Группа Doxsey истощала 15 разных центросомных белков в клетках человека и установила, что все деплеции за исключением одной вызывают остановку клеточного цикла в G1 фазе. Экспрессия конструкции центросомного белка, которая разрушает центросомы доминантно-негативным образом, дает сходные результаты. Кроме того, арест в G1 специфически 'устранялся' с помощьюповторной экспрессии нарушенного гена. Целенаправленно нарушенные центросомные белки локализуются на разных сайтах центросом, это указывает на то, что не существует одной центросомной структуры, ответственной за арест.
Затем авт. показали, что арест индуцируется постмитотически в клетках, которые экспрессируют доминантно-негативную конструкцию центросомного белка. G1 арест сопровождается снижением активности CDK2–cyclin A, но не уровней cyclin A, это указывает на присутствие ингибитора CDK. В самом деле потеря CDK ингибитора p21 супрессирует G1 арестt, это указывает на то, что p21 участвует в ингибировании активности CDK2–cyclin A.
Картина иммунофлюоресценции показывает, что все G1-арестованные клетки обнаруживают один или более дейектов центросом, таких как потеряцентриолей, разделение центриолей и фрагментация центриолей. Центросомы обладают специфическими функциями во время G1, а именно, дупликация центросом и сборка первичных ресничек, обе они также дефектны в G1-арестованных клетках. Дефекты в структуре и функции центросом, следовательно, тесно коррелируют с G1 арестом. связанным с центросомами.
Но что является регуляторным путем, который ингибирует ход клеточного цикла в клетках с дефектными центросомами? Doxsey с коллегами наблюдали ядерную транслокацию p53 в маленьких interfering RNA-обработанных клетках, но не в контрольных клетках, перед G1 арестом. Также клетки, которые содержат мутантный p53 не подвергаются G1 аресту, a если клетки были конкурентно деплетированы по центросомным белкам и p53, G1 арест также супрессировался. Эти находки указывают на то, что ассоциированный с центромерами G1 арест зависит от p53.
В клетках с деплетированными центросомными белками p53 активируется с помощью фосфорилирования остатка Ser33 — известного субстрата для p38 kinase. Этого фосфорилирования не наблюдается в контрольных клетках, а ингибирование или истощение p38 перед деплецией центросом супрессирует арест G1. Используя immunofluorescence микроскопию авт. показали, что в ответ на истощение центросомного белка p38-фосфорилированная форма p53 накапливается в центросомах прежде чем они будут транслоцированы в ядро. Это указывает на многоступенчатый p53- и p38-зависимый путь для ареста клеточного цикла, ассоциированного с центросомами.
Итак, авт. полагают, что существует checkpoint клеточного цикла, который отслеживает целостность центросом и контролирует ход G1–S. Регуляторный путь связан с активацией p53 с помощью p38 и в свою очередь, p53 активирует p21, который ингибирует комплекс CDK2–cyclin A. В самом деле, опухолевые клетки, которые лишены p53, часто обнаруживают последствия устранения checkpoint, включая дефекты веретена и анеуплоидию.
