Посещений:
Регенерация Волосковых Клеток

У Птиц

Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium
JENNIFER S. STONE and DOUGLAS A. COTANCHE
Int. J. Dev. Biol. 51: 633-647 (2007) doi: 10.1387/ijdb.072408js

Regeneration of sensory hair cells in the mature avian inner ear was first described just over 20 years ago. Since then, it has been shown that many other non-mammalian species either continually produce new hair cells or regenerate them in response to trauma. However,mammals exhibit limited hair cell regeneration, particularly in the auditory epithelium. In birds and other non-mammals, regenerated hair cells arise from adjacent non-sensory (supporting)cells. Hair cell regeneration was initially described as a proliferative response whereby supporting cells re-enter the mitotic cycle, forming daughter cells that differentiate into either hair cells or supporting cells and thereby restore cytoarchitecture and function in the sensory epithelium. However, further analyses of the avian auditory epithelium (and amphibian vestibular epithelium) revealed a second regenerative mechanism, direct transdifferentiation, during which supporting cells change their gene expression and convert into hair cells without dividing. In the chicken auditory epithelium, these two distinct mechanisms show unique spatial and temporal patterns, suggesting they are differentially regulated. Current efforts are aimed at identifying signals that maintain supporting cells in a quiescent state or direct them to undergo direct transdifferentiation or cell division. Here, we review current knowledge about supporting cell properties and discuss candidate signaling molecules for regulating supporting cell behavior, in quiescence and after damage. While significant advances have been made in understanding regeneration in non-mammals over the last 20 years, we have yet to determine why the mammalian auditory epithelium lacks the ability to regenerate hair cells spontaneously and whether it is even capable of significant regeneration under additional circumstances. The continued study of mechanisms controlling regeneration in the avian auditory epithelium may lead to strategies for inducing significant and functional regeneration in mammals.
Сенсорные hair cells (HCs) являются механорецепторами, которые локализуются в специализированном эпителии внутреннего уха и боковой линии neuromasts. Полностью развитые HCs в слуховом и вестибулярном эпителии внутреннего уха необходимы для нормального слуха и функции баланса. У людей, если HCs повреждены или потеряны, то возникающий в результате сенсорный дефицит остается постоянным. Хотя вредные изменения происходя в слуховом нерве и на более высоких уровнях вследствие потери слуховых HC, считается, что восстановление здоровых HCs д. приводить к существенному улучшению слуха.
У взрослых млекопитающих регенерация сенсоронейральных структур и функций после повреждения не является общераспространенным. Исключение составляют рецепторы в обонятельном рецепторном эпителии и во вкусовых сосочках, которые подвергаются постоянному обмену в течение всей жизни (Beites et al., 2005; Miura et al., 2006). Сходным образом сенсорный эпителий внутреннего уха, его клетки онтогенетически происходят из поверхностной эктодермы. Напротив, регенерация сенсорных рецепторов и нейронов, происходящих из нервной трубки (напр., нейроны ретинальных ганглиев) или нервного гребня (напр., нейроны ганглиев дорсальных корешков) у зрелых млекопитающих не типична (но см. Gould,2007).
Были предприняты некоторые исследования на экспериментальных животных на предмет реакции на потерю HC и идентификации способов запуска этого процесса. Во время развития слухового эпителия мышей деления клеток предшественников прекращались на 14.5 день эмбриогенеза (Ruben, 1967; Lee et al., 2006; Matei et al., 2005). У взрослых млекопитающих кортиев орган не обнаруживает спонтанной способности формировать новые HCs повреждений от воздействия шумов или лекарств in vivo (e.g., Roberson and Rubel, 1994; Forge et al., 1998), хотя in vitro репарация поврежденных HCs была описана (Sobkowicz et al., 1997; Zheng et al., 1999). Напротив, вестибулярный эпителий у взрослых грызунов обнаруживает небольшое, но достоверное увеличение клеточной пролиферации в ответ на повреждения HC in vivo (Rubel et al., 1995; Kuntz and Oesterle, 1998). Клетки, которые делятся (клетки предшественники), как полагают, являются supporting cells (SCs), которые не являются сенсорными клетками и окружают HCs в сенсорном эпителии. К сожалению , некоторые исследования показали, что in vivo дифференцировка вновь возникших клеток в HCs происходит редко или не происходит (Rubel et al., 1995; Kuntz and Oesterle, 1998; Ogata et al., 1999; Oesterle et al., 2003, but see Forge et al., 1993).
В противоположность млекопитающим происходит пост-эмбриональное замещение поврежденных слуховых и вестибулярных клеток HCs у многих позвоночных не млекопитающих. Ранние исследования продемонстрировали, что холоднокровные животные, хрящевые рыбы и жабы формируют новые вестибулярные HCs как часть их нормального роста тела (Corwin, 1981; Corwin, 1985; Popper and Hoxter, 1984). Кроме того, HCs в эпителиальном чувствительном органе боковой линии регенерируют после ампутации хвоста (Stone, 1933; Stone, 1937; Balak et al., 1990) или после устранения с помощью лазера индивидуальных HCs (Jones and Corwin, 1993; 1996). Удивительно, но виды птиц также формируют новые HCs в вестибулярном эпителии исходя из реакции на нормальный апоптоз HC (Jorgensen and Mathiesen, 1988; Roberson et al., 1992; Kil et al., 1997) и скорости регенерации после повреждения HC damage (Weisleder and Rubel, 1993). Регенерация HCs в слуховом эпителии птиц (наз. также basilar papilla) происходит только в ответ на внешне вызываемую травму и смерть HC (Corwin and Cotanche, 1988; Ryals and Rubel, 1988; Oesterle and Rubel, 1993). Важно, что регенерация HC у птиц происходит после созревания HC эпителия и функционирования слуха. Морфологическое и функциональное восстановление, включая ре-иннервацию, происходит быстро полностью (rev. Cotanche, 1999; Smolders, 1999; Stone and Rubel,2000a; Bermingham-McDonogh and Rubel, 2003).
В конце 1980s, два исследования на цыплятах после вылупления первоначально продемонстрировали. что птицы обладают способностью к регенерации HCs после того. как они повреждены в basilar papilla (BP; Cotanche,1987a; Cruz et al., 1987). В этих исследованиях были использованы два метода индукции повреждений HC; Cotanche воздействовали на цыплят интенсивным шумом чистого тона, тогда как Cruz et al. вводили птицам системные инъекции ототоксического aminoglycoside антибиотика, Gentamicin. Воздействие шумом чистого тона увеличивало повреждения относительно фокальных областей HC и устранение соотв. тонотопических областей BP. Напротив воздействие Gentamicin вызывало полную потерю HC высокочастотного (проксимального) конца BP, начиная с проксимального кончика и двигаясь в направлении низкочастотного (дистального) конца приводя со временем к захвату разных тотальных областей BP в зависимости от количества воздействий лекарством (e.g., Hashino et al., 1991; Janas et al., 1995). В обоих исследованиях морфологический анализ эпителия был осуществлен в разное время после повреждений HC. Cotanche (1987a) обнаружили. что спустя примерно 2 дня после воздействия шумом обнаруживались клетки, выглядящие как эмбриональные HCs в районе потери HC. Эти клетки созревали в течение след. 2-х недель и восстанавливался нормальный клеточный паттерн BP. Cruz et al. (1987) подсчитывали количества HCs в разные моменты времени после воздействия Gentamicin и установили, что количество HC уменьшающееся немедленно, начинало обнаруживать частичное восстановление в течение 3-4 недель. Оба исследования интерпретировали свои результаты, как отражение регенерации сенсорных HCs, за счет неизвестного механизма.
Открытие регенерации HC у птиц после вылупления вызвало существенный интерес к потенциалу стимуляции регенерации HC у взрослых млекопитающих. Согласно некоторым последующим исследованиям, сконцентрировавшимися на идентификации предшественников HC и характеристике клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют непосредственно регенерацией HC у видов птиц, с надеждой, что сравнительные исследования на млекопитающих смогут раскрыть критические различия между двумя классами животных в отношении их реакций на потерю HC loss.

Avian supporting cells give rise to new hair cells through two distinct mechanisms


С первых исследований Cotanche and Cruz et al. in 1987, исследователи пытались понять клеточные и молекулярные механизмы регенерации новых HCs у взрослых птиц. Важные исследования показали, что новые HCs возникают благодаря клеточным делениям несенсорных поддерживающих клеток (SCs; Fig. 1), которые распределены среди HCs. В BPs эмбрионов кур митотическая активность затухает на 9 день эмбриогенеза (Katayama and Corwin, 1989) и мало или совсем не происходит клеточных делений обычно после вылупления (Oesterle and Rubel, 1993). Однако, воздействие на вылупившихся цыплят или перепелят интенсивными шумами стимулирует SCs в области потери HC нарушать арест роста и повторно вступать в клеточный цикл, а вновь сформированные клетки предшественники затем дифференцируются в HCs и SCs (Corwin and Cotanche, 1988; Ryals and Rubel, 1988). Это впервые было продемонстрировано с помощью введения отслеживаемого аналога nucleoside tritiated thymidine птицам после воздействия шумом, чтобы отследить пролиферативную активность. После 10 дней восстановления ядра HCs и соседних SCs содержали аналог, демонстрируя тем самым, что они возникают благодаря возобновлению клеточных делений. Последующие исследования попытались показать, что такое SCs сами по себе, почему они делятся после повреждения HC в BP (Raphael, 1992; Hashino and Salvi, 1993; Stone and Cotanche, 1994; Stone et al., 1999; Warchol and Corwin, 1996). SCs служат в качестве предшественников HC во время регенерации вестибулярного эпителия у птиц (Jorgensen and Mathiesen, 1988; Roberson et al., 1992) и во время регенерации всего HC-эпителия и эпителиальных сенсорных элементов боковой линии у др. животных, не-млекопитающих (e.g., Balak et al., 1990; Yan et al., 1991; Baird et al., 1993). Анализ сенсорного эпителия птиц после повреждений HC показал, как SCs переходят от ареста роста к митозам, их ядра мигрируют из своего обычного положения вблизи базальной ламины к поверхности, обращенной к просвету (Raphael, 1992; Tsue et al., 1994; Fig. 1). Предшественники рождаются в просвет, затем подвергаются специфической транслокации ядер и дифференцировке цитоплазматических и апикальных признаков в зависимости от клеточной судьбы, ими приобретаемой (Stone et al., 1996; Stone and Rubel, 2000b; Roberson et al., 2004; Duncan et al., 2006).
Деление SC является не единственным способом генерации новых HCs у позвоночных не млекопитающих; SCs обладают также способностью к спонтанному превращению в HCs (Fig. 1)посредством прямой трансдифференцировки. Имеется множество примеров дифференцированных типов клеток, которые меняют свой фенотип, чтобы стабильно приобретать состояние др. дифференцировки (transdifferentiation), этот процесс обычно связан с переходом посредстом клеточного цикла (e.g., Nathanson, 1986). Напротив, прямая трансдифференцировка происходит без вступления в клеточный цикл (Beresford, 1990). Напр., нейральная часть сетчатки может непосредственно превращаться в хрусталиковые клетки у эмбрионов кур (Opas and Dziak, 1998). Имеются существенные доказательства регенерации HC за счет прямой трансдифференцировки из SCs в зрелом saccules амфибий и BPs птиц. После воздействия ототоксическим агентом количество HC восстанавливается в культивируемых saccules от лягушек и тритонов несмотря на продолжающееся ингибирование делений SC с помощью блокатора S-фазы, Aphidicolin (Baird et al., 1996; Baird et al., 2000; Taylor and Forge, 2005). Сходные находки описаны в BP кур после повреждений HC (Adler et al., 1996), хотя ингибирование делений SC было лишь временным. Roberson et al. (1996) имплантировали насос. чтобы постоянно поставлять обнаружимый аналог нуклеозида (bromodeoxyuridine или tritiated thymidine) в перилимфу и затем применяли Gentamicin, чтобы вызывать потерю HC. На 12-й день после этого только 50% регенерировавших HCs содержали инкорпорированный нуклеозид, тогда как др. половина не содержала. В сходном исследовании на 10-й день после воздействия Gentamicin, 70% регенерировавших HCs обнаруживало нуклеозид, тогда как остальные 30% нет (Roberson et al., 2004). Т.к. повреждения HC были полными в анализируемой области, то репарация HC исключалась в качестве объяснения. Скорее, т.к. митотический трассер был доступен SCs до, во время и после гибели HC, то полученный результат указывает на то, субпопуляция SCs фенотипически превращается непосредственно в HCs без делений. Дальнейшие доказательства трансдифференцировки SC в HCs , полученные недавно, показали, что Atoh1, пронейральный транскрипционный фактор, чья трансляция во время развития кортиева органа, как полагают, ограничена ранними дифференцирующимися HCs (Chen et al., 2002; Woods et al., 2004; Matei et al., 2005), начинает экспрессироваться на высоком уровне в ядрах SCs вскоре после повреждения HC и позднее экспрессируется на высоком уровне в регенерирующих HCs (Cafaro et al., 2007). Эти исследования предоставляют строгие доказательства того, что прямая трансдифференцировка является важным источником новых HCs во время регенерации HC птиц.
Первые новые HCs появляются после повреждения HC в результате прямой трансдифференцировки, тогда как новые HCs, генерируемые с помощью митозов, появляются позднее и в конечном итоге представляют собой существенную пропорцию новых сенсорных клеток (Roberson et al., 1996; Roberson et al., 2004; Cafaro et al., 2007). Трансдифференцирующиеся SCs выявляются самое раннее спустя 15 ч после воздействия Gentamicin, до исчезновения HCs в этом районе (Cafaro et al., 2007). Т.о., SCs активируются к трансдифференцировке в ответ на сигналы, которые появляются вскоре после инициации повреждений HC. Достоверные количества SCs в поврежденном регионе вступают в S фазу спустя 72 ч (Bhave et al., 1995; Stone et al., 1999; Roberson et al., 2004; Duncan et al., 2006). К этому времени уже имеются регенерировавшие HCs, присутствующие в регионе, где появляются деления SC, на это указывает мечение с помощью ранних HC антигенов (e.g., MyosinVI and TuJ1; Stone and Rubel, 2000b; Roberson et al., 2004). Однако, ни одна из этих первых регенерировавших HCs не происходит от новых постмитотических клеток

Fig. 1. Supporting cell behaviors in the chicken basilar papilla. These schematics depict supporting cells (SCs) in the mature chicken basilar papilla (BP) in different states. (A) SCs in quiescence in an undamaged BP. Hair cells (HCs). (B,C) SCs in the drug-damaged BP undergoing either direct transdifferentiation (B) or cell division (C). In (B,C), arrows indicate the temporal progression of each SC response, starting with a single SC on the left and ending in a single new HC on the right (B, direct transdifferentiation) or starting with a single SC on the left and ending in two new cells (a HC and a SC here) on the right (C, cell division). Abbreviations: BP, basilar papilla; HC, hair cell; SC, supporting cell.

(Roberson et al., 2004). Скорее всего, HCs, регенерировавшие посредством митозов, не выявляются антителами к ранним HC-специфическим антигенам вплоть до приблизительно 96 ч (4 день; Fig. 2) и с помощью более поздних антигенов, таких как MyosinVIIa, вплоть до 120 ч (5d). Количество HCs, формируемое посредством прямой трансдифференцировки достигает пика на 144 ч (6d) и остается неизменным вплоть до 240 ч (10 день), в то время как количество митотически регенерирующих HCs увеличивается достоверно после 5-го дня, так что к 10-му дню они составляют 50-70% от новых HCs (Roberson et al., 1996; Roberson et al., 2004). Эти данные показывают, что первые новые HCs создаются во время ранних стадий регенерации и продуцируются в результате прямой трансдифференцировки и что позднее, когда теряется большая часть HCs митозы участвуют в продукции дополнительных новых HCs. После инициации митозов прямая трансдифференцировка подавляется, так что к 1--му дню большинство HCs, присутствующих в эпителии, происходит посредством клеточных делений. Однако, сигналы, которые регулируют инициацию прямой трансдифференцировки и стимулируют переключение на митозы, еще не идентифицированы.
В дополнение к этому временному разделению не митотической и митотической регенерации SCs разных регионов вдоль width-wise оси BP скорее всего дают новые HCs, используя один механизм скорее, чем др. . Cafaro et al. (2007) показали. что после воздействия Gentamicin плотность делящихся SCs значительно выше в нейральной половине эпителия, чем в не нейральной половине. Так, большинство (81%) регенерируемых HCs в нейральной половине BP формируется за счет делений SC, тогда как в abneural половине, большинство (66%) новых HCs формируется за счет прямой трансдифференцировки. Т.к. время, механизм и степень потери HC являются по существу одинаковыми в этих двух областях BP, то это наблюдение скорее всего отражает прирожденные различия в SCs каждой из областей или дивергенцию локальных сигналов.

Properties of avian supporting cells


В отличие от HCs, чьи клеточные тела ограничены областью просвета сенсорного эпителия, большинство SCs имеет удлиненное тело клетки, которое, по-видимому, контактирует с просветной и базальной поверхностью эпителия. Поэтому неподвижные SC ядра обычно расположены базальнее ядер HC. Ультраструктурные исследования показали, что SCs BP птиц фактически не дифференцированы с плохо развитым цитоскелетом и низкой плотностью органелл (e.g., Takasaka and Smith, 1971; Hirokawa, 1978; Hirose et al., 2004). Фактически изучение saccule рыб продемонстрировало, что активно делящиеся SCs обнаруживают очень высокое сходство с пассивными SCs в отношении их крупных и тонких морфологических признаков (Presson et al., 1996). Несмотря на это в BP птиц SCs выполняют многие функции, включая продукцию внеклеточного матрикса для покрывающей текториальной мембраны (Cotanche, 1987b; Epstein and Cotanche, 1995; Killick et al., 1995; Goodyear et al., 1996; Coutinho et al., 1999), организацию пути для очистки от калия посредством щелевых соединений (Wangemann, 2002; Forge et al., 2003; Nickel et al., 2006), нейротрофную поддержку HCs и нейронов (Stankovic et al., 2004) и закрепление сенсорного эпителия на базальной мембране (Cotanche et al., 1992; Cotanche et al., 1995). Как обсуждалось выше, после повреждений HC некоторые SCs приобретают поведенческие характеристики предшественников, подвергаясь клеточным делениям, тогда как др. напоминают клетки предшественники, формирующие новые HCs посредством поэтапной трансдифференцировки. Количественный анализ после ототоксических повреждений HC показывает, что приблизительно 1/4 SCs делится, 1/4 SCs трансдифференцируется и 1/2 SCs не обнаруживает никакой реакции (Roberson et al., 1996). Логично, что такие реакции SCs д. быть сбалансированы, чтобы они могли устанавливать соответствующие количества и типы новых клеток в BP для поддержания важных функций SC. Т.о., критическим вопросом остается, как индивидуальные SCs инструктируются, чтобы выбрать одну из реакций. Одной из возможностей является то, что субнаборы SCs ограничены так, чтобы вести себя только как стволовые и клетки предшественники или как клетки предшественники, готовые к трансдифференцировке, а остальные SCs являются терминально дифференцированными и неспособны к какой-либо реакции. Или наоборот все SCs могут обладать эквивалентным потенциалом, но субпопуляции отвечают определенным образом благодаря локально регулируемым сигналам. Если верно первое - что SCs специализированы - то субнаборы SCs с отличающимися свойствами д. быть идентифицируемы, но кстати, очень мало исследований посвящено непосредственно этому вопросу. Исследования клеточных клонов выявили две самостоятельные формы SC в позднем эмбриональном BP, который является почти созревшим (Fekete et al., 1998). Небольшая популяция SCs (4%) имеет базально расположенное ядро и тонкие цитоплазматические отростки, ведущие к поверхности, обращенной в просвет. Остальные SCs имеют более толстый вид с ядром, расположенным ближе к просвету. Это интригующее наблюдение, особенно из-за того, что приблизительно 4% SCs обнаруживают поведение, характерное для стволовых клеток, во время регенерации, делятся более одного раза (Stone et al., 1999). Однако, необходимо подтвердить, что SCs с деликатным видом действительно являются стволовыми клетками. В покоящемся BP некоторые молекулярные маркеры, по-видимому, метят все SCs (e.g., Kruger et al., 1999). Однако, лишь немногие маркеры предопределяют субнаборы SCs. Напр., Bhave et al. (1995) установили, что 3% покоящихся клеток SCs экспрессируют обнаружимые уровни proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Кроме того, SCs поперек neural-abneural оси BP экспрессируют разные уровни транскрипционного фактора Prox1 (Stone et al., 2004) или транскрипты для fibroblast growth factor receptor 3 (Bermingham-McDonogh et al., 2001). Функциональное значение этих отличающихся профилей экспрессии неизвестно. Однако, учитывая разные степени делений SC, обнаруживаемые в neural и abneural регионах BP после потери HC (Cafaro et al., 2007), может предположить, что эти молекулы играют роль в регуляции хода клеточного цикла или свойств стволовых клеток в SCs.
Какие свойства могут характеризовать SCs как способные отвечать одним или др. способом? Молекулярный анализ демонстрирует, что зрелые SCs являются не просто клетками предшественниками, не участвующими в развитии. Напр., транскрипционный фактор Prox1 выявляется во всех клетках предшественниках в сенсорном эпителии отоцистов кур, т.к. они делятся (Stone et al., 2003). Но в BP, белок Prox1 подавляется в SCs, когда. постмитотические клетки дифференцируются, так что при вылуплении только субпопуляция SCs в нейральной половине экспрессирует обнаружимые уровни белка. Если функцию Prox1в BP ещё предстоит определить, то гомологи, Prox1 необходимы для пролиферативной активности и выбора судеб клеточными клонами у плодовых мушек (e.g., Reddy and Rodrigues, 1999) и мышей (e.g., Wigle and Oliver, 1999; Dyer et al., 2003). Т.о., одной из возможностей является то, что SCs , которые сохраняют экспрессию Prox1 в зрелости являются подобными эмбриональным и более предрасположенными отвечать делениями. Это может быть также верно для SCs, которые экспрессируют высокие уровни PCNA (Bhave et al., 1995). С этой точки зрения, однако, относительная гомогенность SCs способствует в пользу интерпретации, что SC отвечают данным образом не в результате степени их специализации, а скорее в ответ на разные сигналы, встречающиеся в их микроусловиях (Morest and Cotanche, 2004). Анализ в др. тканях простимулировал исследователей предположить, что прямая трансдифференцировка происходит благодаря сдвигут прирожденных свойств в ответ на изменения в микроусловиях (discussed in Opas and Dziak, 1998).

Avian supporting cells respond to the progression of hair cell death


В нормальном BP после вылупления SCs находятся в состоянии покоя; нет митотической активности и нет указаний на начало трансдифференцировки. Вскоре после повреждения HC начинают активироваться SCs. До не которой степени неожиданно, но эта реакция не ограничивается областью окончательной потери HC. Скорее SCs по всему сенсорному эпителию включаются в области, которые находятся на расстоянии миллиметров от тех, в которых происходит потеря HC, переходя от ареста роста в G1 к ранней фазе клеточного цикла (Bhave et al., 1995). Следовательно, ранний сигнал, запускающий изменения в свойствах SC, глобально распространяется по всему BP. Однако, SCs, которые обнаруживают явные признаки трансдифференцировки в HCs и SCs , которые подвергаются синтезу ДНК и делятся, видны только вблизи области потери HC, которая д. произойти или происходит (Corwin and Cotanche, 1988; Raphael, 1992; Stone and Cotanche, 1994; Cafaro et al., 2007). Следовательно, критические локальные сигналы регулируют в конечном итоге поведение SCs после повреждений HC в BP птиц.
Чем могут быть эти глобальные и локальные сигналы? Одной из стратегий идентификации потенциальных регуляторов поведения SC в BP кур является идентификация специфичных ступеней в клеточных повреждениях и гибели во время повреждений звуками или Gentamicin в улитке кур and в корреляции каждой ступни со специфическими регенеративными реакциями в соседних или удаленных SCs (e.g., Torchinsky et al., 1999; Hirose et al., 2004; Mangiardi et al., 2004; Dai et al., 2006; Duncan et al., 2006; Warchol and Speck, 2007). Очевидно, что поврежденные HCs подвергаются апоптозу, который является тщательно срежиссированной программой, которая приводит к преднамеренному самоубийству клеток (Kerr et al., 1972; Wyllie, 1980). Апоптоз, как полагают, протекает в три фазы: инициации, арбитража и исполнения. Инициация определяется как внутреннее повреждение или внешний сигнал, с которых стартует программа клеточной гибели. После инициации апоптоза имеется период арбитража, когда клеточные сигналы выживания конкурируют с сигналами клеточной гибели



Fig. 2. Hair cell regeneration after drug damage in the chicken basilar papilla. The proximal end of the basilar papilla (BP) is shown in whole-mount preparations in all panels. Panels (A-C) show immunolabeling for the hair cell (HC)-specific protein, MyosinVI (gray), in the control, undamaged BP (A), in the BP at 4 days post-Gentamicin (B) and in the BP at 8 days post-Gentamicin (C). The apical surfaces of normal mature HCs (A) appear round. At 4 days post-Gentamicin (B), note the loss of mature HCs in the proximal region and the reemergence of new, immature HCs with fusiform cell shapes. By 8 days post-Gentamicin, more new HCs have emerged and they appear more mature. (D) Double-labeling for MyosinVI (green) and BrdU (red). BrdU was applied as a single pulse at 4 days post-Gentamicin and animals were euthanized 3 days post-BrdU, at 7 days post-Gentamicin. Hair cells formed by mitosis are double-labeled (arrows). Scale bar, 10 µm.

в попытке восстановить клетку. Если сигналы гибели доминируют на этой стадии, то клетка гибнет; но если доминируют сигналы выживания, то клетка живет. С этой точки зрения неясно, какие специфические изменения HCs происходят достаточно рано, чтобы вызывать инициацию трансдифференцировки в соседних SCs. Для большинства типов клеток стадия исполнения связана с высвобождением Cytochrome C из митохондрий и активацией Caspase-3 (McDonald and Windebank, 2000; Bouchier-Hayes et al., 2005). Это затем мобилизует регулируемый энзимный каскад, который вызывает разрушение множественных клеточных компонентов и в конечном итоге гибель клетки. Наиболее заметными и хорошо изученными компонентами исполнительной фазы являются Caspases (Cryns and Yuan, 1998; Thornberry and Lazebnik, 1998; Earnshaw et al., 1999 Lavrik et al., 2005). Специфические каспазы, как полагают участвуют в ранней, вышестоящей фазе, такие как Caspases 8, 9 и 10, тогда как др. ограничены более поздними нижестоящми стадиями, такие как Caspases 3, 6 и 7.
Gentamicin проникает в HCs вскоре после единичной системной инъекции (спустя 6 ч; Dai et al., 2006). Первоначально, Gentamicin выявляется в наиболее проксимальных HCs, но на 9 ч, он накапливается в HCs по всему BP. SCs не обнаруживают признаков проникновения Gentamicin, указывая тем самым, что изменения в поведении SC не вызываются клеточно-автономными эффектами на лекарство. Вследствие одиночной инъекции Gentamicin HCs сначала начинают отторгаться от проксимального кончика BP на 30 ч, или 24 ч спустя после того, как Gentamicin впервые достигает этих HCs. Потеря волосковых клеток прогрессирует вниз улитки, соответствующему проксимальным 30% BP к 42 ч и к 54 ч все HCs отторгаются от этой области (Mangiardi et al., 2004). Отсутствие меченных миозином клеток внутри проксимальных 30% BP к 54 ч демонстрирует, что не остается жизнеспособных HCs в поврежденной Gentamicin области BP.
Первые указания, что поврежденные HCs подвергаются апоптозу, появляются спустя 12 ч после введения Gentamicin, с транслокацией T-cell restricted intracellular antigen-related (TIAR) белка из ядра в цитоплазму HCs на проксимальном кончике BP. Клеточная транслокация TIAR является ранним индикатором апоптоза во многих тканях (Taupin et al., 1995). Эта ступень происходит 6 ч спустя после первого вступления Gentamicin в HCs и за 18 ч до того, как HCs будут отторгнуты от сенсорного эпителия. Не обнаруживаются изменения в локализации TIAR в области, где не происходит потери и регенерации HC (напр., в дистальной половивне после воздействия Gentamicin). Транслокация TIAR является единственным молекулярным признаком, что HCs подвергаются апоптическому каскаду в этот ранний момент времени. Т.к. транслокация TIAR происходит приблизительно во время, когда SCs начинают обнаруживать явные признаки трансдифференцировки (Cafaro et al., 2007), интересно предположить, что транслокация TIAR может каким-то образом быть связанной с ранними сигналами, которые запускают трансдифференцировку SC. В то время как TIAR, по-видимому, участвует в формировании стрессовых гранул в поврежденных клетках (Kedersha et al., 2000), специфические нижестоящие молекулы, которые это регулируют неизвестны.
Два дополнительных ассоциированных с апоптозом события происходят в HCs примерно в 30 ч post-Gentamicin, т.к. HCs начинают сразу же отторгаться от BP: высвобождение Cytochrome C из митохондрий в цитоплазму и активация или расщепление Caspase-3 (Mangiardi et al., 2004; Cheng et al., 2003). Высвобождение Cytochrome C и активация Caspase-3 впервые обнаруживаются на проксимальном конце и распространяются дистально со временем, тогда как повреждения HC увеличиваются в размере. Никакой реакции не происходит в областях, где теряются HC, а регенерации не происходит. Эти изменения появляются до инициации повторного вступления SC в клеточный цикл и следовательно, могут быть частью каскада событий, ведущих к делениям SC. Недавние исследования с использованием ингибиторов апоптического пути, чтобы блокировать уже происходящую или индуцированную лекарством гибель HC в вестибулярном эпителии птиц in vivo (Matsui et al., 2002; Matsui et al., 2003; Matsui et al., 2004) ив utricle млекопитающих и BP кур in vitro вследствие воздействия aminoglycoside (Cunningham et al., 2002; Cheng et al., 2003; Sugahara et al., 2006). Эти исследования показали, что ингибирование ступеней пути клеточной гибели может блокировать апоптоз в HCs. Было бы интересно определить, как SC реакции осуществляются в этом случае, когда повреждения HC инициируются, но сигналы выживания преобладают, предупреждая гибель HC. Др. важной областью исследований является дистальный конец BP, где HCs безусловно подвергаются кратковременному воздействию Gentamicin, но в конечном итоге выживают. Т.к. было продемонстрировано, что дистальные SCs инициируют переход от покоя к клеточному циклу (Bhave et al., 1995), но неясно начинают ли дистальные SCs проходить ступень в направлении трансдифференцировки. Особенно интересно было бы определить, как HCs и SCs дифференциально изменяются на проксимальном и дистальном концах BP после воздействия Gentamicin, т.к. такая информация могла бы помочь идентифицировать степень повреждений HC, необходимую для инициации выхода SC из покоя и прогрессии в направлении трансдифференцировки или клеточных делений.

Signals directing a SC's pathway for regeneration


Какие сигналы регулируют покой и активацию SC после потери HC ? Согласно одной рабочей гипотезе прямая трансдифференцировка является принципиальным путем регенерации HCs и что деления SC происходят только, чтобы восполнить удаленные SCs после того как они превратились в HCs (Roberson et al., 2004). В этой модели потеря SCs, которая сопровождает инициальную фазу регенерации, трансдифференцировку, может запускать деления соседних SCs. Эта гипотеза представляет интересную дивергенцию от классической идеи, что нормальные HCs латерально ингибируют деления SC (e.g., Corwin and Cotanche, 1988). Однако, эту гипотезу сегодня трудно протестировать, т.к. неизвестен инструмент для экспериментального блокирования прямой трансдифференцировки.
Независимо от источника сигналов последствия сигналов д. быть критическими для регуляции поведения SC behavior: те, что поддерживают SCs в дифференцированном покоящеся состоянии (предупреждают трансдифференцировку и деления), те, которые запускают переход SC от покоя в направлении трансдифференцировки или деления и те, которые обеспечивают только ограниченные количества SCs, отвечающие на активные сигналы. Ключ к идентификации этих сигналов может быть получен благодаря нашим знаниям путей, которые управляют инициальным развитием эпителия внутреннего уха. Некоторые молекулярные пути известны, регулирующие эмбриональные предшественники HC и некоторые из этих путей реактивируются в зрелом HC эпителии после потери HC и следовательно, могут быть важными для управления поведением SC. Сенсорный эпителий, включая BP, сформировавшийся из отической плакоды, специализированной области эктодермы. Во время эмбриогенеза плакода подвергается росту, морфогенезу и дифференцировке, возникновению специфического слухового или вестибулярного эпителия, а также не-сенсорных структур. Индукция отической плакоды контролируется несколькими молекулами, включая Wnts и Fibroblast Growth Factors (reviewed in Fekete and Wu, 2002; Brown et al., 2003). После индукции преплакодные клетки экспрессируют определенные наборы транскрипционных факторов, а позднее, по мере развития отического эпителия, возникают характерные региональные паттерны генной экспрессии. Спецификация регионов как сенсорных участков ассоциирована с экспрессией bone morphogenetic proteins ( BMPs 4 и 7; Wu and Oh, 1996; Cole et al., 2000), Notch-ассоциированные гены (Serrate1, Lunatic Fringe [Lnfg], Notch1 и Delta1 ; Adam et al., 1998; Cole et al., 2000) и некоторые транскрипционные факторы (напр., Prox1, Atoh1 [Stone et al., 2003] и Sox2 [Kiernan et al., 2005; Neves et al., 2007]. Т.к. зрелые SCs в BP птиц отличаются от эмбриональных предшественников, то было бы интересно определить, должны ли SCs переходить к незрелому состоянию (дедифференцироваться) прежде чем они станут делиться или непосредственно трансдифференцироваться в HCs. Если это так, то SCs д. обнаруживать регрессивные изменения своих генетических профилей после повреждений HC. Анализ и пертурбации генов, экспрессирующихся в эмбриональных предшественниках (напр., Prox1, BMP4, Serrate1 или Lnfg) д. предоставить информацию по этому вопросу. Необходимо также идентифицировать закрепленные или диффузные сигнальные молекулы, которые регулируют такие регрессивные генетические изменения в SCs, т.к. они скорее всего необходимы для регенерации. У взрослых млекопитающих регенерация HCs может терпеть неудачу, т.к. SCs ингибируются в результате дедифференцировки , они неспособны реагировать на сигналы, способствующие дедифференцировке, или сигналы,способствующие регрессии и исчезновению.
В зрелом BP кур после потери HC loss, basic helix loop helix (bHLH) пронейральный транскрипционный фактор Atoh1 (atonal, Ath1; Jarman et al., 1993; Ben-Arie et al., 2000) оказывает реактивированным в трансдифференцирующихся и митотически активных SCs (Cafaro et al., 2007). Atoh1 выполняет критическую функцию в развитии HC, которая лучше всего была изучена во внутреннем ухе мышей. Потеря Atoh1 (Math1) ведет к нарушению спецификации и/или дифференцировки HCs (Bermingham et al., 1999; Woods et al., 2004; Matei et al., 2005). SCs также неспособны дифференцироваться, но это может возникать в результате неспособности развития HC скорее, чем в результате прямой реакции на делецию Atoh1 (Woods et al., 2004). Сходным образом нокдаун Atoh1a и/или Atoh1b у рыбок данио вызывает немногих HCs во внутреннем ухе (Millimaki et al., 2007). Во время развития экспрессия Atoh1 выявляется в сенсорных участках (Bermingham et al., 1999; Stone et al., 2003; Woods et al., 2004; Matei et al., 2005), затем оказывается сильно повышенной в HCs после терминальных митозов (Chen et al., 2002; Lumpkin et al., 2003) и подавляется после дифференцировки HC (Lanford et al., 2000; Zheng et al., 2000). Эктопическая экспрессия Atoh1во внутреннем ухе развивающихся и зрелых грызунов ведет к эктопической дифференцировке HC (Zheng and Gao, 2000;Kawamoto et al., 2003; Shou et al., 2003; Izumikawa et al., 2005). В зрелых не поврежденных BP кур Atoh1 белок не выявляется в HCs или SCs (Cafaro et al., 2007). Однако, в течение нескольких часов после повреждения HC , когда HCs всё ещё интактны, белок Atoh1 выявляется в ядрах SCs на проксимальном поврежденном конце BP. Позднее белок Atoh1 виден в регенерирующих HCs. Во время развития отоциста кур транскрипты Atoh1 не обнаруживаются в клетках предшественниках, скорее они первыми обнаруживаются в дифференцирующихся HCs (Pujades et al., 2006). Т.о., вряд ли позитивная регуляция Atoh1 в активированных SCs представляет собой возвращение к незрелому состоянию, сходному с таковым у предшественников. Тем не менее, учитывая критическую роль Atoh1's в регуляции спецификации и дифференцировки HC у грызунов, Atoh1 по-видимому, управляет переключением судьбы SC в HC во время регенерации в BP кур. Поэтому важно определить, как регулируются экспрессия Atoh1 в покоящихся и активированных SCs и являются ли изменения активности Atoh1 достаточными для направления SC поведения или др. Одно исследование - Cafaro et al., 2007 - показало, что повышенная экспрессия Atoh1 в SCs или в пост-митотических клетках предшественниках не достаточна, чтобы безвозвратно специфицировать эти клетки как HC. Скорее экспрессия Atoh1 является высоко динамичной в некоторых постмитотических клетках во время первых 24-48 ч после того, как они позитивно регулируются, и некоторые из клеток, которые инициально обнаруживали высокие уровни белка Atoh1, начинают дифференцироваться как SCs. Следовательно, спецификация клеточной судьбы является сложным процессом, который скорее всего зависит от нескольких сигналов от клеток в эпителиальных микроусловиях.
Регуляция транскрипции atonal/Atoh1 является комбинационной; atonal/Atoh1 (e.g., Helms et al., 2000), Ngn1 (Gowan et al., 2001), Wingless/Wnt (e.g., Niwa et al., 2004), Decapentaplegic/BMPs (e.g., Niwa et al., 2004), epidermal growth factor (zur Lage et al., 2004), fibroblast growth factor (e.g., Millimaki et al., 2007) and



Fig. 3. Notch signaling in hair cell epithelia. (A) Major molecules involved in the Notch signaling pathway and how they cooperate in two adjacent cells to lead to the production of different cell types, a supporting cell and a hair cell in this case. The cell on the right (purple) is the "signaling cell". Its relatively high levels of Notch (N) ligand bind and activate Notch (N) receptors on the cell on the left (yellow), the "receiving cell. As a result, Notch activation is high in the receiving cell and high levels of the Notch intracellular domain (NICD) are released from the membrane and travel to the nucleus. As a result, HES repressor activity is increased and transcription of Atoh1 and N ligand is inhibited. In response, the receiving cell's ability to activate N receptor on the signaling cell is diminished and transcription of Atoh1 and N ligand becomes increased in the signaling cell due to low HES repressor activity. In this manner, signaling cells acquire the sensorineural fate (HC) and receiving cells acquire a non-sensory fate (SC). (B) A working model for how Notch signaling progressively alters SC behaviors in the chicken basilar papilla after HC damage, with stages numbered and later stages shown at lower levels in the figure. On the left, progressive changes in gene expression patterns are shown. On the right, the pertinent signals regulating/reflecting SC behavior at a given time are shown. 1) In the mature, undamaged BP, Notch ligand (Serrate2?) expressed in HCs activates Notch1 in SCs, maintaining them in a quiescent state. 2) After ototoxin treatment, HCs are damaged and lose Notch ligand function; in nearby SCs, Notch1 activity is decreased and Atoh1 levels are increased. 3) Atoh1-positive SCs begin to transdifferentiate and upregulate Delta1; increased Notch1 activity in some SCs prevents them from expressing Atoh1 and initiating direct transdifferentiation. 4) SCs with increased Notch activity either undergo cell division (incorporate BrdU) or remain mitotically quiescent; Delta1/Atoh1-positive cells continue to differentiate as HCs. 5) Some post-mitotic cells upregulate Atoh1 and Delta1 (shown) and activate Notch1 in other post-mitotic cells (siblings?); transdifferentiated HCs down-regulate Delta1 and Atoh1. 6) Delta1/Atoh1-positive post-mitotic cells differentiate as HCs; neighboring cells with high Notch1 activity differentiate as SCs; transdifferentiated HCs approach maturity and reexpress Serrate

Notch (e.g., Baker et al., 1996) все они являются примерами молекул, с помощью которых осуществляется прямое или косвенное влияние на транскрипцию atonal/Atoh1. Из них Notch исследован наиболее полно во внутреннем ухе позвоночных. Роль Notch's в ограничении экспрессии atonal/Atoh1 прекрасно иллюстрируется его ролью в развитии сенсорного органа у плодовых мушек. Первоначально все клетки предшественники в сенсорных примордиях экспрессируют atonal. Со временем atonal ограничивается специфическими клетками, которые приобретают сенсорную или нейральную судьбу (e.g., Baker et al., 1996; Baker and Yu, 1997). Первоначально активность Notch необходима для транскрипции atonal в клетках всего сенсорного примордия. Позднее активность Notch ограничивает транскрипцию atonal определенными клетками. Репрессия пронейральных генов, таких как atonal происходит посредством др. bHLH транскрипционного фактора, наз. Hairy/Enhancer of Split (HES; Heitzler et al., 1996). Репрессор активности HES's становится активированным, когда Notch рецептор связывается одним из своих лигандов, Delta или Serrate (Artavanis-Tsakonas and Simpson, 1991; Muskavitch, 1994), которые локализуются в соседних клетках. После связывания часть Notch высвобождается из мембраны и перемещается в ядро, где она изменяет функцию HES (Fig. 3A). Сходный путь передачи обнаруживается у млекопитающих (rev. Selkoe and Kopan, 2003; Kageyama et al., 2005). Т.к. HES и atonal/Atoh1 имеют противоположные эффекты на транскрипцию лигандов Notch , (Kageyama et al., 1995; Heitzler et al., 1996), то соседние клетки в конечном итоге нуждаются в разных уровнях atonal/Atoh1 и следовательно, приобретают разные судьбы.
Во время развития HC во внутреннем ухе позвоночных Notch выполняет несколько важных ролей (Lewis, 1996; Kelley, 2006). В раннем отоцисте активация Notch рецептора с помощью Jagged1 (аналога Serrate1 у кур и плодовых мух) необходима для спецификации регионов отического эпителия как "сенсорного". Или потеря Jagged1 у мышей (Kiernan et al., 2001; Kiernan et al., 2006) или полное ингибирование активности Notch с помощью фармакоцептического ингибитора DAPT у кур (Daudet et al., 2007) вызывают уменьшение размеров или потерю сенсорных участков. Напротив, эктопическая экспрессия внутриклеточного домена Notch у кур ведет к формированию эктопических сенсорных участков (Daudet and Lewis, 2005). Позднее, когда дифференцируется сенсорны эпителий передача сигналов посредством Notch регулирует спецификацию клеточных судеб прежде всего путем ингибирования HC судьбы. Разрушение Notch1 рецептора, Jagged2/Delta-1-like или функции нижестоящего эффектора ведет к преждевременной дифференцировке и избыточной продукции HCs (Haddon et al., 1998; Lanford et al., 1999; Riley et al., 1999; Lanford et al., 2000; Zhang et al., 2000; Zheng et al., 2000; Zine et al., 2000; Kiernan et al., 2001; Tsai et al., 2001; Zine et al., 2001; Kiernan et al., 2005; Brooker et al., 2006), также как и к ограниченной трансдифференцировке SCs в HCs (Yamamoto et al., 2006). Т.о., как и ожидалось, учитывая Notch's антагонизм Atoh1, потеря активности Notch1 генерирует противоположные фенотипы, как это наблюдается при делеции Atoh1 (Bermingham et al., 1999). С помощью Notch1's негативная регуляция Atoh1, обеспечивается за счет HES1/5, что скорее всего и является механизмом ингибирования им спецификации HC во внутреннем ухе (Lanford et al., 2000; Zine and deRibaupierre, 2002). Путем супрессии Atoh1 во время развития, Notch-обеспечиваемая латеральная ингибиция, по-видимому, ингибируют клетки родоначальники/предшественники от приобретения судьбы HC, а значит и дифференцировки как HCs. Активация Notch существенно консервирует эти клетки в сенсорном эпителии, вообще-то делая возможной продукцию митотических и не-митотических HCs (или SCs) позднее в развитии, вообще-то даже постнатально. Эта роль Notch обнаруживается также и в некоторых др. тканях (rev. Kageyama et al., 2005). Напр., в развивающемся церебральном кортексе потеря HES1/5 ведет к значительному снижению в клональном росте нейральных стволовых клеток в культуре (Ohtsuka et al., 2001).
Т.к. Notch выполняет несколько функций в развитии сенсорного эпителия внутреннего уха, то можно предположить, что эти функции будут повторяться в BP кур во время регенерации HC. Анализ экспрессии в зрелом BP подтверждает эту гипотезу (Stone and Rubel, 1999). В покоящемся (неповрежденном) BP кур SCs активно транскрибируют Notch1 и Serrate1, но не обнаруживается транскрипции Delta1 ни в HCs ни в SCs. Третий Notch лиганд, Serrate2, экспрессируется в развивающихся HCs (Eddison et al., 2000) и может также экспрессироваться в зрелых HCs. Этот общий паттерн экспрессии Notch-связанных генов сравним с тем. что обнаруживается в зрелом кортиевом органе. 3 дня спустя после воздействия Gentamicin, транскрипты Delta1 увеличиваются в делящихся SCs, а позднее оказываются высоко активированными в дочерних клетках, когда они дифференцируются в HCs. Уровни Delta1 низки в постмитотических, регенерировавших SCs, а экспрессия Delta1 во время трансдифференцировки не была исследована. На 10-й день после воздействия Gentamicin Delta1сильно подавляется. Изменения в Notch1, Serrate1 и Serrate2 не были тщательно изучены во время потери HC. Точная роль Notch в покоящихся и регенерирующих BP не была функционально протестирована, хотя некоторые предположения могут быть сделаны на базе их экспрессии (Fig. 3B). В покоящемся (неповрежденном) (undamaged) состоянии Notch1 рецептор в SCs может быть активирован соседними HCs посредством Serrate2 (или с помощью SCs посредством Serrate1). Эта активация может поддерживать характеристики SC и/или покой SC, предупреждая SCs от превращения их в HCs. Вскоре после воздействия Gentamicin функция Notch рецептора или лиганда может быть снижена, приводя (в SCs) к снижению Notch активности и усилению транскрипции Atoh1 и трансдифференцировки в направлении HC фенотипа. Сохранение Notch активации в некоторых SCs д. предупреждать их от трансдифференцировки, консервируя их критическую функцию в BP, или от митотической регенерации позднее. В постмитотических клетках активация Notch, преимущественно посредством Delta1, также д. специфицировать детерминацию клеточных судеб (Stone and Rubel, 1999). Альтернативно активность Notch может быть низкой или отсутствовать в покоящихся BP , а активация Notch возможна только после повреждений HC . В этом случае повышенная активность Notch может быть необходима для респецификации клеток предшественников (SCs) в направлении сенсорной судьбы, как это происходит во время раннего развития. Во всяком случае, как только функция передачи сигналов Notch обнаруживается в покоящихся и поврежденных ВР кур, то важно изучить степень, с которой передача сигналов Notch оказывается активной в зрелом внутреннем ухе млекопитающих после повреждения и какую роль Notch играет в регуляции реакций SC после повреждений HC. Notch активность может ограничивать регенеративную реакцию у млекоптиающих путем предотвращения спонтанной трансдифференцировки SC после потери или повреждния HCs .

Signals regulating SC division


Мало исследованы сигналы, которые запускают процесс выхода SCs из покоя и вступления в клеточный цикл. Хотя большинство доказательств было собрано для вестибулярных SCs (rev. Oesterle and Hume, 1999; see below), некоторые хорошо известные внутриклеточные сигнальные пути участвуют в запуске делений SC в BP кур. Используя органные культуры канала улитки, Navaratnam et al. (1996) показали, что активация adenylate cyclase увеличивает количества SCs, которые делятся после воздействия Gentamicin , а модулирование передачи этих сигналов ведет к снижению делений SC. Используя культуры чистого utricular эпителия, исследование Witte et al. (2000) выявило дополнительные вторичные мессенджеры, включая PI-3 kinase, TOR-kinase и MAP-kinase, в сигнальном каскаде, приводящем к делениями SC. Какие внеклеточные факторы могут изменять эти сигнальные пути? Добавление basic FGF (bFGF) к культивируемым каналам улитки ведет к снижению делений SC (Oesterle et al., 2000). В соответствии с этим экспрессия FGF receptor3 является обильной в покоящихся SCs из BP и становится сильно пониженной в областях, где многочисленные SCs делятся, указывая тем самым, что ослабление передачи сигналов через этот рецептор может происходить прежде повторного вступления SC в клеточный цикл (Bermingham-McDonogh et al., 2001). В вестибулярном эпителии птиц эксперименты in vitro демонстрируют, что пролиферация SC ингибируется с помощью bFGF (Oesterle et al., 2000), Retinoic Acid (Warchol, 2002), N cadherin (Warchol, 2006) и Dexamethasone (Warchol, 1999). Напротив, Insulin, Insulin-like Growth Factor 1, Transforming Growth Factor alpha и Tumor Necrosis Factor alpha обладают митогенными эффектами на вестибулярные SCs, как и молекулы внеклеточного матрикса, Fibronectin (Oesterle et al., 1997; Warchol, 2002). С этой точки зрения эффекты различных сигнальных молекул, только что упомянутых, необходимо проверить in vivo. Эти наблюдения подтверждают. что множественные сигнальные пути взаимодействуют в SC , что бы регулировать ход их клетоного цикла.

Differentiation in post-mitotic cells


Имеется очень мало информации о том. как постмитотические клетки приобретают признаки SCs во время регенерации BP кур. Однако, дифференцировка клеток по пути HC была изучена до некоторой степени (e.g., Stone and Rubel, 2000b; Roberson et al., 2004; Stone et al., 2004; Duncan et al., 2006; Cafaro et al., 2007). Напр., некоторыми уже давно известными маркерами дифференцировки HC являются Myosins VI и VIIa. В чувствительных элементах улитки и преддверия позвоночных, включая кур, иммуномечение показало, что Myosin VI и Myosin VIIa специфически локализуются в HCs (Hasson et al., 1997; Torchinsky et al., 1999; Mangiardi et al., 2004; Roberson et al., 2004; Duncan et al., 2006). MyosinVI , как было показано, является одним из самых ранних маркеров дифференцировки HC у эмбрионов мышей после активации Atoh1 (Montcouquiol and Kelley, 2003; Kelley, 2006). В регенерирующем BP кур, HCs образуются или посредством прямой трансдифференцировки или клеточных делений, и обнаруживают повышенные уровни MyosinVI во время их ранней дифференцировки. Однако, SCs подвергающиеся прямой трансдифференцировке нуждаются в относительно большем времени, чтобы экспрессировать MyosinVI по вравнению с клетками предшественниками, формирующимися в результате делений. Белок Atoh1 обнаруживается в ядрах трансдифференцирующихся SCs спустя 15 ч post-Gentamicin (Cafaro et al., 2007). MyosinVI выявляется в трансдифференцирующихся SCs спустя 78 ч post-Gentamicin или на 63 ч позднее (Roberson et al., 2004). Напротив, вновь образовавшиеся посмитотические клетки обнаруживают обнаружимые уровни MyosinVI спусты 108 ч post-Gentamicin (Roberson et al., 2004), т.е. лишь спустя 36 ч после того как первые пролиферирующие клетки завершают митоз (в 72 ч). Существует, по крайней мере, два возможных объяснения подобной задержки экспрессии Myosin в HCs, возникающих прямо из SCs. Во-первых может быть необходимо достаточное количество времени для покоящихся SCs, чтобы подавить SC-специфические гены и активировать HC-специфические гены. Напротив, вновь сформированные постмитотические клетки предшественники возможно находятся в очень незрелом, лабильном состоянии, в смысле насколько готовы новые гены быть активированы и соотв. они способны быстро вступать на путь дифференцировки HC. Второе объяснение заключается в том, что завершение спецификации клеточной судьбы и дифференцировки задерживается у рано трансдифференцирующ0ихся клеток, поскольку поврежденные HCs остаются в эпителии, тогда как напротив большинство поврежденных HCs полностью отторгается ко времени запуска делений SC. (Временной пик отторжения HC приходится на промежуток между 30h и 42 ч [Mangiardi et al., 2004], который перекрывается с инициальной трансдифференцировкой SC, но предшествует инициации делений SC.) Эта форма регуляции д. указывать на то, что погибающие HCs контролируют превращение SCs с помощью двух путей регенерации.

Controlling regeneration: balancing modes of regen- eration and re-establishing SC quiescence


Сенсорный эпителий внутреннего уха и сенсорные элементы боковой линии высоко специализированы и их функция зависит от точного арранжемента HCs и SCs. Следовательно, крайне важно, чтобы корректное количество и тип клеток был восстановлен во время регенерации. Прямая трансдифференцировка ставит специфическую проблему, т.к. в каждый момент формируются новые HC, используя этот механизм, а SC теряются из эпителия. Тонкая регуляция прямой трансдифференцировки важна. из-за соотношения только 2-4 SCs на HC (Goodyear and Richardson, 1997), избыточная прямая трансдифференцировка д. приводить к истощению SC. Т.к. прямая трансдифференцировка инициируется раньше, то можно предположить, что превращение SC в HCs используется как ранний, быстрый способ получения новых HCs если только лишь немногие из них теряются. Однако, если большое количество HCs погибает, то улитка д. активировать митозы, чтобы поддержать целостность сенсорного эпителия. Избирательная дифференцировка постмитотических предшественников в SCs д. противодействовать SC истощению, вызванному прямой трансдифференцировкой. Деления SC могут генерировать или HCs или SCs (Raphael, 1992; Stone and Cotanche, 1994) , а во время ранних стадий пролиферации SC каждое митотическое событие с равной вероятностью д. давать симметрично дифференцирующиеся пары дочерних клеток (2 SCs или 2 HCs) или асимметричную пару (1 HC и 1 SC; Stone and Rubel, 2000b). Однако, специфические пространственно-временные паттерны митотической регенерации не были охарактеризованы в разные периоды регенерации, так что неясно пока, достаточна ли митотическая регенерация, чтобы компенсировать прямую трансдифференцировку или существуют др. механизмы (напр., клеточная гибель, перестройки клеток или иммиграция клеток извне эпителия) .
Ингибирование активности SC в BP также очень важно для установления корректных количеств и типов новых клеток. Механизмы контроля регенеративного поведения в SCs привлекли очень мало внимания и поэтому плохо изучены. Одним из привлекательных м-мов контроля, который обнаружен в др. сенсорном эпителии - это механизм негативной петли обратной связи, так что регенерируемые HCs и/или SCs ингибируют соседние SCs от дальнейших делений или трансдифференцировки (напр., see Bermingham-McDonogh et al., 2001). Негативная петля обратной связи в сомом деле может быть активной в регенерирующем эпителии внутреннего уха. Ясно, однако, что если негативная петля обратной связи для делений SC исходит от регенерирующих HCs, тогда сигнальные HCs д.ьыть сосвем незрелыми, т.к. деления SC становятся сильно ослабленными прежде, чем возникнут хорошо дифференцированные новые HCs в эпителии. Пик накопления BrdU во время регенерации наступает спустя 72h после одиночной инъекции Gentamicin и начинает снижаться к 96 ч и сильно редуцируется к 120 ч (Bhave et al., 1995; Duncan et al., 2006). Первый идентифицируемый маркер дифференцировки HC во вновь разделившихся клетках (Myosin VI и TUJ1) появляется в 96-108 ч, т.е. приблизительно в то же самое время, когда начинает снижаться мечение BrdU.

Comparisons with mammals


SCs внутреннего уха млекопитающих сходны с таковыми у птиц тем, что они обладают общими клетками предшественниками с HCs во врем развития и они остаются в тесном контакте с HCs в зрелом возрасте. Кроме того, SCs кортиева органа млекопитающих неспособны к какой-либо регенеративной реакции в ответ на потерю HC, посредством ли прямой трансдифференцировки или митозов (e.g., see Forge et al., 1998). Напротив имеются доказательства, что происходит существенная спонтанная регенерации HCs в вестибулярном эпителии млекопитающих, скорее всего посредством прямой трансдифференцировки (Forge et al., 1998).
Некоторые исследования подтверждают способность к регенерации HCs посредством или митотического или не-митотического пути после их потери в кортиевом органе млекопитающих в ходе пост-эмбрионального созревания. Напр., культивируемые SCs из раннего постнатального кортива органа обнаруживают значительную пролиферацию и часть постмитотических клеток может дифференцироваться в новые HCs (Malgrange et al., 2002; Doetzlhofer et al., 2004; White et al., 2006), но эта способность теряется со временем (White et al., 2006; Oshima et al., 2007). Неясно, отражают ли эти онтогенетические изменения внутренне присущий сдвиг в свойствах SC или отсутствие соотв. митогенных сигналов при созревании. Однако, недавние исследования подтвердили первую гипотезу. Во время эмбриогенеза клетки в эмбриональном эпителии улитки позитивно регулируют экспрессию cyclin-dependent kinase inhibitor, p27kip1 , примерно в то время, когда начинаются терминальные митозы (Chen and Segil, 1999; Lowenheim et al., 1999). Уровни p27kip1 белка остаются высокими в дифференцированных SCs в зрелом кортиевом органе, подтверждая. что p27kip1 обусловливает строгое ингибирование хода клеточного цикла в зрелых SCs и может удерживать их от делений в ответ на потерю HC. Делеция p27kip1 гена подтверждает эту гипотезу, т.к. нокаутные мыши обнаруживают расширенные периоды делений онтогенетических клеток предшественников и избыточную продукцию HCs и SCs in vivo (Lowenheim et al., 1999; Chen and Segil, 1999) и усиливают величину пролиферации in vitro (White et al., 2006). Сходные результаты наблюдаются, когда негативный регулятор клеточного цикла , Rb, делетируется (Sage et al., 2005; Sage et al., 2006). Хотя потеря ингибиторов клеточного цикла вызывает также повышенный апоптоз, эти эксперименты с нокаутами показывают, что ингибирование пролиферации SC , по-видимому, является важной ступенью в блокировании регенерации HC в улитке млекопитающих. Сходным образом, SCs могут терять свою способность непосредственно превращаться в HCs в ходе развития. Kelley et al. (1995) показали. что новые HCs генерируются в кортиевом органе мышей до ст. E16, если имеющиеся HCs устранялись с помощью лазера, но эта способность терялась после E16. У постнатальных крыс обработка ототоксином, Amikacin, вызывает значительные повреждения HC и ведет к появлению клеток. которые напоминают HC-SC гибриды (Daudet et al., 1998). Эти клетки, как полагают, являются SCs, в которых инициирована прямая трансдифференцировка, но они неспособны дифференцировать большинство свойств HC. Эти находки подтверждают, что способность слуховых SCs подвергаться прямой трансдифференцировке утеряна в ходе развития. Зрелые SCs могут быть слишком дифференцироваными, чтобы подвергаться прямой трансдифференцировке или имеются сигнальные механизмы, которые её предупреждают. Когда мы будем лучше понимать, как регулируется превращение SC в HC в BP птиц, мы сможем лучше понять степень, с которой SCs будут инициировать прямую трансдифференцировку в кортиевом органе млекопитающих. Немногие исследования подтверждают, что регенерация HC может происходить в вестибулярном эпителии зрелых млекопитающих. Напр., Forge et al. (1998) предприняли тщательный морфологический анализ вестибулярного эпителия морских свинок после ототоксического лекарства в разные моменты времени. Волосковые клетки казались потерянными полностью в striolar области спустя 1-2 недели после воздействия. Однако, количество HC увеличивалось в этой области спустя 2-4 недели. Т.к. мало возникает спонтанных делений SC после повреждений HC в utricle взрослых морских свинок (Rubel et al., 1995), то новые HCs скорее всего возникают благодаря прямой трансдифференцировке SCs. Эта интерпретация подтверждается находками, что количества SC снижаются после восстановления, что д. происходить, если SCs превращаются в HCs без митотического замещения. Исследования с культивиремыми вестибулярными сенсорными элементами показали, что добавление сыворотки или ростовых факторов существенно усиливает деления SC в зрелом вестибулярном эпителии, in vitro (Warchol et al., 1993; Lambert, 1994; Yamashita and Oesterle, 1995; Hume et al., 2003)и in vivo (Kuntz and Oesterle, 1998). Однако, необходимо доказать, что значительные количества постмитотических клеток способны дифференцироваться в HCs.

Summary and future directions


Исследования на позвоночных не млекопитающих, в частности на птицах, выявили несколько важных свойств клеточных и молекулярных процессов, ассоциированных с развитием и регенерацией сенсорных hair cells (HCs). Изучение прогрессивных морфологических и молекулярных изменений, которые происходят в поврежденном сенсорном эпителии начинают указывать на сигнальные пути, которые могут регулировать апоптоз HC и запускать процесс активации не-сенсорных supporting cells (SCs), чтобы они выходили из состояния покоя и дедифференцировались в направлении более примитивного состояния, характерного для клеток предшественников. Дополнительные кандидаты на роль регуляторных молекул, включают диффундирующие факторы и транскрипционные факторы, затем SCs подвергаются прямой фенотипической конверсии в HCs или делятся, чтобы сформировать потомство, которое дифференцируется в новые HCs и SCs. Несмотря на этот прогресс в нашем понимании, предстоит огроная работа по определению критических сигнальных путей, участвующих в этих стадиях регенерации. В частности сигналы, которые поддерживают SCs в покое в неповрежденном состоянии и/или сохраняют предшественники, подобные стволовым клеткам, выявляемые во время регенерации. Далее необходимо установить степень. с которой поведение SC после повреждения HC будет предопределяться прирожденными клеточными изменениями в противовес локально испускаемым сигналам.
Недавние успехи в технике, используемой для изучения регенерации HC у не млекопитающих, обещают расширить наше понимание молекулярных сигналов, необходимых для запуска процесса генерации SCs новых HCs. Напр.. два недавних исследования (Hawkins et al., 2003; Hawkins et al., 2007) использовали геномное профилирование, чтобы идентифицировать большое количество генов, которые меняются в в слуховом и/или вестибулярном эпителии птиц после повреждения HC. Эта характеризация сопровождалась генными микрочипами, которые определяли относительные уровни десятков тысяч транскриптов в данной ткани и позволяли сравнивать уровни экспрессии в тканевых выборках. Микрочиповый анализ делает возможной идентификацию молекулярных маркеров и сигнальных путей, до этого неизвестны., имеющих отношение к регенерации HC. Эти исследования подтвердили дифференциальные уровни экспрессии некоторых генов кандидатов, используя quantitative polymerase chain reaction и in situ гибридизацию, что создает дополнительную уверенность в ценности подхода. Follow-up technologies must now be developed to enable investigators to accept or reject hypotheses regarding the role of specific candidate genes in HC regeneration. Two examples of these are gene knock-down and gene misexpression. Inhibition of gene function through knockdown can be accomplished with RNA interference or RNA antisense approaches. Gene misexpression can be accomplished through delivery of conditionally or constitutively active genes into cells of interest. To our knowledge, no studies involving genetic perturbation in the post-embryonic amphibian or avian inner ear have been performed. However, delivery of modified nucleic acids into the developing chicken otocyst has been accomplished using retrivirus (e.g., Fekete et al., 1998), electroporation (e.g., Daudet and Lewis, 2005) and antisense morpholinos (Gerlach-Bank et al., 2004). The challenge is now to bring these methods for gene transfection and transduction into tissues of the mature inner ear. Another new area of study in the genetics of HC loss and regeneration has recently been developed in zebrafish, a classic model for genetics experiments. Hair cells of the lateral line neuromast are positioned along the external body wall of these fish. Neuromasts are therefore highly accessible to aminoglycosides and allow visual monitoring during HC damage and regeneration. Recent studies have investigated lateral line HCs and SCs after treatment with the aminoglycoside antibiotic, Neomycin (e.g., Williams and Holder, 2000; Harris et al., 2003). At this point, published studies have characterized only the basic morphologic events that occur. Nonetheless, these studies provide proof of concept that the behavior of lateral line HCs and SCs after aminoglycoside exposure is highly analogous to the inner ear of birds and amphibians. One group (E.W. Rubel, D. Raible et al. ) are now conducting mutagenesis studies in zebrafish aimed at identifying genes that confer either protection or increased susceptibility of lateral line HCs to Neomycin, as well as genes that alter the regenerative process after Neomycin exposure. In addition, parallel studies are screening small molecule libraries to identify drugs that alter HC damage after Neomycin. It would be interesting to determine the degree to which blockade of HC loss at various stages of the process alters SC responses. This information could help to pinpoint which HC changes must occur in order for SCs to become activated and initiate HC regeneration. In conclusion, since the discovery of HC regeneration in birds over 20 years ago, significant progress has been made in characterizing HC progenitors and their activities following HC loss in the inner ear of mature non-mammalian vertebrates. It is anticipated that future studies of molecular interactions governing HC development will continue to point the way for investigators interested in unraveling regulation of post-embryonic HC production. In addition, pioneering experimental approaches just described, as well as others, should help to identify new genes of interest and to reveal their function during HC regeneration.
Сайт создан в системе uCoz