HPLC | RA | RALDHs | Sa |

Retinoic acid (RA)индуцирует регенерацию не только в отдельных типах тканей, но и целых органах. Эта способность не ограничена амфимбиями, но распросраняетя и на млекопитающих.

WHAT IS RETINOIC ACID?

RA является эндогенной молекулой, которая образуется из витамина А. Она имеет низкий мол. в. (300 Da) и является липофильной. У взрослых витамин А получается с пищей в форме retinyl эфиров, присутствующих в мясе животных или в β растений. Клетки эмбрионов или взрослых, которые нуждаются в RA, получают ее из кровеносной системы, где она циркулирует как retinol, соединенный с ретинол-связывающим белком. Внутри клетки секвестрированный ретинол ферментативно превращается сначала в retinal с помощью retinol или alcohol dehydrogenases (ADHs) и затем в RA с помощью retinal dehydrogenases (RALDHs). RA затем метаболизируется с помощью цитохромного P450 энзима, наз. Cyp26, чтобы предположительно инактивировать продукты, такие как 4-oxo-RA,4-OH-RA,18-OH-RA,и 5,18-epoxy-RA, и наконеец, экскретируется. Имеется два изомера RA, all-trans-RA и 9-cis-RA, которые действуют посредством разных рецепторов.

Будучи синтезированной в клетке RA вступает в ядро и устанавливает или меняет паттерн активности генов путем связи с лигандами активированных ядерных транскрипионных факторов. Имеется два класса таких транскрипционных факторов: retinoic acid receptors (RARs) и retinoid X receptors (RXRs). У людей, крыс и мышей имеется три RARs α β и γ, каждый из которых имеет мнрожественные изоформы, и три RXRs, α, β и γ, и снова каждый из них имеет несколько изоформ. У тритона имеются RARα, но нет RARβ, и RARδ, которая эквивалентна RARγ млекопитающих. RARs и RXRs действуют как гетеродимеры (напр.,RARα/RXRβ) и распознают консенсусные последовательности, известные как retinoic acid response elements (RAREs) в расположенных выше промотора последовательностях RA-чувствительных генов. Благодрая этому RA м. легко вступать в клетку и индуцировать активность новых генов.

DEVELOPMENT AND REGENERATION

Считается, что регенерация не является отдельным феноменом в эволюции, связанным с использованием новых генетических путей. Однако, это не позволяет нам понять, почему некоторые органы, такие как конечности амфибий, м. успешно регенерировать, тогда как конечности у человека - нет. RA является критической молекулой, необходимой для развития конечностей, выростов нейритов в развитии и в развитии легких, а компоненты пути передачи сигналов RA, синтезирующие энзимы и рецепторы, присутствуют во время развития этих систем. Следовательно, м. ожидать участия RA и ее компонентов в регенерации этих органов, а их отсутствие м.б. связано с отвутствием регенерации. Устраненеие этого недостатка д. приводить к RA-индуцированной регенерации.

RA AND LIMB REGENERATION

Наиболее безупречным примером органной регенерации в царстве животным м. служить регенерация хвоста и конечностей у амфибий. Аксолотли, тритоны и многие виды саламандр м. регенерировать их после ампутации у взрослых. У лягушек эта способность теряется после метаморфоза, но конечности и хвост головастиков регенерируют столь же эффективно. Подобная супер-регенерация впервые описана в 1978 Niazi и Saxena у Bufo andersonii головастиков, они показали, что когда задние конечности головастиков ампутируются по голени и обрабатываются retinyl palmitate, то вместо регенерации удаленной части конечности возникает регенерат, содержащий дополнительные элементы вдоль проксимо-дистальной оси и нередко появляются два регенерата вместо одного (Niazi and Saxena,1978). Этот феномен затем был более подробно изучен на аксолотлях и Rana temporaria (Maden,1982, 1983a,b). У аксолотлей эффект ретиноидов, включая и RA, обнаруживал зависимое от концентрации увеличение количества регенерируемой ткани вдоль проксимо-дистальной оси. В контрроле конечности после ампутации, напр., через середину радиальной и локтевой кости регенерировали все концевые недостающие элементы (Рис.1A).

Fig.1.Retinoic acid (RA)induces super-regeneration in amphibian limbs and tails. Victoria blue .stained whole-mounts show the cartilage patterns.A:Control axolotl forelimb that had been amputated through the mid-radius and ulna (broken line) and regenerated perfectly.h,humerus;ru,radius andulna;c,carpals;1,2,3,4,digits.B:Limb amputated through the mid-radius and ulna (broken line)and treated with a low level of retinoids, which regenerated an extra radius and ulna in tandem with the original.C: Limb amputated through the mid-radius and ulna (broken line)and treated with a medium level of retinoids,which regenerated an extra elbow joint and then forearm.D:Limb amputated through the mid-radius and ulna (broken line)and treated with a high level of retinoids,which regenerated a complete limb from the amputation plane.E:Limb amputated through the carpals (broken line)and treated with a high level of retinoids, which regenerated a complete limb from the amputation plane.F:Control Rana temporaria hindlimb, which was amputated through the foot (broken line)and regenerated perfectly. g,girdle;f,femur;tf,tibia and fibula;mt,metatarsals;1,2,3,4,5,digits.G: Rana hindlimb amputated through the foot (broken line)and treated with a high level of retinoids, which regenerated a complete limb from the amputation plane.H:Rana hindlimb amputated through the foot (broken line)and treated with a high level of retinoids, which regenerated a pair of limbs,including the pelvic girdle from the amputation plane.I:Control Rana temporaria tail,which was amputated (broken line)and which regenerated perfectly.J: Rana temporaria tail amputated through the mid-point and treated with a high level of retinoids,which regenerated two pairs of hindlimbs,including the pelvic girdles (arrow) from the amputation plane.

После обработки регенератов низкими концентрациями ретиноидов регенерировали полный добавочный радиус и ульна (Рис.1B), а при воздействии высоких доз возникали дополнительный локтевой сустав (Рис.1C). При еще более высокой дозе все еще регенерировала полная конечность от поверхности ампутации (Рис.1D) это происходило и при ампутации по запястью (carpals)(Рис.1E). Некоторые др. виды амфибий, такие как Notophthalmus, Pleurodeles,Triturus и Xenopus также обнаруживали подобный феномен (Thoms and Socum,1984;Niazi et al.,1985;Scadding and Maden,1986;Lheureux et al.,1986).

Этот эффект RA был интерпретирован как респецификация позиционной информации вдоль оси конечности в проксимальном направлении. Она использует специфические компоненты ретиноидного сигнального пути, а именно RAR (Pecorino et al.,1996). У Rana temporaria (Maden,1983b) эффект супер-регенерации также очевиден. Т.к. индукция регенерации полной конечности от места регенарации на уровне стопы (Рис. 1F,G)происходил при высоких концуентрациях, то при наиболее высоких концентрациях ретиноиды индуцировали регнерацию пар конечностей, включая тазовый пояс (Рис.1H). В этих случаях, редупликация происходила не только вдоль проксимодистальной оси, но и вдоль передне-задней и дорсо-вентральной осей, т.к. пары конечностей были зеркально симметричны др. др.

Наиблее впечатляющим примером того, что RA м. индуцировать полную конечность не только из предсуществующих клеток конечности, но и из клеток иной органной специфичности, стала индукция конечности из хвостов некоторых видов амфибий. Это впервые было продемонстрировано Mohanti-Hejmadi et al.(Mohanty-Hejmadi et al.,1992) у Uperodon systoma, а затем и Maden (Maden,1993)у Rana temporaria. Когда хвост головастика лягушки ампутировали, то он в точности отрастал (Fig.1I); но когда культя обрабатывалась RA, то тогда регенерировало до 9 нижних конечностей (Fig.1J). Индукция хвостов в конечности также обнаруживала зависимоть от концентрации и от времени, она происходила непосредственно перед метаморфозом, когда уровни циркулирующего в крови тироидного гормана возрастали (Maden and Corcoran,1996).

Этот феномен регенерации и супер-регенерации является отражением эндогенной роли RA в развитии конечностей и регенерации конечностей. Присутствие эндогенной RA не обнаруживается в развивающихся конечностях амфибий, но когда почки конечностей аксолотля обрабатывали disulfiram, компонентом, который ингибирует синтез RA, то развитие конечностей временно останавливалось (Maden, 1998). RA действительно обнаруживалась в зачатках конечностей кур и мышей с помощью high performance liquid chromatography (HPLC;Thaller and Eichele, 1987,1990;Scott et al.,1994;Maden et al.,1998) и с помощью системы репортерных (Wagner et al.,1992;Maden et al.,1998; Sonneveld et al.,1998). Когда синтез RA (Stratford et al.,1996) или передача сигналов RA ингибировались (Helms et al.,1996), то зачатки конечностей кур не развивались. Сходным образом, RA обнаруживалась с помощью HPLC в регенерирующих конечностях амфибий (Scadding and Maden,1994) и с помощью репортерной системы (Brockes,1992; Viviano et al.,1995),а когда синтез RA ингибировался с помощью disulfiram, то регенерация ингибировалась (Maden,1998). Очевидно, что индуцированная RA супер-регенерация связана с индукией того же самого пути, который используется во время развития конечностей в первую очередь.

Эти in vivo данные показывают, что одной из функций RA в развивающейся ЦНС является обеспечение выростов нейритов, это подтверждается большим материалом исследований на клетках эмбриональной карциномы, стволовых клетках, клетках нейробластомы и диссоциированных нейронов. Во всех этих случаях RA или индуцирует нейрональную дифференцировку недифференцированных клеток (embryonal carcinoma, teratocarcinoma, stem и neuroblastoma cells) или увеличивает количество и/или длину нейритов у диссоциированных нейронов (review Maden,2001). Это обеспечивается за счет индукции широкго круга генных продуктов, включая факторы транскрипции, структурные белки, энзимы, гликопротеины клеточной поверхности, внеклеточные белки, нейротрансмиттеры, нейропептидные гормоны, факторы роста и поверхностные рецепторы. Следовательно, RA д.б. способна индуцировать регенерацию нейритов, когда аксоны повреждаются. Это определенно происходит с диссоциированными эмбриональными нейронами, напр., в органной культуре спинного мозга эмбрионов мыши (Рис.2A,B).

THE REGENERATING CNS

Развивающаяся ЦНС еще одна эмбриональная система, которая содержит RA и которая нуждается в RA для своего нормального развития. Фактически, эмбриональный спинной мозг содержит наиболее высокие уровни эндогенной RA (Maden et al.,1998). Если RA удаляется из эмбриона, чтобы получить RA-дефицитных эмбрионов перепела (Maden et al.,1996) или эмбрионов крыс (White et al.,2000), то ЦНС обнаруживает некоторые тяжелые аномалии. Имеется дефекты формирования эмбрионального паттерна, задняя часть заднего мозга неспособна развиваться (Gale et al.,1999), а дорсовентральная организация спинного мозга аномальна (Wilson and Maden,unpublished data), но наиболее важно в данном случае отсутствие выроста нейритов из спинного мозга на периферию (Maden et al.,1996).

Рис.2.Retinoic acid (RA)receptor β2 (RARβ2) induces neurite outgrowth in adult mouse spinal cord in vitro. Neuro filament immunoreactivity of whole-mount cultures.A: Control embryonic day 13.5 mouse spinal cord cultured for 5 days in cellagen organ culture in delipidated serum.Some neurites grow out from the cord into the cellagen.B: Embryonic day 13.5 mouse spinal cord cultured for 5 days in cellagen organ culture with added RA (10^-6M).Many more neurites have grown out.C:Adult mouse spinal cord cultured for 5 days in cellagen organ culture in delipidated serum.No neurites grow out.D: Adult mouse spinal cord cultured for 5 days in cellagen organ culture with added RA (10^-6M).No neurites grow out. E: Adult mouse spinal cord transfected with a lentiviral vector containing the RARβ2 gene. The region of transfection is shown by .uorescein isothiocyanate .labelled anti-Flag immuno .uorescence (green).From this region and not from anywhere else, neurites have grown out,as visualised by Texas Red secondary labelling of neurofilament (NF-200)immunostaining (red).

Однако, сходные культуры из спинного мозга взрослых мышей не отвечают выростом нейритов в ответ на RA (Рис. 2C,D).

Возможно, что во время перехода от эмбрионального к взрослому состоянию некоторые или все трансдукторы сигналов RA м.б. постоянно выключены за счет инактивации их транскрипции. Но если это так, то создание избытка RA должно перекрывать потребность в энзимах и индуцировать вырост нейритов, но этого не происходит (Рис.2D). Рецепторы также м.б. кандидатами, и если это имеет место, то избыток RA не будет способен передавать сигналы в ядро из-за отсутствие рецепторов. В исследованиях диссоциированных эмбриональных неронов показано, что рецепторами, которые передают сигналы RA являются RARβ2 (Corcoran et al.,2000). Это заключение базируется на том, что эти рецепторы активируются после добавления RA, а RARβ agonist (CD2019) индуцирует эббыточные выросты нейритов из этихнейронов, в то время как ни RAR α агонист (CD366), ни RARγ агонист (CD437) не ведут себя подобным образом. Роль RARβ2 подтверждена и тем. что он активируется в эксплантах эмбрионального спинного мозга, которые отвечают на RA увеличениме нейритов, но он не активируется в экплантах взрослого спинного мозга после добавления RA.

Следовательно, хотя RA и является нерит-индуцирующей молекулой, но во взрослом спинном мозге реакция отсутствует из-за инактивации транскрпции RARβ2 в постнатальный период. В этом случае трансфицированные RARβ2 нейроны взрослого мозга д. вызывать реакцию на RA. И в самом деле, это оказалось так в случае использования lentiviral векторной системы для трансфекции гена RARβ2 во взрослый культивируемый спинной мозг мыши и крысы (Corcoran et al.,2002). Носители вирусного вектора имели антигенную метку, так что трансфицированные клетки м.б. определить. На рис. 2E, область культивируемого спинного мозга м. видеть окрашенной в зеленый цвет после окрашивания антителами метки. Эта культура окраливалась также на выявление нейритов антителами к нейрофиламентам в красный цвет и было показано, что область, которая трансфицирована является областью, где нейриты индуцируются из спинного мозга . В этих экспериментах из 34 трансфицированных культур 24 обнарудивали индукцию выроста нейритов, давая частоту индукции в 70%. Ни один из контролей не давал выростов нейритов в культуре.

Когда спинной моз трансфицировался RARβ2, то он давал нейриты независимо от то, добавляли или нет RA в культуральную среду. Несомненено имеется эндогенная RA во взрослом спинном мозге и это присутствие обеспечивает лиганд для RARβ2. Правда, возможно, что активация м. происходить и в отсутсвие лиганда в результате эффекта phantom ligand, когда RAR активируются за счет конформационных изменений их RXR гетеродимерного партнера (Schulman et al.,1997). Итак, RA м. индуцировать регенерацию и во взрослой ЦНС млекопитающих, когда действует на геном через свои обычные рецепторые пути.

ALVEOLAR REGENERATION IN ADULT MAMMALIAN LUNGS

Если учесть, что первичной функцией легких является облегчение газообмена и что это зависит от области поверхности surface area of gas-exchanging tissue (Sa), состоящей в основном из легочных альвеол, то очевидно, что болезни, характеризующиеся уменьшением Sa, такие как bronchopulmonary dysplasia и emphysema, м.б. излечены за счет регенерации альвеол.

Большинство альвеол формируется во время онтогенетически регулулируемого постнатального периода у крыс, мышей и человека, они представлены незрелыми мешочками, которые подвергаются повторяющимся подразделениям или septation. Образование перегородок (septation) альвеол происходит в течение первых двух недель постнатальной жизни у крыс и мышей и по-видимому, до 18 месяцев у человека (Massaro and Massaro,1996). после этого периода имеет место ограниченное образование альвеол и если развитие альвеол нарушено во время septation или нарушены альвеолы после периода septation, то не происходит спонтанного восстановления Sa. Такая неспособность к жндогенной репарации ведет к важным клиническим проявлениям bronchopulmonary dysplasia у детей и легочной эмфиземы у взрослых, когда имеется недостаток Sa для поддержания адекватного газообмена, это ведет к dyspnea, hypoxia и часто к смерти. Эмфизема вместе с хроническими бронхитами ведет к синдрому chronic obstructive pulmonary disease (COPD), котарая, как предсказывают, перейдет с 12-го на 5-е место в ряду причин, обременяющих человечество в 2020 (Lopez and Murray,1998). Сейчас нет эффективного лечения кроме кислородной терапии и трансплантации легких (Barnes,2000).

Передача ретиноидных сигналов исследовалась во время формирования альвеол на крысах и мышах и была установлена потребность в RA для инициального развития альвеол. У мышей HPLC результаты показали, что септации альвеол предшествует пик RA и это сопровождается падением ретинола, указывая на использование ретиноидов (Hind et al.,2002a). У крыс изменения в уровне эндогенных ретиноидов обнаруживаются непосредственно после рождения (Geevarghese and Chytil,1994;McGowan et al.,1995). Два RA синтезирующих энзима присутствуют с postnatal day 1 (P1) до P4, увеличивая свое пространственное распределение, это коррелирует с пространственным паттерном пролиферации альвеол. RALDH1 экспрессируется в альвеолярной паренхиме во время периода, когда происходит драматическое увеличение пролиферации клеток с P4,которое в основном заканчивается к P14. RALDH2 экспрессируется по периферии легких в плевральных мезотелиальных клетках, это ассоциирует с низким уровенем и периферическим паттерном пролиферации (Hind et al.,2002a). Когда синтез RA ингибируется с помощью ежедневного применения disulfiram у мышей между P2 и P14, то образование альвеол нарушается, образуются большие альвеолярные пространства, а средняя chord length (определение среднего диаметра альвеол) увеличивается (Рис.3A .C).

Fig.3.Retinoic acid (RA)is required for alveologenesis and induces alveolar regeneration in adult mouse lungs. Hematoxylin and eosin staining of inflation fixed,wax sectioned tissue; all photomicrographs are at the same magnification. A:Control adult (postnatal day [P ]24) mouse lung,showing typical arrangement of alveoli.B:P24 lung,which had been treated with disulfiram to inhibit RA synthesis during alveologenesis from P2 to P14.Large air spaces caused by inhibition of alveolar development are apparent.C:Quantitation of the mean chord length (average diameter of alveoli)in control (as in A)and disulfiram-treated (as in B)lungs. D:Control adult (P90)mouse lung,showing typical arrangement of alveoli. E:Adult mouse lung (P90),which had been treated with dexamethasone during alveologenesis from P2 to P14.An irreversible inhibition of alveolar development is apparent with highly enlarged air spaces. F:Dexamethasone-treated (P2 - P14)mouse,which had received RA from P30 to P42.By P90,alveoli have regenerated and returned the lung to the control condition (compare with D). G:Data on gas exchanging surface area per 100 g body weight for the control animals (as in D),dexamethasone-treated animals (as in E ),and RA-treated dexamethasone animals (as in F ),showing that RA fully regenerates the lung capacity.

Образование альвеол сопровождается также достоверными изменениями в уровнях retinoid связывающих белков CRBP1 и CRABP1 и у мышей (Hind et al.,2002b) и у крыс (Ong and Chytil,1976; McGowan et al.,1995). Экспрессия RARs охарактеризована во время образования альвеол у крыс (McGowan et al.,1995),а авт. охарактеризовали временную и пространственную экспрессию RAR изоформ α1, β2, β4 и γ2 у мышей(Hind et al.,2002b). Нокаут этих рецепторов выявил, что эти рецепторы играют и ингибирующую и стимулирующу роль. Нулевые мутанты по гену RAR имеют малоочень больших альвеол,Это указывает на то, что RARγ необходим для образования альвеол (McGowan et al., 2000). Напротив, нулевые мыши по гену RARβ bv.n мальеньки более многочисленные альвеолы, это указывает на то, что RARβ м. функционировать как негативный регулятор образования альвеол (Massaro et al.,2000). Следовательно, если RA необходима для образования альвеол, то будет ли ее воздействие на легкие, чьи альвеолы были потеряны, индуцировать их регенерацию? Удивительно, но ответ положительный. Massaro and Massaro (1997) описали признак для демонстрации, что системное воздействие RA treatment м. устранять патологические свойства экспериментальной эмфиземы у взрослых крыс. В этом эксперименте потерю альвеол индуцировали instillation эластазы в трахею, а легочные параметры, такие как объем легких, расстояния между альвеолярными стенками и область поверхности на объем легких, восстанавливались на 12 день после воздействия RA. Сходные результаты получены на крысах (Belloni et al.,2000;Tepper et al.,2000). RA восстанавливала также альвеолы в др. моделях деструкции альвеол, таких как tight skin mouse, генетическая причина спонтанной эмфиземы, и в моделях нарушения развития альвеол, таких как воздействие glucocorticoid на крыс (Massaro and Mas- saro,2000).

Авт. использовали обработанных dexamethasone мышей в качестве модели потери альвеол. Обработка мышей между P2 и P14 dexamethasone (dex) вызывает драматичпескую потерю альвеол (Fig.3D,E). Когда такие dex-обработанные мыши затем начали получать ежедневно инъекции RA с P30 по P42 и затем они росли до P90, то их альвеолы выглядели нормальными (Fig.3F). После гистологического анализа этих экспериментальных легких определяли объям легких, расстояния между альвеолярными стенками в соответствии с их весом тела, то становилось очевидным, что эти обработанные RA мыши имеют полностью регенерировавшие легкие (Fig.3G). Следовательно, RA рестимулирует т е самые чувствительные к RA генные пути, которые используются во время нормальрного генеза альвеол. М. ли RA восстанавливать альвеолы у людей необходимо тщательно исследовать.

PERSPECTIVES

We review here the data which demonstrate that RA is a regeneration-inducing molecule in three systems - the regenerating amphibian limb,where it induces super-regeneration; the mammalian CNS,where RA cannot function because RAR is missing,and when RARβ2 is virally transduced into the spinal cord, neurites are induced; and the mammalian lung,where RA induces alveolar regeneration.In each of these systems,we suggest that RA acts to invoke regeneration because that organ developed originally under the influence of RA and those gene pathways used in development are being re-induced for regeneration. If so,then we can identify other organ systems that might be capable of being regenerated by RA by identifying further organ systems whose development depends on RA.One such example is the kidney (Lelievre- Pergorier et al.,1998;Mendelsohn et al.,1999).Perhaps RA can regenerate nephrons. Another example is the pancreas (Stafford and Prince, 2002),and this possibility might mean that RA could regenerate the islets as a treatment for diabetes. There are also potential examples within the CNS.The RA synthesising enzyme RALDH1 is present in a lo calised region of the ventral mesencephalon during development, which is the forerunner of the neurons of the substantia nigra.This enzyme is localised to these neurons in the adult (McCaffery and Drager,1994).Perhaps RA may have a role to play in the treatment of Parkinson's disease.It is clear,therefore, that developmental studies of gene pathways have an important role to play in revealing potential therapies for the regeneration of cells and organs.

Retinoic Acid, A Regeneration-Inducing MoleculeMalcolm Maden and Matthew HindDEVELOPMENTAL DYNAMICS 226:237 –244,2003

Retinoic Acid, A Regeneration-Inducing Molecule
Malcolm Maden and Matthew Hind
DEVELOPMENTAL DYNAMICS 226:237 –244,2003