
CELL SENESCENCE AND CANCER Nicole F. Mathon & Alison C. Lloyd Nature Reviews Cancer 1, 203-213 (2001)
(Рис. 1.) \| Telomere shortening determines the proliferative lifespan of human diploid fibroblasts. (Рис. 2.) \| Pathways to senescence. (Рис. 3.) \| Telomerase regulation during tumorigenesis. Boxes Box 1 \| Telomeres and telomerase Box 2 \| Telomere signalling Telomeres are complex structures that protect the ends of linear chromosomes. A telomere is considered to be 'capped' when it is sufficiently stable to signal continued proliferation to the cell. An 'uncapped' telomere triggers a cell-cycle arrest or apoptosis. In addition, 'uncapped' telomeres can lead to an increase in genetic instability, resulting in an increased mutation rate In the absence of telomerase, telomeres will shorten at each division. Analysis of individual chromosome ends has shown that it is the length of the shortest telomere that determines replicative capacity rather than the average telomere length. These short telomeres are seen as 'uncapped'. Telomeres can also become uncapped by the disruption of telomere structure. Expression of a dominant-negative version of TRF2 (Box 1) disrupts the normal structure and results in the rapid onset of either senescence or apoptosis, depending on the cell type. Disruption of telomeres by the expression of dominant-negative TRF2 activates a damage pathway that is known to be activated in response to double-stranded DNA breaks. This involves activation of the ATM kinase that signals to the cell-cycle machinery and apoptotic pathways in a p53-dependent manner.> Telomerase expression has also been proposed to increase genetic stability in a manner that is independent of regulating telomere length. It has been suggested that telomerase expression increases the overall stability of the 'capped state'. The idea that the telomere state is dynamic and that even long telomeres can become uncapped fits with the stochastic onset of senescence in telomerase-deficient cells. A second suggestion is that, following DNA damage, de novo telomere addition by telomerase to broken chromosomal ends can change the spectrum and decrease the severity of the resultant chromosomal rearrangements. Box.3 \|Telomere knockout mice Box 4 \| Telomerase expression The laboratory mouse expresses telomerase in almost all cell types. There is, however, tissue-specific differential regulation, which is reflected by differences in telomere length. Activity is high in the testes and liver, lower in the kidney and spleen, and undetectable in the brain. Telomerase activity has been detected in a variety of human somatic tissues, including haematopoietic cells, basal keratinocytes and epithelial cells in the endometrium, oesophagus, prostate and pancreas. Telomerase activity correlates with the proliferative requirements of cells at various stages throughout life: the endometrium undergoes significant replication throughout the menstrual cycle and is telomerase positive. By contrast, telomerase activity in endometrial tissues from menopausal women is very low. Haematopoietic cells are required to undergo massive proliferation during development and following immune responses. Mitogenic stimulation of T cells (for example, by antigen application) results in a 500–1000-fold increase in telomerase activity. The lobular epithelium of the breast is required to proliferate at various stages throughout life — for example, during pregnancy — and maintains active telomerase. Downregulation of telomerase following exit from the cell cycle has been shown by inducing quiescence in tumour cell lines and differentiation of stem cells in culture Box 5 \| The role of replicative senescence in ageing In considering a role for replicative senescence in the ageing process, we can first assume that it is only a contributory factor. Lower organisms, consisting mostly of post-mitotic cells, still age, as do the post-mitotic tissues of higher organisms. Moreover, mice have long telomeres and telomerase knockout mice have no phenotype for several generations, arguing against a role for telomere shortening and replicative senescence in the ageing process. Do cells reach their replicative limit during a normal human lifespan? An inverse correlation between the lifespan of cells in culture and donor age indicated that replicative capacity is depleted as we age, but another study indicates that this correlation is not significant. Attempts to measure telomere length to look for evidence of telomere shortening in older people has also proved inconclusive as there seems to be no clear link between telomere repeat number and donor age in certain cell types. Whether replicative senescence occurs as we age therefore remains controversial. Accelerated ageing of late-generation telomerase knockout mice has been used to argue in favour of an important role for replicative senescence in ageing, as does the discovery that some human premature ageing syndromes are associated with telomere defects. The phenotype of the ageing disorder dyskeratosis congenita closely mirrors that of the telomerase knockout mice — cells from these patients have reduced telomerase activity and accelerated telomere shortening. Severe telomeric dysfunction therefore leads to certain signs of ageing, but does this actually occur during a normal human lifespan? What is interesting about the human diseases is that, unlike the mouse, defects in telomerase activity have an effect during a single lifetime, arguing that human telomeres are critically poised at a length that is sensitive to attrition. Box 6 \| Clinical applications of telomeres and cancer Diagnostics Telomerase activity might be useful as a diagnostic and prognostic marker for cancer as telomerase activity is detected in >90% tumours. Sensitive assays for telomerase activity and expression are easy to carry out and can be used on fresh/frozen tumour biopsies, fluids and secretions. Assays include the following: TRAP (telomere repeat amplification protocol), a polymerase chain reaction (PCR)-based enzymatic assay. Immunohistochemical detection of telomerase reverse transcriptase (TERT), which correlates well with telomerase activity and allows detection at the single-cell level. RT/PCR (reverse transcriptase/PCR) analysis, which can be used to detect expression of TERT mRNA. Therapeutics Inhibiting telomerase in cancer cells might also be of therapeutic benefit. TERT (the reverse transcriptase) and TR (the RNA template) have been identified as valid targets in vitro: dominant-negative TERT induces apoptosis in tumour cell lines, and treatment of tumour cell lines with antisense oligodeoxynucleotides to TR results in a crisis-like response after the lag required for telomere shortening. Promising therapeutic strategies based on these approaches include: Inhibiting TERT: small-molecule screens using standard assays for telomerase activity have identified isothiazolone derivatives as specific, efficient inhibitors of TERT . Inhibiting TR: antisense peptide nucleic acids (PNAs) to TR, delivered in vitro by a carrier, inhibit tumour-cell proliferation. Telomerase might also be a useful tumour-specific antigen. Effective antitumour T-lymphocyte responses against TERT-expressing cells have been generated, showing the potential for immunotherapy. This strategy circumvents the time lag required for telomere Links DATABASES LocusLink: \| Apc \| -galactosidase \| Cdkn2a \| CDKN2A \| MYC \| p53 \| RAS \| RB \| TERT \| Tert \| TRF1 \| TRF2	40 лет назад, Leonard Hayflick впервые предположил, что существует "finite limit to the cultivation period of diploid cell strains" и что это "attributable to intrinsic factors which are expressed as senescence at the cellular level". Он предположил, что нормальные клетки не м. делиться бесконечно, т.к. они запрограммированы на определенный пролиферативный период жизни. Он достаточен для обеспечения пролиферативных потребностей, но действует как тормоз избыточной пролиферации и тем самым защищает от рака. Diploid fibroblasts (HDFs) широко использовались для изучения механизмов replicative lifespan. Эти клетки осуществляют 60–80 популяционных удвоений в культуре после чего они прекращают деления и дают фенотип старения, характеризующийся крыпными разменами, уплощенной морфологией и высокой часотой аномалий ядра и позитивной окраской на frnbdyjcnm β-galactosidase при pH 6.0. Эти метаболически активные в состоянии старения клетки чрезвычайно стабильны и могут поддерживаться в кулдьтуре в течение нескольких лет. Арест клеточного цикла, который происходит в этих клетках, поддерживается с помощью сигналов, которые активируют опухолевые супрессоры p53 и retinoblastoma (RB). Закрытие этих путей — с помощью, например, экспрессии опухолевых вирусов — ведет к обходу ареста клеточных циклов, ассоциированных со старением, и клетки продолжают пролиферацию и после их нормаьного периода жизни. Эти клетки все еще не м. делиться неопределенно долго - они не имморатлизованы. После 20–30 дополнительных популяционных удвоений они вступают в состояние, называемое 'crisis'. При кризисе клети продолжают пролиферировать, но обнаруживают высокие уровни апоптоза — запускаемого большими хромосомными аномалиями — так что не происходит увеличения общего числа клеток. Некоторым клеткам удается избежать кризиса и они становятся бессмертными (immortal) (Рис.1). Молекулярные механизмы, которые предопределяют внутренне присущий репликативный период жизни у HDFs, по-видимому, контролируются с помощью одиночного процесса — telomere shortening. Теломеры являются повторяющимися последовательностями ДНК, связанными с помощью комплексов белков на концах линейных хромосом (Box 1). Теломераза, рибонуклеопротеиновый энзим, необходимый для завершения репликации концов ДНК (Box 1). HDFs, подобно большинству соматических клеток человека, не экспрессируют теломеразу, в результате теломеры прогрессивно укорачиваются в каждом делении. Когда теломера достигает критической длины, то повреждающий сигнал запускает состояние старения посредством механизмов, еще полностью неизученных (Box 2). Емли этот повреждающий сигнал удалить путем инактивации p53 и RB, то клетки м. продолжать пролиферировать, но теломеры будут продолжать укорачиваться до тех пор, пока они не приведут к хромосомной нестабильности, ответственной за кризис (Рис. 1). Укорочение теломер ответственно за ограничение периода жизни HDFs, т.к. экспрессия теломеразы в HDFs достаточна, чтобы избежать как старения, так и кризвиса и ведет к immortality. Итак, укорочение теломеры действует как митотический счетчик, определяющий пролиферативный период жизни HDFs и должно ультиматисно ограничивать пролиферативную способность любого типа клеток, у которых отсутствует теломеразная активность. Однако, др. типы клеток, которые сохраняют длину теломер в культуре или в результате эндогенной теломеразной активности или в результате экспериментальной экспрессии теломеразы все же приобретают старческий фенотип в культуре. Напр., кератиноциты человека или эпителиальные клетки молочных желез не иммортализуются при экспрессии одной лишь теломеразы. Сходным образом, клетки грызунов, экспрессирующие теломеразу и сохраняющие очень длинные теломеры, все же стареют в культуре. Это указывает на то, что имеются дополнительные, независимые от теломер, механизмы, которые ограничивают пролиферативный период жизни определенных типов клеток. Известно, что 'damage' сигналы м. индуцировать старческий фенотип в клетках независимо от их репликативной истории. Напр., молодые HDFs становятся старыми, если подвергаются воздействию агентов, которые индуцируют клеточные повреждения, такие как ДНК-повреждающие агентыили оксидативный стресс. Кроме того, несоответствующая активация митогенных сигнальных путей за счет экспрессии онкогенного RAS также м. вызывать вступление на путь старения этих клеток. Эти пути к старению названы преждевременным стерением, т.к. они укорачивают свойственный им репликативный период жизни (Рис. 2). Предполагается, что независимые от теломер механизмы, ограничивающие репликативный период жизни — обнаруживаемые в некоторых эпителиальных клетках человека и клетках грызунов — вызывают преждевременное старение, запускаемое с помощью кумулятивной травмы культивируемых клеток in vitro. Доказательства в пользу этой гипотезы, полученые на некоторых типах клеток, указывают на то, что эти клетки, по-видимому, не имеют ограничения репликативной способности и что при изменении культуральных условий возможно изменение начало старения. Изучение двух типов клеток у крыс — SCHWANN CELLS и OLIGODENDROCYTE PRECURSOR CELLS, которые обычно экспрессируют telomerase — показало, что они м. культивироваться неопределенно долго, но изменение культуральных условий м. затем вызывать вступление на путь старения. Сходным образом, изменение кульуральных условий эпителиальных клеток человека — путем выращивания их на питающих слоях скорее, чем на пластике — позволяет этим клеткам избегать старения и, если они экспрессируют экзогенную теломеразу, то пролиферировать неопределенно долго (Рис. 2). Эти результаты показывают, что в присутствии теломеразной актинвости нет внутренне присущего механизма, ограничивающего период жизни этих клеток, но что внешние факторы м. ограничивать их пролиферативную способность. Это м. указывать на то, что культуральные условия др. типов клеток ответственны за кажущееся ограничение их пролиферативного периода жизни и что любые клетки, экспрессирующие теломеразу д. пролиферировать неопределенно долго, если имеются подходящие культуральные условия. Is replicative senescence tumour suppressive? Большинство соматических клеток человека не экспрессирует теломеразу и д. иметь ограниченный репликативный период жизни. Этот встроенный механизм, как полагают, защищает против развития опухолей органичением пролиферации, необходимой для образования клональных опухолей. На первый взгляд, пролиферативная способность нормальных клеток in vitro кажется занчительно превосходящей количество делений, необходимых для образования опухолей. Напр., 40 популяционных удвоений эквивалентны тому, что одна клетка даст 10¹² клеток, тогда как выявляемые опухоли редко содержат более, чем 10⁹ клеток. Однако, известно, что хотя ранние стадии развития опухолей являются высоко пролиферативными, экспансия опухоли удерживаетсясоответственно высокой скоростью апоптоза. Следовательно, трудно определить количество делений, необ ходимое для развития опухоли у человека и оценить каков лимит репликативной способности м. служить препятствием этому процессу. Ясно, что стабилизация теломер является важной ступенью в развитии опухолей. Большинство злокачественных опухолей человека экспрессируют telomerase; те, которые этого не делают, стабилизируют свои теломеры с помощью различных механизмов — альтернатива удлиннению теломер (ALT). Теломеры часто короче внутри опухолей, чем в окружающих тканях, указывая тем самым, что укорочение теломер происходит в некоторой точке во время развития опухоли. Более того, экспрессия теломеразы в опухолевых клетках является существенной для их непрерывной пролиферации, т.к.экспрессия DOMINANT-NEGATIVE telomerase reverse transcriptase (TERT) вызывает апоптоз. Эта потребность в активации теломеразы воспроизводится in vitro. Начиная с нормальных фибробластов человека, экспрессия теломеразы является ключевой потребностью - в дополнение к экспрессии онкогенных RAS и SV40 LARGE T ANTIGEN — для продукции трансформированных клетое, которые способны формировать опухоли in vivo. Итак, соматические клетки человека не экспрессируют теломерызы. Пролиферация, необходимая для развития опухолей, достаточна для запуска репликативного старения и действует как защита против опухолей. Редко клетки обходят этот КПП (checkpoint) путем активации теломеразы или стабилизации теломер, после чего м. наступить развитие опухоли. Это делает теломеразу прекрасной мишенью для лекарст против опухолей, т.к. большинство опухолевых клеток нуждается в теломеразной активности, а нормальные клетки нет. Lessons from mice Однако, нокаутные по telomerase мыши развиваются, имея делетированным РНК компонент, mTR. Из-за чрезвычайно длинных теломер у лабораторных мышей, успешное разведение нокаутных мышей требует генерации теломер, которые приближаются по длине к человеческой, но в 4-м поколении начинают обнаруживаться различные эффекты укорочения теломер. Как и предсказывалось, самые ранние эффекты укорочения теломер проявлялись в высоко пролиферативных тканях. Но неожиданным оказалось то, что эти мыши последней генерации имели повышенную частоту появления опухолей по сравнению с диким типом или предыдущими поколениями животных. Это указывало на то, что, у этих мышей, укорочение теломер увеличивает частоту поухолей скорее, чем противодействует им (Box 3). Возможным объяснением этой аномалии является то, что укороченные теломеры имеют двойной эффект: они инициируют checkpoint сигналы, которые провоцируют арест клеточного цикла или запуск апоптоза, но они м. также вызывать нестабильность хромосом. Итак, если checkpoint сигналы защищают от образвания опухолей, то повышенная генетическая нестабильность скорее всего ускоряет многоступенчатый туморогенный процесс. Показано, что как in vitro , так и in vivo, укороченные теломеры провоцируют хромосомную нестабильность. HDFs , прибилижающиеся к кризису, обнаруживают рост хромосомных аномалий типа слияний конец-в-конец, ведущих к MULTICENTRIC CHROMOSOMES с разрывами, появляющимися в митозах. У дрожжей, хромосомны аномалии, индуцируемые короткими теломерами ведут к увеличению скорости мутирования. Сходным образомy, клетки, изолированные из пролиферирующих тканей теломеразы нокаутных мышей поздней генерации, предоставляют доказательства сходных хромосомных аномалий и это в тех тапах тканей, в которых возникают опухоли. Более быстрое накопление вредных мутаций в результате укорочения теломер перевешивает любые защитные преимущества пролиферативного checkpoint. Этот эффект умножается на p53-нулевом фоне, возможно из-за увеличения жизнеспособности генетически поврежденных клеток. Если скорость мутаций увеличивается при применение канцерогенов или потребность в мутациях снижается при скрещивании теломараза-негативных мышей с мышами, которые уже несут онкогенные мутации, то в противоположность защитной роли укорочение теломер м. наблюдаться усиление показателя образования опухолей. Напр., CDKN2A нокаутные мыши имеют значительно более высокую частоту возникновения опухолей из-за отсутствия у них двух супрессоров опухолей, которые кодируются Cdkn2a геном — INK4A (известен также как p16) и ARF (известен также как p19). Скрещенные с telomerase knockouts и обработанные канцерогенами мыши поздней генерации имеют пониженную частоту опухолей по сравнению с мышами ранних генераций, которые сохраняют длинные теломеры. Следовательно, в этой ситуации ограничение репликативной способности, по-видимому, защищает против образования опухолей. Сходным образом, короткие теломеры защищают от образования эпителиальных опухолей, когда воздействуют канцерогенами на кожу telomerase-knockout мышей (Box 3). Наиболее драматическая ситуация противоположных эффектов, когда укорочение теломер влияет на показатель опухолей, обнаруживается у Apc^Min мышей. Они имеют укорачивающую мутацию в гене adenomatous polyposis coli tumour-suppressor Apc и,как результат, развиваются множественные кишечные неоплазии. Люди со сходной мутацией также предрасположены к развитию множественных полипов и у них повышен риск образования карцином толстого кишечника (FAMILIAL ADENOMATOUS POLYPOSIS). Мыши Apc^Minс короткими теломерами обнаруживают повышенные частоты микроскопических аденом по сравнению с животными, имеющими длинные теломеры, возможно повышенная генетическая нестабильность повышает склонность к потере второго аллеля Apc allele. Однако, количество прогрессирующих до образования макроскопических аденом снижено и мыши живут дольше, чем Apc^Min мыши с длинными теломерами. Это указывает на то, что репликативная способность ограничивает прогресс микроаденом в злокачественные опухоли и в этом контексте укорочение теломер действует как защита против образования опухолей (Box 3). From mice to man Итак, экспрессия теломеразы защищает от генетической нестабильности и как показывает фенотип telomerase knockout мышей, отсутствие теломеразной активности м. способствовать туморогенезу. Почему же telomerase выключается в соматических клетках человека? Не ведет ли это к увели чению возникновения опухолей? Возможным объяснением является то, что баланс в клетках человека отличается от такового у мышей — преимущества ограниченые пролиферативной способностью м. перевешивать цену повышенной генетической нестабильности. Однако, т.к. клетки человека имеют более низкую скорость спонтанных мутаций in vitro, чем клетки грызунов, и необходимо больше генетических изменений для достижения tumorigenicity, то это кажется маловероятным. Не все соматические клетки человека telomerase негативны (Box 4). Фактически, в пролиферирующих тканях, экспрессия telomerase довольно распространена. Экспрессия, однако, ограничена клетками предшественниками, такими как базальные слои эпителия в коже и кишечнике или тонко регулируется для гарантии экспрессии только в определенных типах клеток, нуждающихся в пролиферации, напр., в лимфоцитах во время активации. Следовательно, за небольшими возможными исключениями активность теломеразы коррелирует тесно с пролиферативными потребностями клеток. Итак, люди не м. рассметриваться как эквиваленты теломараза-негативным мышам в том смысле, что опухоли у человека м. возникать из клеток, обычно экспрессирующих telomerase. Если экспрессия теломеразы важна в пролиферирующих клетках, особенно в тех, которые нуждаются в большой репликативной способности, то почему теломераза не экспрессируется во всех наших клетках? Почему созданы механизмы для регуляции теломеразной активности? Единственная возможность, что теломераза выполняет дополнительные функции, которые вредны для нормального поведения некоторых клеток. Если Tert экспрессируется избыточно в базальных кератиноцитах мыши, то мыши формируют нормальные структуры кожи, но воздействие опухолевых промоторов или повреждения кожи вызывают значительное усиление пролиферации кератиноцитов. Это указывает на то, что высокие уровни теломеразы м. действительно способствовать пролиферации клеток — функция, которая, по-видимому, отлична от функции поддержания теломерных концов. Экспрессия Tert в сердце, ткани, которая у взрослых мышей обычно не экспрессирует теломеразу, ведет к кардиальной гипертрофии и способствует выживанию миоцитов после повреждений, это также указывает на то, что теломераза м. вызывать и др. клеточные эффекты. Дополнительные функции теломеразы м. объяснить, почему высокие уровни ее экспрессии прогрессивно селектируются во время возникновения опухолей у человека. Это объясняет также, почему мыши обладают ткане-специфичной регуляцией теломеразы и селектируются на высокие уровни экспрессии теломеразы во время прогрессии опухолей, несмотря на наличие теломер более чем в 10 раз более длинных, чем у человека. Др. возможность в том, что регуляция теломеразы отражает преимущества или цену для определенных типов клеток экспрессии теломеразы, которая м. варьировать в соответствии с пролиферативными потребностями и функциями клеток. Это м. объяснить то, что активация теломеразы в некоторых типах клеток — напр., лимфоцитах — кажется недостаточной для поддержания длины теломер. Возможно, для эжтих клеток экспрессия теломеразы является набором уровней, которые обеспечивают защиту при нормальных пролиферативных потребностях клеток, но прогрессивное укорочение теломер все еще пролиферативный барьер для защиты от малигнизации. Telomerase regulation in tumour development Теломеразная активность обнаруживатеся в большинстве опухолей человека, и теломеры оказываются стабилизированы с помощью ALT у остальных. Кроме того, кажется, что повышенные уровни экспрессии теломеразы избираются во время малигнизации опухолей. Это указывает на то, что стабилизация теломер необходимая ступень для развития опухолей, высокие уровни экспресси теломеразы предоставляют селективные преимущества опухолевым клеткам. Ген TERT амплифицирован у части опухолей, указывая на то, что прямой мутационный механизм м.б. ответственным за усиление активности теломеразы. Интересно, что экспрессия определенных онкогенов — гапр., MYC и tumour virus protein E6 — м. непосредственно активровать экспрессию теломеразы. Эта способность, по-видимому, клеточно-специфична и коррелирует со способностью этих онкогенов иммортализовать клетки. Следовательно, возможно, что активация теломеразы во время образования опухоли м. осуществляться непрямо, в результате активации онкогенов или изменения пролиферативного или дифференциального статуса клетки. Возможны несколько сценариев, по которым регуляция теломеразы м. вносить вклад в формирование опухолей (Рис. 3). У telomerase-негативных клеток, укорочение теломер, в результате множественных делений на ранних стадиях возникновения опухолей, м. защищать от туморогенеза благодаря репликативному старению. Наличие теломеразной активности д. обеспечивать преодоление этого ренпликативного блока. Или укорочение теломер м. выхзывать генетическую нестабильность и усиливать вероятность дополнительных онкогенных мутаций и прогрессирующую малигнизацию. Последующая активация теломеразы м. действовать, стабилизируя злокачественный генотип, обеспечивая экспансию возникших в результате клеток. Для опухолей, которые произошли от теломераза-позитивных клеток, потеря генетической стабильности м.б. необходимой для управления туморогенезом, которй м. использовать репрессию теломеразной активности. Теломераза д.б. необходимой тогда и включаться на поздней стадии для рестабилизации генома. Для многих опухолей в ходе туморогенеза клетки, которые экспрессируют высокие уровни теломеразной активности, скорее всего будут избраны, что отражает пролвиферативные преимущества этих клеток. Is premature senescence tumour suppressive? Повреждающие сигналы от укороченных теломер являются не единственным путем к старческому фенотипу. Активация онкогенного RAS это др. повреждающий сигнал — такой как γ-облучение и оксидативный стресс — и несоответствующие культуральные услови, все они запускают преждевременное вступление на путь старения молодых клеток, по крайней мере in vitro (Рис. 2). Считается, что преждевременное старение м. также дейстовать защитно как механизм супрессии опухолей за счет выведения поврежденных клеток из пролиферативного состояния (Рис. 3). Известно, что нормальные клетки in vitro рефрактерны к трансформации одиночными онкогенами. Клетки, которые содержат эти онкогенные изменения не имеют тенденции сохраняться в популяции, а понуждаются или к выходу из клеточного цикла (RAS) или к гибели (MYC). Пути передачи сигналов RAS sпостоянно активированв в большой пропорции опухолей человека, так что активация RAS. по-видимому, важный путь к туморогенезу. Если несоответствующая активация RAS запускает вступление в старение, то это м.б. важным механизмом ограничения образования опухолей. In vitro арест клеточного цикла, индуцированный в первичных клетках, является эффективным барьером клеточной трансформации с помощью RAS, и генетические изменения, которые преодолевают старение, необходимы для продукции опухолевых клеток. Эти генетические изменения — такие как потеря CDKN2A или TP53 (ген, кодирующий p53 у людей), или экспрессия MYC — часто обнаруживаются вместе с активацией RAS в первичных опухолях человека и м. кооперироваться с Ras для более быстрого формирования опухолей у трансгенных мышей. Как преждевременное старение в результате активации RAS действует как барьер образованию опухолей in vivo неясно. Трансгенные животеные, которые экспрессируют активированный Ras во всех тканях, указывают на то, что они не действуют, т.к. эти ткани пролиферируюдт нормально, или даже гиперпролиферируют в ответ на экспрессию онкогенного Ras. Однако, эти мыши экспрессируют также активированный Rasв течение всего развитияt, ситуация, которая м. вести к возникновению адаптации. У др. трансгенных мышей, события спонтанной рекомбинации запускают продукцию активрованного Kras с низкой частотой в клетках всего тела в ходе их развития. Эти мыши предраспоожены к возникновению ряда типов опухолей, особенно легочных. Анализ ранних стадий образования легочных опухолей идентифицировал небольшие области гиперплазии, которые уеазывают на то, что активация Ras является пролиферативной, предполагается также, что на этой ранней стадии возможно появление дополнительных мутаций. Инетерсно, что многие ткани не дают опухолей. Возможно, в этих тканях активированный Ras является, на самом деле, антипролиферативным. Клеточно-специфичпеские различия эффектов активации Ras на пролиферацию нормальных клеток in vitro: активация Ras в фибробластах>, Schwann клетках и кератиноцитах ведет к аресту клеточного цикла, тогда как экспрессия в клетках тироидного эпителия вызывает усиление пролиферации. Наблюдаение, что многие из checkpoint-mediating белков, контролирующих репликативную способность или индуцирующие преждевременное старение, являются онкогенами или опухолевыми супрессорами, м. указывать на то, что преодоление этих пролиферативных checkpoints является важной ступенью в формировании опухолей. Однако, т.к. белки, такие как MYC и p53 мультифункциональны и играют важные роли в др. клеточных процессах, включая дифференцировку и апоптоз, то это делает затруднительным выяснение их точной роли во время формирования опухолей. Старение эпителиальных клеток молочных желез у людей в культуре после примерно 20 популяционных удвоений и арест связаны с индукцией INK4A, но checkpoint старения преодолевается с высокой частотой (одна клетка на 10⁵), т.к. экспрессия INK4A транскриптов теряется из-за метилирования промоторов. В различных культуральных условиях, уровни INK4A остаются низкими, так что пролиферативная способность экпителиальных клеток расширяется. Следовательно, индукция старения in vitro, являющаяся результатом 'culture' шока — внешних, скорее, чем внутвренних, механизмов, ответственна за предопределение кажущейся пролиферативной способности клеток этого типа. Однако, возникновение карцином молочных желез человека ассоциировано с индукцией INK4A до уровня, более высокого, чем тот, что в окружающей нормальной ткани, хотя его экспрессия затем затем репрессируется в результате de novoметилирования промотора. Это указывает на то, что INK4A индуцируется вро время формирования опухолей, но продолжающаяся пролиферация нуждается в более низких уровнях, ситуация, напоминающая постоянную пролиферацию in vitro. Возможно, чтовнешние условия, обнаруживаемые в опухолевых микроусловиях, запускают преждевременное старение способом, сходным с тем, что индуцируется суб-потимальными условиями in vitro. Cell senescence, ageing and cancer Старение, ассоциированое с прогрессивным уменьшением всех функций, ультимативно ведет к болезни и гибели. Механизмы, ответственные за старение плохо изучены, но накопление клеточных повреждений в результате оксидативных повреждений макромолекул, являтся наиболее общей важной причиной. Репликативное старение, является, как полагают, одинм из компонентов процесста старения — т.к. старея мы накапливаем клетки, находящиеся в конце их пролиферативного периода жизни, это м. снижать пролиферативный потенциал и увеличивать генетические повреждения. Накопление стареющих клеток в теле м. вносить вклад в старение с возрастом благодаря их определенным свойствам — нарушениям экспрессии генов. Напр., стареющие фибробласты секретируют повышенные уровни коллагеназы, которая м. объяснить снижение эластичности стареющей кожи. Доказательства роль репликативного старения в процессте возрастного старения остаются противоречивыми (Вох 5). Наиболее прямым доказательством появления стареющих клеток in vivo является обнаруджение повышенного количества стареющих (senescent) клеток в старческом теле. Окраска на β-galactosidase показывает, что стареющие кератиноциты накапливаются в старческой коже и это используется как аргумент, что репликативное старение происходит in vivo с возрастом. Однако, т.к. старческий фенотип, индуцируемый репликативным путем и путем преждевременного старения, неотличим, то возможно, что старение, ассоциированное с β-galactosidase-позитивными клетками в старческой коже, не является результатом достижения клетками конца их репликативной способности в ответ на изнашивание теломер, а индуцируется в ответ на другие повреждщающие сигналы. Растут доказательтсва, что оксидативный стресс и др. формы клеточных повреждений ответственны за процессы старения. In vitro, оксидативный стресс и др. повреждающие сигналы, включая те, что индуцируются неподходящими культуральными условиями, запускают преждевременное старение клеток. Следовательно, не сюрприз, что стареющие клетки накапливаютися в тьелде в ответ на эти сигналы с помощью путей, независимых от укорочения теломер. Показатель опухолей увеличивается с возрастом. Этот отражает время, необходимое для накопления необходимых мутаций для возникновения опухолей. Люди, несущие мутации в cancer-promoting гене, продуцируют опухоли в раннем возрасте. Увеличение генетической нестабильности также м.вносить вклад. Т.к. увеличивается количество клеток, приближающихся к концу своего репликативного периода жизни, то было предположено, что это возникающее в результате укорочение теломер м. увеличивать генетическую стабильность. Определенно, увеличение генетических аномалий наблюдается в клетках от старых людей, но является ли это результатом теломерного укорочения требует дальнейшего изучения. Второе предположение, что накопление стареющих клеток с возрастом создает условия, которые наиболее пригодны для роста опухолей. Нетрансформированные типы клеток важны для успешного развития опухолей. В частности, стромальные условия, по-видимому, наиболее важны для развития эпителиальных cancers. Предполагается, что это м. отражать накопление клеток в конце их репликативного периода жизни. как результата укорочения теломер, но скорее всего это м.б. связано с накоплением стареющих клеток, вызыванных др. повреждающими путями. Implications for cancer therapy Барьер, накладываемый на пролиферацию укорочением теломер, как полагают, действует как механизм супрессии опухолей. Однако, сложность регуляции теломеразы и стабильности теломер, указывает на то, что роль теломеразы не столь прямолинейна. В зависимости от контекста укорочение теломер м. или способствовать или защищать от опухолей. Более того, экспрессия теломеразной активности в нормальных клетках более распространена, чем это предполагалось. Находка, что по крайней мере 90% опухолей человека экспрессируют высокие уровни теломеразной активности, м. использоваться как диагностический маркер, а также как терапевтическая мишень (Вох 6). Ингибирование активности теломеразы с помощью доминантно-негативной версии TERT показывает, чтоэта активность существенна для непрерывной пролиферации опухолевых клеток in vitro. Это ведет к предположению, ингибиторы теломеразы м.б. эффективным лекарством прогрессирующих опухолей. Однако, этот тип терапии м.б. использован только для опухолей, которые имеют короткие теломеры, т.к. временная задержка необходима для успешного укорочения длинных теломер. Более того, эта терапия будет неэффективна для low percentage опухолей, которые поддерживают свои теломеры с помощью ALT механизма. Др. неудобство, что нгибирование теломеразы м. также сказываться на нормальных клетках, экспрессирующих теломеразу, снижая регенеративный потенциал и повышая генетическую нестабильность. Однако, несмотря на эти недостатки, использование теломеразной активности остается потенциально возможным. Сигналы, иные чем укорочение теломер, м. запускать старение клеток. Сюда взодят и сигналы от RAS,который активен в большой пропорции опухолей человека.Потенциальным терапевтичским путем м.б. восстановление сигнальных путей к старению опухолевых клеток и необратимому блоку клеточного цикла. Эксперименты in vitro показали, что экспрессия CYCLIN-DEPENDENT KINASE INHIBITORS (CDKIs) в линиях опухолевых клеток вызывает фенотип старения, показывая, что некоторые опухолевые клетки сохраняют этот потенциал. In vitro арест клеточного цикла, индуцируемый онкогенным RAS зависит от функции p53. Реактивирование p53 в опухолевых клетках — с помощью, напр., использования малых молекул, которые 'normalize' активность мутантного p53 — м.б., следовательно, терапевтическим путем к индукции старения опухолевых клеток.

40 лет назад, Leonard Hayflick впервые предположил, что существует "finite limit to the cultivation period of diploid cell strains" и что это "attributable to intrinsic factors which are expressed as senescence at the cellular level". Он предположил, что нормальные клетки не м. делиться бесконечно, т.к. они запрограммированы на определенный пролиферативный период жизни. Он достаточен для обеспечения пролиферативных потребностей, но действует как тормоз избыточной пролиферации и тем самым защищает от рака.

Diploid fibroblasts (HDFs) широко использовались для изучения механизмов replicative lifespan. Эти клетки осуществляют 60–80 популяционных удвоений в культуре после чего они прекращают деления и дают фенотип старения, характеризующийся крыпными разменами, уплощенной морфологией и высокой часотой аномалий ядра и позитивной окраской на frnbdyjcnm β-galactosidase при pH 6.0. Эти метаболически активные в состоянии старения клетки чрезвычайно стабильны и могут поддерживаться в кулдьтуре в течение нескольких лет. Арест клеточного цикла, который происходит в этих клетках, поддерживается с помощью сигналов, которые активируют опухолевые супрессоры p53 и retinoblastoma (RB). Закрытие этих путей — с помощью, например, экспрессии опухолевых вирусов — ведет к обходу ареста клеточных циклов, ассоциированных со старением, и клетки продолжают пролиферацию и после их нормаьного периода жизни. Эти клетки все еще не м. делиться неопределенно долго - они не имморатлизованы. После 20–30 дополнительных популяционных удвоений они вступают в состояние, называемое 'crisis'. При кризисе клети продолжают пролиферировать, но обнаруживают высокие уровни апоптоза — запускаемого большими хромосомными аномалиями — так что не происходит увеличения общего числа клеток. Некоторым клеткам удается избежать кризиса и они становятся бессмертными (immortal) (Рис.1).

Молекулярные механизмы, которые предопределяют внутренне присущий репликативный период жизни у HDFs, по-видимому, контролируются с помощью одиночного процесса — telomere shortening. Теломеры являются повторяющимися последовательностями ДНК, связанными с помощью комплексов белков на концах линейных хромосом (Box 1). Теломераза, рибонуклеопротеиновый энзим, необходимый для завершения репликации концов ДНК (Box 1). HDFs, подобно большинству соматических клеток человека, не экспрессируют теломеразу, в результате теломеры прогрессивно укорачиваются в каждом делении. Когда теломера достигает критической длины, то повреждающий сигнал запускает состояние старения посредством механизмов, еще полностью неизученных (Box 2). Емли этот повреждающий сигнал удалить путем инактивации p53 и RB, то клетки м. продолжать пролиферировать, но теломеры будут продолжать укорачиваться до тех пор, пока они не приведут к хромосомной нестабильности, ответственной за кризис (Рис. 1). Укорочение теломер ответственно за ограничение периода жизни HDFs, т.к. экспрессия теломеразы в HDFs достаточна, чтобы избежать как старения, так и кризвиса и ведет к immortality. Итак, укорочение теломеры действует как митотический счетчик, определяющий пролиферативный период жизни HDFs и должно ультиматисно ограничивать пролиферативную способность любого типа клеток, у которых отсутствует теломеразная активность.

Однако, др. типы клеток, которые сохраняют длину теломер в культуре или в результате эндогенной теломеразной активности или в результате экспериментальной экспрессии теломеразы все же приобретают старческий фенотип в культуре. Напр., кератиноциты человека или эпителиальные клетки молочных желез не иммортализуются при экспрессии одной лишь теломеразы. Сходным образом, клетки грызунов, экспрессирующие теломеразу и сохраняющие очень длинные теломеры, все же стареют в культуре. Это указывает на то, что имеются дополнительные, независимые от теломер, механизмы, которые ограничивают пролиферативный период жизни определенных типов клеток.

Известно, что 'damage' сигналы м. индуцировать старческий фенотип в клетках независимо от их репликативной истории. Напр., молодые HDFs становятся старыми, если подвергаются воздействию агентов, которые индуцируют клеточные повреждения, такие как ДНК-повреждающие агентыили оксидативный стресс. Кроме того, несоответствующая активация митогенных сигнальных путей за счет экспрессии онкогенного RAS также м. вызывать вступление на путь старения этих клеток. Эти пути к старению названы преждевременным стерением, т.к. они укорачивают свойственный им репликативный период жизни (Рис. 2).

Предполагается, что независимые от теломер механизмы, ограничивающие репликативный период жизни — обнаруживаемые в некоторых эпителиальных клетках человека и клетках грызунов — вызывают преждевременное старение, запускаемое с помощью кумулятивной травмы культивируемых клеток in vitro. Доказательства в пользу этой гипотезы, полученые на некоторых типах клеток, указывают на то, что эти клетки, по-видимому, не имеют ограничения репликативной способности и что при изменении культуральных условий возможно изменение начало старения. Изучение двух типов клеток у крыс — SCHWANN CELLS и OLIGODENDROCYTE PRECURSOR CELLS, которые обычно экспрессируют telomerase — показало, что они м. культивироваться неопределенно долго, но изменение культуральных условий м. затем вызывать вступление на путь старения. Сходным образом, изменение кульуральных условий эпителиальных клеток человека — путем выращивания их на питающих слоях скорее, чем на пластике — позволяет этим клеткам избегать старения и, если они экспрессируют экзогенную теломеразу, то пролиферировать неопределенно долго (Рис. 2). Эти результаты показывают, что в присутствии теломеразной актинвости нет внутренне присущего механизма, ограничивающего период жизни этих клеток, но что внешние факторы м. ограничивать их пролиферативную способность. Это м. указывать на то, что культуральные условия др. типов клеток ответственны за кажущееся ограничение их пролиферативного периода жизни и что любые клетки, экспрессирующие теломеразу д. пролиферировать неопределенно долго, если имеются подходящие культуральные условия.

Is replicative senescence tumour suppressive?

Большинство соматических клеток человека не экспрессирует теломеразу и д. иметь ограниченный репликативный период жизни. Этот встроенный механизм, как полагают, защищает против развития опухолей органичением пролиферации, необходимой для образования клональных опухолей. На первый взгляд, пролиферативная способность нормальных клеток in vitro кажется занчительно превосходящей количество делений, необходимых для образования опухолей. Напр., 40 популяционных удвоений эквивалентны тому, что одна клетка даст 10¹² клеток, тогда как выявляемые опухоли редко содержат более, чем 10⁹ клеток. Однако, известно, что хотя ранние стадии развития опухолей являются высоко пролиферативными, экспансия опухоли удерживаетсясоответственно высокой скоростью апоптоза. Следовательно, трудно определить количество делений, необ ходимое для развития опухоли у человека и оценить каков лимит репликативной способности м. служить препятствием этому процессу.

Ясно, что стабилизация теломер является важной ступенью в развитии опухолей. Большинство злокачественных опухолей человека экспрессируют telomerase; те, которые этого не делают, стабилизируют свои теломеры с помощью различных механизмов — альтернатива удлиннению теломер (ALT). Теломеры часто короче внутри опухолей, чем в окружающих тканях, указывая тем самым, что укорочение теломер происходит в некоторой точке во время развития опухоли. Более того, экспрессия теломеразы в опухолевых клетках является существенной для их непрерывной пролиферации, т.к.экспрессия DOMINANT-NEGATIVE telomerase reverse transcriptase (TERT) вызывает апоптоз. Эта потребность в активации теломеразы воспроизводится in vitro. Начиная с нормальных фибробластов человека, экспрессия теломеразы является ключевой потребностью - в дополнение к экспрессии онкогенных RAS и SV40 LARGE T ANTIGEN — для продукции трансформированных клетое, которые способны формировать опухоли in vivo.

Итак, соматические клетки человека не экспрессируют теломерызы. Пролиферация, необходимая для развития опухолей, достаточна для запуска репликативного старения и действует как защита против опухолей. Редко клетки обходят этот КПП (checkpoint) путем активации теломеразы или стабилизации теломер, после чего м. наступить развитие опухоли. Это делает теломеразу прекрасной мишенью для лекарст против опухолей, т.к. большинство опухолевых клеток нуждается в теломеразной активности, а нормальные клетки нет.

Lessons from mice

Однако, нокаутные по telomerase мыши развиваются, имея делетированным РНК компонент, mTR. Из-за чрезвычайно длинных теломер у лабораторных мышей, успешное разведение нокаутных мышей требует генерации теломер, которые приближаются по длине к человеческой, но в 4-м поколении начинают обнаруживаться различные эффекты укорочения теломер. Как и предсказывалось, самые ранние эффекты укорочения теломер проявлялись в высоко пролиферативных тканях. Но неожиданным оказалось то, что эти мыши последней генерации имели повышенную частоту появления опухолей по сравнению с диким типом или предыдущими поколениями животных. Это указывало на то, что, у этих мышей, укорочение теломер увеличивает частоту поухолей скорее, чем противодействует им (Box 3).

Возможным объяснением этой аномалии является то, что укороченные теломеры имеют двойной эффект: они инициируют checkpoint сигналы, которые провоцируют арест клеточного цикла или запуск апоптоза, но они м. также вызывать нестабильность хромосом. Итак, если checkpoint сигналы защищают от образвания опухолей, то повышенная генетическая нестабильность скорее всего ускоряет многоступенчатый туморогенный процесс. Показано, что как in vitro , так и in vivo, укороченные теломеры провоцируют хромосомную нестабильность. HDFs , прибилижающиеся к кризису, обнаруживают рост хромосомных аномалий типа слияний конец-в-конец, ведущих к MULTICENTRIC CHROMOSOMES с разрывами, появляющимися в митозах. У дрожжей, хромосомны аномалии, индуцируемые короткими теломерами ведут к увеличению скорости мутирования. Сходным образомy, клетки, изолированные из пролиферирующих тканей теломеразы нокаутных мышей поздней генерации, предоставляют доказательства сходных хромосомных аномалий и это в тех тапах тканей, в которых возникают опухоли. Более быстрое накопление вредных мутаций в результате укорочения теломер перевешивает любые защитные преимущества пролиферативного checkpoint. Этот эффект умножается на p53-нулевом фоне, возможно из-за увеличения жизнеспособности генетически поврежденных клеток.

Если скорость мутаций увеличивается при применение канцерогенов или потребность в мутациях снижается при скрещивании теломараза-негативных мышей с мышами, которые уже несут онкогенные мутации, то в противоположность защитной роли укорочение теломер м. наблюдаться усиление показателя образования опухолей. Напр., CDKN2A нокаутные мыши имеют значительно более высокую частоту возникновения опухолей из-за отсутствия у них двух супрессоров опухолей, которые кодируются Cdkn2a геном — INK4A (известен также как p16) и ARF (известен также как p19). Скрещенные с telomerase knockouts и обработанные канцерогенами мыши поздней генерации имеют пониженную частоту опухолей по сравнению с мышами ранних генераций, которые сохраняют длинные теломеры. Следовательно, в этой ситуации ограничение репликативной способности, по-видимому, защищает против образования опухолей. Сходным образом, короткие теломеры защищают от образования эпителиальных опухолей, когда воздействуют канцерогенами на кожу telomerase-knockout мышей (Box 3).

Наиболее драматическая ситуация противоположных эффектов, когда укорочение теломер влияет на показатель опухолей, обнаруживается у Apc^Min мышей. Они имеют укорачивающую мутацию в гене adenomatous polyposis coli tumour-suppressor Apc и,как результат, развиваются множественные кишечные неоплазии. Люди со сходной мутацией также предрасположены к развитию множественных полипов и у них повышен риск образования карцином толстого кишечника (FAMILIAL ADENOMATOUS POLYPOSIS). Мыши Apc^Minс короткими теломерами обнаруживают повышенные частоты микроскопических аденом по сравнению с животными, имеющими длинные теломеры, возможно повышенная генетическая нестабильность повышает склонность к потере второго аллеля Apc allele. Однако, количество прогрессирующих до образования макроскопических аденом снижено и мыши живут дольше, чем Apc^Min мыши с длинными теломерами. Это указывает на то, что репликативная способность ограничивает прогресс микроаденом в злокачественные опухоли и в этом контексте укорочение теломер действует как защита против образования опухолей (Box 3).

From mice to man

Итак, экспрессия теломеразы защищает от генетической нестабильности и как показывает фенотип telomerase knockout мышей, отсутствие теломеразной активности м. способствовать туморогенезу. Почему же telomerase выключается в соматических клетках человека? Не ведет ли это к увели чению возникновения опухолей? Возможным объяснением является то, что баланс в клетках человека отличается от такового у мышей — преимущества ограниченые пролиферативной способностью м. перевешивать цену повышенной генетической нестабильности. Однако, т.к. клетки человека имеют более низкую скорость спонтанных мутаций in vitro, чем клетки грызунов, и необходимо больше генетических изменений для достижения tumorigenicity, то это кажется маловероятным.

Не все соматические клетки человека telomerase негативны (Box 4). Фактически, в пролиферирующих тканях, экспрессия telomerase довольно распространена. Экспрессия, однако, ограничена клетками предшественниками, такими как базальные слои эпителия в коже и кишечнике или тонко регулируется для гарантии экспрессии только в определенных типах клеток, нуждающихся в пролиферации, напр., в лимфоцитах во время активации. Следовательно, за небольшими возможными исключениями активность теломеразы коррелирует тесно с пролиферативными потребностями клеток. Итак, люди не м. рассметриваться как эквиваленты теломараза-негативным мышам в том смысле, что опухоли у человека м. возникать из клеток, обычно экспрессирующих telomerase.

Если экспрессия теломеразы важна в пролиферирующих клетках, особенно в тех, которые нуждаются в большой репликативной способности, то почему теломераза не экспрессируется во всех наших клетках? Почему созданы механизмы для регуляции теломеразной активности? Единственная возможность, что теломераза выполняет дополнительные функции, которые вредны для нормального поведения некоторых клеток. Если Tert экспрессируется избыточно в базальных кератиноцитах мыши, то мыши формируют нормальные структуры кожи, но воздействие опухолевых промоторов или повреждения кожи вызывают значительное усиление пролиферации кератиноцитов. Это указывает на то, что высокие уровни теломеразы м. действительно способствовать пролиферации клеток — функция, которая, по-видимому, отлична от функции поддержания теломерных концов. Экспрессия Tert в сердце, ткани, которая у взрослых мышей обычно не экспрессирует теломеразу, ведет к кардиальной гипертрофии и способствует выживанию миоцитов после повреждений, это также указывает на то, что теломераза м. вызывать и др. клеточные эффекты. Дополнительные функции теломеразы м. объяснить, почему высокие уровни ее экспрессии прогрессивно селектируются во время возникновения опухолей у человека. Это объясняет также, почему мыши обладают ткане-специфичной регуляцией теломеразы и селектируются на высокие уровни экспрессии теломеразы во время прогрессии опухолей, несмотря на наличие теломер более чем в 10 раз более длинных, чем у человека.

Др. возможность в том, что регуляция теломеразы отражает преимущества или цену для определенных типов клеток экспрессии теломеразы, которая м. варьировать в соответствии с пролиферативными потребностями и функциями клеток. Это м. объяснить то, что активация теломеразы в некоторых типах клеток — напр., лимфоцитах — кажется недостаточной для поддержания длины теломер. Возможно, для эжтих клеток экспрессия теломеразы является набором уровней, которые обеспечивают защиту при нормальных пролиферативных потребностях клеток, но прогрессивное укорочение теломер все еще пролиферативный барьер для защиты от малигнизации.

Telomerase regulation in tumour development

Теломеразная активность обнаруживатеся в большинстве опухолей человека, и теломеры оказываются стабилизированы с помощью ALT у остальных. Кроме того, кажется, что повышенные уровни экспрессии теломеразы избираются во время малигнизации опухолей. Это указывает на то, что стабилизация теломер необходимая ступень для развития опухолей, высокие уровни экспресси теломеразы предоставляют селективные преимущества опухолевым клеткам.

Ген TERT амплифицирован у части опухолей, указывая на то, что прямой мутационный механизм м.б. ответственным за усиление активности теломеразы. Интересно, что экспрессия определенных онкогенов — гапр., MYC и tumour virus protein E6 — м. непосредственно активровать экспрессию теломеразы. Эта способность, по-видимому, клеточно-специфична и коррелирует со способностью этих онкогенов иммортализовать клетки. Следовательно, возможно, что активация теломеразы во время образования опухоли м. осуществляться непрямо, в результате активации онкогенов или изменения пролиферативного или дифференциального статуса клетки.

Возможны несколько сценариев, по которым регуляция теломеразы м. вносить вклад в формирование опухолей (Рис. 3). У telomerase-негативных клеток, укорочение теломер, в результате множественных делений на ранних стадиях возникновения опухолей, м. защищать от туморогенеза благодаря репликативному старению. Наличие теломеразной активности д. обеспечивать преодоление этого ренпликативного блока. Или укорочение теломер м. выхзывать генетическую нестабильность и усиливать вероятность дополнительных онкогенных мутаций и прогрессирующую малигнизацию. Последующая активация теломеразы м. действовать, стабилизируя злокачественный генотип, обеспечивая экспансию возникших в результате клеток. Для опухолей, которые произошли от теломераза-позитивных клеток, потеря генетической стабильности м.б. необходимой для управления туморогенезом, которй м. использовать репрессию теломеразной активности. Теломераза д.б. необходимой тогда и включаться на поздней стадии для рестабилизации генома. Для многих опухолей в ходе туморогенеза клетки, которые экспрессируют высокие уровни теломеразной активности, скорее всего будут избраны, что отражает пролвиферативные преимущества этих клеток.

Is premature senescence tumour suppressive?

Повреждающие сигналы от укороченных теломер являются не единственным путем к старческому фенотипу. Активация онкогенного RAS это др. повреждающий сигнал — такой как γ-облучение и оксидативный стресс — и несоответствующие культуральные услови, все они запускают преждевременное вступление на путь старения молодых клеток, по крайней мере in vitro (Рис. 2). Считается, что преждевременное старение м. также дейстовать защитно как механизм супрессии опухолей за счет выведения поврежденных клеток из пролиферативного состояния (Рис. 3).

Известно, что нормальные клетки in vitro рефрактерны к трансформации одиночными онкогенами. Клетки, которые содержат эти онкогенные изменения не имеют тенденции сохраняться в популяции, а понуждаются или к выходу из клеточного цикла (RAS) или к гибели (MYC). Пути передачи сигналов RAS sпостоянно активированв в большой пропорции опухолей человека, так что активация RAS. по-видимому, важный путь к туморогенезу. Если несоответствующая активация RAS запускает вступление в старение, то это м.б. важным механизмом ограничения образования опухолей. In vitro арест клеточного цикла, индуцированный в первичных клетках, является эффективным барьером клеточной трансформации с помощью RAS, и генетические изменения, которые преодолевают старение, необходимы для продукции опухолевых клеток. Эти генетические изменения — такие как потеря CDKN2A или TP53 (ген, кодирующий p53 у людей), или экспрессия MYC — часто обнаруживаются вместе с активацией RAS в первичных опухолях человека и м. кооперироваться с Ras для более быстрого формирования опухолей у трансгенных мышей.

Как преждевременное старение в результате активации RAS действует как барьер образованию опухолей in vivo неясно. Трансгенные животеные, которые экспрессируют активированный Ras во всех тканях, указывают на то, что они не действуют, т.к. эти ткани пролиферируюдт нормально, или даже гиперпролиферируют в ответ на экспрессию онкогенного Ras. Однако, эти мыши экспрессируют также активированный Rasв течение всего развитияt, ситуация, которая м. вести к возникновению адаптации. У др. трансгенных мышей, события спонтанной рекомбинации запускают продукцию активрованного Kras с низкой частотой в клетках всего тела в ходе их развития. Эти мыши предраспоожены к возникновению ряда типов опухолей, особенно легочных. Анализ ранних стадий образования легочных опухолей идентифицировал небольшие области гиперплазии, которые уеазывают на то, что активация Ras является пролиферативной, предполагается также, что на этой ранней стадии возможно появление дополнительных мутаций. Инетерсно, что многие ткани не дают опухолей. Возможно, в этих тканях активированный Ras является, на самом деле, антипролиферативным. Клеточно-специфичпеские различия эффектов активации Ras на пролиферацию нормальных клеток in vitro: активация Ras в фибробластах>, Schwann клетках и кератиноцитах ведет к аресту клеточного цикла, тогда как экспрессия в клетках тироидного эпителия вызывает усиление пролиферации.

Наблюдаение, что многие из checkpoint-mediating белков, контролирующих репликативную способность или индуцирующие преждевременное старение, являются онкогенами или опухолевыми супрессорами, м. указывать на то, что преодоление этих пролиферативных checkpoints является важной ступенью в формировании опухолей. Однако, т.к. белки, такие как MYC и p53 мультифункциональны и играют важные роли в др. клеточных процессах, включая дифференцировку и апоптоз, то это делает затруднительным выяснение их точной роли во время формирования опухолей.

Старение эпителиальных клеток молочных желез у людей в культуре после примерно 20 популяционных удвоений и арест связаны с индукцией INK4A, но checkpoint старения преодолевается с высокой частотой (одна клетка на 10⁵), т.к. экспрессия INK4A транскриптов теряется из-за метилирования промоторов. В различных культуральных условиях, уровни INK4A остаются низкими, так что пролиферативная способность экпителиальных клеток расширяется. Следовательно, индукция старения in vitro, являющаяся результатом 'culture' шока — внешних, скорее, чем внутвренних, механизмов, ответственна за предопределение кажущейся пролиферативной способности клеток этого типа. Однако, возникновение карцином молочных желез человека ассоциировано с индукцией INK4A до уровня, более высокого, чем тот, что в окружающей нормальной ткани, хотя его экспрессия затем затем репрессируется в результате de novoметилирования промотора. Это указывает на то, что INK4A индуцируется вро время формирования опухолей, но продолжающаяся пролиферация нуждается в более низких уровнях, ситуация, напоминающая постоянную пролиферацию in vitro. Возможно, чтовнешние условия, обнаруживаемые в опухолевых микроусловиях, запускают преждевременное старение способом, сходным с тем, что индуцируется суб-потимальными условиями in vitro.

Cell senescence, ageing and cancer

Старение, ассоциированое с прогрессивным уменьшением всех функций, ультимативно ведет к болезни и гибели. Механизмы, ответственные за старение плохо изучены, но накопление клеточных повреждений в результате оксидативных повреждений макромолекул, являтся наиболее общей важной причиной. Репликативное старение, является, как полагают, одинм из компонентов процесста старения — т.к. старея мы накапливаем клетки, находящиеся в конце их пролиферативного периода жизни, это м. снижать пролиферативный потенциал и увеличивать генетические повреждения. Накопление стареющих клеток в теле м. вносить вклад в старение с возрастом благодаря их определенным свойствам — нарушениям экспрессии генов. Напр., стареющие фибробласты секретируют повышенные уровни коллагеназы, которая м. объяснить снижение эластичности стареющей кожи.

Доказательства роль репликативного старения в процессте возрастного старения остаются противоречивыми (Вох 5). Наиболее прямым доказательством появления стареющих клеток in vivo является обнаруджение повышенного количества стареющих (senescent) клеток в старческом теле. Окраска на β-galactosidase показывает, что стареющие кератиноциты накапливаются в старческой коже и это используется как аргумент, что репликативное старение происходит in vivo с возрастом. Однако, т.к. старческий фенотип, индуцируемый репликативным путем и путем преждевременного старения, неотличим, то возможно, что старение, ассоциированное с β-galactosidase-позитивными клетками в старческой коже, не является результатом достижения клетками конца их репликативной способности в ответ на изнашивание теломер, а индуцируется в ответ на другие повреждщающие сигналы. Растут доказательтсва, что оксидативный стресс и др. формы клеточных повреждений ответственны за процессы старения. In vitro, оксидативный стресс и др. повреждающие сигналы, включая те, что индуцируются неподходящими культуральными условиями, запускают преждевременное старение клеток. Следовательно, не сюрприз, что стареющие клетки накапливаютися в тьелде в ответ на эти сигналы с помощью путей, независимых от укорочения теломер.

Показатель опухолей увеличивается с возрастом. Этот отражает время, необходимое для накопления необходимых мутаций для возникновения опухолей. Люди, несущие мутации в cancer-promoting гене, продуцируют опухоли в раннем возрасте. Увеличение генетической нестабильности также м.вносить вклад. Т.к. увеличивается количество клеток, приближающихся к концу своего репликативного периода жизни, то было предположено, что это возникающее в результате укорочение теломер м. увеличивать генетическую стабильность. Определенно, увеличение генетических аномалий наблюдается в клетках от старых людей, но является ли это результатом теломерного укорочения требует дальнейшего изучения.

Второе предположение, что накопление стареющих клеток с возрастом создает условия, которые наиболее пригодны для роста опухолей. Нетрансформированные типы клеток важны для успешного развития опухолей. В частности, стромальные условия, по-видимому, наиболее важны для развития эпителиальных cancers. Предполагается, что это м. отражать накопление клеток в конце их репликативного периода жизни. как результата укорочения теломер, но скорее всего это м.б. связано с накоплением стареющих клеток, вызыванных др. повреждающими путями.

Implications for cancer therapy

Барьер, накладываемый на пролиферацию укорочением теломер, как полагают, действует как механизм супрессии опухолей. Однако, сложность регуляции теломеразы и стабильности теломер, указывает на то, что роль теломеразы не столь прямолинейна. В зависимости от контекста укорочение теломер м. или способствовать или защищать от опухолей. Более того, экспрессия теломеразной активности в нормальных клетках более распространена, чем это предполагалось.

Находка, что по крайней мере 90% опухолей человека экспрессируют высокие уровни теломеразной активности, м. использоваться как диагностический маркер, а также как терапевтическая мишень (Вох 6).

Ингибирование активности теломеразы с помощью доминантно-негативной версии TERT показывает, чтоэта активность существенна для непрерывной пролиферации опухолевых клеток in vitro. Это ведет к предположению, ингибиторы теломеразы м.б. эффективным лекарством прогрессирующих опухолей. Однако, этот тип терапии м.б. использован только для опухолей, которые имеют короткие теломеры, т.к. временная задержка необходима для успешного укорочения длинных теломер. Более того, эта терапия будет неэффективна для low percentage опухолей, которые поддерживают свои теломеры с помощью ALT механизма. Др. неудобство, что нгибирование теломеразы м. также сказываться на нормальных клетках, экспрессирующих теломеразу, снижая регенеративный потенциал и повышая генетическую нестабильность. Однако, несмотря на эти недостатки, использование теломеразной активности остается потенциально возможным.

Сигналы, иные чем укорочение теломер, м. запускать старение клеток. Сюда взодят и сигналы от RAS,который активен в большой пропорции опухолей человека.Потенциальным терапевтичским путем м.б. восстановление сигнальных путей к старению опухолевых клеток и необратимому блоку клеточного цикла. Эксперименты in vitro показали, что экспрессия CYCLIN-DEPENDENT KINASE INHIBITORS (CDKIs) в линиях опухолевых клеток вызывает фенотип старения, показывая, что некоторые опухолевые клетки сохраняют этот потенциал. In vitro арест клеточного цикла, индуцируемый онкогенным RAS зависит от функции p53. Реактивирование p53 в опухолевых клетках — с помощью, напр., использования малых молекул, которые 'normalize' активность мутантного p53 — м.б., следовательно, терапевтическим путем к индукции старения опухолевых клеток.

CELL SENESCENCE AND CANCERNicole F. Mathon & Alison C. Lloyd Nature Reviews Cancer 1, 203-213 (2001)

Boxes

Links