей нарушают нейруляцию, и это дает возможность проанализировать механизмы, лежащие в основе этого процесса. И хотя изучение большинства этих мутантов находится еще в зачаточном состоянии, уже сейчас идентифицировано несколько молекулярных путей, играющих критическую роль в нормальном протекании нейруляции. Это planar cell-polarity pathway, необходимый для инициации закрытия нервной трубки, и sonic hedgehog (Shh) signalling pathway, регулирующий изгиб нервной пластинки. Мутантные мыши дают также возможность распутать сложные механизмы, посредством которых фолиевая кислота препятствует образованию дефектов нервной трубки, и разработать новые подходы для терапии фолат-резистентных дефектов.
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ
CAUDAL The tail end of the body axis of the developing embryo.
CHONDROITIN SULPHATE A glycosaminoglycan of repeating N-acetyl-galactosamine and glucuronic-acid residues that forms part of some proteoglycan molecules.
DORSOLATERAL HINGE POINT (DLHP). Paired bending points in the dorsolateral region of the closing neural tube.
ECTODERM The outer of the three embryonic (germ) layers that gives rise to the entire central nervous system, plus other organs and embryonic structures.
EPHRINS A family of cell-surface ligands that interact with a family of cell-surface receptor tyrosine kinases (Eph receptors), which is implicated in the interaction of cell types and the mediation of chemorepulsion and cell adhesion.
GLYCOSYL-PHOSPHATIDYL-INOSITOL (GPI) ANCHORS Inositol-containing linkages that tether some proteins (for example, ephrins) to the cell surface.
HYALURONAN A high molecular weight polysaccharide of repeating N-acetyl glucosamine and glucuronic-acid residues that is included among the proteoglycans (which are proteins that comprise a peptide backbone with abundant glycosaminoglycan side chains), although it does not have a protein backbone.
MEDIAN HINGE POINT (MHP). A single midline bending point in the closing neural tube.
NEURAL CREST A migratory cell population that arises from the midline of the neural tube, which gives rise to a range of cell types in the developing embryo.
NEURAXIS The developing central nervous system and its main subdivisions, both in the developing brain (forebrain, midbrain and hindbrain) and the spinal cord (cervical, thoracic, lumbar, sacral and caudal/coccygeal).
NEUROPORE A transient 'hole-like' opening in the neural tube at which neural tube closure is undergoing completion.
NOTOCHORD The rod-like mesodermal structure that extends the length of the body axis, beneath the neural tube of vertebrate embryos.
ORTHOLOGUE A gene that is the evolutionary counterpart of a similar gene in another species.
PARAXIAL MESODERM The unsegmented mesoderm of the caudal embryonic region that subsequently becomes segmented into somites.
PRIMITIVE STREAK The structure in the gastrulation-stage embryo at which ectoderm to mesoderm transformation occurs, with epithelium to mesenchyme transformation.
ROSTRAL The front end of the body axis of the developing embryo.
SOMITES Segmented blocks of mesoderm on either side of the neural tube in vertebrate embryos.
TAIL BUD The population of stem cells at the extreme caudal end of the embryo that contains the progenitor cells for formation of the lowest levels of the body axis.
(Рис.1.) | The rostro-caudal sequence of neurulation events in the mouse embryo.
(Рис.2.) | Mouse fetuses with neural tube defects.
(Рис.3.) | Shaping of the neural plate at the onset of mouse neural tube closure.
(Рис.4.) | Transition in the morphology of neurulation along the developing spine, as seen in schematic transverse section.
(Рис.5.) | Adhesion, fusion and remodelling of the midline at completion of neural tube closure.
(Рис.6.) | Schematic summary of cranial neurulation as exemplified by neural tube closure in the midbrain region.
Нейруляция является одним из важнейших событий во время эмбриогенеза. В результате этого процесса образуeтся нервная трубка – предшественник головного и спинного мозга. Область особой дорсальной ECTODERM (см. словарь терминов) (эктодермы) – нервная пластинка – образует билатеральные нервные валики в месте соединения с поверхностной (не невральной) эктодермой. Эти валики приподнимаются, вступают в контакт в области средней линии и сливаются, образуя нервную трубку, которая впоследствии покрывается будущей эпидермальной эктодермой. В качестве модели морфогенеза, нейруляция долгое время привлекала внимание специалистов в области биологии развития. Эпидемиологи и клиницисты также акцентировали свое внимание на процессе нейруляции, чтобы понять возникновение дефектов нервной трубки (neural tube defects – NTDs), относящихся к тяжелым и угрожающим для жизни врожденным уродствам (BOX 1). Недавние исследования, показавшие, что применение фолиевой кислоты на ранних сроках беременности нормализует нейруляцию и предупреждает развитие NTDs у человека, заставили исследователей вновь вернуться к изучению процесса нейруляции.
Box 1 | Neural tube defects: common malformations of the central nervous system
Neural tube defects (NTDs) are a group of congenital malformations that arise when the neural tube fails to close during embryogenesis. NTDs occur at an average rate of 1 per 1,000 pregnancies worldwide, and are the second most prevalent malformations, after congenital heart defects, among human pregnancies. If closure fails in the developing brain, the result is exencephaly, in which the persistently open cranial neural folds have an everted appearance and seem transiently enlarged. As development proceeds, the exposed neural folds degenerate, which produces the defect by late in gestation. In the anencephalic fetus, the interior of the brain is exposed to the outside and the skull vault is absent. Anencephaly can be associated with facial malformations, such as split face, which indicates that the most ROSTRAL part of the neural tube has failed to close. A related cranial defect is encephalocele, in which the neural tube closes normally but part of the brain herniates through a defect in the bony skull. In the spinal region, the failure of initiation of closure at the upper spinal level results in the severe defect craniorachischisis, in which most of the brain and the entire spinal cord remain open. The commonest defect of spinal closure, however, involves the lower spinal neural tube, which produces open (also called myelomeningocele or myelocele).
Unlike the cranial defects, which are usually lethal at or before birth, spina bifida is compatible with postnatal survival; however, affected individuals can suffer from motor and sensory defects in the legs, urinary and faecal incontinence, vertebral curvature defects and hydrocephalus (increased cerebrospinal-fluid pressure in the brain). A milder group of defects (occult spina bifida or spinal dysraphism) result from defective secondary neurulation, in which the spinal cord fails to separate from the adjacent tissues. Tethering of the spinal cord prevents its normal mobility in the vertebral canal and can cause leg weakness and difficulties in gaining urinary continence in young children.
Несмотря на долгую историю изучения нейруляции, фундаментальные механизмы закрытия нервной трубки во время развития поняты плохо. И хотя клеточные механизмы нейруляции описаны достаточно подробно, изучение молекулярной регуляции этого процесса значительно отстает от цитологических исследований. К примеру, достаточно много известно о молекулярной регуляции нервного гребня и о появлении детерминированной популяции нейронов в различных участках головного и спинного мозга. Но механизмы, лежащие в основе формирования, подъема и слияния нервных валиков не выяснены.
В настоящее время появилась возможность анализировать механизм нейруляции с помощью набора генетически таргетированных и мутантных линий мышей, у которых NTDs является частью мутантного фенотипа. Было показано, что, по крайней мере, 80 мутантных генов нарушают нейруляцию ().
Более того, региональная локализация NTDs (в головном или спинном мозге) различна у разных мутантов, что свидетельствует о существовании регион-специфичных различий в экспрессии генов, имеющих отношение к нейруляции.
В данном обзоре авторы попытались провести механистический анализ генетических влияний на нейруляцию. Они идентифицировали основные категории генов, необходимые для каждого успешного этапа нейруляции, и попытались связать эти функциональные генные группы с возможными механизмами. Инициирование закрытия нервной трубки, приподнимание нервных валиков и их изгиб, адгезия (сцепление) и слияние нервных валиков – все эти процессы рассматриваются по отдельности, поскольку имеется некоторая специфика нейруляции в области будущего головного и спинного мозга. Предотвращение появления NTDs экзогенными агентами рассматривается менее подробно и только в аспекте механизмов, лежащих в основе развития нервной трубки. Цель авторов – создание основы (структуры), для будущего анализа генетической регуляции нейруляции.
The neurulation sequence and types of NTD
Эффекты таргетированных или мутантных генов лучше рассматривать в контексте последовательных этапов формирования нервной трубки у млекопитающих, поскольку разные мутантные гены нарушают разные этапы во время нейруляции.
Primary neurulation. Нейруляцию условно подразделяют на первичную и вторичную. При первичной нейруляции, нервная трубка образуется посредством изменения формы нервной пластинки, образования валиков и их слияния. Затем нервная трубка покрывается поверхностной эктодермой, которая ранее ограничивала по краям нервную пластинку. В результате первичной нейруляции образуется головной мозг и большая часть спинного мозга. Переход от первичной к вторичной нейруляции происходит позже на уровне будущего верхнего крестцового отдела (upper sacral level).
Secondary neurulation. На более каудальных уровнях нервная трубка образуется в хвостовой почке (TAIL BUD), называемой также caudal eminence (каудальной возвышенностью) (РИС.1) без образования нервных валиков. В хвостовой почке находится популяция стволовых клеток, представляющих собой остатки исчезающей первичной полоски(PRIMITIVE STREAK). Клетки мезенхимы в дорсальной части хвостовой почки подвергаются конденсации и эпителиализации для того чтобы сформировать вторичную нервную трубку, просвет которой является продолжением просвета первичной нервной трубки. В результате вторичной нейруляции образуется наиболее отдаленный участок спинного мозга – большая часть крестцового отдела и копчиковой области.
Rostro-caudal events in primary neurulation.
У мышей закрытие первичной нервной трубки инициируется в на границе заднего мозга и шейной области (hindbrain/cervical) («закрытие 1» – closure 1) и затем распространяется одновременно в области будущего головного и спинного мозга (РИС.1). Закрытие нервной трубки головного мозга на границе переднего и среднего мозга (forebrain/midbrain boundary) происходит de novo («закрытие 2» – closure 2). Закрытие в конечной (ростральной) области переднего мозга называется «закрытие 3» – closure 3. Полное закрытие между этими двумя сайтами инициации приводит к завершению краниальной (черепной) нейруляции в антериоральном нейропоре и нейропоре заднего мозга. Однонаправленное закрытие вдоль спинальной оси заканчивается закрытием постериорального нейропора, и это означает окончание первичной нейруляции.
Оказалось, что «закрытие 1» и «закрытие 3» инвариантны у мышей разных линий, и оба этих типа закрытия встречаются в эмбрионе человека. «Закрытие 2» полиморфно – у мышей некоторых линий оно может происходить каудальнее (по сравнению с нормой) в среднем мозге, у мышей других линий оно может быть ростральнее в переднем мозге. Стоит отметить, что линии с более каудальным «закрытием 2» резистентны к экзэнцефалии (exencephaly), тогда как мыши с более ростральным «закрытием 2» отличаются высокой предрасположенностью к экзэнцефалии. У последних закрытия 2 и 3 могут локализоваться очень близко друг к другу, что затрудняет проведение различий между этими двумя событиями. Вариабельность в морфологии «закрытия 2» у мышей напоминает ситуацию у человека, когда четко невозможно зарегистрировать «закрытие 2». Таким образом, вариабельность этапа «закрытие 2» может быть важным фактором риска при развитии NTDs у человека и, вероятно, этим можно объяснить некоторую межлинейную вариабельность в частоте NTDs, наблюдаемую у ген-таргетированных мышиных моделей.
NTDs vary at different axial levels. Согласно основному правилу нейруляции, только уровни оси тела, подвергающиеся первичной нейруляции (т.е. уровни головного, шейного, грудного, поясничного и верхнего крестцового отделов), могут приводить к «открытым» NTDs (например, к анэнцефалии, spina bifida и craniorachischisis). Возникновение этих аномалий происходит в результате патологического взаимодействия между просветом нервной трубки и внешней средой. Аномальная вторичная нейруляция, напротив, ведет к «закрытым» формам spina bifida (к так называемым дизрафическим (dysraphic) состояниям), т.е. к неспособности спинного мозга отделяться от других тканевых производных хвостовой почки. В этом случае спинной мозг, «привязанный» к соседним тканям является характерным признаком «закрытых» повреждений, поражающих нижнюю часть позвоночника. По сравнению с множеством мутантных моделей открытых NTDs, известно лишь несколько мутаций мышей, имеющих каудальные закрытые NTDs (например, Gcml, см. (). В данном обзоре эта тема больше рассматриваться не будет.
При отсутствии «закрытия 1» почти вся нервная трубка от среднего мозга до нижней части позвоночника остается открытой. Такое состояние называется краниоспондилосхизом (craniorachischisis) (РИС.2а). Обычно «закрытие 2» и «закрытие 3» у таких эмбрионов нормальное, поэтому у них закрытые и относительно хорошо развитые передний мозг и передняя часть среднего мозга. Однако у эмбрионов с отсутствием или нарушениями «закрытия 2» в переднем или в midbrain–hindbrain нейропорах развивается экзэнцефалия (РИС.2b). Последующая дегенерация нервных валиков ведет к превращению экзэнцефалии (на поздних стадиях беременности) в анэнцефалию, при которой свод черепа (skull vault ) отсутствует, а мозговая ткань разрушена. Специфическое отсутствие «закрытия 3» ведет к анэнцефалии, ограниченной областью переднего мозга и часто ассоциируется с уродствами «расщепления лица». Если распространение закрытия нервной трубки не может быть завершено в области позвоночного столба, то задняя часть нейропора остается открытой, что ведет к spina bifida (его также называют миелоцеле или грыжей спинного мозга (myelocele) или миеломенингоцеле или грыжей спинного мозга и мозговых оболочек (myelomeningocele) (Рис.2b).
Следует иметь в виду, что у мышиных мутаций эмбриональная летальность на средних сроках беременности может мимикрировать NTDs, поэтому всегда следует удостовериться, что эмбриолетальность и/или дегенеративные процессы не ответственны за аномальное развитие вне нейруляции (BOX 2).
Box 2 | Mid-gestation embryonic lethality can mimic NTDs
Embryonic lethality around the stage of neural tube closure is often preceded by developmental retardation, so that dying embryos might seem to fail to close their neural tubes. However, if embryos die before the stage at which a particular aspect of neurulation would normally be completed, the finding of an open neural tube is not reliable evidence of a neurulation defect. For example, embryos that lack an active c-src tyrosine kinase () gene die after 9 days of gestation, when their cranial neural tube has not yet closed, although prolonged survival might have been compatible with successful closure. Other examples of early embryonic lethality with apparent NTD formation are listed in () Before concluding that a mouse mutant has NTDs, therefore, care must be taken to ensure that embryonic lethality and/or degenerative processes are not responsible for preventing normal development beyond neurulation. Mouse embryos do not die in utero because of NTDs and, hence, lethal anomalies such as faulty maternal–embryonic connections or defective cardiovascular development are probably present. By altering the genetic background, or through the use of conditional gene-targeting approaches, it is increasingly possible to prolong the survival of embryos with lethal gene defects, which allows an evaluation of the role of the particular gene in neurulation.
Initiation of closure
Непосредственно перед началом закрытия нервной трубки («закрытия 1») у эмбриона меняется форма нервной пластинки (РИС.3). Изначально эллиптическая нервная пластинка превращается в удлиненную, похожую по очертаниям на замочную скважину структуру, с более широкими краниальным (ростральными) и узкими спинными (каудальными) областями. Основной движущей силой при изменении формы нервной пластинки (изначально это было описано для эмбрионов амфибий и птиц) является конвергентное расширение (convergent extension) – сеть медиально направленного движения клеток с интеркаляцией в среднюю линию, – ведущее к сужению и удлинению нервной пластинки. Сходные клеточные движения встречаются одновременно как в нейроэктодерме, так и в подлежащей мезодерме.
Недавно выяснили необходимые условия для конвергентного расширения во время инициации закрытия нервной трубки. Насколько известно, лишь у небольшого числа мышиных мутаций – loop-tail, crash, circletail и dishevelled-1; dishevelled-2 двойных мутантов – не происходит «закрытия 1», которое приводит впоследствии к краниоспондилосхизму (craniorachischisis). Позиционное клонирование (positional cloning) показало, что каждый из мутантных генов, дающий проявление краниоспондилосхизма, кодирует белок функционирующий в нестандартном Wnt/frizzled сигнализировании – так называемом planar cell-polarity pathway. loop-tail – мутация мышей, являющаяся ортологом (ORTHOLOGUE) гена strabismus у Drosophila (её называют также Van Gogh (), которая взаимодействует с dishevelled при planar cell-polarity пути сигнализирования. Мыши crash имеют мутацию в гене Celsr1, являющимся ортологом гена flamingo у Drosophila (ее также называют starry night (). Он кодирует binding partner of frizzled. – это ген, который мутирован у circletailи он также необходим для planar cell polarity, хотя он лучше известен как ген, участвующий в регуляции апикально-базальной полярности (apical–basal polarity) у Drosophila. Тяжелые NTDs наблюдали не только у гомозигот по loop-tail, circletai и crash. Сходный фенотип обнаружен и у двойных мутантов loop-tail; circletail и loop-tail; crash, и это является признаком, указывающим на общие функции этих генов во время развития.
Роль planar cell polarity в регуляции конвергентного расширения и начале нейруляции экспериментально изучали у Xenopus.. Нарушенная экспрессия dishevelled или strabismus вызывала у них появление эмбрионов с аномально короткой и широкой нервной пластинкой, и у них отсутствовало закрытие нервной трубки. Похожий фенотип встречается у полосатых данио (zebrafish) после нарушения экспрессии или в результате мутации гена strabismus (ортолога trilobite (tri)) и нарушения экспрессии Rho kinase 2, которая лежит ниже (downstream) Wnt11 при planar cell-polarity сигнализировании. Дефекты Xenopus, возникающие в результате нарушения экспрессии dishevelled сходны с NTDs у loop-tail, circletaiи crashэмбрионов. Нервная пластинка у них аномально широкая с не-изогнутой областью, лежащей между нервными валиками, в отличие от четко очерченной срединной точки изгиба (MEDIAN HINGE POINT –MHP) у нормального эмбриона (РИС.4b). И хотя приподнимание нервных валиков происходит у них нормально, сами нервные валики локализованы слишком далеко друг от друга и не могут соединиться.
Следовательно, конвергентное расширение является необходимым условием для установления ширины нервной пластинки, что совместимо с медиальным изгибанием, необходимым для «закрытия 1».
Следует отметить, что loop-tail, circletail, crash и disheveled группа функционально родственных мутаций является единственными мышиными моделями краниоспондилосхизма (craniorachischisis). У всех других мутаций имеется экзэнцефалия и/или spina bifida. Это указывает на то, что «закрытие 1» хотя и зависит в значительной степени от установления planar cell polarity, но оно относительно независимо среди поздних событии, которые являются критическими для других уровней оси тела.
Elevation and apposition of the neural folds
Изгиб нервной пластинки у млекопитающих происходит в двух главных сайтах – в MHP, расположенном над нотохордой (как при «закрытии 1») (РИС.4b) и в парных дорсо-латеральных точках изгиба (dorsolateral hinge points –DLHPs), которые расположены в точках прикрепления поверхностной эктодермы к наружной стороне каждого нервного валика (РИС.4с и d). MHP индуцируется сигналами из нотохорды и является единственным сайтом изгиба в верхней спинальной нервной пластинке. Эксперименты с культивируемыми мышиными эмбрионами показали, что sonic hedgehog (Shh), происходящие из нотохорды, подавляют формирование DLHP на этом верхнем спинальном уровне. По мере того, как волна нейруляции продвигается вниз по нейрооси (NEURAXIS), интенсивность Shh сигнализирования из нижележащей нотохорды снижается, что позволяет DLHP образованию «прорваться» на более низкие уровни оси тела. DLHP образование в нижней части позвоночника может быть подавлено локальным высвобождением Shh пептида, который негативную регулирует дорсо-латеральное изгибание при воздействии Shh. Вероятно, похожий регуляторный механизм работает в краниальной области, где дорсо-латеральный изгиб также заметен во время нейруляции, хотя это пока етально не исследовано.
Идея о том, что Shh негативно регулирует DLHP образование поддерживается фенотипом нескольких ген-таргетированных мышей. У
-null мутантов DLHPs наблюдали на всех уровнях оси тела и закрытие нервной трубки у них происходит нормально. В то же время сверхэкспрессия Shh может продуцировать NTDs предположительно посредством подавления дорсо-латерального изгиба на тех уровнях оси тела, где он необходим для закрытия нервной трубки. Сходный механизм, вероятно, лежит в основе дефектов краниальной нейруляции, которые наблюдали у гомозиготных extra-toes мышей, у которых мутация негативно регулирует Shh сигнализирование. В то же время мутации генов и , опосредующих Shh сигнал, не приводят к NTDs. Patched1 (Ptc1) рецептор отвечает за поддержание Shh сигнализирования в «выключенном» состоянии, в отсутствии Shh лиганда. Следовательно, мутация ведет к лиганд-независимому конститутивному Shh сигнализированию и, как это видно при сверхэкспрессии Shh, Ptc1-null мыши характеризуются тяжелыми NTDs. Протеин киназа А (Protein kinase A – PKA) является гетеромерным ферментом, функции которого заключаются в том числе и в подавлении Shh сигнализирования. У нескольких PKA генов существует функциональная избыточность, однако снижение дозы гена до 75 % приводит к высокой частоте спинномозговых дефектов и частично пенетрантной эксэнцефалии. Отсюда следует, что сверхстимулирование Shh пути сигнализирования подавляет дорсо-латеральное сгибание закрывающихся нервных валиков, что ведет к spina bifida и экзэнцефалии у различных мутантов. Это свидетельствует о том, что Shh регуляция сгибания нервных валиков является механизмом, работающим во время нейруляции на всех уровнях оси тела.
У других мутации – open-brain (opb) и Zic2, отсутствует закрытие нервной трубки и в области головного мозга, и в более отдаленных отделах позвоночника. opb разрушает ген, который кодирует негативный регулятор Shh сигнализирования. Zic гены, кодирующие семейство транскрипционных факторов, влияют на anti-Shh активность у Xenopus.
Оказалось, что у opb и у Zic гомозигот и дорсальная, и дорсо-латеральная клеточная судьба детерминирована в развивающейся нервной трубке, на что указывает отсутствие экспрессии генов и . Это может указывать на то, что действие Shh в негативно регулируемом Shh образовании на верхних спинальных уровнях должно «вентрализировать» (ventralize) закрытие нервной трубки и предотвращать дорсально расположенные клетки от дифференцировки в направлении необходимом для DLHP участия. Каким образом этот механизм соотносится с регуляцией морфогенетического клеточного «поведения» (такого, как продвижение клеточного цикла, сила клеточного сцепления), изменения которого может лежать в основе изгиба нервной пластинки, в настоящее время неясно.
Fusion of the neural folds
Любые генетические нарушения, изменяющие адгезию верхушек нервных валиков, препятствуют закрытию нервной трубки. На практике, однако, крайне трудно сделать различия между отсутствием приподнимания нервных валиков и отсутствием слияния валиков у мутантных эмбрионов. Не слившиеся нервные валики быстро расходятся в стороны, что мимикрирует дефект приподнимания нервных валиков. В результате известно очень мало определенных генетических NTD моделей с нарушениями адгезии нервных валиков и/или их слияния. Более того, молекулы, опосредующие адгезию нервных валиков и их слияние, почти не изучены. Из апикальных клеток нервных валиков появляются клеточные протрузии (выпячивания), когда валики приближаются друг к другу в дорсальной срединной линии (РИС.5а), и при контакте нервных валиков эти выпячивания сливаются. В результате возникает возможность межклеточного распознавания и обеспечивается первичная адгезия, еще до установления постоянных клеточных контактов. Верхние части мышиных нервных валиков ассоциируются с «cell-surface coat» - материалом, обогащенным углеводами, удаление которого с помощью фосфолипазы С, препятствует слиянию нервных валиков. Эта находка стала значимой после сообщения об экзэнцефалии у части эмбрионов с null мутацией по EPHRIN-A5, который является GLYCOSYLPHOSPHATIDYLINOSITOL (GPI)-linked поверхностно-клеточным Eph лигандом. Инактивация EphA7 рецептора также ведет к экзэнцефалии. Оказалось, что у гомозигот приподнимание нервных валиков и их контакт происходят нормально в области дорсальной срединной линии, но их слияние дефектно. Как ephrin-А5, так и EphA7 экспрессируются в краниальном эпителии до и во время закрытия нервной трубки, но не в спинальном нейроэпителии и это объясняет отсутствие спинальных NTDs у этих мышей. Эти данные указывают на важную роль ephrin/Eph рецепторного взаимодействия в слиянии нервных валиков.
Традиционно считали, что слияние и последующее обособление нервной трубки и поверхностной эктодермы является результатом различной адгезии двух типов ткани. Нервная трубка экспрессирует клеточно-адгезивные белки Т-CAM (neural cell-adhesion molecule) и neural (N)-cadherin, тогда как поверхностная эктодерма экспрессирует epithelial (E)-cadherin. В действительности, у эмбрионов Xenopus, у которых нервная трубка и поверхностная эктодерма экспрессируют N-cadherin, нервная трубка и поверхностная эктодерма не обособляются, и имеется дефект закрытия нервной трубки. Экспрессия доминантной негативной формы N-cadherin у эмбрионов Xenopus также ведет к дефектам образования нервной трубки, хотя экспрессия доминантно негативной молекулы E-cadherin не вызывает такого эффекта. Однако эктопическая экспрессия N-CAM в поверхностной эктодерме не подавляет закрытие нервной трубки и мыши с null мутациями по или N-cadherin (называемому также ) генам характеризуются нормальным закрытием нервной трубки. Таким образом, кажется маловероятным, что указанные молекулы клеточной адгезии играют важную роль в нейруляции у млекопитающих.
Neurulation events specific to the cranial region
У мышей закрытие нервной трубки в краниальной области более чувствительно к нарушениям, чем в спинальной области, о чем свидетельствует более высокая частота экзэнцефалии по сравнению со spina bifida у нокаутных и мутантных животных Аналогичным образом, гораздо большее число тератогенных агентов индуцирует краниальные NTDs по сравнению со спинальными. Приподнимание и сближение нервных валиков осуществляется не только за счет регулирования дорсо-вентрального изгиба через Shh в краниальной и спинальной областях, но и за счет других клеточных событий (суммировано на РИС.6). Но, как оказалось, эти механизмы имеют отношение только к краниальной области, поскольку спинальных дефектов не наблюдали у ген-таргетированных мышей, у которых эти механизмы отсутствовали.
Expansion of the cranial mesenchyme. Приподнимание нервных валиков в краниальной области у эмбрионов млекопитающих начинается с начальной фазы, при которой краниальная мезенхима подвергается заметному расширению, происходящему в результате клеточной пролиферации и увеличения внеклеточного пространства. На этом этапе нейруляции в области среднего мозга образуются двояковыпуклые нервные валики, которые выпячиваются наружу (РИС.6а). Во второй фазе закрытия нервных валиков в краниальной области края нервных валиков «изворачиваются» (“flip around”), приближаются к дорсальной срединной линии и остаются двояковогнутыми до тех пор, пока верхушки нервных валиков не встретятся в области срединной линии (РИС.6b). Такая двухфазовая последовательность во время нейруляции в краниальной части не похожа на нейруляцию в спинальной области, где расширение параксиальной мезодермы (PARAXIAL MESODERM – см. словарь терминов) не сопровождается приподниманием нервных валиков. На верхних спинальных уровнях нервные валики фланкированы эпителиальными сомитами, на нижних уровнях – компактная пресомитная (presomitic) мезодерма примыкает к спинальным нервным валикам. Более того, экспериментальное удаление paraxial mesoderm не блокирует закрытие нервных валиков. Оказалось, что краниальная нейруляция, напротив, крайне зависима от пролиферации и расширения краниальной мезенхимы, что доказано при исследованиях следующих нокаутных линий мышей.
и нокауты с нарушенной пролиферацией и экспансией краниальной мезодермы характеризуются краниальными NTDs. Оба гена экспрессируются в мезенхиме и химерный анализ у Twist мутации показал, что значительная доля Twist-/- клеток в мезенхиме может приводить к экзэнцефалии. Избыток же Twist-/- клеток в нервной пластинке не влияет на закрытие нервной трубки. Кажется вполне вероятным, что краниальная мезенхима играет жизненно важную роль на начальной фазе краниальной нейруляции. Это предположение поддерживается данными, показавшими, что переваривание внеклеточного матрикса HYALURONAN у культивируемых крысиных эмбрионов ведет к разрушению краниальной мезенхимы и к задержке закрытия краниальной нервной трубки.
Actin cytoskeleton and cranial neurulation. Вторая фаза краниальной нейруляции, при которой нервные валики становятся двояковогутыми, существенно зависит от актинового цитоскелета. Таргетирование генов, необходимых для нормальной цитоскелетной функции, в некоторых случаях ведет к краниальным NTDs. Экзэнцефалию наблюдали у мышей с отсутствием filamentous (F)-actin-associated protein shroom, actin-binding protein vinculin, protein kinase C target MARCKS (which crosslinks actin filaments) и RhoGAP p190 регулятора актинового цитоскелета. Краниальные NTDs зарегистрированы у эмбрионов, являющихся двойными мутантами по гену Mena (имеющего отношение к цитоскелету и называемого также ) и profiling (), а также по не-рецепторным тирозин киназам и , функции которых также имеют отношение к актину. Все эти нокаутные мыши имеют дефекты только краниальной нейруляции. Закрытие спинальной нервной трубки у этих null-мутантных эмбрионов протекает нормально.
Данные по мутантным мышам согласуются с исследованиями, в которых использовали цитохалазины (cytochalasins) – вещества, «демонтирующие» актиновые микрофиламенты. Закрытие краниальной нервной трубки у куриных, мышиных и крысиных эмбрионов высокочувствительно к действию цитохалазинов, тогда как нейруляция в позвоночном отделе относительно резистентна к действию этого соединения. При действии цитохалазина D изгиб нервной пластинки в MHP и DLHPs не прекращается и спинальная нервная трубка закрывается так же, как и в норме. Эти находки показали, что “purse-string” стягивание (purse-string – ремешки, которыми затягивают кошелек) sub-apically расположенных микрофиламентов актин-миозина в нейроэпителиальных клетках является необязательным для спинальной нейруляции, при которой актиновый цитоскелет, как оказалось, играет прежде всего стабилизирующую роль в неизогнутой нервной пластинке. И, напротив, такой актин-опосредующий механизм имеет критическое значение для закрытия краниальной нервной трубки и, вероятно, важен для дорсо-латерального изгиба краниального нейроэпителия.
Neural crest emigration and cranial neurulation. Связь между миграцией нервного гребня и закрытием нервной трубки пока неясна. Эти два процесса родственны между собой как в пространственном, так и во временном отношении, поэтому предполагается их взаимосвязь. Для краниальной области имеются доказательства, что переход от морфологически двояковыпуклой к двояковогнутой нервной пластинке (что необходимо для закрытия нервной трубки) может зависеть от начала миграции краниального нервного гребня. В среднем и заднем мозге клетки нервного гребня начинают открепляться от верхних частей нервных валиков и начинают миграцию раньше закрытия нервной трубки. Мыши со сверэкспрессией gap junction protein connexin 43 характеризуются заметными миграционными дефектами краниального нервного гребня и развитием экзэнцефалии. У культивируемых крысиных эмбрионов, обработанных chondroitinase ABC для переваривания pre-existing CHONDROITIN SULPHATE происходит задержка эмиграции и дорсолатерального изгиба краниальных нервных валиков. Это указывает, что эмиграция нервного гребня необходима завершения закрытия краниальной нервной трубки.
В спинальной области связь между эмиграцией нервного гребня и закрытием нервной трубки иная. Эмиграция нервного гребня начинается через несколько часов после полного закрытия нервной трубки. Дефекты, которые чаще всего ассоциируются с гомозиготными splotch мутантами являются дефектами нервного гребня – они локализуются преимущественно в нижней части позвоночника и у мутантов развивается spina bifida. Однако у этих мутантов дефекты закрытия нервной трубки и миграции нервного гребня функционально разграничены. У splotch эмбрионов нарушения закрытия спинальной нервной трубки может встречаться при явно нормальной миграции нервного гребня. Также добавление мутантного splotch аллеля к мутантным гомозиготам curly tail (ct) усиливает фкнотип spina bifida, не подвергая риску миграцию нервного гребня. Следовательно, фенотипы нервного гребня и нервной трубки splotch мышей, вероятно, являются независимыми «следствиями» одного и того же молекулярного дефекта в Pax3 функции. Точно пока не известно, почему нервная трубка splotch не закрывается. Хотя была предложена гипотеза, согласно которой избыточный нейроэпителиальный апоптоз снижает клеточную пролиферацию и меняет нейроэпителиальные клеточные связи.
Apoptosis in the cranial neural folds. Долгое время велись наблюдения за окрашенными клетками во время нейруляции и в настоящее время показано, что клетки во время этого процесса гибнут в результате апоптоза. У некоторых нокаутных линий мышей дефекты закрытия нервной трубки ассоциируются с изменениями в уровнях гибели нейроэпителиальных клеток, и у многих из этих нокаутов в этом участвуют гены, имеющие отношение к апоптозу. Интересно то, что вред приносит как снижение уровня апоптоза, так и его увеличение. Например, у , caspasa 9 () и p53 нокаутов, а также у двойных мутантов Ikk1Ikk2() и Ink1(); Jnk2() снижен уровень апоптоза и у всех у них развивается экзэнцефалия, тогда как AP-2, и нокауты ()
характеризуются повышенным уровнем апоптоза в области краниальных нервных валиков или в нервной трубке. Следует обратить внимание, что у этих мышиных мутаций нарушена только краниальная нейруляция, за исключением мутации fog/ являющейся спонтанной мутацией Apaf1, у которой описан дефект закрытия спинальной нервной трубки.
Избыточная клеточная гибель может нарушать нейруляцию в результате недостаточного числа нормально функционирующих клеток, необходимых для морфогенеза, как это происходит при тератогенном эффекте этанола, вызывающем краниальные NTDs. Однако данные о том, что и пониженный уровень апоптоза приводит к экзэнцефалии, свидетельствует о более значимой специфической физиологической роли нейроэпителиальной клеточной гибели во время нейруляции. Апоптозные клетки встречаются в дорсолатеральных областях краниальной нервной пластинки и на верхушках сливающихся нервных валиков. (РИС.6). Дорсолатеральная клеточная гибель может происходить вместе с эмиграцией клеток нервного гребня, «ослабляя» (“loosen”) краниальный нейроэпителий и позволяя, таким образом, менять двояковыпуклую морфологию нервных валиков на двояковогнутую. Нейруляция в области среднего мозга с механической точки зрения кажется невыгодной, из-за краниального изгиба, при котором нейроось (neuroaxis) поворачивается вентрально на 90 градусов как раз на уровне среднего мозга. И, в самом деле, вентральный изгиб, который экспериментально устанавливали у куриных и мышиных эмбрионов, вел к задержке закрытия нервной трубки. Следовательно, любое снижение способности нервных валиков среднего мозга к изгибу, приведет к экзэнцефалии.
Апоптоз на верхушке нервных валиков имеет разное значение. После того, как соединяющиеся нервные валики начнут контактировать и сольются, для ремоделирования нейроэпителия в области средней линии необходимо нарушить её целостность между нейроэпителием и поверхностной эктодермой с каждой стороны, что позволяет отделить нейроэпителий от эктодерму в области средней линии (РИС.5b,c). Подавление апоптоза пептидом Zvad-fmk вызывает NTDs у куриного эмбриона и это, вероятно, связано с нарушениями описанного выше ремоделирования в области дорсальной средней линии. Для выявления точных механизмов, ведущих к экзэнцефалии, необходимо детальное изучение нокаутных мышей с пониженным уровнем апоптоза.
Disrupting the proliferation/differentiation balance. Во время нейруляции пролиферация происходит во всем нейроэпителии. Клетки начинают выходить из клеточного цикла, когда начинается дифференцировка нейронов, и только после того, как во всех отделах полностью закроется нервная трубка. У нокаутов с нарушениями Notch и родственных ему сигнальных путей, отсутствие краниальной нейруляции связано с преждевременным началом дифференцировки нейронов в нервной пластинке. Инактивация RBPJk, и предотвращает закрытие нервной трубки через дерепрессирование нейрональной дифференцировки, что ведет к преждевременному появлению маркеров нейрональной дифференцировки во время нейруляции. Более тяжелые фенотипы наблюдали у Hes1; двойных мутантов. Преждевременная дифференцировка нейроэпителия у этих мутантов может компенсировать отсутствие механического сгибания в нервной пластинке и предотвращать дорсолатеральное изгибание, препятствуя высвобождению клеток нервного гребня или ингибируя процесс адгезии, необходимый для слияний нервных валиков. В настоящее время пока невозможно сделать различия между этими и другими механизмами нарушения нейруляции у Notch-pathway мутантов.
У некоторых мутантов найдена избыточная пролиферация. Сверхэкспрессия вызывает увеличение числа клеток, являющихся позитивными для нейрального предшественника nestin, который ассоциируется с экзэнцефалией. Более того, включение бромдезоксиуридина (BrdU), которым метят пролиферирующие клетки, увеличено у аллельных fog и Apaf1 мутантов наряду с пониженной клеточной гибелью. Гомозиготы характеризуются эктопическими тканевыми массами в переднем мозге, которые выпячиваются из лобной области из-за локального отсутствия свода черепа и такой дефект напоминает фронтальную мозговую грыжу (frontal encephalocele) у человека. Нейроэпителиальное разрастание иногда описывают в связи с экзэнцефалическим мозгом у других мутантов. (РИС.2b), но гораздо реже, и при детальном анализе оказалось, что в экзэнцефалическом мозге нормальная или даже увеличенная продолжительность клеточного цикла.
Prevention of NTDs by exogenous agents
Частота NTDs у человека может быть снижена при употреблении фолиевой кислоты на ранних сроках беременности. Было показано, что фолиевая кислота предупреждает развитие NTDs у splotch, Cart1, Crooked tail и Cited2 мышиных моделей. И хотя у мутации splotch определяется дефект метаболизма фолата, то при таком же методе оценки, аномалий метаболизма фолата у эмбрионов Cited2 не обнаружено. Кроме того, нокауты по важному folate metabolic enzyme 5,10-methylene tetrahydrofolate reductase и фармакологическая инактивация метионин синтазы не ведут к NTDs. Следовательно, механизм, лежащий в основе предотвращения NTDs фолиевой кислотой, может быть не связан с наследственными аномалиями метаболизма фолата. Возможно, это совсем иной путь, чувствительный к коррекции экзогенной фолиевой кислотой. Возможно, фолиевая кислота увеличивает выживаемость нейроэпителиальных клеток благодаря ее действию на ДНК репарационные процессы.
При клинических испытаниях витаминных добавок фолиевая кислота предотвращала 70% NTDs, в остальных случаях наблюдали фолат-резистентность. Интересно, что NTDs у некоторых мышиных моделей резистентны к фолиевой кислоте – к ним относятся curly tail, Axd и EphA7. Витамин-подобная молекула инозитол (inositol) может предотвращать спинальные NTSs (которые наблюдали у фолат-резистентных curly tail мутантов) посредством механизма, который стимулирует протеин киназу С в эмбриональных клетках. Главным эффектом оказалось стимулирование клеточной пролиферации в каудальной области эмбриона, которая, как известно, является дефектной у линии curly tail. То, что инозитол может предотвращать фолат-резистентные NTDs у мышиных моделей, дает надежды на его использование в будущем для предотвращения NTDs у человека. Остается выяснить, являются ли другие мышиные модели NTDs чувствительными к терапии инозитолом.
Conclusions
Нейруляция, т.е. процесс закрытия нервной трубки, не привлекает столь пристального внимания исследователей, как, например, вопрос о регуляции паттернирования и дифференцировки. В настоящее время наличие достаточного числа генетических мутаций с нарушениями нейруляции дает возможность тщательно проанализировать молекулярные механизмы нейруляции у млекопитающих. Уже сейчас мы можем оценить роль planar cell polarity в инициации закрытия нервной трубки и Shh сигнализирования в изгибе нервной пластинки. Оказалось, что функции цитоскелета крайне важны для краниальной, но не для спинальной нейруляции. В будущем, несомненно, будут подробно изучены механизмы адгезии и слияния нервных валиков и роль скоординированной клеточной пролиферации и клеточной гибели. Не решен еще вопрос о роли эндогенной ретиноевой кислоты (retinoic acid – RA) в процессе нейруляции. Известно, что NTDs возникают у нокаутов по генам, которые либо усиливают, либо снижают RA сигнализирование, однако детальное участие RA в нейруляции остается пока плохо понятым. И хотя мы пока далеки от «закрытия» вопроса нейруляции, нервная трубка сейчас «открыта» для молекулярных исследований.
