Сердце является первым функционирующим органом у эмбриона. У эмбрионов человека сокращения сердца начинаются примерно на 17-й день после зачатия, когда сердце представляет собой одиночную относительно прямую, окруженную мышцами трубку. Вскоре после начала контракций сердечная трубка изгибается и скручивается (loops) в изогнутую трубку со своей convex поверхностью обычно направленной в правую сторону эмбриона. Образование кардиальной петли является первым видимым признаком левосторонней асимметрии у эмбрионов позвоночных. Когда петлеобразование заканчивается, то сердце принимает базовую конфигурацию, необходимую для дальнейшего развития в четырехкамерный насос. Из-за аномального петлеобразования возникают врожденные пороки сердца. Большинство исследователей согласно, что развитие сердца зависит от генетических и эпигенетических факторов, с привлечением позднее механохимических условий. Быстрый прогресс был достигнут в определении генетических и молекулярных факторов, которые регулируют петлеобразование (Brand, 2003; Harvey, 1998; Mercola and Levin, 2001; Srivastava and Olson, 1997), но биофизические механизмы, которые управляют петлеобразованием остаются плохо изученными (Mаnner, 2000; Taber et al., 1995). В обзоре исследуется роль биомеханики в процессе петлеобразования.

Эмбрионы кур популярная экспериментальная модель для изучения кардиального морфогенеза. Развитие сердца кур обнаруживает параллелизм с таковым сердца человека (DeHaan, 1967). Базируясь на внешних характеристиках развивающегося эмбриона Hamburger and Hamilton (1951) подразделили 21-дневный инкубационный период цыплят на 46 стадий.

Сердце возникает из мезодермы, слоя ткани, который расположен между энтодермой и эктодермой у ранних эмбрионов (Linask, 2003; Yutzey and Kirby, 2002). У кур на ст. 5 (20 h), прекардиальные клетки располагаются в мезодермальных областях (кардиогенных пластинках) на левой и правой стороне эмбриона (Fig. 1A). Первоначально перемещающиеся индивидуально, эти клетки мигрируют кпереди и в направлении срединной линии эмбриона, возможно благодаря наведению пространственно градированной сети fibronectin, располагающейся между мезодермой и энтодермой (Linask and Lash, 1986).

По мере миграции прекардиальных мезодермальных клеток формируются N-cadherin обусловленные клеточные соединения, связывающие клетки в парный билатеральные слои, которые образуют дугу вблизи формирующейся впереди головной складки (Fig. 1B) (de la Cruz and Sanchez-Gomez, 1998; Linask, 2003; Trinh and Stainier, 2004). После этого происходят незначительные перестройки, бранши этой аркообразной области продолжают двигаться латерально по направлению к срединной линии, где они встречаются и формируют сердечную трубку (Fig. 1 C,D). По ходу миграции мезодерма расщепляется на два слоя - сомитную и спланхническую мезодерму - которые окружают целомическую полость (Patten, 1951). Сомитная мезодерма и этодерма представляют собой somatopleure на дорсальной стороне эмбриона, тогда как splanchnic мезодрема и энтодерма представляют splanchnopleure (SPL) на вентральной стороне (Figs. 2,3A).

На ст. 7-10 (24-36 h) сердечная трубка и первичная передняя кишка формируются посредством образования складок и слияния билатеральных областей SPL в кранио-каудальном направлении (Fig. 2). Согласно De Jong et al. (1990), как только прекардиальная мезодерма достигает своей соответствующей позиции на дорсальной стороне целомной полости, её клеточные компоненты секретируют extracellular matrix (ECM), который раздувает этот эпителий в относительно прямую, суживающуюся в конце тубулярную форму (примерно 200 мm в диаметре), которая оказывается открытой на своей дорсальной стороне, т.е. на поперечном срезе она имеет U-образную форму (6S и 10S in Fig. 2B). первоначально сердечная трубка

Fig. 1. Heart-forming region in chick embryo. Dotted areas show heart-forming region during stages 5-8 (from Linask and Lash, 1986). See text for details.

состоит из трех слоёв (Fig. 3A): внутреннего слоя endocardium (EN), относительно толстого срединного слоя из ECM, называемого cardiac jelly (CJ) и наружного слоя myocardium (MY), с EN и MY эпителием толщиной в один-два клеточных диаметра, соотв. Вскоре появляются первые миофибриллы (Manasek et al., 1978), появляются первые сокращения (Hiruma and Hirakow, 1985) и начинается петлеобразование (Patten, 1922; Romanoff, 1960), но эффективный кровоток не начинается вплоть до ст. 12 (1.9 days).

Петлеобразование начинается на ст. 10, т.к. относительно прямая трубка сердца сгибается и скручивается в искривленную трубку (Patten, 1922; Romanoff, 1960). Петлеобразование состоит из двух основных фаз: c-петлеобразование и s-петлеобразования (Mаnner, 2000). Во время обычного c-петлеобразования (ст. 9-13, 30-50 h), сердце трансформируется из прямой трубки в c-образную трубку (Fig. 3B) за счет двух основных компонентов деформации: вентрального сгибания и dextral (направленного вправо) скручивания (torsion¹). Это хорошо видно в экспериментах с мечением (Fig. 4 A,B). Недавно Voronov et al. (2004) показали, что наблюдается и относительно небольшая величина dextral сгибания. Важно отметить, что благодаря этим деформациям исходная вентральная поверхность прямой сердечной трубки становится наружной кривизной (convex поверхностью) петлеобразного сердца, тогда как исходная дорсальная сторона становится внутренней кривизной (concave поверхностью). Во время s-петлеобразования (ст. 14-18, 52-68 h), предсердия перемещаются выше желудочков, создавая базовую финальную форму сердца (Fig. 3B). Позднее, во время ст. 21-36 (3.5-10 days), процесс образования перегородок делит трубку на 4 камеры.

Внешние давления играют роль в формообразовании сердца во время петлеобразования. Первоначально сердечная трубка испытывает давление благодаря соединениям с omphalomesenteric veins (OVs) на своём каудальном конце и в тракте оттока на своем краниальном конце (Fig. 3B). Кроме того, продольная структура, называемая dorsal mesocardium (DM) прикреплена по всей длине сердца к эмбриону, а энтодермальный слой SPL выстилает вентральную поверхность сердца (Patten, 1951; Romanoff, 1960) (Fig. 3A). OVs создаются за счет билатеральных складок в SPL, т.к. они продолжают сливаться от головы до пят, добавляя всё новые сегменты к каудальному концу сердечной трубки (de la Cruz and Sanchez-Gomez, 1998). Во время петлеобразования дорсальная сторона трубки закрывается и DM прорывается (на ст. 13-, 2 дня), приводя к тому, что сердце оказывается прикрепленным к эмбриону только на своих концах. На ст. 12 сердечная трубка представлена серией сегментов, представляющих собой первичное предсердие, желудочек (будущие левый и правый желудочки) и conotruncus (Fig. 3B). Перистальтические контрактильные волны движут кровь от предсердия через желудочек и conotruncus.

Петлеобразование является жизненно важным событием во время развития сердца, т.к. даже относительно небольшие пертурбации петлеобразования ведут к серьезным структурным дефектам. Очевидно, что сгибание и скручивание сердечной трубки нуждается в механических силах и исследователи показали, что изменения генерируемых внешних и внутренних сил могут влиять на петлеобразование (Itasaki et al., 1991; Manasek, 1976; Voronov et al., 2004; Voronov and Taber, 2002). Несмотря на интенсивные исследования, многие из фундаментальных механизмов, которые управляют и регулируют петлеобразованием всё ещё плохо изучены.

Исследователи изучали биофизические механизмы петлеобразования более 80 лет. В следующем списке мы суммируем принципиальные результаты эти х исследований.

1. Петлеобразование начинается, когда появляются первые миофибриллы (Manasek et al.,1978).

2. DM всегда располагается вдоль внутренней кривизны петлеобразного желудочка независимо от направления петлеобразования (Butler, 1952; Itasaki et al., 1991).

3. Во время c-петлеобразования MY утолщается по внутренней кривизне сердечной трубки и истончается к наружной кривизне (Manasek et al., 1972).

4. Перед петлеобразованием актиновые микрофиламенты в наружном слое клеток MY расположены в виде сете-образного паттерна на клеточных границах (Itasaki et al., 1989), тогда как ориентированные по окружности (circumferentially) актиновые пучки и поперечно исчерченные миофибриллы начинают формировать слой клеток внутреннего MY. Во время c-петлеобразования кольцевой актин остается вблизи внутренней кривизны трубки, но случайно ориентированные пучки появляются вблизи наружной кривизны (Itasaki et al., 1989; Shiraishi et al., 1992). Изменения формы миокардиальных клеток также следуют этому паттерну (Manasek et al., 1984a).

5. Во время петлеобразования белок ECM flectin экспрессируется в высоких концентрациях на левой стороне трубки и вблизи DM (Tsuda et al., 1996; Tsuda et al., 1998). Однако, механистический эффект flectin не известен.

6. Нет четких паттернов дифференциальных клеточных делений или клеточной гибели в сердце. формирующем петлю (Stalsberg, 1969b; Stalsberg, 1970).

Effects of perturbing external loads and boundary conditions

7. Сердечная трубка сгибается, но не поворачивается, если удалена из эмбриона и растет в культуре (Butler, 1952; Manning and McLachlan, 1990). Более того, когда на ст. 12-13 сердце курицы отделяется на любом из концов, то сердце образует петлю так как оно делает это в культуре, т.е. только сгибается (Flynn et al., 1991).

8. Удаление splanchnopleure существенно снижает величину торсионного поворота (ротацию) во время раннего c-петлеобразования (Voronov et al., 2004; Voronov and Taber, 2002).

9. Ингибирование шейного изгиба (flexure) эмбриона существенно затрагивает формирование сердца во время s-петлеобразования, т.к. предсердие остается ниже conotruncus (Mаnner et al., 1993).

Effects of perturbing cells and ECM

10. Ингибирование синтеза контрактильных белков с помощью cycloheximide или bromodeoxyuridine, или ингибирование myofibrillogenesis с помощью cytochalasin B препятствуют петлеобразованию (Chacko and Joseph, 1974; Manasek,1976; Manasek et al., 1978). Др. исследования указывают, однако, что петлеобразование не нуждается в присутствии организованных миофибрилл (Koushik et al., 2001).

11. Глобальное разрушение актиновых филамент высокими дозами cytochalasin B предупреждают или останавливают петлеобразование (Itasaki et al., 1991; Manasek, 1976). Ингибирование полимеризации актина относительно низкими концентрациями cytochalasin D или latrunculin A оказывает сходные эффекты (Latacha et al., 2005).

12. Арест миокардиальных сокращений высокой концентрацией калия (Manasek and Monroe, 1972) или 2,3-butanedione monoxime (BDM) (unpublished results) не препятствует петлеобразованию.

13. Ингибирование цитоскелетных контракций с помощью ингибиторов немышечного миозина Y-27632 и blebbistatin не предупреждало петлеобразования у эмбрионов кур (unpublished results), но Wei et al. (2001) установили, что Y-27632 ингибирует петлеобразование у мышей. Причины этого расхождения не ясны.

14. Разрушение микротрубочек с помощью colchicine заставляет клетки MY округляться, но не влияет на c-петлеобразование (Icardo and Ojeda, 1984; Itasaki et al., 1991). Однако, форма сердца нарушается во время s-петлеобразования (Icardo and Ojeda, 1984).

15. Устранение CJ с помощью hyaluronidase не ингибирует петлеобразования (Baldwin and Solursh, 1989; Linask et al., 2003).

Итак, имеющиеся данные подтверждают, что компоненты изгибания при c-петлеобразовании являются внутренне присущими сердечной трубке и не зависят от её функционирования. Напротив, торсионный компонент c-петлеобразования и процесс s-петлеобразования испытывают влияние со стороны внешних нагрузок. Среди важных структурных элементов в сердечной трубке являются актин, flectin и DM, но CJ давление, цитоскелетные контракции и дифференциальный рост, по-видимому, оказывают незначительные или не оказывают эффектов.

Хотя позвоночные выглядят билатерально симметричными снаружи, лево-правосторонняя асимметрия является как правило внутри. Расположение внутренних органов на левой или правой стороне тела, а также их ориентация, является высоко законсервированным свойством, с нормальным асимметричным расположением (situs solitus) имеющим место в более чем 99% случаев у людей. Интересно, что индивиды, которые имеют все органы, расположенные зеркально симметричным образом (situs inversus) обычно не обнаруживают побочных физиологических последствий. Однако, архитектура кардиальных мышечных волокон у таких людей обратна только в базальной области лев. желудочка, ведущая к аномальному (не обязательно обратному) повороту (torsion) во время кардиального цикла (Delhaas et al., 2004). Напротив, серьёзные пороки могут возникать. если сердце является единственным органом, которое оказывается на др. стороне (dextrocardia). По этой причине, а также исходя из фундаментальных морфогенетических механизмов билатеральной симметрии, исследователи уже давно интересуются причинами петлеобразования в левую сторону, которое д. приводить к dextrocardia.

Сегодня известно, что направление петлеобразования коррелирует с асимметричной экспрессией ряда генетических и молекулярных маркеров (Brand, 2003; Harvey, 1998; Mercola and Levin, 2001; Srivastava and Olson, 1997). Однако, как и в отношении др. аспектов петлеобразования биофизические механизмы, которые вызывают образование сердечной петли влево или вправо известны недостаточно.



Fig. 2. Formation of heart tube. (A) 3D schematic of membrane folding to create the primitive foregut (GUT) in the chick embryo (from Bellairs, 1953). (B) Cross section showing temporal formation of the foregut and heart tube (From De Jong F. et al., 1990). Abbreviations: AIP, anterior intestinal portal; CC, coelomic cavity; CP, cardiogenic plate; DM, dorsal mesocardium; end, endoderm; HT, heart tube; S, somite (4S, stage 8; 8S, stage 9; 10S, stage 10; 13S, stage 11); SPL, splanchnopleure; VM, ventral mesocardium.

Stalsberg (1970) использовала данные литературы, чтобы проверить направление петлеобразования в деталях. Она исследовала ряд возможностей. включая дифференциальную клеточную пролиферацию и гибель, различия в количествах клеток между левым и правым кардиальными примордиями и др. внешние и внутренние асимметрии. Хотя большинство заключений Stalsberg's являются ценными, однако некоторые из её анализов базируются на неверных предпосылках, что петлеобразование заключается только в правостороннем сгибании. Эта неправильная идея заставила многих исследователей неправильно интерпретировать некоторые экспериментальные результаты (Mаnner, 2000, 2004).

Интригующие эксперименты Lepori (1967) и Itasaki et al. (1991) часто цитируются для демонстрации влияния внешних и внутренних сил, соотв. на напрпвление петлеобразования. В своём исследовании Lepori (1967) установил, что рассечение (cutting) SPL на левой стороне эмбрионов кур не меняет направления петлеобразования, но рассечение на правой стороне ведет к аномальному петлеобразованию влево. Itasaki et al. (1991), с др. стороны, использовали кристаллы cytochalasin B для дизорганизации актина в ограниченных областях миокарда. В то время как разрушение актина на левой стороне сердца не вызывало видимых эффектов на направление петлеобразования, то разрушение на правой стороне на ст. 8-9 у эмбрионов кур приводило к левостороннему петлеобразованию в значительном количестве сердец. Отмечая ориентацию circumferential актиновых филамент в сердце перед началом петлеобразования (Itasaki et al., 1989; Shiraishi et al., 1992), эти исследователи высказали предположение, что circumferential цитоскелетные контрактильные силы, обывчно более сильные на правой стороне, сгибают сердечную трубку в правую сторону, заставляя её ротировать около дорсального мезокардия, который первоначально закрепляет сердечную трубку на эмбрионе и действует как точка вращения (pivot). Если контракция на правой стороне нарушена, тогда контракции на левой стороне тянут сердце влево.

Хотя кажется очевидным. что SPL и актиновые микрофиламенты играют основную роль в процессе петлеобразования, но недавние работы поставили под сомнение результаты, полученные Lepori (1967) и Itasaki et al. (1991). В частности, Voronov and Taber (2002; Voronov et al., 2004) повторили оба эти эксперимента со сходными результатами, но они нашли, что поверхностное натяжение, присутствующее в стандартных методах культивирования эмбрионов кур может влиять на морфологию петлеобразования. Когда они провдили эти эксперименты под тонким слоем жидкости, чтобы устранить поверхностное натяжение, то в действительности не возникало левостороннего петлеобразования. Т.о., результаты Lepori (1967) и Itasaki et al. (1991) может считать артефактом.

Многочисленные доказательства подтвердили, что направление петлеобразования предопределяется, по крайней мере частично, событиями, которые происходят до образования сердечной трубки. Исследования показали, напр., что ингибирование клеточной адгезии в раннем развитии м. нарушать направление петлеобразования. Блокирование функции адгезивной молекулы N-cadherin до ст. 5 рандомизирует направление петлеобразования (Garcia-Castro et al., 2000), тогда как деградация heparan sulfate, чтобы разрушить адгезию в правой прекардиальной области на ст. 7-8, ведет к левостороннему петлеобразованию (Yue et al., 2004). Кроме того, обратное лево-правостороннее пространственное распределение белка flectin в прекардиальной мезодерме коррелирует с аномальными образованием петли влево (Linask et al., 2002; Linask et al., 2003; Tsuda et al., 1996; Tsuda et al., 1998), но роль, выполняемая flectin, не установлена.

Вообще-то одной из наиболее возбуждающих находок в последние годы яв илось открытие набора быстро ротирующих моноцилий, расположенных на узелке (Nonaka et al., 1998), который является сигнальным центром у ранних эмбрионов (Gilbert, 2003). Обычно эти цилии ротируют по часовой стрелке vortical способом при приблизительно 600 rpm и эти круговые движения создают ток, направленный на левую сторону (Nonaka et al., 1998; Nonaka et al., 2002; Okada et al., 1999). Недавно Cartwright et al. (2004) анализировали этот феномен, используя жидкостную механику. Очевидно, что нокаут ресничек или их подвижности приводит к рандомизации направления петлеобразования (Nonaka et al., 1998; Okada et al., 1999), а искусственно индуцированный правосторонний ток приводит к левому петлеобразованию. Рассуждения о значении этих данных включают гипотезу, что ток жидкости депонирует морфоген на левой стороне узла, что инициирует лево-правостороннюю асимметрию (Brueckner, 2001; Mercola, 2003; Nonaka et al., 1998; Supp et al., 2000).

Исследователи давно обсуждают биофизические механизмы, которые управляют петлеобразованием. Любая подходящая гипотеза петлеобразования д. согласовываться с наблюдениями, представленными в предыдущем разделе. В ранней работе Patten (1922) было предположено, что сердечная трубка просто принуждена сгибаться т.к. её длина увеличивается быстрее, чем пространство, в котором она заключена. Эта идея позднее была оспорена находкой, что сердечная трука сгибается, культивируемая в изоляции (Butler, 1952; Manning and McLachlan, 1990). Кроме того, Patten (1922) предполагал, что сердце вынуждено сгибаться влево или вправо из-за физических препятствий, создаваемых дорсально с помощью тела эмбриона и вентрально с помощью желтка. Но он не смог объяснить, почему сердце почти всегда образует петлю в направлении правой стороны тела.



Fig. 3. Looping chick heart. (A) Schematic of cross section of stage 10 chick heart (from Manasek, 1983). CJ, cardiac jelly; DM, dorsal mesocardium; EN, endocardium;MY, myocardium; SPL, splanchnopleure (B) Ventral views of looping chick heart (from Mдnner, 2000). a, atrium; c, conotruncus; OT, outflow tract; OV, omphalomesenteric veins; V, ventricle

Некоторые исследователи полагали, что гемодинамические силы лепят формирующееся сердце, с изгибанием, вызываемым ударами крови о стенку наружной curvature сердечной трубки (Spitzer and Lev, 1951). Фактически, Hove et al. (2003) недавно установили, что сердца рыбок данио не образуют петли, если блокируется приток или отток крови. Концепция формирования сердца кровотоком противоречит, однако трем типам доказательств. Во-первых, небольшой кровоток проходит через сердце, когда оно изгибается в изолированной культуре. Во-вторых, петлеобразование происходит нормально, если сердцебиения останавливаются с помощью высоких уровней калия (Manasek and Monroe, 1972). В-третьих, c-петлеобразование в основном заканчивается прежде, чем начинается эффективный кровоток на ст. 12 (Patten, 1951). Причины результатов, полученных Hove et al. (2003) неясны.

Др. возможность заключается в том, что дифференциальный рост заставляет сердце сгибаться, с клетками на наружной кривизне делящимися быстрее, чем клетки на внутренней кривизне. Однако, Sissman (1966) установил, что скорость клеточного размножения в сердце, формирующем петлю, не соогласуется с пространственным паттерном, а Stalsberg (1969b; 1970) пришел к заключению, что регионалные отличия в скоростяъ клеточных делений и клеточной гибели, по-видимому, не настолько существенны, чтобы быть достаточными для достоверного сгибания. С др. стороны, дифференциальный рост может вызываться миокардиальными клетками, будучи добавляемых к противоположным сторонам сердца с разными скоростями, или клетками, перемещающимися из одного области в др. , напр., с внутренней на наружную кривизну. Некоторые данные указывают на то, что первый механизм вносит вклад в петлеобразование, т.к. относительно больше клеток вкладывается в правую сторону краниальной части желудочка и левую сторону каудальной части (DeHaan, 1967; Stalsberg, 1969a; Stalsberg, 1970). Эти находки, однако, более согласуются с относительно скромно направленным вправо сгибанием, описанным Voronov et al. (2004) скорее, чем с более выраженным вентральным сгибанием. Более того, миокард состоит из тесно связанных клеток во время петлеобразования (Stalsberg and DeHaan, 1969) и мы не осведомлены о прямых доказательствах, подтверждающих механизм, базироующийся на перегруппировке клеток. Поэтому имеющиеся данные, по-видимому, не подтверждают дифференциального роста в качестве главного в петлеобразовании.

При изучении изменений формы клеток в сердце кур Manasek et al. (1972) установили, что миокардиальные клетки на наружной кривизне уплощены во время c-петлеобразования, тогда как те, что вблизи внутренней кривизны становятся толще радиально и и длиннее по окружности (circumferentially). Они предположили, что изменения формы этих клеток активно генерируются, возможно благодаря миофибриллогенезу, чтобы заставить сердечную трубку сгибаться. Позднее, однако, они отказались от этой идеи по неизвестным причинам в пользу новой гипотезы.

Новая гипотеза, предложенная группой Manasek базруется на трех основных наблюдениях: (1) кардиальный гель осуществляет давление, направленное наружу на миокард и меняет объем в ответ на изменения osmolarity окружающей среды (Manasek et al., 1984a; Nakamura and Manasek, 1978). (2) Структура DM подтверждает, что он создает довольно жесткое давление вдоль дорсальной стороны сердечной трубки (Manasek et al., 1984b; Manasek, 1983). Фактически, прямые механические измерения сегодня подтверждают, что внутренний изгиб значительно жестче, чем др. области на ст. 12 серда кур (Zamir et al., 2003). (3) Миофибриллогенез начинается примерно в то же самое время, что и петлеобразование, а ингибирование этого процесса предупреждает петлеобразование (Manasek, 1976; Manasek et al., 1978). Объединив эти наблюдения, Manasek et al. (1984b) постулировали, что сгибание вызывается давлением CJ, раздувающим сердце, с DM, мешающим продольному расширению и заставляющим трубку сгибаться с DM вдоль внутренней кривизны (см. наблюдение 2 выше), тогда как торсионный поворот обусловливается давлением (stress) стенки, перенаправляемым посредством спиральной системы миофибрил. Согласно этой модели



Fig. 4. Effect of splanchnopleure and omphalomesenteric veins on cardiac rotation (from Voronov et al., 2004). (A) Intact stage-10 heart with fluorescent labels along left and right sides. (B) Same heart at stage 11; as the heart rotates (twists), labels move toward dorsal and ventral sides of heart. (C) Splanchnopleure is removed; most rotation disappears within 1 hour. (D) Omphalomesenteric veins are severed; label positions indicate that remainder of torsion is lost, but heart remains bent slightly toward the right.

следовательно, давление CJ является движущей силой для петлеобразования, при этом развивающиеся кардиомиоциты играют скорее пассивную, чем активную роль. Используя физическую модель, сконструированную из цилиндрической latex мембраны (MY), тесьмы (DM) и спирального жесткого материала (миофибриллы), эти исследователи показали, что такой механизм физически возможен. Они также подтвердили, что региональные различия в поддатливости стенки могут вызывать наблюдаемое выпячивание наружной кривизны. К сожалению эта ясная идея была отправлена на покой Baldwin and Solursh (1989) и позднее Linask et al. (2003), которые установили, что переваривание CJ с помощью hyaluronidase не предупреждает петлеобразования. Итак, к 1990 ряд гипотез петлеобразования был выдвинут и отвергнут и наиболее интересной стала казаться генетическая сторона этой проблемы. Однако, даже если генетические и молекулярные факторы, участвующие в петлеобразовании действительно будут определены, всё ещё будет необходимо устанавливать связь со специфическими морфогенетическими механизмами.

Имеются, по крайней мере, три трудности, которые осложняют проблему петлеобразования. Во-первых, многие исследователи не полностью принимают во внимание (или осведомлены) в необходимости учитывать как вентральное сгибание, так и dextral ротацию для интерпретации экспериментальных результатов. [как новичок в петлеобразовании, так и авт., восприимчивые к этому (Taber et al., 1995).] Хотя эта характеристика c-петлеобразования известна уже многие годы (Butler, 1952), Mаnner (2000) считают необходимым подчеркнуть это снова. Недавно Mаnner (2004) показал. что петлеобразное сердце действительно является спиралью и что смысл этой спирали в трехмерном пространстве д. учитываться для аккуратного описания морфологии петлеобразования. В свете этого повторное проведение некоторых предыдущих экспериментов может оказаться пригодным. Во-вторых, петлеобразование м. вовлекать комбинацию нескольких отличающихся механизмов, некоторые из которых могут быть избыточными и компенсаторными, когда др. неспособны (Stalsberg, 1970). Такое перекрывание может быть благоприятным для эмбриона, но оно существенно осложняет жизнь исследователям. В-третьих, визуализация поведения такой сложной трехмерной структуры может быть затруднительна (Mаnner, 2004) а физическая интуиция в такой нелинейной проблеме может оказаться уводящей в сторону.

Сгибание и torsion трубки действительно использует механические силы. В последнюю декаду мы приблизились к проблеме петлеобразования с точки зрения инженера биомеханика². Наша работа связана с экспериментами на эмбрионах кур и компьютерными моделями, базирующимися на принцыпах continuum механики. Мы полагаем, что компоненты изгибания и торсионного поворота c-петлеобразования управляются двумя разными наборами сил: т.к сгибание явления в первую очередь прирожденным процессом сердечной трубки, а торсионный поворот управляется с помощью внешних нагрузок.

Сегодня большинство исследователей принимают мнение, что сгибание является прежде всего процессом внутренне присущим сердечной трубке. Идентификация источника сил, которые управляют кардиальным сгибанием, всё ещё ускользает. Было бы логичным предположить, что актин вовлечен, т.к. этот цитоскелетный белок играет роль во многих морфогенетических процессах (Alberts et al., 2002). В самом деле, эксперименты с cytochalasin B Manasek (1976) and Itasaki et al. (1991) согласуются с этой идеей. Но какова в действительности роль актина? Как обсуждалось выше, ранне работы по петлеобразованию эффективно исключили дифференциальный рост и перегруппировку клеток. В 1990, две возможности, которые оставались, это были контракция цитоскелета и полимеризация актина.

Сфокусировавшись на направленном кардиальном torsion и петлеобразовании, Itasaki et al. (1991) подтвердили, что контракция цитоскелета вызывает образование петли сердцем вправо, но их результаты позднее были поставлены под сомнение (Voronov and Taber, 2002; Voronov et al., 2004). Недавно мы использовали этот потенциальный механизм далее путем ингибирования контрактильной активности не-мышечного миозина II, используя ML-7, Y-27632 и blebbistatin (unpublished results). Ни одно из этих соединений не оказывало ощутимого эффекта на морфологию петлеобразования в культуре целого эмбриона, а результаты оказались сходными, когда эти эксперименты были повторены на изолированных сердцах с учетом только сгибания. Влияние этих веществ на контрактильность подтверждено с использованием измерений региональной жесткости. Хотя эффекты ML-7 были относительно слабыми, сердца. обработанные Y-27632 и blebbistatin обнаруживали значительное снижение жесткости по сравнению с контролем, указывая тем самым на потерю контрактильных сил. Исходя из этих результатов, мы пришли к выводу, что контракции цитоскелета играют незначительную роль в петлеобразовании. Чтобы исследовать эффекты полимеризации актина, сердца кур на ст. 9-11

Fig. 5. Schematic of hypothesis for cardiac rotation. (courtesy Patrick Alford. (A,B,C) Ventral view; (A',B',C') cross sectional view. (A,A') Straight heart tube before looping. (B,B') Cytoskeletal contraction and cell migration cause compressive and tensile stresses along cranial and caudal surfaces, respectively, of omphalomesenteric veins (OV). Relatively greater force in left vein displaces caudal end of heart tube slightly toward the right. (C,C') The splanchnopleure (SPL) pushes the heart tube dorsally, increasing rotation magnitude.

подвергали воздействию cytochalasin D и latrunculin A (Latacha et al., 2005), которые являются более специфическими лекарствами, чем cytochalasin B для ингибирования полимеризации актина (Fenteany and Zhu, 2003). В культуре целых эмбрионов оба вещества ингибировали петлеобразование зависимым от дозы и стадии образом, сходно с результатами, полученными Manasek (1976) для cytochalasin B. Сходные результаты были получены и на изолированных сердцах, но петлеобразование затрагивалось более низкими дозами. Эти данные указывают на то, что полимеризация актина необходима для сгибания кардиальной трубки во время c-петлеобразования и с помощью процесса элиминации, как мы полагаем, она обеспечивает движущиеся силы. Если можно будет установить, что полимеризация актина в само деле управляет сгибанием сердца, то мы ё д. ответить на вопросы: (1) Каков специфический механизм, с помощью которого полимеризация актина управляет наблюдаемыми изменениями морфогенетической формы? (2) Как силы интегрируются. чтобы согнуть сердечную трубку? (3) Как эти силы регулируются?

Чтобы ответить на первый вопрос, мы постулировали, что растущая сеть цитоскелетного актина вызывает изменения в форме клеток путем приложения усилий к клеточной мембране. Др. словами, мы в общем-то оживили идею активного изменения клеточной формы Manasek et al. (1972), которая была забыта. этот механизм сходен с тем, который управляет выпусканием псевдоподий в перемещающихся клетках (Alberts et al., 2002) и подтверждается четкими актиновыми пучками, видимыми во время петлеобразования вокруг границ миокардиальных клеток (Itasaki et al., 1989).

Для ответа на второй вопрос мы исследовали микроструктурные детали развивающегося миокарда. В начале петлеобразования расположенные по окружности (circumferentially) актиновые микрофиламенты присутствуют в миокарде (Itasaki et al., 1991; Manasek et al., 1984b; Shiraishi et al., 1992), но когда сердечная трубка сгибается, то актиновые волокна на наружной кривизне становятся организованы более случайно, тогда как волокна вблизи внутренней кривизны сохраняют свою circumferential ориентацию (Itasaki et al., 1989). Полимеризация волокон в этих предпочтительных направлениях (изотропные на вентральной стороне и по окружности на дорсальной стороне) д. заставлять клетки вблизи наружной кривизны (вентральная сторона) уплощаться в радиальном направлении и длиннее в circumferential и продольном направлениях, тогда как клетоки вблизи внутренней кривизны (дорсальная сторона) д. становиться длиннее circumferentially, но короче в продольном направлении (чтобы сохранить клеточный объем). Эти изменения клеточной формы согласуются с теми, что наблюдали Manasek et al. (1972) и, как будет обсуждаться позднее, компьютерная модель показывает, что они могут вызывать наблюдаемое сгибание.

Третий вопрос наиболее труден. Онтогенетические гены скорее всего играют роль в регуляции морфогенетических сил. В сердце они могут диктовать геометрию актина, которая затем определяет последующие изменения формы клеток. Сигнал к остановке сгибания также может быть генетическим или он может контролироваться с помощью ограничений, таких как постепенное накопление продольно ориентированных миофибрилл, которые д. делать клетки жестче и сердечную трубку более твердую для сгибания, как предполагается Nakamura et al. (1980). Др. возможный регуляторный механизм это механическая обратная связь, которая была изучена на др. системах развития Beloussov (1998). Регуляция процесса петлеобразования остается открытым вопросом и нуждается в дальнейших исследованиях.

Кстати, полимеризация актина ранее не предполагалась в качестве причины крупно массштабных изменений морфогенетических форм. Более того, может возникнуть вопрос, могут ли растущие актиновые филаменты вызывать силы. достаточные для сгибания сердечной трубки. Фактически разные исследователи подсчитали, что стрессы от полимеризации могут быть



Fig. 6. Finite element model for looping heart (from Voronov et al., 2004). (A) Oblique view of undeformed model showing specified morphogenetic forces (DM, dorsal mesocardium; V1, ventral half of ventricle - longitudinal- circumferential actin polymerization; V2, dorsal half of ventricle - circumferential polymerization; OV1, cranial half of omphalomesenteric veins - longitudinal growth (cell influx); OV2, caudal half of omphalomesenteric veins - longitudinal contraction). (B) Diagonal view showing ventral bending. (C) Ventral view showing rightward rotation (colors indicate longitudinal stresses). (D) Stage-10+chick heart for comparison with (C) (from Manner, 2000).

достигать нескольких сотен pascals (Howard, 2001; Upadhyaya et al., 2003). Согласно измерениям свойств материала в сердце кур на ст.12, такие стрессы и в самом деле могут вызывать существенные деформации миокарда, достаточные для сгибания кардиальной трубки (> 50% strain) (Zamir and Taber, 2004a; Zamir and Taber, 2004b).

Некоторые исследователи полагают, что торсионное вращение подобно сгибанию вызывается внутренними силами (Itasaki et al., 1991; Manasek et al., 1984b). Недавняя работа показала, что SPL и OVs влияют на torsion во время раннего c-петлеобразования (Voronov et al., 2004; Voronov and Taber, 2002). Напр., когда SPL удаляется у эмбрионов кур ст. 11, то сердце немедленно прыгает обратно, частично в направлении срединной линии эмбриона и затем медленно раскручивается пока почти полностью не исчезнет torsion (Fig. 4 B,C). Если OVs затем отсечь, то исчезнут остатки скручивания, с желудочком оставшимся согнутым несколько в направлении вправо (Fig. 4D). Кроме того, когда SPL удаляется из эмбрионов на ст. 10 то сердце сгибается ветрально, но ротирует мало, когда культивируется в течение 6 ч (Voronov and Taber, 2002). Следовательно, внешние силы, прикладываемые к SPL и OVs, по-видимому, играют доминирующую роль в торсионном компоненте clooping.

Мы полагаем, что OVs заставляют сердечную трубку вращаться слегка вправо и затем SPL толкает ее дорсально и еще дальше вправо, т.к. трубка ротирует вокруг DM.

Всё вместе позволяет выдвинуть следующую рабочую гипотезу механизма c-петлеобразования (see Fig. 5; Voronov et al., 2004):

1. Начиная со ст. 10 (у кур), прекардиальные клетки в каудальной области OVs подвергаются продольной контракции цитоскелета. Это генерирует стрессы растяжения и сжатия в каудальной и кардиальной частях вен,соотв., как это было обнаружено Voronov et al. (2004) (Fig. 5B). Эти стрессы проталкивают прекардиальную мезодерму через вены в направлении каудального конца сердца, возможно индуцируя дополнительный приток клеток через активную миграцию вдоль линий stress-aligned fibronectin (Linask and Lash, 1986; Linask and Lash, 1988a; Linask and Lash, 1988b; Toyoizumi et al., 1991; Trinh and Stainier, 2004). 2. Клетки, вошедшие в обе OVs проталкиваются к каудальному концу сердечной трубки и сливаются, формируя первичный левый желудочек и предсердие. Благодаря возможно асимметричной геометрии вен или контрактильных сил левая вена обычно толкает с большей силой, смещая сердце слегка вправо (Fig. 5B). DM препятствует этому смещению, превращая его в незначительную правостороннюю ротацию относительно фиксированной дорсальной стороны сердца (Fig. 5B'). 3. Сердце сгибается вентрально за счет полимеризации актина, а SPL вызывает сдавливающую силу на вентральную поверхность желудочка, проталкивая его дальше вправо (Fig. 5 C,C'). Дальнейшее сгибание и торсионный поворот вызывает прорыв DM, позволяя сердцу деформироваться в c-образую трубку.

Мы также полагаем, что излишняя асимметрия, помимо той, что обеспечивается OV силами, заставляет сердца формировать петлю в направлении правой стороны. Право-направленное сгибание трубки (Voronov et al., 2004) и право-направленный сдвиг conotruncus (Mаnner, 2000) являются двумя кандидатами. Т.о., если одна асимметрия не срабатывает, то др. ё может индуцировать нормальное dextral петлеобразование.

Чтобы проверить, может ли эта гипотеза объяснена физически, Voronov et al. (2004) разработали компьютерную модель для ст. 10 сердца. которая включает OVs и DM (Fig. 6A). В соответствии с морфологией (Fig. 3B), левая вена больше в диаметре, чем правая вена. И в согласии с наблюдаемыми изменениями в геометрии актина и формы клеток MY во время c-петлеобразования (Itasaki et al., 1989; Itasaki et al., 1991; Manasek et al., 1984b; Manasek et al., 1984a; Manasek et al., 1972; Shiraishi et al., 1992), полимеризация актина специфицируется в circumferential направлении по дорсальной половине желудочка и в циркулярно-продольном направлениях по вентральной половине. В OVs продольные контракции приписываются нижним половинам вен, тогда как верхние половины растут продольно,



Fig. 7. Effects on looping of removing splanchnopleure and right omphalomesenteric vein (from Voronov et al., 2004). (A,D) Stage-10 heart and idealized model. (B,E) Heart and model immediately after removing vein. (C,F) Heart and model 18 h later; in agreement with observed geometry, the model ventricle first jogs leftward (E) and then deforms rightward (F).

чтобы стимулировать приток клеток в сердце. Когда эти силы были включены, то сердечная трубка сгибалась вентрально (Fig. 6B) и смещалась и ротировала слегка в направлении вправо (Fig. 6C). Возникающие в результате геометрии сердца и вен напоминали таковые на ст. 10+ у эмбрионов кур (Fig. 6D), а стрессы растяжения и сжатия в нижней и верхней частях OVs, соотв., сравнимы с измеряемыми stress данными. Чтобы проверить способность к предсказаниям этой модели Voronov et al. (2004) удаляли правую OV на ст. 10 у эмбрионов и наблюдали, что желудочек сначала слегка перемещается влево, а затем проталкивается в правую сторону с помощью оставшейся OV во время последующих 18 h в культуре (Fig. 7 A,B,C). При удалении правой вены при тех же самых параметрах модели, используемых при нормальном петлеобразовании, модель предсказывает морфологию, которая очень сходна с таковой в экспериментальном сердце (Fig. 7 D,E,F). Согласно этой модели, растяжение в левой вене первоначально толкает сердце слегка в правую сторону. Когда же левая вена отсечена, то экспериментальные и компьютерные деформации были сходны, но противоположны по своему направлению.

Наконец, согласно нашей гипотезе, редукция силы в левой OV ниже той, что имеет место в правой OV д. приводить к петлеобразованию в левую строну. В самом деле, когда Voronov et al. (2004) удаляли часть левой вены, при этом оставляли SPL в основном интактной, то более чем 25% из этих операций давали лево-направленное петлеобразование, что редко происходит в нормальных культуральных условиях.

While aspects of the mechanics of looping are now becoming clear, much remains unsettled. For example, although some mechanical forces involved in looping have been identified, it remains to be established how these forces are regulated spatially and temporally to produce a looped heart tube. Further investigation is needed to determine whether the proposed actin polymerization mechanism can produce the necessary changes in tissue shape on a global scale. In addition, the possible roles played by redundant mechanisms have not been elucidated. Finally, the mechanisms of s-looping have received relatively little attention, as have the mechanisms involved in the initial creation of the heart tube. The latter may have implications in left-right looping directionality.

In the long term, gaining a complete understanding of heart development requires finding the link between gene expression and morphomechanics (Brouzes and Farge, 2004). Reaching this goal will require the combined expertise of developmental biologists and biomechanical engineers. Toward this end, the pioneering studies of Huang et al. (2001b; 2001a) may provide a valuable roadmap.