Molecular cross-talk between the transcription, translation, and nonsense-mediated decay machineries Francisco J. Iborra, Alexandre E. Escargueil, Kon Y. Kwek, Alexandre Akoulitchev, and Peter R. Cook JCS 2004 117: 899-906.
См. также:
Известно, что messenger RNA транскрипбируется в ядре, но транслируется в цитоплазме. but translated in the cytoplasm. Недавнее откровение, что трансляция м. происходить также и в ядре, поражает. Итак, если трансляция и в самом деле возможна в ядре, то какова её роль? Peter Cook и др. предположили, что это для корректированния РНК (см. ). Они показали, что что компоненты транскрипционной и трансляционной кухни (machineries) ко-локализуются и совместно очищаются с machinery для nonsense-mediated decay (NMD) – механизмом коррекции, который сканирует мРНК на наличие несоответствующих стоп-кодонов и разрушает ошибочные сообщения (messages). Авт. продемонстрировали, что взаимодействия между этими различающимися machineries возможно обеспечиваются с помошью RNA polymerase II (Pol II) C-terminal domain (CTD), который участвует в созревании мРНК транскриптов. Они также показали, что неядерный белок (CD2) м. обнаруживаться в ядре – and so must be made there – и что его деградация тесно связана с транскрипцией. Cook и др. , следовательно, полагают, что NMD использует трансляционную кухню для коррекции вновь транскрибированных мРНК и что это связано с деградацией как неправильных мРНК, так и некоторых пептидов, продуцируемых как следствие этого.
Does protein synthesis occur in the nucleus?
James E Dahlberg1 and Elsebet Lund Current Opinion in Cell Biology 2004, 16:335–338
Although it is universally accepted that protein synthesis occurs
in the cytoplasm, the possibility that translation can also take
place in the nucleus has been hotly debated. Reports have been
published claiming to demonstrate nuclear translation, but
alternative explanations for these results have not been
excluded, and other experiments argue against it. Much of
the appeal of nuclear translation is that functional proofreading
of newly made mRNAs in the nucleus would provide an
efficient way to monitor mRNAs for the presence of premature
termination codons, thereby avoiding the synthesis of
deleterious proteins. mRNAs that are still in the nucleusassociated
fraction of cells are subject to translational
proofreading resulting in nonsense-mediated mRNA decay and
perhaps nonsense-associated alternate splicing. However,
these mRNAs are likely to be in the perinuclear cytoplasm
rather than within the nucleus. Therefore, in the absence of
additional evidence, we conclude that nuclear translation is
unlikely to occur.
См также оригинал "Nuclear translation: What is the evidence?"
JAMES E. DAHLBERG,1 ELSEBET LUND,1 and ELIZABETH B. GOODWIN2
в pdf формате
Эукариотические клетки высоко компартментализованы со многими ступенями экспрессии генов, ограниченной ядром или цитоплазмой. Эта секвестрация функций способствует контролируемому и эффективному синтезу, созреванию и деградации макромолекул [1]. Большинство РНК, которые участвуют в трансляции в цитоплазме, синтезируются и созревают в ядре, где они м. разрушаться, если подверглись неправильным превращениям или были инкорпорированы в дефектные RNPs [2-4]. Отслеживали интегральность зрелых рибосом и тРНК во время экспорта из ядра посредством их взаимодействий с рецепторами экспорта и адаптерами [5,6]. Наконец, мРНК после процессинга оказываются функционально предварительно считана (proof-read)с помощью трансляции, чтобы удостовериться, что она кодирует белки полной длины [7,8].
Считается, что белки синтезируются только в цитоплазме, но в некоторых лаб. установлено, что трансляция м. происходить и в ядре в месте или рядом с сайтом синтеза пре-мРНК [9,10-13]. Мы критически проанализировали опубликованные данные за и против существования ядерной трансляции [14] и обнаружили слабость аргументов обеих строн по этому вопросу.
Translation within nuclei?
К сожалению, трудно изолировать ядра полностью свободные от загрязняющих цитоплазматических компонентов, особенно от endoplasmic reticulum (ER), который составляет единое целое с ядерной оболочкой. Т.к. большая часть если не вся трансляция происходит в цитоплазме, то небольшие количества загрязнений с помощью ER-связанных рибосом м. давать неправильные позитивные результаты. Кроме того, если ядра не являются интактными во время изоляции и исследования, то важные трансляционные факторы или ингибиторы м. из них вытекать. Следовательно, необходимы множественные контроли, чтобы показать, что 'очищенные ядра' являются структурно и функционально интактными и лишены цитоплазматических рибосом.
Об этом писали ранее Iborra et al. [9]. Эти неопределенности вызвали сомнения, являются ли представленные результаты доказательствами ядерной трансляции в живых клетках [14]. За это время Nathanson et al. [15] выявили способность изолированных ядер доводить до конца белковый синтез снижается пропорционально очистке ядер. Однако, это исследование не исключило, что ядра м.б. повреждены во время очистки, что могло бы вызывать инактивацию или потерю важных трансляционных фактора(ов) translation factor(s). Herbert и др. [11] наблюдали, что в клетках, содержащих деформированные ядрышки, избыточная экспрессия химерного репортерного белка обнаруживалась только в исходных ядрах гетерокариона, если прошло короткое время после слияния клеток. Хотя эти авт. полагают, что ядерный синтез белка, ответственен за этот эффект, они оказались не способны продемонстрировать это непосредственно или исключить хотя бы возможность, что искусственный репортёрный белок поступает или выходит из ядер очень медленно. Итак, прямых доказательств трансляции внутри ядер по-прежнему нет.
Inherent capacity for nuclear translation
Каковы же результаты поиска компонентов трансляционной кухни (трансляционных факторов, тРНК и рибосом) в ядрах. Интерпретация таких исследований сложна, т.к. функционирование скорее, чем присутствие этих компонентов в ядрах, необходимо продемонстрировать. В некоторых случаях существует потенциальная функция; напр., тРНК синтезируются, созревают и даже aminoacylated в ядрах [6]. Напротив, вновь синтезированные субъединицы рибосом в ядрах вряд ли функционируют, т.к. они все ещё незрелые и не обнаруживаются в форме 80S рибосом [5,16,17]. Хотя возможно, что 80S рибосомы и существуют в ядрах, попытки выявить их биохимически или с помощью ЭМ оказались безуспешными, а комплексы вновь возникших mRNPs, связанных с рибосомами, обнаружены только в околоядерной цитоплазме [18].
Как уже обсуждалось ранее [14], возможность отыскать рибосомы и трансляционные факторы вблизи мест образования мРНК в ядре зависит от используемого занда. Напр., Brogna et al. [10] используя антитела, не охарактеризованной специфичности и чувствительности, продемонстрировали возможность ложных позитивных ( или негативных) результатов. Эта проблема м. бы быть преодолена мечением белков green
fluorescent protein (GFP), учитывая, что GFP метка не влияет на внутриклеточную локализацию химерного белка. Определение количеств некоторых GFP-меченных трансляционных факторов, каждый из которых является предметом активного экспорта из ядра. привело Bohnsack et al. [19] к выводу, что ядерные уровни большинства факторов скорее всего слишком низки, чтобы поддерживать синтез белков (см [20]). Более того, BjoЁrk et al. [18] сообщили, что фактор инициации трансляции eIF4H, который м.б. обнаружен в ядре, обнаруживается в ассоциации с вновь образованными Balbiani ring mRNPs только в околоядерной цитоплазме, где появляются нагруженные рибосомы. Итак, мало вероятно, что белковый синтез м. происходить в ядре в большинстве случаев.
mRNA proofreading by translation
Часто цитируемой причиной поиска возможности ядерной трансляции является тот факт, что многие сплайсированные мРНК, отслеживаемые на присутствие nonsense (трансляционных стоп) кодонов внутри их кодирующих областей всё ещё находятся во фракции, ассоциированной с ядрами [2,7,8]. Пробное считывание вновь возникших мРНК на наличие преждевременного premature termination codons (PTCs) указывает на трансляцию, т.к. оно чувствительно к ингибиторам белкового синтеза, изменениям рамки считывания или к внесению nonsense-супрессорных тРНК. В целом, выявление PTC ведет к существенной деградации мРНК с помощью
nonsense-mediated mRNA decay (NMD). Очевидно, что присутствие PTC в мРНК ведет также к nonsense-associated altered splicing (NAS), причем мРНК после альтернативного сплайсинга оказываются лишенными экзона, содержащего PTC [21]. Мониторинг мРНК на PTCs в ходе трансляции внутри ядра предполагает, что выявление и последствия PTC д. происходить в том же самом клеточном компартменте [22,23]. (У дрожжей, NMD происходит в цитоплазме, так что пробное считывание (proofreading), по-видимому. не связано с ядерными событиями [4].)
Если NMD является внутриядерным событием, как полагают Buhler et al. [13], то это м.б. строгим подтверждением некоторой трансляции, имеющей место в ядре. Эти авт. показали, что NMD происходит даже если скорость экспорта мРНК сильно редуцирована. Однако, если экспорт все ещё более быстрый, чем NMD, то скорее всего их результаты д. также согласовываться с NMD, использующим трансляцию непосредственно после выхода мРНК через ядерные поры [14]. Как отмечено выше, вновь экспортированные мРНК временно ассоциированы с околоядерными рибосомами [18], даже если кодируюемый белок предназначен для просвета ER [24,25]. Т.о., мРНК м. подвергаться 'pioneer' раунду трансляции, в течение которой происходит NMD [26], после того как она покидает ядро, но все ещё остается в ассоциированной с ядром (perinuclear) цитоплазме. Следовательно, кажущаяся ядерная локализация NMD не м. служить доказательством трансляции внутри ядра.
PTC-induced alteration of intra-nuclear
events
Выявление PTC с помощью трансляционной кухни способствует двум ядерным событиям, NAS и накоплению пре-мРНК вблизи места транскрипции. Но неясно, являются ли эти два феномена причинно связанными др. с др.
Хотя NAS выявлена для большинства различных пре-мРНК (rev. [21]), почти во всех случаях эти изменения являются следствием мутационной инактивации exonic splicing enhancer (ESE) скорее, чем результатом распознавания, зависящего от рамки считывания, PTC [27]. Однако, очень трудно определить, вызываются ли PTC мутации, характеризующиеся NAS, только результатом инактивации ESE [28 ].
Наиболее достоверным примером NAS, для которого инактивация ESE по-видимому. м.б. исключена, является процессинг T-cell receptor-β (TCR-β) пре-мРНК [12]. В этом случае высоко полиморфный экзон VDJ генерируется с помощью соматической перестройки последовательностей ДНК, которые кодируют множественные variable, diversity and junction
(VDJ) последовательности, так что большинство возникающих в результате генов TCR-β скорее всего кодируют мРНК с PTCs. Однако, NAS и особенно сильная форма fNMD удерживает уровень таких PTC-содержащих TCR-β мРНК низким. Интересно, что Wang et al. [12,29] показали, что зависимые от рамки считывания NAS пре-мРНК TCR-β функционируют в trans, т.к. распознавание PTC, генерируемых с помощью нормального сплайсинга одной TCR-β пре-мРНК молекулы затрагивает сплайсинг др. молекул. Предложены две модели для объяснения того, как трансляционная кухня м. общаться с аппаратом ядерного процессинга пре-мРНК. Согласно одной трансляционное proofreading мРНК происходит в сайте процессинга пре-мРНК в ядре, а детекция PTC обеспечивается ещё неизвестным механизмом, локального избытка (или дефицита) факторов, необходимых для изменения паттерна сплайсинга пре-мРНК TCR-β [22,29]. Согласно др. модели мониторинг мРНК на PTCs осуществляется целиком с помощью цитоплазматических рибосом и что трансляционная кухня общается с ядерными spliceosomes с помощью секвестрации снующего (shuttling), TCR-β-специфического фактора сплайсинга [14]. Тест на существование сигнальной молекулы, которая бы сновала между рибосомами и spliceosomes, в поиске(O Muhlemann, personal communication).
Подобно TCR-β, пре-мРНК Ig-m (которая также является результатом запрограммированной генной перестройки), как было установлено, накапливается в месте транскрипции, когда кодирующая мРНК содержит PTC [30] и такие транскрипты м. также подвергаться NAS (discussed in [21,29]). М. ожидать, что PTC-индуцированное накопление пре-мРНК и/или NAS, д. отражаться в изменениях кинетики сплайсинга индивидуальных интронов. Однако, Lytle and Steitz [31] нашли, что присутствие нескольких разных кодируемых PTCs не оказывает существенного влияния на скорость, с которой соседние интроны удаляются из предшественников Ig-m (или DHFR) мРНК [31]. Неожиданно эти авт. выявили также существенную изменчивость в уровнях Ig-m пре-мРНК в разных изолятах клеточных линий, экспрессирующих пре-мРНК Ig-m дикого типа. Эта необъяснимая изменчивость между контрольными клетками ставит вопрос о значении описанного увеличения наблюдаемых уровней PTC-содержащих пре-мРНК [30]. Т.о., доказательства для reading-frame-зависимых изменений NAS и/или накопления ядерных пре-мРНК необходимо исследовать заново, прежде чем эти наблюдения м.б. использованы в качестве подтверждения предположения, что трансляция происходит и внутри ядра.
Conclusions
Nuclear translation remains a controversial topic.
Although the papers favoring nuclear translation have
generated a great deal of excitement, they were often
incomplete and required further experimentation. In
spite of considerable effort by several laboratories to
demonstrate synthesis of specific proteins at the sites
of transcription of their pre-mRNAs, a ‘smoking gun’
has not yet appeared. Instead, the only recent publications
on this subject that we are aware of tend to support
the idea that protein synthesis is restricted to the cytoplasm.
Hence, we continue to be skeptical and feel that
there is no reason to embrace the idea that protein
synthesis occurs within cell nuclei.
Update
Recently published data have been interpreted as being
consistent with nuclear translation [32]. However, the
citation of unpublished results of several important
experiments, and a lack of certain controls, allow for other
explanations of the data.
and Elsebet Lund