Во время феодального периода в Японии самурай без хозяина назывался ronin. Сегодня Dejosez с коллегами описали современного Ronin, который контролирует плюрипотентность embryonic stem (ES)-клеток и лишен какой-либо взаимосвязи с известными 'master' регуляторами плюрипотентности (OCT4, SOX2 и NANOG).
Предыдущие исследования показали, что caspase-3, компонент системы клеточной гибели, расщепляет и истощает в ES клетках NANOG, индуцируя тем самым дифференцировку. Используя caspase-3 в качестве затравки при двугибридном скрининге, авт. открыли Ronin, ядерный белок с zinc-finger ДНК-связывающим доменом, который является общераспространенным среди факторов, которые участвуют в эпигенетическом замалчивании генной экспрессии.
Используя генетические делеции авт. показали, что Ronin является существенным для эмбриогенеза и для образования и размножения ES клеток in vitro. Затем они продемонстрировали, что форсированная экспрессия Ronin позволяет клеткам пролиферировать без дифференцировки в условиях, которые не поддерживают самообновления. Итак, Ronin поддерживает плюрипотентность ES клеток, но делает ли он это совместно с каноническими факторами плюрипотентности? в
Это, по-видимому, не так. т.к. нокдаун Oct4, Sox2 и Nanog с помощью siRNA в ES клетках не влияет на экспрессиию Ronin. Более того, избыточная экспрессия Ronin в клетках, обработанных siRNA, может преодолевать потребность в этих факторах для поддержания плюрипотентности. Итак, Ronin в самом деле 'samurai without a master', но как он поддерживает плюрипотентность?
Выяснение профилей генной экспрессии в ES клетках, избыточно экспрессирующих Ronin, выявило широкую репрессию транскрипции. Авт. также обнаружили усиление по всему геному деметилирования Lys9 гистона H3 (H3K9me2; репрессивная метка) в избыточно экспрессирующих Ronin ES клетках по сравнению с клетками дикого типа. Эти находки указывают на то, что Ronin действует в качестве репрессора транскрипции. В согласии с этой гипотезой и то, что Ronin соединяется с промоторами Gata4 и Gata6 в недифференцированных ES клетках, которые были также обогащены H3K9me2. После дифференцировки связывание Ronin и H3K9me2 метка теряются и гены Gata4 и Gata6 активно транскрибируются. Ronin также взаимодействует с HCF1, с ключевым регулятором транскрипции и является частью крупных хроматин-модифицирующих комплексов.
Потеря PRMT5 вызывала гибель эмбрионов из-за неспособности становления плюрипотентности в клетках бластоциста. Было установлено, что его локализация динамически регулируется во время развития мыши: он локализуется в ядре во время раннего развития, но 6.5 день эмбриогенеза он активируется и обнаруживается в цитоплазме плюрипотентных клеток эпибласта из внутренней клеточной массы (ES клетки). Истощение Prmt5 с помощью RNA interference (RNAi) в ES клетках приводило к потере H2ARme2, с кинетикой, которая указывала на то, что PRMT5 метилирует H2A в цитоплазме; редукция PRMT5 ведет к потере плюрипотентности и к активации ключевых генов дифференцировки.
Methylosome protein 50 (MEP50) известный кофактор PRMT5; однако, Tee et al. установили, что фенотип нокдауна MEP50 в ES клетках, хотя и сходен с таковым при нокдауне PRMT5, но менее тяжелый. Это указывает на то, что PRMT5 может выполнять дополнительные роли, которые не зависят от MEP50, вообще-то в метилировании не гистоновых белков. Более того, было выявлено физическое взаимодействие между PRMT5 и signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), последний обладает известной ролью в контроле плюрипотентности посредством передачи сигналов LIF. Путь STAT3, по-видимому, не нарушен у истощенных по Prmt5 клеток, не отмечено каких-либо отклонений в экспрессии генов. активируемых с помощью STAT3. Однако гены, которые активируются в ответ на истощение Prmt5, как известно, непосредственные цели для репрессии с помощью STAT3. Как же PRMT5 и STAT3 кооперируются, чтобы контролировать плюрипотентность предстоит определить. Однако ясно, что сигнальные пути могут взаимодействовать с хроматином посредством прямого действия в цитоплазме, чтобы регулировать плюрипотентность.
Многоклеточные организмы нуждаются в существовании и точном контроле STEM CELLS, которые поддерживают тканевой HOMEOSTASIS путем замещения окончательно дифференцированных., старых или поврежденных клеток. В дополнение к естественно возникшей системе соматических стволовых клеток, таких как гематопоэтическая система у плодов и взрослых, стволовые клетки могут быть получены из EMBRYOS пери- и ранних пост-имплатанционных стадий. В перспективе онтогенеза производные эмбрионов PLURIPOTENT стволовые клетки могут рассматриваться как представляющие исходное (archetypal) состояние генома, из которого др. паттерны геномной активности возникают позднее в ходе развития. Эти происходящие из эмбрионов стволовые клетки распределены по категориям, используя разные названия (EMBRYONIC STEM CELLS (ESCs), embryonal carcinoma cells (ECCs) и embryonic germ cells (EGCs); FIG. 1). Хотя эти определения туманны и разные клетки могут иметь перекрывающиеся свойства, но происходящие из эмбрионов стволовые клетки унифицированы в отношении некоторых определенных преимуществ по сравнению со взрослыми стволовыми клетками. Они легче идентифицируются, выделяются и поддерживаются в виде линий стволовых клеток, которые могут содержаться в культуре неопределенное время, служа в качестве резервуара клеток предшественников на случай необходимости ('on-demand'). Т.к. они плюрипотентны, то они могут быть превращены в зародышевые клетки или любые производные трех первичных эмбриональных зародышевых слоёв. Они могут также изменены генетически и многочисленными протоколами, которые делают возможной дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в почти любой тип клеток. Соответственно регуляторные механизмы, которые контролируют плюрипотентность стволовых клеток, д.б. достаточно гибки, чтобы давать такие многоликие и обычно внешне различимые реакции. Поэтому плюрипотентность является фундаментальной биологической функцией многоклеточных организмов, она возможно эволюционно защищена многочисленными генетическими системами отката (backup) и законсервирована в разных типах стволовых клеток (TABLE 1). Напр., элемент наиболее хорошо известного пути сигнальной трансдукции ESCs у мышей - glycoprotein-130 (gp130) рецептором-опосредованный путь, который обнаруживается во многих неродственных тканях. Существует огромный интерес к поискам путей увековечивания плюрипотентности линий клеток, происходящих из эмбрионов, такое знание явилось бы критическим для многих потенциальных биомедицинских аппликаций, связанных с регенерацией ткани ('regenerative medicine'). Однако, это знание необходимо также, чтобы оценить, как in vivo, стволовые клетки дирижируют генерацией, поддержанием и регенерацией ткани, в то же время предупреждая или супрессируя аберрантный рост и избегая истощения. Эти цели скорее всего достигаются комбинационной сложностью и нелинейностью или ранее не идентифицированными взаимодействиями между известными внеклеточными сигналами, вторичными мессенджерами и нижестоящими эффекторами (BOX 1).
ESCs as a cell-line model of pluripotency
Эмбриональные стволовые клетки не были бы интересны для практики, если бы они не запускали вновь развитие. Хотя эра ESC началась официально в 1981, попытки найти, могут ли эмбрионы млекопитающих меняться с помощью экзогенных клеток, которые бы могли возобновить развитие, начались раньше (BOX 2). Плюрипотентные ESC клеточные линии могут быть получены из INNER CELL MASS (ICM) или PRIMITIVE ECTODERM (известной также как epiblast)пери-имплантационных BLASTOCYSTS1, как установлено у мышей (FIG. 1). После трансплантации в неродственные бластоцисты эти клетки могут инкорпорироваться в эмбрион и участвовать в развитии. Плюрипотентные клетки впервые были распознаны в ICM мышиных бластоцистов на 3.5 день эмбриогенеза (E3.5) и присутствовали самое позднее в пре-гаструляционном эмбрионе (FIG. 1). Вплоть до ~E5.5, по крайней мере, некоторые клетки примитивной эктодермы остаются плюрипотентными. В быстро изменяющемся эмбрионе они не обязательно выглядят как популяция стволовых клеток и они не существуют очень долго. Однако, их потенциал как стволовых клеток может быть выявлен с помощью экспериментальных вмешательств, которые способны 'отлавливать' клетки в состоянии stem-cell. Martin использовал нормальные бластоцисты мыши, культивируемые в ECC-кондиционированной среде2, тогда как Evans and Kaufman использовали систему совместного культивирования, в которой клетки, происходящие из ICM задержанных мышиных бластоцистов, росли на слое митотически инактивированных mouse embryonic fibroblast (MEF) FEEDER CELLS в присутствии сыворотки крови3. В отсутствие кондиционированной среды самообновление и плюрипотентность ESC фенотипа не сохранялись, что вело к преимущественно нейрональной дифференцировке.
Плюрипотентность ESCs могут быть оценена по их способности интегрироваться после трансплантации в ICM E3.5 бластоцистов и по экспрессии, как и ICM, alkaline phosphatase, E-cadherin, stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) и octamer-binding transcription factor-4 (OCT4)4 (TABLE 1). Плюрипотентность была с определенностью продемонстрирована у мышей, когда ESCs полностью интегрировались в развивающийся в развивающийся эмбрион после инъекции внутрь бластоциста и продуцировали с высокой частотой CHIMAERISM тканей развивающегося плода. В зависимости от определения 'extra-embryonic', ESCs давали ограниченный вклад во вне-эмбриональные ткани5,6. Фактически, посредством ICM, которую они колонизируют, ESCs могут вносить вклад во вне-эмбриональную MESODERM и, следовательно, в комбинированные придатки, такие как амнион, алантоис и желточный мешок. Мышиные ESCs не дают
TROPHECTODERM, которая образуется во время первого выбора клеточного клона, который разделяет ICM и трофэктодерму в бластоцисте.
Как и у мышей, были установлены клоны клеток, напоминающие ESCs, и у определенных приматов7, включая людей8. Однако, клоны клеток от эмбрионов др. видов млекопитающих (таких как кролики, свиньи, кошки и овцы), пользующихся дурной славой, трудны для выявления или размножения без потери плюрипотентности9 или разработки похода для уверенного определения онтогенетического потенциала (использование инъекций внутрь бластоцистов) и поэтому д. определяться как 'ESC-подобные клетки'. Нет единообразия даже среди мышей и ESCs от определенных линий мышей могут быть выделены и поддерживаться в культуре относительно легко, тогда как др. требуют более сложных культуральных условий10. Даже из одиночного мышиного бластоциста возникют разные линии ESC клеток11. Способность давать ESCs после somatic-cell nuclear transfer (SCNT) - впервые достигнута на мышах12,13, а теперь и на человеке14 - это может служить более униформным источником ESCs.
Signalling that controls nuclear decisions
Помимо общих путей сигнальной трансдукции, которые оперируют в большинстве типов клеток, таких как передача сигналов extracellular
matrix (ECM), которая базируется на рецепторах клеточной мембраны семейства integrin (напр., integrin β1; REF. 15), некоторые экзогенные факторы, которые участвуют в управляемых ядром сигнальных путях, как известно, модулируют плюрипотентность стволовых клеток in vivo и in vitro. Замечательно, что гены, которые экспрессируют белки, участвующие в сигнальной трансдукции и регуляции, составляют большую часть TRANSCRIPTOME у ESCs, и представляют собой 17% of генов, которые обогащены в плюрипотентных по сравнению с дифференцированными ESCs человека. Эти гены кодируют несколько пар лиганд-рецептор и секретируемые ингибиторы сигнальных путей fibroblast growth factor (FGF), transforming growth factor (TGF)-β/bone morphogenetic protein (BMP), Nodal и Wingless type (WNT)16,17.
The LIF signal cascade. In vitro, leukaemia inhibitory factor (LIF; известный также как ингибитор, Dia
18) является важным для поддержания недифференцированного состояния мышиных ESCs. Интересно, что LIF является единственным, способным поддержанию ESCs в присутствии сыворотки, это указывает на необходимость дополнительных факторов. Продуцируемый или питающим слоем из MEFs или клеточной линией (напр., STO-SNL клеточной линией) или как рекомбинантный белок человека, LIF осуществляет свой эффект путем связывания LIF receptor (LIFR)-gp130 гетеродимерного рецептора на клеточной мембране и путем активации signal transducer and activator of transcription-3 (STAT3; FIG. 2). Идентифицировано 6 ключевых STATs (STAT1-6) и - за исключением STAT4, который ограничен миэлоидными клетками и тестисами - STATs экспрессируются повсеместно
19.
In vivo исследованиях выявляются разные сценарии, в которых LIF каскад не нужен для пре-гаструляционного развития мышей (FIG. 3). Хотя LIF необходим
in vitro, чтобы продуцировать и сохранять плюрипотентные ESCs, эмбрионы мышей
in vivo, которые лишены LIF, м. развиваться до стадии следующей за возникновением ESC. Эти контрастирующие находки указывают на то, что м. участвовать альтернативные пути в поддержании плюрипотентности
in vivo и in vitro. Напротив, популяция плюрипотентных клеток из бластоциста является преходящей в нормальных условиях, так что разрушение цитокинового пути
in vivo могут не проявлять своего вредного эффекта. Подтверждением этого являются эксперименты, которые бросают вызов бластоцисту с необычными условиями, известными как 'DIAPAUSE' (при которых развитие замедляется, имплантация задерживается и эмбрион д. сохранять свою популяцию плюрипотентных клеток основателей способными имплантироваться и позднее формировать плод). После окончания диапаузы
Lif-/- бластоцисты оказываются неспособными восстанавливать развитие
20.
| |
|
| Box 1 | Pluripotency networks might involve nonlinear interactions We often assume that understanding cellular decisions requires the identification of
novel molecules and phenomena. Although unique proteins are necessary for pluripotency in embryonic stem cells (ESCs) (for example, octamer-binding transcription factor-4 (OCT4) and Nanog) these proteins seem to be the downstream effectors of upstream signalling events. At the level of microenvironmental sensing and signal processing, unique fate-specific exogenous factors and intracellular signalling proteins seem to be rare. Several lines of evidence indicate that molecular signals might exert their developmental control through the magnitude and/or duration of their stimulation of membrane-spanning proteins. That is, through nonqualitative and nonlinear interactions whereby known, rather than new, molecules exert effects that are dependent on the dose and mode of their exposure to stimulating signals107-109.
|
В присутствии LIF в культуральной среде, STAT3 соединяется с остатками фосфотирозина активированных LIFR-gp130 гетеродимерных рецепторов21 и сам подвергается фосфорилированию и димеризации. Фосфорилированные STAT3 димеры затем транслоцируются в ядро, где они функционируют как транскрипционные факторы. Условно активная форма STAT3, которая индуцируется с помощью tamoxifen (STAT3-oestrogen-receptor (ER) слитого белка)22, м.б. использована для подержания плюрипотентного фенотипа, если LIF
удаляется из культуральной среды. Однако, ESC клеточные линии, которые экспрессируют STAT3-ER на низком уровне, не полностью поддерживают недифференцированное состояние с помощью tamoxifen.
Итак, минимальная доза STAT3, по-видимому, необходима для умножения и плюрипотентности ESC.
Помимо пути, ведущего к транслокации в ядро STAT3, внутриклеточные домены гетеродимеров LIFR-gp130 могут, после связывания LIF, рекрутировать не-рецепторную тирозин киназу Janus (JAK) и antiphosphotyrosine immunoreactive kinase (TIK) и активировать др. пути (FIG.2). Обработка ESCs с помощью LIF также индуцирует фосфорилирование extracellular signal-regulated protein kinases, ERK1 и ERK2 (REF. 23), и увеличивает активность mitogen-activated protein kinase (MAPK)24. Это происходит благодаря активации образующего связи (bridging) фактора между цитокинами и MAPKs - широко экспрессируемыми tyrosine phosphatase
SRC-HOMOLOGY-2 (SH2)-DOMAIN-содержащим белком tyrosine
phosphatase-2 (SHP2; REF. 25).
Несмотря на способность передачи сигналов LIF-STAT3 для поддержания само-обновления мышиных ESCs, это не предупреждает дифференцировку человеческих ESCs26 (TABLE 1). В частности,
даже с человеческим LIF в культуральной среде, активность гена OCT4 снижается и человеческие ESCs дифференцируются27. Неясно, оказывают ли LIF др. эффекты на ESCs людей. Напр., он м. не быть достаточно эффективным для поддержания недифференцированного роста или он м. активно ингибироваться28. Хотя LIF-(LIFR-gp130)-STAT3 сигнальный путь не является универсальным (потребность людей в этом пути не эквивалентна потребности у мышей) и он не является обязательным для плюрипотентности мышиных ESC (форсированная экспрессия Pem м. компенсировать отсутствие LIF; см. ниже), он представляет собой четкий пример того, как активация цитокинового пути м.б. использована для изменения клеточной судьбы и потенциала. Безусловно, это указывает на то, что возможно достичь фенотипических изменений без генетический манипуляций с важными pluripotency-associated генами.
BMP4. Наши сегодняшние знания bone morphogenetic
protein-4 (BMP4) и родственных факторов имеют многочисленные пробелы и нет определенного мнения о том, как этот фактор укладывается в общую молекулярную схему плюрипотентности. Подобно LIF, BMP4 рассматривается ключевым анти-нейрогенным фактором в эмбрионе и его эффект на культивируемые ESCs напоминает LIF, тем, что ESCs дифференцируются в нейроны в его отсутствие
29. Более того, мышиные эмбрионы без BMP4 развиваются до стадии, на которой возникают ESCs
30. В присутствии LIF, BMP4 вносит вклад в LIF каскад,
усиливая само-обновление и плюрипотентность ESCs путем активации гена, кодирующего транскрипционный фактор SMAD4 (similar to mothers against decapentaplegic homologue-4), который, в свою очередь, активирует членов
Id (inhibitor of differentiation) семейства генов
29 (FIG. 2). Это взаимодействие облегчается в присутствии сыворотки. Напротив, в отсутствие LIF, BMP4 противодействует LIF каскаду, взаимодействуя с разными SMAD транскрипционными факторами (напр., SMAD1, 5 и 8), которые обладают ингибирующим эффектом на
Id гены, Результаты также указывают на то, что BMP4 м. регулировать клеточную судьбы по отношению к клеточной плотности
31, активируя отдельные цитоплазматические сигналы. В заключение, BMP4, по-видимому, является производным сыворотки фактором в культурах ESC, которые содержат сыворотку + LIF
29. А баланс между LIF и BMP4, и то, как этот баланс сигналов, воспринимается на клеточной поверхности, в целом ответственен за поддержание
| |
|
| Box 2 | Before the ESC era
Investigators had tried to manipulate mouse-embryo development using native cells110,111 or embryonal carcinoma cells (ECCs) of explanted TERATOMA112-116, which could integrate into the embryo after injection into the blastocyst cavity. After being placed in such a microenvironment, ECCs can lose their malignant phenotype and enter normal development113,117 (although tumours might recur in the adults116). Some ECC cell lines have been maintained for eight years as ascites that were transplanted every two to three weeks into a new host114, and which retained the ability to participate in normal mouse development after blastocyst injection. But other ECC cell lines lost the ability to differentiate118, or differentiated only under specialized conditions119, and accumulated chromosomal aberrations116. More recently, F9 and P19 ECCs were described that had subtle genetic changes compared to mouse euploid totipotent teratocarcinoma (METT)-1 cells120, which were not previously detected due to the resolution of the
assays121. Results would be easier to obtain with a robust, pluripotent cell line that could be stably maintained in vitro
for a long time. This was accomplished independently by three groups in 1981 (REFS 2,3) and in 1984 (REF. 122) with the
'creation' of a new type of stem cell, embryonic stem cells (ESCs), in the culture dish. |
недифференцированного состояния мышиных ESCs. Очевидно, что BMP белки, как было установлено, являются мишенями др. лигандного каскада, который инициируется соединением WNT со свои рецептором (см. ниже)
32.
WNT proteins. WNT белки являются секретируемыми glycoproteins, которые выполняют многообразные роли в дифференцировке тканей и органогенезе33. In vivo, Wnt5a и Wnt11 экспрессируются у мышиных эмбрионов, которые осуществляют переход от морулы к бластоцисту, но они экспрессируются очень слобо или не экспрессируются совсем у эмбрионов, которые осуществляют это in vitro. Это согласуется с повышенной смертностью эмбрионов, культивируемых in vitro. Усиление активности Wnt11 скоординировано по времени с быстрым ростом материнского эстрадиола на ст.t E4 - время имплантации34.
Канонический WNT путь активируется в результате связывания WNT белка с рецептором Frizzled на клеточной мембране (FIG. 2). Активация пути ведет к ингибированию glycogen-synthase kinase-3 (GSK3), последующему накоплению в ядре β-catenin и экспрессии генов мишеней. Sato и др. использовали новый, специфический обратимый ингибитор GSK3, 6-bromoindirubin-3'-oxime (BIO), чтобы показать, что активация канонического WNT пути поддерживает недифференцированнй фенотип ESCs мышей и людей и поддерживает экспрессию специфичных для плюрипотентного состояния транскрипционных факторов OCT4, REX1 (известного также как zinc-finger protein-42; ZFP42) и Nanog27 в отсутствие добавления LIF. Генетические манипуляции с передачей сигналов WNT в ESCs - или путем инактивации комплекса adenomatous polyposis coli (APC) (мультибелкового комплекса опухолевого супрессора, который обеспечивает передачу сигналов от WNT рецепторов на поверхности клеток к β-catenin в ядре) или путем внесения доминантно-активной формы β-catenin - вызывали подавление нейральной дифференцировки in vitro32. Это происходило также после активации нижестоящих мишеней для передачи сигналов WNT, таких как cyclin-D1 (REF. 35), MYC36 и BMP белков32. Нейральная дифференцировка может быть частично восстановлена добавлением BMP4 антагониста Noggin32.
Emerging transcriptional regulators of ESCs. Недавние исследования подчеркнули один сигнальный путь, с помощью которого сигналы от пищевых веществ и внешней среды - т.е., аминокислот37,38 и inositols39 - регулируют выживаемость ранних мышиных эмбрионов и ESCs. The mammalian target of rapamycin (mTOR) является серин/треониновой киназой, которая первоначально была идентифицирована как мишень для rapamycin у Saccharomyces cerevisiae, а затем была обнаружена высоко законсервированной у эукариот40,41. Этот сигнальный путь безусловно регулирует взаимодействие между mTOR и двумя нижестоящими субстратами, eukaryotic translation-initiation factor 4E (eIF4E)-binding protein-1 и ribosomal-protein-S6 kinase42.
Inositols участвуют также в др. пути, который нацелен на ген phosphatase and tensin (Pten), делетированный на хромосоме 10.
Инактивация PTEN увеличивает пролиферацию мышиных примордиальных зародышевых клеток и усиливает возникновение EGCs43. В ESCs, это приводит к повышению вступления в S фазу и повышению клеточной жизнеспособности44. PTEN является phosphatase, которая имеет широкий спектр функций45 а её lipid-phosphatase активность связана с супрессией опухолей. Основным субстратом для PTEN является phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). PTEN, следовательно, завершает передачу сигналов phosphatidylinositol
3-kinase (PI3K) путем дефосфорилирования PtdIns(3,4,5)P3 вторичного мессенджера43. Серин/треониновая киназа AKT является нижестоящим эффектором PI3K, которая фосфорилирует mTOR in vitro, указывая тем самым на прямую связь между mTOR и PI3K-AKT путем, который негативно регулируется с помощью PTEN46. С помощью подхода двойных генов, при котором Pten и Akt1 были мутантными, было продемонстрировано, что усиление активности AKT1 существенно для туморогенного фенотипа, наблюдаемого в Pten-нулевых ESCs44.
Выявляется также и функция microRNAs (miRNAs) в транскрипционном регуляторном циркуите (circuitry) ESCs. Было установлено, что miRNAs играют важную роль в регуляции генов, т.к. более трети генов, кодирующих белки у млекопитающих, являются законсервированными мишенями для miRNA47,48. Более того, ESCs, лишенные кухни (machinery), которая осуществляет процессинг miRNA транскриптов, не способны дифференцироваться49. Однако, эта новая область д. обсуждаться в более специфических работах, чем этот обзор.
Nuclear (transcription factor) pathways
Сигнальные пути в конечном счете ведут в ядро, а в случае ESCs, приводят в результате к индукции транскрипции или репрессии генов, которые ответственны за поддержание плюрипотентности стволовых клеток. Постоянно возникают вопросы, связанные с существованием др., еще не идентифицированных, 'stemness' генов (т.е. генов, которые наделяют свойствами стволовых клеток клетки) и как их находить50,51. Oct4 распознан в качества одного из таких генов задолго до современных методов анализа экспрессии генов (BOX 3). Хотя статус stemness приложим к таким генам, но ни Oct4, ни Nanog не могут рассматриваться как 'master genes' плюрипотентности - по удалению LIF Oct4 не может предупредить дифференцировку ESCs самостоятельно, а Nanog не эффективен без Oct4 (BOX 4).
The transcription factor OCT4. OCT4 является POU-DOMAIN
транскрипционным фактором, который экспрессируется всеми плюрипотентными клетками во время эмбриогенеза мышей и обильно экспрессируется недифференцированными мышиными ESCs и ECC клеточными линиями52-55, также как и EGC клеточными линиями56. Однако, эксперименты показывают, что экспрессия Oct4 в целом слабее в germline stem cells (GSCs)57. OCT4, как было установлено, является маркером плюрипотентных ESCs человека - анализ микромассивов и quantitative reverse-transcription (Q-RT)-PCR aнализ показали, что он подавляется в дифференцированно по сравнению с недифференцированным состоянием стволовых клеток16. Это наблюдение следует использовать с осторожностью из-за наблюдения, что нейрональная дифференцировка происходит при сохранении экспрессии Oct4 (REF. 58), что ставит под сомнение общепринятое мнение, что подавление Oct4 необходимо для дифференциации соматических клонов. OCT4-дефицитные эмбрионы мышей развиваются только до ст., которая выглядит как бластоцист, и хотя клетки проникают внутрь, эти бластоцисты в действительности состоят из клеток трофэктодермы (FIG. 3). Т.к. эти структуры лишены подлинной ICM, то они не могут быть использованы для продукции ESC клеточных линий59. OCT4 , следовательно, может рассматриваться как участвующий в предупреждении дифференцировки трофэктодермы и вообще соматических клеток из ICM, а также как являющийся критическим для поддержания плюрипотентного состояния во время эмбрионального развития. В мышиных ESCs манипуляции с экспрессией Oct4 посредством индуцибельных или репрессируемых трансгенов Oct4 показали, что относительные количества OCT4 белка безусловно предопределяют судьбы клеток60. Однако, гены мишени, которые в действительности ответственны за выполнение решений OCT4, известны только частично61,62. Сходным образом, потенциальные взаимодействия OCT4 с др. (ко)факторами - за исключением SOX2 (SRY related
high-mobility group (HMG)-box protein-2; FIG. 2) - остаются неясными.
The transcription factor SOX2. SOX2 является членом семейства HMG-доменовых ДНК-связывающих белков, которые участвуют в регуляции транскрипции и архитектуры хроматина
63. SOX2 формирует четвертичный комплекс или с OCT4 или повсеместным OCT1 белком на энхансерных ДНК последовательностях
Fgf4 (REF. 64). Это позволяет SOX2 участвовать в регуляции ICM и у её потомков или в производных клетках. С этой ролью согласуется то, что
Sox2 экспрессируется в ESCs, но он экспрессируется также в нервных стволовых клетках. Когда был использован генный таргетинг для инактивации
Sox2, то примитивная эктодерма оказывалась дефектной, но она могла быть нормализована (хотя только выживала дольше) с помощью инъекций ESCs дикого типа в
Sox2-/- бластоцисты
65. С помощью проверки фенотипических последствий у мутантных
Sox2 эмбрионов и у химер, была выявлена клеточно автономная потребность в гене как в примитивной, так и вне-эмбриональной эктодерме (MULTIPOTENT предшественниках всех эмбриональных и TROPHOBLAST типов клеток, соотв.) Сходные роли были
| |
|
| Box 3 | Transcription factor OCT4: 'master' of pluripotency?
The protein encoded by Oct4, also known as Oct3 and Pou5f1 was first described independently by Scholer, Rosner and Okamoto53-55. The mouse gene - located at the t-locus on chromosome 17 - is specifically expressed in thegermline and encodes a homeodomain-containing protein that was called 'OCT' because of its ability to bind to and activate transcription through the 'octamer' DNA sequence 5'-ATGCAAAT-3'. Members of this transcriptionfactor family share a conserved DNA-binding domain, the POU domain, which was originally identified in the transcription factors PIT1, OCT1, OCT2 and UNC86. The POU domain consists of two structurally independent subdomains - the POU-specific domain (POUS) and the homeodomain (POUH), which are connected by a flexible
linker. Interestingly, OCT4 binding of octamer-containing DNA sequences can either repress or activate transcription depending on the flanking sequences123, which is consistent with its critical role in maintaining
pluripotency and controlling differentiation.
Methods of SUPPRESSION.SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION have been used to identify several putative downstream genes of Oct4 (REFS 61,62). These include the gene encoding the extracellular matrix (ECM) protein osteopontin (Spp1)124, which is expressed in the primitive endoderm; heart and neural crest derivatives expressed-1 (Hand1), which is
expressed in early trophectoderm60,64; fibrobast-growth factor-4 (Fgf4) which is expressed in the ICM125; F-box
protein-15 (Fbx15), which is expressed in embryonic stem cells and later in testis88; and Rex1, which is also known as
zinc-finger protein-42 (Zfp42; REF. 79). It is becoming more and more clear that this crucial transcription factor is
not sufficient on its own, but that the presence of interacting cofactors determines whether the target genes are activated or repressed by OCT4. For instance, a possible viral partner that is required for remote transcriptionalactivation by OCT4 is the adenoviral protein E1A126,127. SRY-related high-mobility group (HMG)-box protein-2
(SOX2) stimulates undifferentiated-embryonic-cell transcription factor-1 (Utf1) and Fgf4 gene expression64,128 and
represses OCT4-mediated activation of Spp1 (REF. 124) by acting cooperatively with OCT4.
|
выявлены и для др. генов, которые экспрессируются в популяции клеток-основательниц эмбрионов -
Foxd3 (ген транскрипционного фактора, который также известен как
Genesis и принадлежит к forkhead семейству транскрипционных факторов с winged-helix ДНК-связывающей структурой). Заметная потеря клеток примитивной эктодермы происходит в
Foxd3-/- бластоцистах, а
Foxd3-/- ESCs не могут возникнуть, хотя экспрессия
Oct4, Sox2 и Fgf4, по-видимому, нормальна в
Foxd3-/- ICM
66. Эти данные подтверждают прямое взаимодействие между OCT4 и FOXD3, точно также как оно очевидно между OCT4 и SOX2 (REF. 67), но это нуждается в дальнейших подтверждениях. Эти фенотипы могут и не отражать первичные функции этих генов, т.к. более ранние роли SOX2 и FOXD3 в ICM могут быть замаскированы сохранением материнских белков. Всё это показывает, что материнские компоненты могут принимать участие в установлении ранних решений клеточных судеб и что комбинационный код, нуждающийся в SOX2 и OCT4 (FIG. 2), специфицирует первые три клеточных клона сразу после имплантации.
The transcription factor Nanog. Исследования по поддержанию плюрипотентности привели к идентификации нового гена, кодирующего HOMEODOMAIN-содержащий транскрипционный фактор, который отвечает за LIF-независимую способность обновления и плюрипотентности мышиных ESCs. Этот ген впервые был описан Wang и др., как ENK68 (early embryo-specific NK, где NK представляет NK-2, который является синонимом гена
Drosophila melanogaster ventral nervous system defective) благодаря его гомологии с членами NK семейства генов
69. Присутствие гомеодомена указывает на то, что ENK функционирует как регулятор транскрипции. Оригинальное название изменилось после независимого клонирования в двух лаб. и последующего функционального анлиза. Он стал называться
Tir nan Og или Tir Na Nog, по мифологической стране Кельтов 'вечной молодости'
70,71 (BOX 4).
Nanog мРНК присутствует в примордиальных зародышевых и EGCs, и выявлена также с помощью
in situ рибозондовой гибридизации в генитальном гребне
70, и она может быть обнаружена с помощью RT-PCR во взрослых тканях
72. Белок Nanog не найден в
Stella-позитивных примордиальных зародышевых клетках мышей
73, несмотря на то, что Stella сам по себе (который также известен как PGC7 или DPPA3) рассматривается как маркер плюрипотентности
74. Nanog мРНК не выявляется на более поздних стадиях - ни в зрелых овариях, ни в тестисах
71 ни в GSC клеточных линиях, происходящих из тестисов новорожденных
57. Это указывает на то, что функция Nanog в зародышевых клетках прогрессивно уменьшается по мере из созревания и что очень немногие молекулы, которые выявляются с помощью высоко чувствительных методов на поздних стадиях, несущественны, если вообще выполняют какую-либо роль. Недифференцированные дикого типа ESCs обычно экспрессируют Nanog. Однкао, физиологические уровни Nanog в ESCs не предупреждают их дифференцировку после удаления LIF. Так при физиологических условиях, Nanog , по-видимому, является одним из нескольких факторов, которые экспрессируются в плюрипотентных клетках и подавляются в начали дифференцировки. Хотя expressed sequence tags (ESTS) NANOG, как было установлено, появляются более часто в недифференцированных, чем в дифференцированных ESCs человека, но NANOG не входит в группу из 532 генов. которые были идентифицированы, как специфичные для ESCs людей
16.
Nanog-/- мышиные ESCs дифференцируются медленно во клоны вне-эмбриональной энтодермы, что согласуется с отсутствием примитивной эктодермы у
Nanog-/- эмбрионов, которые были проанализированы на ст. E5.5
in vivo71 (FIG. 3). Итак, экспрессия
Nanog ответственна за поддержание примитивной эктодемы у эмбрионов. В отличие от ESCs дикого типа и у тех, у которых форсирована экспрессия
Oct4, мышиные ESCs, которые избыточно экспрессируют
Nanog резистентны, но не полностью рефрактерны к спонтанной дифференцировке, возникающей после удаления LIF или после химической индукции (напр., после
| |
|
| Box 4 | Discovery of the transcription factor Nanog: more than one 'master'?
After the initial report of Wang and colleagues68 the role of ENK (early embryo-specific NK, where NK represents NK-2,
which is a synonym of the Drosophila melanogaster gene ventral nervous system defective) remained unclear. Chambers
and colleagues70 took advantage of leukaemia inhibitory factor (LIF) receptor (LIFR)-deficient embryonic stem cells
(ESCs). Rare ESCs that could survive and form colonies on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells without binding LIF were expanded in culture, and cDNA libraries were constructed from the ESC-MEF co-cultures. The inserts from the libraries were subcloned into episomal-plasmid vectors that were based on the replicative function of the
polyoma virus. The vectors were used to transfect ESCs that were expressing the polyoma large T antigen, and these cells
were then selected for growth in the absence of LIF. This led to the isolation of surviving, LIF-independent cells, which
were found to express Nanog that was not integrated in the nucleus. Using a different strategy, Mitsui and colleagues71
searched for genes that were enriched in undifferentiated ESCs by performing digital (in silico) differential display of
expressed sequence tag (EST) libraries in undifferentiated ESCs versus somatic tissues, as well as in undifferentiated
versus differentiated ESCs. In the Nanog overexpression experiments performed by Chambers and colleagues, a Nanog transgene was used and loxP sites flanked this transgene. This elegant trick allowed the Nanog transgene to be removed by Cre/loxP RECOMBINATION. As the removal of the Nanog transgene restored a dependence on LIF for pluripotency, it also
showed that a secondary mutation that might have been caused accidentally by previous genetic manipulations (Cre/loxP) was not responsible for the effect caused by the Nanog overexpression. The overexpression of Nanog also renders ESCs independent of bone morphogenic protein-4 (BMP4) (which is usually provided together with LIF in the absence of
serum). In contrast to wild-type ESCs, which markedly downregulate the inhibitors of differentiation (Id) genes in
serum-free, BMP4-free and LIF-free culture conditions, ESCs that overexpress Nanog contain reduced but appreciable
(Id1) or even increased (Id2 and Id3) mRNA levels of Id genes29.
|
обработки 3-methoxybenzamide или all-trans ретиноевой кислоты). Персистенция Nanog, следовательно, скорее задерживает, чем блокирует дифференцировку ESCs; т.е. порог дифференцировки скорее увеличивается, чем устраняется. Напротив, избыточная экспрессия
Nanog дает в результате лабильную плюрипотентность, причем спонтанная дифференцировки наиболее вероятно происходит после длительного времени, проведенного в культуре ('passages')
73. Итак, количество Nanog на клетку является критическим для стабильного поддержания в недифференцированном состоянии даже в присутствии LIF. Как и в случае с OCT4, было предположено, что Nanog может регулировать дифференцировку посредством репрессии транскрипции генов, которые способствуют дифференцировке (напр., энтодермальный GATA-binding protein-6,
Gata6), предположение, которое базируется на присутствии Nanog-связывающих сайтов в контролирующих регионах этих генов, а также такового в
Rex1/Zfp42 (REF. 71). Мало известно о регуляции гена
Nanog, за исключением того, что активатор транскрипции и опухолевый супрессор p53 соединяется с промотором
Nanog, делая тем самым возможной p53-зависимую супрессию экспрессии
Nanog75. Потеря p53 приводит к 100-кратному увеличению восприимчивости к тестикулярной тератоме
76. Т.к. формирование тератомы может быть обусловлено дерепрессией генов, таких как
Nanog. В согласии с этим GSCs
in vitro дают мультипотентные GSCs, если выделяются из p53-дефицитных, но не из мышей дикого типа
57. Сигналы или агенты, которые индуцируют повреждения ДНК, также подавляют Nanog и это поддерживает генетическую стабильность в ESCs
путем индукции дифференцировки ESCs в др. типы клеток. Интересно, что p53-связывающий элемент был также обнаружен непосредственно выше PTEN
77 (см. выше).
STAT3, OCT4, SOX2 and Nanog are not alone. В отсутствие LIF, форсированная экспрессия Pem78 - ещё одного гена помимо Oct4 и Nanog, который продуцирует гомеодомен-содержащий белок - блокирует дифференцировку ESCs как in vitro, так и in vivo (избыточная экспрессия Nanog также блокирует дифференцировку в отсутствие LIF). Блокирование дифференцировки ESC в результате форсированной экспрессии Pem обусловливается или доменовым регионом PEM - состоящем из гомеодомене и не-гомеодомена - хотя последний, по-видимому, более ответственен. ESCs, которые постоянно экспрессируют Pem не способны формировать опухоли после подкожных инъекций, это указывает на роль PEM в регуляции перехода между недифференцированными и дифференцированными клетками у ранних эмбрионов мышей. Из-за скоротечности существования клеточной популяции ICM или примитивной эктодермы, ранняя роль PEM in vivo менее очевидна, чем его поздняя роль на пост-имплантационных стадиях. После имплантации, экспрессия PEM обнаруживается в ectoplacental cone, PRIMITIVE ENDODERM (известном также как гипобласт) париетальной и висцеральной энтодерме (но не в примитивной эктодерме), указывая тем самым, что PEM выполняет вне-эмбриональные функции.
Combinatorial signals for pluripotency
В мышиных ESCs, активация LIFR-gp130 пути с помощью цитокинов ECM, и поддержание экспрессии Oct4 и Nanog являются ключевыми элементами генетической программы, которая обеспечивает 'stemness'. Как указывалось выше, др. пути (такие как те, что используют WNT, BMP4 и inositol) и факторы (такие как SOX2 и mTOR) являются наложенными др. на др. ключевыми элементами (FIG. 2), что увеличивает комбинаторную сложность. Обсудив элементы программы отдельно, теперь необходимо описать комбинаторную модель их функции.
Combinatorial signalling of Nanog and OCT4. Усиление экспрессии Oct4 заставляет мышиные ESCs дифференцироваться во вне-эмбриональную энтодерму и мезодерму, тогда как усиление экспрессии Nanog усиливает состояние. С др. стороны, пониженная экспрессия Oct4 заставляет мышиные ESCs дифференцироваться трофэктодерму, это выявлется по клеточной морфологии и экспрессии маркерных генов (напр., caudal-type homeobox transcription factor-2, Cdx2). Однако, Nanog-дефицитные эмбрионы не формируют примитивную эктодерму и Nanog-/- клетки дифференцируются в висцеральную и париетальную энтодерму (GATA6- и GATA4-позитивные клетки соотв.). Эти наблюдения указывают на то, что два гена оперируют независимо др. от др., но их функции скоординированы. Взаимоотношение между OCT4 и Nanog изучены экспериментально.
Избыточная экспрессия Nanog в клетках, которые лишены как эндогенного аллеля Oct4, так и в клетках, которые были размножены с помощью чувствительного к doxycycline Oct4 трансгена70, не может ревертировать дифференцировку, которая возникла в присутствии doxycycline - т.е. в отсутствие OCT4. Следовательно, экспрессия Oct4 необходима для Nanog-обеспечиваемого само-обновления в ESCs. Однако, экспрессия Nanog сохраняется в ICM клетках бластоцистов от
Oct4-дефицитных эмбрионов, хотя обладают ли они какой-либо остаточной плюрипотентностью, сомнительно. Это указывает на то, что др. обеспечивающие плюрипотентность клеточно-специфические факторы могут вносить вклад в альтернативные транскрипционные регуляторные механизмы Nanog. Было установлено, что OCT1 и OCT6 экспрессируются в плюрипотентных эмбриональных клетках79,80 и обладают способностью соединяться с октамерными элементами в Fgf4, Sox2, undifferentiated embryonic-cell transcription factor-1 (Utf1), и промоторной областью Rex181,82.
В заключение, первичная функция OCT4 и Nanog может заключаться в репрессии дифференциации эмбриональных клеток, а комбинационный сигнал от обоих белков ведет к обновлению и плюрипотентности примитивной эктодермы. Исходя из предположения, что OCT4 и Nanog последовательно супрессируют дифференцировку ICM во вне-эмбриональные клоны - сначала в трофэктодерму (OCT4), затем в примитивную энтодерму (Nanog) - т.к. их уровни снижаются в примитивной эктодерме, то дальнейший онтогенетический контроль последующей дифференцировки примитивной эктодермы может обеспечиваться др. генами, такими как Sox2 (REF. 65) и Foxd3 (REF. 66).
Nanog and STAT3 function in parallel. В клетках с избыточной экспрессией Nanog, уровни, кинетика и распределение фосфорилирования STAT3 не отличаются в сравнении в ESCs дикого типа. Сходным образом, уровни Nanog не затрагиваются в клетках с нарушением передачи сигналов STAT370 - напр., если gp130 ко-рецептор мутанте и лишен способности рекрутировать STAT3, или если gp130 гиперактивен после индукции гена мишени suppressor of cytokine signalling-3 (Socs3). Сходным образом, ингибирование JAK, вышестоящего активатора STAT3, не влияет на способность Nanog обеспечивать обновление ESC. Итак, Nanog не активирует STAT3, a STAT3 не индуцирует экспрессии Nanog. Однако активация STAT3 посредством LIFR усиливает пролиферацию клеток с избыточной экспрессией Nanog и и изменяет их морфологию - происходит изменение от случайного распределения в монослой с плотной упаковкой и слипчивостью. Следовательно, эти сигналы могут дополнять один др., но не являются идентичными. Сходным образом ингибирование ERK усиливает способность LIF обеспечивать само-обновление ESCs. Однако, ингибирование ERK не меняет эффектов, которые меняют экспрессию Nanog в ESCs. Все эти доказательства, полученные от избыточной экспрессии и ингибирования с участием Nanog, gp130, JAK и
др. молекул, указывают на то, что Nanog и STAT3 скорее всего функционируют параллельно, а не в одном и том же пути, хотя они могут иметь общие мишени.
No direct interaction between OCT4 and STAT3.
Экспрессия доминантно-негативной формы Stat3 индуцирует дифференцировку ESCs21. Более того, в отсутствие LIF, экспрессия условно активного STAT3 слитого белка STAT3-ER предупреждает дифференцировку и способствует само-обновлению ESC после обработки tamoxifen22. Конституитивная экспрессия др. генов, таких как Nanog и Pem, также предупреждает LIF-удалением-индуцируемую дифференцировку ESCs. Напротив, усиленное поддержание экспрессии Oct4 не м. предупредить дифференцировку ESCs, которая индуцируется с помощью или удаления LIF или экспрессии доминантно-негативного STAT3 (REF. 60). Эти находки подразумевают отсутствие взаимодействия между OCT4 и STAT3 и появление взаимодействия между Nanog и STAT3, природу которого еще предстоит установить.
WNT and OCT4. OCT4 выполняет критическую функцию и оказывает несколько известных эффектов на развитие эмбрионов. Напр., экспрессия Oct4, как известно, увеличивается у germ-cell nuclear factor (Gcnf )-дефицитных эмбрионов мышей (это согласуется с дерепрессией гена Oct4)83. Несмотря на это, однако, OCT4 является генетическим 'orphan' из-за отсутствия ассоциации с любым сигнальным путем или любым др. геном, которые могут функционировать выше него. Однако,
путь передачи сигналов WNT может обеспечивать некоторые сигналы как для внеклеточных, так и на поверхности клеток событий, оказывающих влияние на Oct4. Wnt3-дефицитные эмбрионы экспрессируют высокие уровни OCT4 (REF. 84). Весь Wnt3-дефицитный эмбрион остается двухслойным во время гаструляции и продолжает экспрессировать Oct4 повсюду, это указывает на то что потеря передачи сигналов от WNT рецепторов на клеточной поверхности ведет к пертурбациям не дифференцированного состояния. APC, который формирует часть мультибелкового опухолевого супрессора, который ассоциирован с colorectal раком, обеспечивает передачу сигналов от WNT рецептора на клеточной поверхности к β-catenin в ядре85. Аллели, которые представлены всё увеличивающимися по тяжести мутациями в Apc - что оценивается повышенными уровнями активного β-catenin - все больше и больше затрагивают онтогенетический потенциал ESCs и ограничивают потенциал дифференцировки ESCs in vivo и in vitro86. Предложена пороговая модель, согласно которой аллели Apc с разной силой (обусловленной разными мутациями) д. давть в результате разные уровни β-catenin в ядре, что затем приводит к фенотипическим изменениям32. Эта пороговая модель напоминает ту, что для OCT4 для дифференцировки ESC. Итак, эффект мутантных Wnt3 на уровни OCT4 в мышиных ESCs, и участие и WNT и OCT4 в порогами опосредованных реакциях, указывают на интригующую возможность, что каскад передачи сигналов WNT и роль OCT4 в качестве детерминанта клеточной судьбы непосредственно связаны.
Oct4 and Sox2. Белки, кодируемые этими генами, действуют кооперативно на промоторы. Как обсуждалось выше, octamer и sox элементы, как ндавно было установлено, необходимы для усиления транскрипции Nanog у мыши и человека87. Соседние octamer и sox элементы были также идентифицированы как цис-регуляторные элементы в Fgf4 (REF. 64), Sox2 (REF. 82), Utf1 (REF. 81) и Fbx15 (REF. 88) генах, которые экспрессируются в ECC и ESCs и во время эмбриогенеза.
Pluripotency pathways in other systems
На базе данных, представленных выше, интересно бы определить, може ли плюрипотентность устанавливаться и размножаться in vitro с помощью методов, иных, чем возникновение ESCs от зиготических эмбрионов. Современное отсутствие контроля над судьбами эмбриональных стволовых клеток приводит к интересной параллели отсутствия дефинитивного контроля над ядрами дифференцированных клеток, которые приобретают повторно плюрипотентность после переноса в ооциты (cloning). Недавние успехи в получении линий плюрипотентных стволовых клеток человека14,89 и успехи в клонировании эмбрионов млекопитающих с помощью NUCLEAR TRANSFER, создают привлекательные возможности для восстановления функции ткани с помощью клеточных трансплантаций с использованием SCNT - часто обозначаемым как терапевтическое клонирование. CLONAL бластоцисты могут быть использованы для получения почти безупречно подходящих ESC клеточных линий, которые может будут заставить дифференцироваться in vitro и обеспечить пациента клетками для аутологичных трансплантаций. Терапевтическое клонирование не является неразумным предположение, т.к. было продемонстрирована его осуществимость на мышах90,91, а недавно и на людях89. Прежде чем эта процедура будет разрешена для клинического применения необходимо установить, как заканчивается в действительности процесс ре-программирования. Контроль экспрессии Oct4 и Nanog является важным для успешного клонирования, при котором UNIPOTENT клеточное ядро становится плюрипотентным, перенесенное в ооплазму, установлено, что ряд онтогенетических генов, ассоциированных с плюрипотентностью, экспрессируется92,93. Потребность в Oct4 и Nanog для поддержания плюрипотентности указывает на то, что аллели, производные соматических клеток, могут реактивироваться в результате ядерного ре-программирования после SCNT в ооциты. Показано, что реактивация молчащих соматических аллелей Oct4 и Nanog происходит только частично в мышиных клонах73,92. Интересно, что частота реактивации Nanog превосходит таковую Oct4 (REF. 73). Напротив, инактивация Х хромосомы, по-видимому, происходит также как во время нормального развития94. Однако, даже в случае Х инактивации, как было показано, когда она происходит собственно в производных соматических клеток клонируемых эмбрионах мышей, то незначительные аномалии в экспрессии и METHYLATION некоторых импринтируемых генов происходят в мышиных клонах, которые происходят из соматических клеток95 и ESCs96. Однако, жизнеспособное клональное 'offspring' может доживать до взрослого состояния несмотря на распространенные нарушения в экспрессии этих генов.
Внутри клональных эмбрионов ре-программирование соседних бластомеров, по-видимому, происходит независимо др. от др. и на ст. бластоциста OCT4 экспрессируется соматическими клетками, но не др. в ICM - феномен известный как 'mosaicism'. Хотя частичное ре-программирование одного ключевого гена, ассоциирующее с частичным ре-программированием др., и т.д., показывает, что имеется субнабор клонов, в которых имеются, по крайней мере, некоторые клетки, которые ре-программированы по всем генам. ESC-производная, дифференцировочная и трансплантационная терапия после SCNT не нужна для полноценного эмбрионального развития. Она необходима для формирования бластоцистов, возникновения ESCs из них, и затем дифференцировки ESCs в специфические типы клеток. Итак, частичное превращение однопотентной программы в плюрипотентную может быть достаточным для терапевтического клонирования.
Мы задавались вопросом, может ли плюрипотентность вызвана и умножена in vitro с помощью методов, иных, чем базирующиеся на ESCs из зиготических эмбрионов - и ответ до с помощью SCNT. Сходным образом было бы интересно определить, могут ли методы, иные, чем клонирование с помощью SCNT в ооцитах, достичь подобных результатов. Когда плюрипотентные стволовые клетки используются вместо ооцитов в качестве реципиентов для переносимых ядер, которое осуществляется в результате межклеточного слияния, то гибридные клетки обнаруживают потерю стадио- и ткане-специфических маркеров родительских соматических клеток (gene extinction) и de novo активацию признаков и генов, которые характерны для плюрипотентных клеток. X инактивация, напр., является процессом, который тесно связан с дифференцировкой и происходит в теле самок. Путем демонстрации ре-активации X хромосомы после слияния клеток и и её последующей случайной инактивация во время дифференцировки возможно подтвердить, что плюрипотентные стволовые клетки могут перенастроить метку инактивации правильно97,98. Более того, индуцированные к дифференцировке или in vitro или in vivo, может быть получен широкий спектр дифференцирующихся клеток несмотря на их тетраплоидное состояние. Гибридные клетки могут быть также проверены в отношении их онтогенетического потенциала путем инъекций их в хозяйский бластоцист. Путем генерации жизнеспособных химер возможно получать клеточные гибриды в разных тканях, это указывает на способность этих инъецированных клеток вносить вклад во все клеточные клоны. Имеется заманчивая возможность, что клеточное слияние может естественно происходить in vivo, так что взрослые стволовые клетки одной ткани могут генерировать дифференцированные клетки, которые специфичны для др. ткани путем слияния с местными клетками99-102 и последующей сегрегацией. Однако, клеточное слияние не может обяснить всех появляющихся кажущихся трансдифференцировок103.
Безусловно было бы интересно определить, может ли плюрипотентность быть достигнута и умножена in vitro с помощью методов, иных чем перенос ядер - или в ооциты или др. клетки (слияние) - используя клеточную и регуляторную системы, иные, чем ESCs, и вообще в отсутствие внеклеточных факторов. Напр., мультипотентные взрослые клетки предшественники, MAP-C клетки, которые происходят из стромы взрослого костного мозга, по-видимому, приобретают снова плюрипотентность in vitro в отсутствие компании др. клеток, которые могли бы секретировать плюрипотентные факторы. Однако, это долговременный процесс, а уровень экспрессии клетками MAP-C Oct4 в 1,000-раз меньше, чем в ESCs104.
Итак, очевидно, что плюрипотентность достигается посредством комбинации собственно последовательно расположенных процессов, которые контролируют доступность хроматина, модификации хроматина, активацию и экспрессию специфических генов. Это осложняется потребностью в тонко настроенной регуляции относительных уровней экспрессии. Nanog оказался прославленным как столь же важный, как и OCT4, который в течение многих лет считался единственным транскрипционным фактором, который строго и без сомнения ассоциирован с плюрипотентностью. Однако, OCT4-связывающие сайты недавно были обнаружены в вышестоящей контролирующей области Nanog, что подкрепляет центральную тему этого обзора. Мы подтвердили, что невозможно, чтобы скрининг 'pluripotent' библиотеки кДНК не привел к открытию того, что действительно наделяет плюрипотентностью. Некоторые вопросы, связанные с плюрипотентностью остаются открытыми. Учитывая , что прирожденные регуляторы OCT4 и Nanog существенны, но недостаточны для спецификации плюрипотентного состояния клеток, мы д. открыть гены, лежащие выше и контролирующие экспрессию Oct4 и Nanog. Имеются ли и др. гены, которые обеспечивают плюрипотентность, в частности какие-либо 'master' гены? Манипуляции с такими 'master' генами могли бы послужить инструментом для разрешения этических затруднений, связанных с клонированием человека, т.к. такой ген мог бы быть мишенью для ANT (altered nuclear transfer)105. Этот подход мог бы послужить панацеей для современной регенеративной медицины, хотя нет согласия относительно правомерности этого предположения106.
Note added in proof
Boyer et al.135 картировали транскрипционные факторы OCT4, SOX2 и Nanog в промоторах большой популяции генов, которые предопределяют позитивно или негативно ESCs человека. Авт. показали, что промоторные области ко-оккупируются OCT4, SOX2 и Nanog как в транскрипционно активных генах, которые выполняют роль в предопределении качественных особенностей ESC (недифференцированный фенотип) и в неактивных генах, которые способствуют их развитию, будучи депрессированными (дифференцировка). Совместное присутствие OCT4, SOX2 и Nanog на генных промоторах интерпретируется клетками комбинационным способом посредством ауторегуляторных и петель прямой связи (feed-forward). Это исследование предоставило более исчерпывающую карту основных регуляторных циркуитов плюрипотентности.
Online summary
• Embryo-derived stem cells can be considered archetypal stem cells.
Among them, embryonic stem cells (ESCs) are derived at an earlier
stage of embryo development than others, such as embryonal carcinoma
cells (ECCs) and embryonic germ cells (EGCs). Compared
to adult or fetal stem cells, embryo-derived stem cells are easier to
identify, to isolate and to use as established cell lines.
• The golden feature of ESCs is their pluripotency, as defined as the
ability to give rise to any derivative of the three primary embryonic
germ layers and to germ cells. Pluripotency can be maintained
indefinitely if ESCs are cultured under correct conditions, and
can be demonstrated in mice when ESCs injected into blastocysts
become incorporated in the conceptus and participate in normal
development. Notably, disorganized proliferation and tumour formation
of ESCs might also occur, regarded here as ‘the other side’
of pluripotency.
• ESCs behave normally within a blastocyst but give rise to tumours
when transplanted ectopically, for example, under the skin, it therefore
implies that exogenous cues have a bearing on cell fate. Whether
they do so by priming or by selecting ESC states is not known.
• Most of the extrinsic and intrinsic regulators that are known to
operate in mouse ESCs (for example, LIF and BMP4 extracellular
ligands; OCT4, SOX2 and Nanog transcription factors) have a
dose-dependent effect on pluripotency. Genes that are required to
maintain pluripotency in human ESCs are mostly unknown, with
the exception of OCT4. Combinatorial interactions and nonlinear
responses, which have been described in mice, compound this situation.
• The current lack of definitive control over stem-cell fate finds an
interesting parallel in the lack of definitive control over nuclei of
differentiated cells regaining pluripotency after transfer into oocytes
(cloning).
• An understanding of how pluripotency is secured in ESCs is likely to
indicate ways to reinstate pluripotency in somatic cells. The oocyte is
the common reactor that is used to reinstate pluripotency on somatic
nuclei. However, in the future we might not even need oocytes to
reinstate pluripotency, as has been shown for somatic cells fused
with ESCs and for bone marrow cells that can become multipotent
adult progenitor cells (MAP-C cells) in culture.
• An understanding of the ESC circuitry might reveal how to achieve
phenotypic changes without genetic manipulation of Oct4 and
Nanog and other pluripotency-associated genes.
Online links
Swiss-Prot: http://cn.expasy.org/sprot
BMP4
http://us.expasy.org/uniprot/P12644
ERK1
http://us.expasy.org/uniprot/P27361
ERK2
http://us.expasy.org/uniprot/P28482
FOXD3
http://us.expasy.org/uniprot/Q9UJU5
gp130
http://us.expasy.org/uniprot/Q00560
LIF
http://us.expasy.org/uniprot/P15018
LIFR
http://us.expasy.org/uniprot/P42702
mTOR
http://us.expasy.org/uniprot/P42345
Nanog
http://us.expasy.org/uniprot/Q6JZS5
OCT4
http://us.expasy.org/uniprot/Q01860
PEM
http://us.expasy.org/uniprot/P52651
PTEN
http://us.expasy.org/uniprot/P60484
SOX2
http://us.expasy.org/uniprot/P48431
STAT3
http://us.expasy.org/uniprot/P42227
STAT4
http://us.expasy.org/uniprot/Q14765
Entrez Gene: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene
Lif
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Re
trieve&dopt=full_report&list_uids=16878
OCT4
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&
cmd=Retrieve&dopt=Graphics&list_uids=18999
Pem
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=18617
Further information
The official National Institutes of Health
resource for stem cell research: Appendix E:
Stem Cell Markers: http://stemcells.nih.gov/info/
scireport/appendixE.asp
Hans Schцler’s laboratory:
http://www.mpi-muenster.mpg.de/research/cd/reportse/html
Michele Boiani’s laboratory:
http://www.mpi-muenster.mpg.de/research/cd/boiani/html
Сайт создан в системе
uCoz 
