Большинство эпителиальных тканей замещаются и способны к репарации после повреждения. Эпителии добавляют новые клетки, используя механизм пролиферации стволовых клеток. Напр., эпителий щеточной каймы кишечника и кожа. Однако, слуховой сенсорный эпителий, обнаруживаемый у птиц и млекопитающих является исключением тем, что стволовые клетки в них не идентифицированы. У птиц потеря волосковых клеток может быть спонтанно замещена (Corwin and Cotanche, 1988, Ryals and Rubel, 1988). Структурное восстановление, наблюдаемое в слуховом эпителии птиц сопровождается выраженным функциональным восстановлением (Adler et al., 1993, Dooling et al., 1997,
Marean et al., 1995, Niemiec et al., 1994). Клеточной основой для регенерации волосковых клеток у птиц является спонтанная трансдифференцировка поддерживающих клеток в новые волсковые клетки с или без митозов (Adler and Raphael, 1996, Roberson et al., 1996, Stone and Cotanche,1994). Способность зрелых дифференцированных клеток изменять свои характеристики в основном редка. mature differentiated cells to change their
identity is rather uncommon. Однако, она направлена на поддержание клеток в качестве потенциального источника для генерации новых волосковых клеток в ухе млекопитающих. Необходимо лучше понять молекулярный механизм инициации и регуляции фенотипических изменений, которые происходят, когда поддерживающие клетки спонтанно трансдифференцируются в восковые клетки у птиц.
Трансдифференцировка в базилярном отроске может происходить с или без митозов (Adler and Raphael, 1996, Raphael, 1993, Roberson et al., 1996; Stone and Cotanche, 1994). В случае прямой трансдифференцировки (без митозов) клетки со смешанным фенотипом обнаруживаются в сенсорном эпителии. Такие клетки обладают признаками волосковых и поддерживающих клеток (Adler and Raphael, 1996). Молекулярная передача сигналов, которая регулирует трансдифференцировку в базилярном отростке, использует передачу сигналов Notch и обнаруживает сходство в онтогенетическими событиями (Stone and Rubel, 1999), а Atoh1
участвует в дифференцировке новых волосковых клеток (Cafaro et al., 2007).
Если экспериментальные повреждения в базилярном отростке чрезвычайно тяжелые, то регенерация волосковых клеток неполная. В этом случае клетки из областей, фланкирующих сенсорный эпителий могут мигрировать в сайт сенсорного эпителия (Cotanche et al., 1995). Это исследование продемонстрировало, что степень повреждения не-сенсорных клеток детерминирует способность этих клеток генерировать новые волосковые клетки и репарировать эпителий и его функцию. Было также показано, что эпителиальные клетки из областей соседних с сенсорным эпителием могут мигрировать и вносить вклад в поддержание эпителиального слоя. Оба эти факта будут рассмотрены ниже. В целом же способность дифференцированных не-сенсорных клеток становиться новыми функциональными стволовыми клетками и восстанавливать слух у птиц предлагает концептуальную стратегию по индукции сходного регенеративного механизма в слуховом эпителии млекопитающих.
Два метода могли бы быть пригодными для генерации новых волосковых клеток. Первый базируется на использовании онтогенетических генов для реактивации онтогенетических сигнальных каскадов и индукции трансдифференцировки не-сенсорных клеток в новые волосковые клетки. Второй связан с введением стволовых клеток в улитку. Если стволовые клетки будут интегрироваться с тканью хозяина, но они смогут дифференцироваться и функционировать как волосковые клетки. Оба метода полагаются на выживание не-сенсорных клеток в качестве субстрата для этих терапевтических вмешательств. Следовательно, одной из наиболее важных целей усовершенствования этой технологии является характеризация реципиентной ткани, мишени и субстрата для воздействия. Несколько факторов влияют на судьбу несенсорных клеток. которые остаются в ухе. Среди наиболее важных факторов это тип (etiology) и тяжесть делеции и количество времени, прошедшее с момента повреждения.
Когда волосковые клетки дегенерируют после умеренного ототоксического инсульта, то инициируется высоко регулируемый и сложный механизм формирования рубца с помощью не-сенсорных клеток, которые окружают погибающие клетки (Forge, 1985, Leonova and Raphael, 1997, Raphael and Altschuler, 1991a, Raphael and Altschuler, 1991b). Непосредственная роль процесса формирования рубца, по-видимому, предупреждает перемешивание жидкости. Особенно важно предупредить утечку эндолимфы в жидкость, омывающую базальный домен внутренних волосковых клеток, где располагаются окончания слухового нерва. Богатая калием эндолимфа д. деполяризовать волосковые клетки и нейроны , устраняя слух и приводя, скорее всего, к дополнительным травмам кортиевого органа.
Спустя короткое время после ототоксического повреждения, индуцированного kanamycin и ethacrynic кислотой, поддерживающие клетки, которые формируют phalangeal рубцы, сохраняют большинство своих дифференциальных признаков (Forge, 1985,
Fig. 1. The area of the organ of Corti after hair cells are eliminated using kanamycin and ethacrynic acid (A-C) or neomycin (D-F). (A) SEM view of the surface showing lack of hair cells, while pillar cells (p) remain differentiated and well organized. (B) A whole-mount stained with phalloidin and photographed immediately below the reticular lamina showing differentiated pillar cells and well organized phalangeal scars (ps) in the former outer hair cell area. (C) A plastic section showing the auditory epithelium devoid of hair cells with surviving tall pillar cells and other supporting cells. (D) SEM image of the flat epithelium in which no organized cellular pattern can be discerned. (E) Phalloidin labeled whole-mount viewed at the reticular lamina showing a poorly organized epithelium with abundance of actin in intercellular junctions. (F) A plastic section showing a flat epithelium lining the scala media on the basilar membrane. Bars are 20 мm and apply to the paired image on the right.
Lenoir et al., 1999, Raphael and Altschuler, 1991a). Клетки остаются высокими, некоторые из их цитосклетных признаков остаются интактными, а апикальная поверхность эпителия остается хорошо организованной и напоминает нормальный орган корти за исключением отсутствия волосковых клеток (Figs. 1A-C and 2A,B). Сходный паттерн образования рубцов может также появляться после повреждений , которые менее тяжелые, чем от комбинации kanamycin
и ethacrynic кислоты. Усиленная стимуляция с помощью шумов или звука, которые вызывают потерю волосковых клеток, может также приводить к дифференцировке не-сенсорных клеток (Abrashkin et al., 2006). Переход от нормального кортиева органа к эпителию, содержащему дифференцированные поддерживающие клетки и не содержащему волосковых клеток может происходить в течение одного двух дней (Izumikawa et al., 2005, Wang and Li, 2000).
Если не-сенсорные клетки в кортиевом органе дифференцируются несмотря на потерю волосковых клеток, то клеточная пролиферация или вновь генерируемые клетки не обнаруживаются в этой области (Roberson and Rubel, 1994, Wang and Li, 2000). Однако, эти два исследования показали, что небольшое количество BrdU позитивных клеток может быть обнаружено в областях, фланкирующих кортиев орган. Такие клетки не обнаруживаются в ушах, которые не получают экспериментальной травмы. Состояния сенсорного эпителия в ушах, потерявших свои волосковые клетки в результате наследственных заболеваний не достаточно охарактеризованы на животных моделях, хотя в некоторых случаях эпителий становится плоским (Pawlowski et al., 2006). В др. случаях pillar клетки могут сохраняться в течение нескольких мес. не смотря на потерю волосковыхв клеток (Hertzano et al., 2004). У людей временные исследования костей восновном проводили на ушах с генетическими заболеваниями, которые также получали кохлеарные имплантаты. В таких ушах слуховой эпителий был плоским в большинстве случаев (Nadol, 1997, Nadol and Eddington, 2006, Nadol et al., 2001). Подобные исследования на ушах старых людей также обнаруживали плоский эпителий на базилярной мембране, но исследования на животных показали. что в ушах старых животных могут оставаться дифференцирующиеся поддерживающие клетки.
Lesions that leave a flat epithelium
Тяжелые повреждения могут приводить к потере волосковых клеток, а также к дегенерации поддерживающих клеток. Если дифференцированные поддерживающие клетки исчезают, то слой плоских или кубовидных клеток, выстилает scala media, на которой располагается кортиев орган (Figs. 1 D-F and 2C). Эти короткие кубовидные клетки не были изучены в деталях в основном из-за того, что не было особого смысла в выяснении их характеристик. Однако, недавний прогресс в генной терапии и биологии стволовых клеток привели к необходимости характеристики эпителиального слоя кубовидных и плоских клеток. Ясно. что плоский эпителий может играть важную роль в качестве мишени для терапии.
Плоский эпителий замещает дифференцированные поддерживающие клетки кортиева органа, когда повреждения достаточно тяжелые. чтобы вызывать дегенерацию поддерживающих клеток. Во многих случаях эпителий уплощается во время сторой стадии патологии. Сначала гибнут волосковые клетки, а поддерживающие клетки формируют типичные phalangeal рубцы. Затем, после формирования рубцов и исчезновения волосковых клеток поддерживающие клетки замещаются простым эпителием. Переход от нормального кортиева органа к такому. который содержит плоский эпителий может происходить в течение двух дней (Kim and Raphael, 2007) или нескольких месяцев (Sugawara et al., 2005). В последнем исследовании было продемонстрировано, что удаленный исход ототоксического инсульта может проявляться как дифференцированный не-сенсторный эпителий в апикальной части улитки и плоский эпителий в базальной части. Были также продемонстрированы важные взаимоотношения между состоянием не-сенсорного эпителия и жизнеспособностью спирального ганглия.
Сегодня неизвестно из какого типа клеток возникает плоский эпителий. две наиболее вероятные возможности: (a) оригинальные поддерживающие клетки (Deiters и pillar клетки и вообще Hensen's клетки и внутренние phalangeal клетки) дедифференцируются и становятся плоскими или (b) оригинальные поддерживающие клетки погибают, а клетки из фланкирующих областей мигрируют и замещают их. Фланкирующие клетки д. формироваться из регионов, таких как Hensen's клетки, или внутренней или наружной бороздок и вообще даже из Claudius клеток или interdental клеток на краю.
Клетки плоского эпителия обнаруживаются в ушах, которые потеряли волсковые клетки из-за тяжелой ототоксичности, сильных шумов или повышенной стимуляции звуком, инфекций и старения. Такие клетки наблюдались также в ушах с кохлеарными имплантами, которые становились глухими в результате действия факторов, перечисленных выше. Плоские клетки могут выглядеть кубовидными или полностью плоскими. Пока мало известно о причинах деградации слухового эпителия до стадии плоского эпителия и о биологии этих клеток. Возможно, что большинство (если не все) пациенты, которые хотели бы разузнать о замещении волосковых клеток при тяжелой потере слуха, имеют улитки с плоским эпителием. Хотя покой находится среди признаков сенсорного эпителия
Fig. 2. Schematic depiction of the transition of the auditory epithelium
from the normal morphology (A) to the state where supporting cells
remain differentiated despite the loss of hair cells (B) and to the state of
the flat epithelium (C). (A) The normal organ of Corti contains inner hair
cells (green) and outer hair cells (blue), as well as supporting cells (white).
(B) After hair cells are lost (at the short term and/or after a moderate
insult), supporting cells remain as tall differentiated cells but their volume
is increased as they fill the space vacated by the degenerated hair cells.
(C) After severe lesions and/or long durations after the insult, the organ
of Corti becomes a simple flat epithelium.
нормальной улитки, он не характерен для плоского эпителия. Так, в улитке взрослых морских свинок после инъекции neomycin образуется плоский эпителий из не-сенсорных клеток, которые подвергаются существенно пролиферации спустя 4 дня после ототоксического инсульта (Kim and Raphael, 2007). В результате плотность не-сенсорных клеток, которые отделяют эндолимфу, увеличивается и эпителиальный слой поддерживает их слияние. Эта пролиферативная реакция предоставляет возможности для переноса генов и терапии стволовыми клетками. Необходимо расширить исследования митозов в плоском эпителии у др. видов, чтобы выявить не могут ли дополнительные повторные инсульты индуцировать возобновление фазы пролиферации.
Factors that influence the fate of supporting cells
Последовательность дегенерации разных типов клеток может помочь пониманию их взаимозависимости. Было показано, что первичная потеря слуховых нейронов не ведет ко вторичной дегенерации поддерживающих клеток и что присутствие поддерживающих клеток в области внутренних волосковых клеток влияет на жизнеспособность нейронов (Sugawara et al., 2005). Пока неясно, почему поддерживающие клетки выживают в дифференцированном состоянии в некоторых случаях и становятся плоскими в др. с этой точки зрения мы можем только предполагать, что поддерживающие клетки непосредственно чувствительны к чрезвычайным уровням определенных повреждающих воздействий, таких как избыточная стимуляция звуком или ототокисческие вещества. Причина дегенерации поддерживающих клеток может быть важной для разработки способов индукции выживания этих клеток. Однако, будучи дифференцированными поддерживающие клетки теряются, причиной их потери не может иметь отношения к индукции регенеративных процессов в ткани.
Reparative strategy for differentiated supporting cells
Когда дифференцированные поддерживающие клетки остаются в оглохшем ухе, то форсированная экспрессия онтогенетических генов, таких как Atoh1 может генерировать новые волосковые клетки без или с помощью митоза. Трансдифференцировка не является распространенным процессом, в котором дифференцированные клетки меняют свои характеристики и становятся клетками нового типа (Call et al., 2005, Li et al., 2005). Находки. что поддерживающие клетки в базилярном отростке птиц делятся и трансдифференцируются в новые волосковые клетки после элиминации оригинальных волосковых клеток (Raphael, 1992, Stone and Cotanche, 1994, Stone and Rubel, 2000) инспирировало попытки индуцировать трансдифференцировку в улитке млекопитающих, где спонтанная трансдифференцировка не происходит. Исследования in vitro и in vivo показали, что в зрелом кортиевом органе избыточная экспрессия гена, который индуцирует дифференцировку волосковых клеток во время нормального эмбрионального развития, также может индуцировать трансдифференцировку дифференцированных поддерживающих клеток в волосковые клетки (Izumikawa et al., 2005, Shou et al., 2003, Zheng and Gao, 2000).
Усиленная экспрессия Atoh1 в поддерживающих клетках может индуцировать их трансдифференцировку в течении немногих дней после потери волосковых клеток. присутствие эктопических волосковых клеток после форсированной экспрессии Atoh1 подтверждает, что дифференцированные клетки, расположенные вне кортиева органа также могут отвечать экспрессией этого гена (Kawamoto et al., 2003). Одной из проблем, связанных с трансдифференциальной терапией является уменьшение количества поддерживающих клеток. Комбинация этой терапии с усилением митозов в эпителии может улучшать структурный и функциональный результат этой процедуры. Др. проблема, связанная с использованием онтогенетических генов, является ограниченная временная рамка их действия. Трансдифференцировка может быть обнаружена, когда форсированная экспрессия Atoh1 индуцируется спустя 4 дня после потери стволовых клеток (Izumikawa et al., 2005), а позднее эта способность уменьшается (our unpublished data).
Манипуляции с регуляторными генами клеточного цикла является др. потенциальным путем для использования регенерации волосковых клеток в оглохшем слуховом эпителии. Как упоминалось выше увеличение количства доступных поддерживающих клеток может усиливать репарацию, обеспечиваемую с помощью Atoh1. необходимо найти пути, которые ведут непосредственно от пролиферации клеток к регенерации новых волосковых клеток. Мутации мышей, в которых поддерживающие клетки выходили из состояния покоя, характеризовались повышенными количествами волосковых клеток (Chen and Segil, 1999, Lowenheim et al., 1999). В то время как слух у этих мышей находится под угрозой большинство исследований функции таких ушей может помочь улучшить слух и подготовить почву для использования генов клеточного цикла для регенерации волосковых клеток. Дефицит экспрессии др. гена, регулирующего клеточный цикл, Rb1, также характеризуется повышенной продукцией волосковых клеток (Sage et al., 2005). Очевидно, что в нормальных ушах пролиферация не-сенсорных клеток сама по себе не индуцирует генерацию новых волосковых клеток (Minoda et al., Raphael paper in revision).
Терапия стволовыми клетками является др. подходом для помещения новых волосковых клеток в оглохший слуховой эпителий, который сохраняет дифференцированные поддерживающие клетки. Стволовые клетки из нескольких источников могут заставить дифференцироваться в фенотип волосковых клеток (Li et al., 2004, Li et al., 2003). Чтобы интегрироваться в ухо и стать функциональными эти клетки д. или быть дифференцированы
in vitro и затем имплантированы или имплантированы и затем вынуждены дифференцироваться в ухе. В настоящее время оба подхода кажутся обнадеживающими. Оставшиеся поддерживающие клетки в оглохшем ухе участвуют в обеспечении герметизации эндолимфы и вряд ли облегчат интеграцию экзогенных клеток, внесенных в ухо. Создание интерфейса между реципиентной тканью и стволовыми клетками может помочь интеграции впоследствии.
Reparative strategy for the flat epithelium
Две стратегии могут быть представлены для восстановления слуха в ушах с плоским эпителием. одна возможность связана с воспроизведением развития путем применения набора генов последовательно, в той последовательности. в которой эти гены экспрессируются во время развития. Большинство из важных генов идентифицировано (Fritzsch et al., 2006). Такая терапия д. начинаться с ранних онтогенетических генов и заканчиваться экспрессией
Atoh1. Возможно, что количество генов может оказаться не слишком большим, если экспрессия некоторых из них будут спонтанно приводить к экспрессии др. Способность плоского эпителия пролиферировать (Kim and Raphael, 2007)
д. облегчать использование крупных генов, вставленных с множественными промоторами, чтобы создать такой комплекс генной экспрессии. Подход со стволовыми клетками является др. потенциальной стратегией для биологической репарации слуха, когда эпителий плоский. Детальная характеристика клеток плоского эпителия д. помочь в создании путей интеграции стволовых клеток в эту ткань. Скорее всего, как стволовые клетки, так и реципиентные клетки необходимо видоизменить для такой интеграции. Использование вирусных векторов или др. средств для переноса генов может быть необходимым для препарирования плоского эпителия, для восприятия им стволовых клеток. Т.о., обнадеживающий прогресс в получении и дифференцировке стволовых клеток в волосковые клетки д. учитывать параллельный прогресс для успешной интеграции этих клеток в ткань.
Nerves interaction with epithelial cells
Новые волосковые клетки д. быть иннервированы, чтобы функционировать. Сколь долго будут выживать первичные слуховые нейроны столь же долго волосковые клетки будут привлекать их к области, где они смогут контактировать и создавать функциональные окончания. Нейриты. как было установлено, извиваются в слуховом эпителии, лишенном волосковых клеток (Bohne and Harding, 1992). Доказательства способности нейронов достигать новых мишеней в слуховом эпителии следуют из находок по иннервации эктопических волосковых клеток (Kawamoto et al., 2003) и по улучшению функции после терапии Atoh1 в оглохших ушах (Izumikawa et al., 2005). Если слуховые нейроны отсутствуют, то необходимы дополнительные меры, подобные использованию стволовых клеток (see Chapter by Edge). В ушах людей слуховые нервы выживают во многих случаях повреждений волосковых клеток и как погалают отсылают новые периферические отростки, если появляются новые мишени (волосковые клетки).
Концептуальным следствием событий, описанных выше, следует ожидать сначала появления новых волосковых клеток, а затем привлечение нейронов. Концепция не определяет роли нейронов для дифференцировки новых волосковых клеток, по крайней мере, на ранней стадии. Это согласуется с находками, что волосковые клетки могут развиваться в отсутствие иннервации (Fritzsch and Beisel, 2004, Fritzsch et al., 2005). Не-сенсорные клетки, которые остаются в оглохшем ухе также могут быть использованы для усиления жизнеспособности нервов и действуют так, чтобы улучшить результат кохлеарного импланта. Эти клетки могут быть искусственно преобразованы, чтобы секретировать ростовые факторы иди др. молекулы, которые могут позитивно влиять на нейроны. Поэтому важно охарактеризовать способность плоского эпителия трансдуцироваться с помощью вирусных векторов или др. средств экспрессии трансгенов. Способность плоского эпителия пролиферировать (Kim and Raphael, 2007) подтверждает, что вирусные вектора могут интегрироваться в ДНК хозяев и обеспечивать долговременную экспрессию генов.
Сайт создан в системе
uCoz
YOUNG-HO KIM, YASUNORI OSUMI and MASAHIKO IZUMIKAWA