Мечников впервые описал врожденную иммунную систему более ста лет тому назад, но до сих пор исследования в этой критической ветви иммунитета оказались в тени открытия антибиотиков, B и T клеток и др. компонентов адаптивной иммунной системы (Silverstein 2003). Недавние работы, однако, дали важную информацию о составе и функции врожденного иммунитета и сегодня очевидно, что врожденная иммунная система использует замысловатую сеть эффекторных механизмов, чтобы устранить или ослабить репликацию патогенов до тех пор, пока адаптивная иммунная система не сможет обеспечить более специфический и сильный ответ. В 1989, Janeway (1989) предположил, что врожденные эффекторные механизмы запускаются посредством специфической детекции микробов с помощью кодируемых зародышевой линией, не клональных рецепторов, которые существенны для непосредственной детекции и контроля инфекции у млекопитающих. Эти молекулы были названы pattern-recognition receptors (PRRs), с функцией главным образом распознавать микробные структуры, обозначаемые как pathogen-associated molecular patterns (PAMPs).

Построенные на этой фундаментальной гипотезе, исследования показали, что врожденная иммунная система филогенетически законсервирована и присутствует у всех многоклеточных организмов (Hoffmann 1999, Medzhitov 2001, Medzhitov & Janeway 1997). Как было предположено Janeway (1989), врожденный иммунитет фактически основывается на детекции с помощью PRR обильно экспрессирующихся PAMPs, которые законсервированы среди широких классов микроорганизмов. Эти молекулы являются критическими для репликации и/или выживания патогенов и являются уникальными для микроорганизмов. Т.о., они отсутствуют в клетках хозяина и тем самым обеспечивают хозяина эффективным, не направленным на себя самого, средством выявлять инвазирующие патогены. Примеры таких микробных продуктов включают lipopolysaccharide (LPS), lipoproteins и вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты. Предача сигналов посредством PRRs индуцирует каскад событий, включая продукцию провоспалительных хемокинов и цитокинов, активацию комплемента, рекрутирование фагоцитирующих клеток и мобилизацию профессиональных антиген-презентирующих клеток.

В конце 1990s, 3 ключевых открытия существенно повысили наше понимание и определение PRR-обеспечиваемого врожденного иммунитета. Во-первых, в 1996 идентифицирован у Drosophila melanogaster белок Toll, идентифицирован прежде всего благодаря его роли в формировании дорсо-вентрального паттерна эмбрионов, который как было установлено является критическим для эффективного иммунного ответа у взрослых мух против грибка Aspergillus fumigatus (Lemaitre et al. 1996). В следующем году идентифицирован гомолог Drosophila Toll рецептора у млекопитающих был назван первоначально human Toll, а теперь известен как Toll-like receptor 4 (TLR4). Конституитивно активная форма этого рецептора д. активировать транскрипцию фактора nuclear factor-kappa B (NF-κB), что ведет к экспрессии про-воспалительных генов, кодирующих interleukin (IL)-1, IL-6 и IL-8 и к позитивной регуляции ко-стимулирующих молекул (Medzhitov et al. 1997). Наконец, идентификация точковой мутации в гене Tlr4, которая делает мышей не чувствительными к воздействию LPS и более чувствительными к Грам-негативному бактериальному сепсису, что определенно связывает TLRs с реакциями врожденного иммунитета (Poltorak et al. 1998).

TLRs являются типа I трансмембранными белками из семейства Interleukin-1 receptor (IL-1R), которые обладают N-терминальным leucine-rich-repeat (LRR) доменом для связывания лиганда, одиночным трансмембранным доменом и С-теримнальным внутриклеточным сигнальным доменом. С конец TLR является гомологичным внутриклеточному домену IL-1R и поэтому обозначается как Toll/IL-1 receptor (TIR) домен. TLRs экспрессируются на клеточной мембране и в субклеточных компартментах, таких как эндосомы. TLRs широко экспрессируются во многих типах клеток, включая не-гематопоэтические эпителиальные и эндотелиальные клетки, хотя большинство типов клеток экспрессирует только избранный субнабор этих рецепторов. Гематопоэтического происхождения сторожевые клетки, такие как макрофаги, нейтрофилы и dendritic cells (DCs), однако, экспрессируют большинство TLRs, с некоторой вариацией в разных субнаборах, напр., между обычными DCs и plasmacytoid DCs. До сих пор идентифицировано 13 у млекопитающих, 10 у людей и 13 у мышей (Beutler 2004). TLRs 1-9 законсервированы у людей и мышей, однако TLR10 присутствует только у людей, а TLR11 функционален только у мышей. Хотя многое известно о лигандах и сигнальных путях TLRs 1-9 и 11, биологическая роль TLRs 10, 12 и 13 остается неизвестной, т.к. паттерны их экспрессии, лиганды и способы передачи сигналов еще не установлены.

В последние несколько лет опубликовано несколько замечательных обзоров, детализирующих многие аспекты биологии TLR. Чтобы избежать повторения мы сфокусируемся на механизмах, с помощью которых TLRs распознают лиганды и индуцируют специфические сигнальные каскады для уникальных антимикробных генных программ и общих про-воспалительных ответов. Мы коротко рассмотрим известные лиганды TLR, обсудим механизмы, с помощью которых TLRs добиваются разнообразия в распознавании лигандов и обсудим молекулярные пути, которые предопределяют сигнальную специфичность.

TLR LIGAND SPECIFICITIES

TLR1, TLR2, and TLR6

LPS первоначально рассматривались как лиганд для TLR2, но последующие исследования показали, что загрязняющий бактериальный липопротеин в препаратах LPS является настоящим лигандом (Wetzler 2003). Согласуются с этим и последние находки, TLR2-дефицитные макрофаги оказались гипочувствительными к некоторым компонентам стенок Грам-позитивных бактериальных клеток , а также к Staphylococcus aureus peptidoglycan (Takeuchi et al. 2000). Дополнительные исследования показали, что TLR2 участвует в распознавании широкого круга микробных продуктов и в общем действует как гетеродимер или с TLR1 или TLR6 (Ozinsky et al. 2000, Wyllie et al. 2000). Гетеродимер TLR2/TLR1 распознает разнообразные липопротеины, включая и из микобактерий и менингококков (Takeuchi et al. 2002, Wetzler 2003), в то время как TLR2/TLR6 комплекс распознает lipoproteins и peptidoglycan из микоплазм (Takeuchi et al. 2001). Недавние сообщения продемонстрировали, что триацилированные липопротеины из бактерий преимущественно распознаются с помощью комплекса TLR1/TLR2, в то время как диацелированные липопротеины распознаются комплексом TLR2/TLR6 (Takeuchi et al. 2002). Однако, дополнительные TLR2 лиганды. по-видимому, не нуждаются в TLR1 или TLR6 для передачи сигналов, это указывает на то, что TLR2 может распознавать некоторые лиганды в качестве гомодимеров или гетеродимеров с др. не-TLR молекулами. Такие TLR2 лиганды включают компонент стенки Грам-позитивных клеток, lipoteichoic acid; компонент стенки клеток mycobacteria

Figure 1 TLR ligand specificities. TLRs recognize a diverse array of PAMPs from bacteria, viruses, protozoa, and fungi. For detection of bacteria, heterodimeric TLR2/1 binds triacyl lipopeptides, whereas TLR2/6 dimers bind diacyl lipopeptides and lipoteichoic acid. Homodimeric TLR2 binds peptidoglycan, atypical LPS, phenol-soluble modulin from Staphylococcus epidermidis, and porin proteins from Neisseria. In addition, TLR4 binds LPS, TLR5 binds flagellin, and TLR9 binds bacterial CpG DNA. TLR11 detects an unidentified protein(s) from uropathogenic Escherichia coli. Viral dsRNA, RSV F protein, ssRNA, and unmethylated CpG DNA are sensed by TLRs 3, 4, 7/8, and 9, respectively. Finally, heterodimeric TLR2/6 binds fungally derived zymosan and Trypanosoma cruzi GIPLs, whereas TLR11 also senses a profilin-like protein from Toxoplasma gondii. Abbreviations: dsRNA, double-stranded RNA; LPS, lipopolysaccharide; GIPLs, glycolipids; PAMP, pathogen-associated molecular pattern; RSV F, respiratory syncytial virus fusion; ssRNA, single-stranded RNA; TLR, Toll-like receptor.

lipoarabinomannan; атипичные LPS, продуцируемые Legionella, Leptospira interrogans, Porphyromonas gingivitis и Bordetella; и porins, присутствующие на наружной мембране Neisseria (Figure 1) (Massari et al. 2002,Wetzler 2003).

В дополнение к бактериальным PAMPs, TLR2 гетеро/гомодимеры распознают молекулы грибков и простейших. Zymosan (грубая смесь из glucans, mannan, белков, хитина и гликолипидов, экстрагированных из клеточных мембран грибов) индуцирует передачу сигналов посредством TLR2/6 (Kataoka et al. 2002, Underhill et al. 1999a). Кроме того, glycosylphosphatidylinositol (GPI) закрепляет, а glycoinositolphospholipids из паразитического простейшего Trypanosoma cruzi индуцирует передачу сигналов посредством TLR2 (Campos et al. 2001).

TLR3

Давно предполагалось, что double-stranded RNA (dsRNA) является вирусным PAMP, т.к. она возникает во время многих вирусных инфекций. Экспрессия TLR3 человека обеспечивает чувствительность к очищенной dsRNA и к polyinosinic-polycytidylic acid [poly(I:C)] в клетках HEK293, a TLR3-дефицитные мыши обнаруживают нарушенные реакции на эти лиганды. Передача сигналов TLR3 приводит к активации NF-κB и interferon regulatory factor 3 (IRF3), что в конечном счете ведет к продукции антивирусных молекул, таких как типа I interferons (IFN-α/β) (Alexopoulou et al. 2001).

Недавние исследования, однако, продемонстрировали независимое от TLR3 распознавание вирусной dsRNA посредством helicases RIG-I (retinoic acid-inducible gene I) и MDA5 (melanoma-differentiation-associated gene 5), которые являются цитоплазматическими PRRs, экспрессируемыми в обилии во многих типах клеток (Andrejeva et al. 2004, Yoneyama et al. 2004). RIG-I и MDA5 дифференциально распознают разные группы вирусных РНК и поэтому являются критическими для мощной антивирусной реакции (Kato et al. 2006). Эти рецепторы содержат helicase домен для связывания РНК и два caspase recruitment domains (CARDs) для сигнальной трансдукции. После связывания лиганда RIG-I и MDA5 присоединяют и активируют адаптор IPS-1 (interferon-β promoter stimulator 1; наз. также CARDIF, MAVS и VISA) для активации NF-κB и IRF3 и последующей продукции IFN-β (Kawai et al. 2005, Meylan et al. 2005, Seth et al. 2005, Sun et al. 2006, Xu et al. 2005). Важность обеспечиваемого с помощью RIG-I и MDA5 распознавания вирусов в дальнейшем была подтверждена с помощью экспериментов по генному таргетингу, показавшими, что TLR3 и его адаптор TRIF не нужны для продукции type I IFN в некоторых инфицированных вирусом клетках, таких как фибробласты и обычные DCs (Honda et al. 2003). Однако plasmacytoid дендритные клетки используют исключительно передачу сигналов TLR3/TRIFдля продукции типа I IFN в ответ на РНК вирусов и poly(I:C) (Kato et al. 2005).

TLR4

LPS являются наиболее тщательно изученным лигандом TLR. LPS, гликолипидный компонент из наружной мембраны Грам-отрицательных бактерий, обладает наиболее мощной иммуностимулирующей активностью среди известных лигандов для TLR (Miyake 2004). Следовые количества LPS активируют врожденную иммунную систему посредством TLR4, приводя к продукции многочисленных про-воспалительных медиаторов, таких как TNFα, IL-1, и IL-6. Одного TLR4 не достаточно для сильной реакции на LPS; необходим комплекс распознавания дополнительных компонентов LPS, CD14 и MD-2. Др. лигандами для TLR4 являются аналоги Lipid A (Lien et al. 2000), taxol (Perera et al. 2001), микобактериальные компоненты (Means et al. 1999), гифы Aspergillus (Mambula et al. 2002), Cryptococcus neoformans капсулярный полисахарид (Shoham et al. 2001) и respiratory syncytial virus (RSV) F protein (Kurt-Jones et al. 2000).

TLR5

Flagellin, белковый компонент жгутиков Грам-отрицательных бактерий, является известным лигандом для TLR5 (Hayashi et al. 2001). TLR5 распознает высоко законсервированную, центральную стержневую структуру из flagellin, которая важна для сборки протофиламент и подвижности бактерий (Smith et al. 2003). Интересно, что место распознавания в TLR5 замаскировано в филаментозную жгутиковую структуру, указыая тем самым, что TLR5 распознает только мономерный flagellin (Smith et al. 2003). Более того, flagellin, по-видимому, соединяется непосредственно с TLR5 остатками 386-407 в extracellular domain (ED), т.к. TLR5-ED мутанты, лишенные этого домена неспособны взаимодействовать с flagellin в биохимических пробах (Mizel et al. 2003b). Недавно было продемонстрировано TLR5-независимое распознавание цитозольного Salmonella typhimurium flagellin посредством Ipaf, члена nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-LRR (Franchi et al. 2006, Miao et al. 2006). Ipaf-обеспечиваемое распознавание цитозольного flagellin является критическим для активации caspase-1 и последующей секреции IL-1β макрофагами, это подчеркивает важность TLR-независимого паттерна распознавания в общей сложности реакций врожденного иммунитета.

TLR7 and TLR8

Мышиный TLR7 распознает класс синтетических антивирусных соединений, таких как imidazoquinolines и loxoribine (Hemmi et al. 2002). Более того, TLR7 и человеческий TLR8 выявляют антивирусное azoquinoline соединение R-848 (Jurk et al. 2002). Эти синтетические соединения структурно родственны нуклеиновым кислотам; TLR7 и человеческий TLR8 распознают guanosine- или uridine-обогащенные single-stranded RNA (ssRNA), происходящие из РНК вирусов (Diebold et al. 2004, Heil et al. 2003, Lund et al. 2004). Интересно, что РНК млекопитающих, которая содержит много модифицированных нуклеозидов, является существенно менее стимулирующей для TLRs 7 и 8, чем бактериальная РНК, это говорит о том, что млекопитающее хозяин использует модификации нуклеозидов как средство для создания отличий между эндогенными и производными патогенов РНК (Kariko et al. 2005). Сходно с функцией TLR3, использование этих рецепторов ведет к продукции типа I IFNs, которые являются облигатными компонентами антивирусного врожденного иммунитета.

TLR9

TLR9 распознает бактериальную ДНК, содержащую неметилированные CpG мотивы, a TLR9-дефицитные мыши не отвечают на вызов CpG ДНК (Hemmi et al. 2000). TLR9 экспрессируется в plasmacytoid DCs, распознавая вирусного происхождения CpG последовательности для индукции IFN-α (Krug et al. 2004, Lund et al. 2003, Takeshita et al. 2001). Низкая частота и высокая скорость метилирования CpG мотивов предупреждает распознавание ДНК млекопитающих с помощью TLR9 при физиологических условиях. При некоторых аутоиммунных заболеваниях, однако, IgG2a/chromatin комплексы, содержащие CpG ДНК, могут ангажироваться В клеточными рецепторами и соответственно TLR9, приводя к продукции ревматоидного фактора и др. аутореактивных молекул (Leadbetter et al. 2002, Viglianti et al. 2003). Установлено, что внутриклеточное, эндосомное ограничение TLR9 является критическим для дискриминации между собственной и чужой ДНК, т.к. ДНК хозяина в отличие от микробной ДНК, обычно не попадает в эндосомный компартмент (Barton et al. 2006). Наконец, Coban et al. (2005) сообщили, что TLR9 распознает новый не-ДНК лиганд, наз. hemozoin, который является гидрофобным heme полимером, продуцируемым малярийными паразитами, т.к. он переваривает гемоглобин хозяина.

Помимо TLR9-обусловленной детекции CpG ДНК в эндосомном компартменте, врожденная иммунная система млекопитающих реагирует также на чужеродную ДНК в цитозоле. Эта реакция важна для продукции типа I IFN в ответ на вирусы и внутриклеточные патогены, такие как Listeria monocytogenes и Shigella flexneri, которые реплицируются в цитоплазме (Ishii et al. 2006, Stetson & Medzhitov 2006). Т.к. ограничение мембранами предупреждает TLRs от скопления в цитозоле для PAMPs, то цитозольные PRRs независимо от TLRs 3, 5 и 9 вовлекаются в обеспечение всестороннего распознавания врожденным иммунитетом в противовес ограничению TLR.

TLR11

Исследования по генному таргетингу показали, что TLR11-дефицитные мыши чувствительны к уропатогенной инфекции Escherichia coli (Zhang et al. 2004). Хотя бактериальный лиганд для TLR11 пока не открыт, стимулирующая активность уропатогенных бактерий может быть нарушена с помощью воздействия proteinase K, это указывает на то, что TLR11 распознает белковый лиганд. TLR11 распознает также класс profilin-подобных молекул, экспрессируемых apicomplexan простейшими, включая Toxoplasma gondii (Yarovinsky et al. 2005).

DIVERSITY OF TLR LIGAND RECOGNITION

Как показано выше, TLRs распознают чрезвычайно разнообразный репертуар молекулярных структур патогенов. Т.к. TLRs распознают законсервированные молекулы, распространенными среди членов определенного класса микробов (напр., LPS из Грам-отрицательных патогенов и ssRNA из РНК вирусов), то весь патогенный универсум действительно может быть собран небольшой группой рецепторов (Medzhitov & Janeway 1997). Однако, механизм, с помощью которого эта ограниченная группа из germline-кодируемых рецепторов уникально распознает свои лиганды, всё ещё неясен и удивительно, что TLRs распознают столь разнообразные молекулы, используя законсервированный LRR мотив. Так, TLRs 2 и 4 являются уникальными по своей способности распознавать множественные, разнообразные PAMPs. В свете этого разнообразия распознавания мы рассмотрим возможные механизмы, с помощью которых TLRs связывают свои лиганды, а именно, благодаря разнообразию LRR мотивов, кооперативным взаимодействиям между разными TLRs и использованию не-TLR ко-рецепторов или дополнительных молекул.

Leucine-Rich-Repeat Diversity

Основной LRR мотив представлен 24 аминокислотами, которые формируют β-нить и α-спираль, соединенные петлей и он присутствует в нескольких прокариотических и эукариотических рецепторах (Kobe & Kajava 2001). TLRs содержат уникальный консенсус LRR, xLxxLxLxx[N/L]x+xx+xxxxFxxLx, где x может представлять любую аминокислоту, а + представляет любую гидрофобную аминокислоту (Bell et al. 2003). Эта типичная последовательность появляется повторно по всему внеклеточному домену TLRs, хотя присутствуют др. варианты этого мотива. Недавно Bell et al.(2003) подробно охарактеризовали каждый из LRR в TLRs 1-10 и предположили, что нетипичные LRRs содержат инсерции после остатка 10 и 15, отвечающих за лигандную специфичность. Инсерции в LRRs после 10-й аминокислоты, как предполагается, создают места связывания лиганда на вогнутой поверхности TLRs, в то время как инсерции в позиции 15, как предполагается, создают сайты связывания на выпуклой поверхности.

Имеется несколько неотразимых примеров, подтверждающих эту модель, включая TLR9 и TLR5 LRR инсерции, которые потенциально создают места связывания для CpG ДНК и flagellin, соотв. Относительно TLR9, инсерции в позиции 10 у LRRs 2, 5, 8 и 11 появляются на вогнутой поверхности рецептора и вообще создают потенциальные места связывания CpG. Отметим, что инсерция в 8-м LRR содержит два богатых cysteine CXXC мотива, которые обеспечивают непосредственное связывание CpG ДНК с помощью транскрипционного активатора, названного CpG-связывающим белком (Lee et al. 2001). Т.о., локализация и последовательности этих нетипичных LRRs указывает на то, что они участвуют в TLR9-зависимом связывании CpG ДНК, хотя эта гипотеза не была протестирована экспериментально (Bell et al. 2003, Lee et al. 2001). Как упоминалось выше, Mizel et al. (2003b) недавно картировали внеклеточный домен TLR5, необходимый для связывания flagellin (аминокислоты 386-407), и показали также, что домен заключает в себя LRR. Интересно, что предсказываемый сайт связывания flagellin располагается в LRR 14 внеклеточного домена и он содержит инсерцию в 6 остатков после позиции 15, это является дальнейшим экспериментальным подтверждением модели специфичности инсерций (Bell et al. 2003).

Наконец, мутационный анализ внеклеточного домена TLR2 проиллюстрировал, что делеция первых 7 N-терминальных LRRs не влияет критически на его способность передавать сигналы для активации NF-κB и mitogen-activated protein kinase (MAPK) в 293 клетках; следовательно, его способность взаимодействовать с микробными полипептидами и peptidoglycan остается незатронутой (Meng et al. 2003, Mitsuzawa et al. 2001). Однако, N-терминальный мутант TLR2, характеризующийся недостаточностью передачи сигналов вниз в ответ на многие др. TLR2 лиганды, предоставляет доказательство того, что специфические LRR домены в TLR2 взаимодействуют с разными PAMPs, что увеличивает их способность распознавания. Следовательно, LRRs каждого TLR, по-видимому, действуют, чтобы создавать уникальную специфичность к лигандам для соотв. рецепторов, это объясняет разнообразные наборы PAMPs, распознаваемых с помощью этого семейства PRRs.

Большинство данных, связанных с LRRs и со связыванием лигандов, предсказывается некоторой формой мутационного анализа, при котором большие порции различных TLR эктодоменов удаляются, а степень ингибирования взаимодействия PAMP/receptor определяется биохимически. Хотя эти эксперименты высоко информативны, они не касаются мутантных частей любого из белков, которые могли бы давать изменения общей конформации. Т.о., измененное связывание лигандов мутантными TLRs может не быть непосредственным результатом удаления сайта связывания per se. В конечном счете, cocrystallographic исследования необходимы, чтобы получить конкретные доказательства специфичности доменов PAMP/TLR взаимодействия, но учитывая трудность очистки больших количеств внеклеточных доменов TLR, этих доказательств придется ждать долго.

Недавно Bell et al. (2005) и Choe et al. (2005) независимо получили кристаллическую структуру человеческого TLR3-ED, совершив большой прорыв в структурном анализе TLRs. Обе группы пришли к заключению, что структура человеческого TLR3 является подково-образной формой соленоида, который сильно гликозилирован и обе идентифицировали возможные сайты связывания. Несогласие с современной моделью связывания лиганда с помощью TLR Choe et al. (2005) объясняют тем, что гликозилирование и общий негативный заряд вогнутой поверхности д. скорее всего предупреждать связывание dsRNA. Они предполагают, что сайт связывания dsRNA существует на выпуклой, не подверженной гликозилированию поверхности TLR3, которая соотв. имеет множество основных остатков, чтобы приспособиться к конечному негативному заряду нуклеиновых кислот. Напротив, Bell et al. (2005) выдвигают аргумент, что место связывания для dsRNA может располагаться в вогнутой области соленоида, т.к. ионы sulfate, которые воспроизводят фосфатную основу нуклеиновых кислот, были найдены прикрепленными к боковым цепочкам некоторых аминокислот на вогнутой поверхности. Эти авт. предполагают также, что петли, создаваемые инсерциями в LRRs 12 и 20 дают карманы на свободный от гликозилирования, выпуклой стороне TLR3, пригодные для связывания dsRNA. Т.к. такие инсерции высоко законсервированы среди TLR3 от разных видов, то эти сайты скорее всего участвуют в связывании лиганда (Bell et al. 2005). Структурный анализ дает важную информацию о потенциальном способе связывания dsRNA с помощью TLR3. Т.к. последовательность LRR и кристаллическая структура TLR3 указывают на множественные сайты связывания лиганда, интересно было бы посмотреть, связывает ли рецептор лиганды помимо dsRNA. Необходимы дополнительные доказательства, чтобы установить, правильна ли эта идея. Однако, др. TLRs связывают множественные лиганды, а большая поверхность области и пространственное распределение предполагаемых сайтов связывания на TLR3 могут объяснить разнообразие лигандной специфичности др. TLRs.

Cooperative Interactions Between TLRs

Как показано выше, TLR2 действует как гетеродимер с TLRs 1 и 6 для распознавания разнообразной группы PAMPs. Хотя бактериальные липопептиды являются важными лигандами для таких гетеродимерных пар, данные по многим др. группам подтверждают, что TLR2/1 или TLR2/6 димеры распознают дополнительные лиганды, такие как zymosan, Yersinia V antigen (Sing et al. 2002) и Escherichia coli enterotoxins (Hajishengallis et al. 2005). Эти лиганды структурно не родственны бактериальным липопептидам, а разнообразие распознавания скорее всего обеспечивается за счет комбинации LRR доменов на каждом из TLR. Недавно Omueti et al. (2005) показали, что LRRs 9-12 человеческого TLRs 1 и 6 обеспечивают способность этим рецепторам делать различия между ацилированными липопротеинами, т.к. домен обмена между двумя рецепторами меняет липопептидную чувствительность в трансфицированных клетках. Кроме того, LRRs 7-10 из TLR2, как было показано, являются критическими для реакции на tri-lauroylated липопептиды (Grabiec et al. 2004, Meng et al. 2003). Вместе эти данные показывают, что TLR2/1 и TLR2/6 гетеродимеры связывают липопептидные PAMPs кооперативно в областях, предположительно расположенных на выпуклых, наружных петлях обоих рецепторов (Omueti et al. 2005). Хотя эти исследования объясняют реакции гетеродимерных TLR на липопептиды, они не могут объяснить необходимость как TLR2, так и или TLR1 или TLR6 рецепторных пар для распознавания структурно не родственных PAMPs. Анализ всех трех TLRs показал, что некоторые нетипичные LRRs, содержащие инсерции, расположены вне предполагаемых доменов связывания липопептидов (Bell et al. 2003), тем самым открывается возможность, что эти LRRs, действующие по одиночке или сочетанно с областями их партнеров по гетеродимеру, участвуют в распознавании дополнительных PAMPs. Т.о., благодаря кооперативным взаимодействиям, TLRs могут существенно увеличивать свои PAMP специфичности, гарантируя тем самым детекцию многочисленных патогенов. Гетеродимеризация TLR может также иметь функциональные последствия для путей передачи сигналов, индуцируемых после связывания лиганда. TLRs используют один из двух адапторов для сигнальной трансдукции, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) или TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β(TRIF), хотя др. адапторы вносят вклад в специфичность передачи сигналов. MyD88-зависимые и TRIF-зависимые пути передачи сигналов вызывают индукцию разных эффекторов врожденного иммунитета, а передача сигналов от гетеродимерных рецепторных пар может вовлекать оба адаптора для дополнительных или разнообразия реакций. Напр., передача сигналов и TLR4 и TLR5 является критической для flagellin-индуцированной продукции nitric oxide (NO), но не для TNFα, в макрофаг-подобных линиях (Mizel et al. 2003a). TLR4 может передавать сигнал посредством как MyD88-зависиого, так и -независимого пути, а вовлечение TRIF-индуцированной передачи сигналов посредством гетеродимерных TLR4/TLR5 пар может приводить к активации молекул, таких как IFN-β, для увеличения продукции NO. Т.к. NO обладает важными антимикробными свойствами, то его индукция скорее всего является критической для контроля жгутиковых бактерий, а комбинированная передач сигналов посредством TLRs 4 и 5 может усиливать антибактериальную реакцию NO. Хотя примеры гетеродимеризации TLR, индуцирующей уникальные про-воспалительные пути, ограничены, однако посредством анализа TLR и/или TLR-адаптор нокаутных мышей можно подтвердить и предоставить дополнительную информацию для этой интересной гипотезы.

Coreceptors and TLR Binding Specificity

Хотя некоторые TLRs, как было предположено, соединяются с соотв. PAMPs непосредственно (Bellet al. 2005, Iwaki et al. 2002, Lien et al. 2000, Mizel et al. 2003b, Poltorak et al. 2000), исследователи идентифицировали также дополнительные молекулы, которые усиливают распознавание и тем самым передачу сигналов с помощью некоторых TLRs. Так, TLR4 формирует комплекс на клеточной мембране с несколькими связанными с мембраной и растворимыми молекулами, включая CD14 и MD-2. CD14, LRR-содержащая, GPI-сцепленная молекула связывает LPS связывающего белок/LPS комплекса и тем самым переносит LPS к комплексу TLR4 (Ulevitch 1993, Wright et al. 1990). Генетическое устранение гена Cd14 у мышей ведет к снижению очистки от Грам-отрицательных бактерий и к снижению чувствительности к провокации LPS, подтверждая мнение, что CD14 участвует в TLR4-обусловленных реакциях врожденного иммунитета (Haziot et al. 1996). Более того, некоторые группы продемонстрировали, что экспрессия CD14 усиливает TLR2-обеспечиваемые реакции на многие PAMPs, включая peptidoglycan и липопептиды, и они постулировали, что CD14 также участвует в переносе этих лигандов к TLR2 для передачи сигналов (Sellati et al. 1998, Vasselon et al. 2004,Wetzler 2003, Wooten et al. 1998). CD14 , как было показано, также играет критическую роль в TLR3-обеспечиваемых реакциях на poly(I:C) путем связывания внеклеточных poly(I:C) и вызывая их поступление и высвобождение в эндосомный компартмент для передачи сигналов TLR3 (Lee et al. 2006). Др. молекула, MD-2, взаимодействует с TLR4внутриклеточно и на клеточной поверхности и её присутствие необходимо для восприимчивости LPS (Nagai et al.2002, Shimazu et al. 1999). Хотя MD-2 содержит LRRs, она, по-видимому, участвует в таргетинге TLR4 на клеточную мембрану и неизвестно, усиливает ли эта молекула связывание лигандов с помощью TLR4. Недавно было показано, что dectin-1, C-type lectin рецептор для β-glucans, соединяется и индуцирует интернализацию zymosan в клетках из клона моноцитов (Brown & Gordon 2001, Brown et al. 2003). Фагоцитоз zymosan ведет к рекрутированию TLR2/6 гетеродимеров во внутриклеточные фагосомы для передачи сигналов и последующей индукции про-воспалительных цитокинов. В отношении TLR2/6-обеспечиваемого распознавания diacylated липопептидов и lipotechoic кислоты, CD36, типа B scavenger рецептор, необходим для надежной активации NF-κB и продукции про-воспалительных цитокинов, а также удаления Грам-позитивных бактерий (Hoebe et al. 2005). Хотя механизм, с помощью которого CD36 усиливает реакцию на специфические для TLR2 лиганды, неизвестен, но CD36 может действовать аналогично CD14 приводя лиганды в тесную близость к рецепторам для вызывания сигнальной трансдукции. Следовательно, TLRs 2, 3, и 4 используют дополнительные рецепторы и/или кофакторы для распознавания некоторых PAMPs, т.к. эти молекулы увеличивают эффективность и специфичность PAMP/TLR взаимодействий. Др. TLRs могут также использовать дополнительные молекулы для усиления своего лиганд-связывающего потенциала.

TLR SIGNALING PATHWAYS

Множество PAMPs стимулирует различные TLRs, чтобы индуцировать транскрипцию различных генов мишеней, необходимых для эффективных иммунных ответов, и молекулярные пути, с помощью которых TLRs инициируют специфические генные программы, активно исследуются в последнее время.

PAMP связывание с помощью TLRs, как полагают, облегчает димеризацию рецепторов, чтобы индуцировать конформационные изменения, необходимые для привлечения адапторов, хотя PAMP/TLR взаимодействие может также индуцировать структурные изменения в цитоплазматических доменах прежде сформированных мембранных димеров (Akira & Takeda 2004). Тем не менее, связывание лиганда инициирует каскады сигнальной трансдукции, которые исходят от цитоплазматических TIR доменов TLRs. Критическая важность домена TIR впервые была продемонстрирована на мышах C3H/HeJ, которые имели точковую мутацию цитоплазматического остатка proline 712 и были гипочувствительны к LPS благодаря неспособности TLR4 TIR домена рекрутировать нижестоящие эффекторы (Poltorak et al. 1998). Дальнейшие исследования показали, что этот остаток законсервирован в большинстве TLRs, за исключением TLR3, a временно трансфицированные мутантные TLRs, имеющие мутационную замену пролина на гистидин, не передают сигнала (Hoshino et al. 1999, Underhill et al. 1999b). Это обусловлено неспособностью TIR мутантов рекрутировать нижестоящие молекулы, такие как MyD88, критический адаптор путей передачи сигналов TLR. Показано, что существуют MyD88-зависимые и -независимые TLR сигнальные пути (Figure 2).

Figure 2 TLR signaling pathways. TLRs 1/2/6, 3, 4, and 5 are localized at the plasma membrane of most cells, whereas TLRs 7-9 are localized exclusively in the endosomal compartments of conventional and/or plasmacytoid dendritic cells. PAMP binding initiates confirmational changes to the TLRs, such that TIR-containing adaptors are recruited to the TLR TIR domain. Adaptors TIRAP and TRAM link MyD88 and TRIF to specific TLRs. Signaling through TLRs 1/2/6, 5, and 7-9 is exclusively mediated by MyD88. Receptor-associated MyD88 recruits IRAK-1 and IRAK-4, which then associate with and phosphorylate TRAF6. TRAF6 then activates TAK1, which subsequently activates IKK, JNK, and p38,ultimately leading to early-phase NF-κB and AP-1 activation and the transcription of effectors of the innate response. In addition, the MyD88/IRAK/TRAF6 complex mediates the activation of transcription factors IRF5 and IRF7 for cytokine and IFN-? production, respectively. TLR3 utilizes TRIF for signaling exclusively, whereas TLR4 utilizes both MyD88 and TRIF. TRIF promotes the activation of both TRAF6 and RIP1, which activate TAK1, resulting in NF-κB and AP-1 activity and the production of innate immune effector molecules. Additionally, TRIF-dependent signaling activates TBK1 for IRF3 phosphorylation, which results in IFN-β production.

MyD88-Dependent Signaling

MyD88 , как первоначально было показано, является критическим для передачи сигналов посредством IL-1R, т.к. избыточная экспрессия доминантно-негативного MyD88 блокировала передачу сигналов и тем самым активацию NF-κB в ответ на IL-1 (Muzio et al. 1997, Wesche et al. 1997). MyD88 обладает С-терминальным TIR доменом, который взаимодействует с TLR или IL-1R TIR доменами, и N- терминальным death доменом, который соединяется с др. death домен-содержащими молекулами, такими как члены семейства Interleukin-1 receptor-associated kinase (IRAK). Значение MyD88 для LPS-индуцированной передачи сигналов TLR4 была продемонстрирована путем генерации и анрализа MyD88-дефицитных мышей (Adachi et al. 1998, Kawai et al. 1999). LPS- и IL-1-индуцированная продукция про-воспалительных цитокинов макрофагами и фибробластами от таких мышей резко снижалась, если не исчезала. Более того, MyD88-дефицитные клетки не отвечали на peptidoglycans, flagellin, CpG DNA, ssRNA или Toxoplasma profilin-подобный белок, указывая тем самым, что передача сигналов TLR2, TLR5, TLR7/8, TLR9, и TLR11 осуществляется исключительно через MyD88 (Adachi et al. 1998, Beutler et al. 2005, Takeda 2003, Yarovinsky et al. 2005).

MyD88-зависимая передача сигналов инициируется PAMP-индуцированными конформационными изменениями в цитоплазматическом домене TLR, которые ведут к ассоциации MyD88 с TLR посредством гомотипического взаимодействия между их TIR доменами. Последующая передача сигналов вниз обеспечивается посредством взаимодействия MyD88 с serine/threonine IL-1 receptor-associated kinase-4 (IRAK-4) посредством их соотв. death доменов (Burns et al. 2003, Medzhitov et al. 1998, Muzio et al. 1997, Suzuki et al. 2002). Как только IRAK-4 соединяется с MyD88, он рекрутирует и фосфорилирует IRAK-1, это активирует киназную функцию IRAK-1. IRAK-1 затем аутофосфорилирует себя саму, рекрутируя tumor necrosis factor receptor-associated factor-6 (TRAF6) на комплекс MyD88/IRAK-4/IRAK-1. Затем IRAK-1 и TRAF6 диссоциируют с рецепторного комплекса и взаимодействуют с дополнительными молекулами, приводя в результате к активации c-Jun N-terminal kinase (JNK) и ингибиторной κB kinase (IKK). Эти белки затем индуцируют активацию AP-1 (activator protein-1) и NF-κB, приводя в конечном итоге к транскрипции генов, кодирующих про-воспалительные цитокины и хемокины, такие как TNFα, IL-6, IL-8, and IL-1β (Chen & Goeddel 2002, Hayden & Ghosh 2004, Takeda & Akira 2005).

Механизм, с помощью которого TRAF6 активирует IKK всё ещё неясен. Однако, предполагается, что убиквитилирование димеризованного TRAF6 ведет к рекрутированию и последующей активации комплекса, состоящего из transforming growth factor-β-activated kinase-1 (TAK1) и двух адапторных белков, TGF-β binding protein-1 (TAB1) b TAB2 (Deng et al. 2000, Shibuya et al. 1996, Sun et al. 2004, Takaesu et al. 2000). После димеризации, TRAF6 взаимодействует с ubiquitin-conjugating enzyme 13 (UBC13)и UBC-подобным белком UEV1A, оба они облегчают убиквитилирование lysine 63 в TRAF6 (Chen 2005). Ub-TRAF6 затем соединяется с TAB2 и фосфорилирует TAK1, что вызывает TAK1-зависимое фосфорилирование и активацию IKK, p38 и JNK (Wang et al. 2001). Благодаря эмбриональной летальности TAK1-, TAB1- и TAB2-дефицитных животных трудно получить генетические доказательства роли TAK1 в активации TLR/IL-1R-индуцированного NF-κB и AP-1. Однако, недавний анализ эмбриональных фибробластов, выделенных от нокаутных животных, иллюстрирует, что TAK1, но не TAB1 или TAB2, необходим для активации IL-1R- и TLR-обусловленной индукции NF-κB и AP-1 (Sato et al. 2005, Shim et al. 2005). Т.о., очевидно, что TAK1 расположен выше IKK и JNK и является критическим для их активации. Точный способ, с помощью которого это осуществляется, неизвестен.

Др. молекула, ECSIT (evolutionary conserved signaling intermediate in Toll pathways), была идентифицирована как TRAF6-взаимтодействующий белок с помощью дрожжевого двугибридного метода, она участвует в IL-1R- и TLR-индуцированной активации NF-κB (Kopp et al. 1999, Xiao et al. 2003). ECSIT взаимодействует и с TAK1 и с mitogen-activated protein kinase MEKK3(A.P.West& S. Ghosh, unpublished observations), которые являются критическими медиаторами передачи сигналов TLR и IL-1R (Huang et al. 2004). Т.о., ECSIT может регулировать активность MEKK3 и/или TAK1, сегодня исследования идут полным ходм, чтобы выяснить точный мехенизм, с помощью которого ECSIT обеспечивает передачу сигналов TLR.

MyD88-Independent/TRIF-Dependent Signaling

Как было показано выше, целенаправленная делеция MyD88 вызывает аномальную передачу сигналов и резкое снижение продукции цитокина большинством TLRs. Однако, стимуляция с помощью LPS MyD88-дефицитных клеток приводит к активации NF-κB b MAPK, хотя и с задержанной кинетикой. Кроме того, созревание DC, измеренное с помощью активации ко-стимулирующих молекул в ответ на LPS, оказывается не измененным в MyD88 нокаутных клетках (Hoshino et al. 2002, Kaisho et al. 2001). Более того, TLR4 и TLR3 стимуляция приводит к MyD88-независимой активации IRF3, ключевого транскрипционного фактора, необходимого для IFN-β продукции и активации задержанной фазы NF-κB посредством TLR4 (Covert et al. 2005, Kawai et al. 1999). Т.о., эти данные подтверждают существование передачи сигналов TLR посредством путей, не зависящих от MyD88, и это привело к характеристике TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β (TRIF)/TIR-containing adaptor molecule-1 (TICAM-1), которая является критическим трансдуктором MyD88-независимой передачи сигналов (Akira et al. 2001, Hoebe et al. 2003, Yamamoto et al. 2003a, Yamamoto et al. 2002b).

Несмотря на обширные исследования механизм. с помощью которого TRIF активирует NF-κB b IRF3 понят не до конца. Первоначальная характеристика TRIF показала, что N- и C-терминальные домены обеспечивают самостоятельные функциональные роли. Относительно N-терминального домена, две нетипичные IκB kinases, IKKi/IKKε и TRAF family-member-associated NF-κB activator (TANK)-binding kinase (TBK-1), оказались связанными с IRF3 активацией нижестоящего TRIF (Fitzgerald et al. 2003a). N конец TRIF, как полагают, формирует комплекс с TBK-1, IRF3 и возможно с IKKi для специфического фосфорилирования и активации IRF3 (Fitzgerald et al. 2003a). Соотв.,

TLR-INDUCED NF-κB ACTIVATION: A DETAILED LOOK

Signaling from the IL-1R and TLRs induces the activation of NF-κB, an inducible transcription factor critical for proper immune function. Upon PAMP binding and subsequent recruitment of adaptors MyD88 or TRIF and TRAF6 to TLRs, the TAK1 kinase is activated, thus initiating the classical NF- ?B pathway (Hayden & Ghosh 2004). TAK1 phosphorylates the ? subunit of the I?B kinase (IKK) complex, which leads to IKK-mediated phosphorylation of the inhibitor of ?B (I?B) molecules, which sequester NF-κB subunits p65 (REL-A) and p50 in the cytoplasm. Upon phosphorylation, the I?B complex is recognized by ubiquitin ligase machinery, polyubiquitinated, and subsequently degraded by the proteasome (Karin & Ben-Neriah 2000). This results in the release of p65/p50 heterodimers for nuclear translocation; once at the nucleus, they bind specific sequences in the promoter or enhancer regions of immune genes (Hayden & Ghosh 2004).

TBK-1-дефицитные фибробласты обнаруживают заметный дефицит в IRF3 активации и IFN-β продукции в ответ на TLR3 и TLR4 лиганды (Hemmi et al. 2004,McWhirter et al. 2004, Perry et al. 2004). IKKi^-/- и TBK-1^-/- клетки обнаруживают неразличимые дефекты в NF-κB транскрипционной активности, указывая тем самым, что эти киназы не участвуют в TRIF-обеспечиваемой активации NF-κB (Hemmi et al. 2004, McWhirter et al. 2004).

Относительно TLR4- и TRIF- зависимой активации NF-κB некоторые исследования подтвердили, чт о TRAF6 ассоциирует с N-терминальным доменом TRIF для индукции NF-κB (Sato et al. 2003). Однако, клетки дважды дефицитные по MyD88 и TRAF6 частично активировали NF-κB в ответ на LPS, указывая тем самым на существование TRAF6-независимой, TRIF-обусловленной передачи сигналов (Kawai et al. 2001). Более того, др. исследование демонстрирует, что TRAF6 безразличен для поздней фазы активации NF-κB в ответ на LPS, указывая тем самым, что TRAF6 не участвует в TRIF-обеспечиваемом TLR4 сигнальном пути (Gohda et al. 2004).

Касательно C-терминального домена TRIF, недавние исследования продемонстрировали, что киназа, критическая для TNFR-обеспечиваемой активации IKK, receptor-interacting protein 1 (RIP1), может ассоциировать с TRIF посредством своего соотв. RIP interaction домена (Meylan et al. 2004). Анализ TRIF C-терминальной последовательности выявил небольшую область гомологии с RIP1, обозначенную как RIP homotypic interaction motif (RHIM), a мутационные исследования показали, что RHIM необходим для ассоциации TRIF и RIP1 (Meylan et al.2004). В отсутствие RIP1, poly(I:C)- индуцированная активность NF-κB существенно снижена, хотя активность JNK и IRF3 не изменена. Это указывает на то, что RIP1 является критической TLR3-обусловленной передачей сигналов к NF-κB. RIP1 может также играть критическую роль в TRIF-зависимой активации NF-κB с помощью TLR4, т.к. RIP1/MyD88 двойные нокаутные клетки не активируют NF-κB в ответ на LPS (Cusson-Hermance et al. 2005). Более того, после poly(I:C) стимуляции, RIP1 polyubiquitinated и рекрутируется вместе с TRAF6 и TAK1 на TLR3, указывая тем самым, что RIP1 связывает TRIF с TRAF6 и таким образом с TAK1.

Как упоминалось выше, TRIF-зависимая передача сигналов TLR4 приводи к позденй фазе активации NF-κB, хотя молекулярные механизмы. лежащие в основе этого феномена неизвестны. Однако, недавние публикации независимых групп, посвященные этому вопросу, подтвердили, что инициальная TRIF-обусловленная активация IRF3 необходима для последующей активности NF-κB (Covert et al. 2005, Werner et al. 2005). Поздняя фаза активации NF-κB посредством TLR4/TRIF, в частности, нуждается в de novo синтезе белка, особенно в продукции TNFα (Covert et al. 2005, Werner et al. 2005). С помощью siRNA деплеция IRF3 резко снижает MyD88-независимую активацию NF-κB; следовательно, TRIF-обусловленная передача сигналов в ответ на LPS, по-видимому, запускает активацию IRF3, которая соединяется с TNFα промотором и облегчает транскрипцию (Covert et al. 2005). TNFα затем передает сигналы посредством TNF рецептора с помощью аутокринной петли обратной связи, приводя в результате к активации IKK для поздней фазы активности NF- κB. Дальнейший анализ IRF3 и/или TBK-1 нокаутных мышей может подтвердить и в дальнейшем прояснить эти находки.

Additional TIR Adaptor Proteins

Передача сигналов TLR оказалась более замысловатой, чем первоначально предполагалось: активация специфических TLRs ведет к разнообразным паттернам экспрессии генов, как результат дифференциальной активации транскрипционных факторов, таких как NF-κB, AP-1 и IRFs. Как показано выше, передача сигналов через TLR3 или TLR4,но не через TLR2 или TLR5, ведет к активации IRF3, который регулирует экспрессию IFN-β и является критическим для обеспечения антивирусных иммунных реакций. Кроме того, специфическая передача сигналов посредством TLRs 7-9 ведет к индукции IFN-α, который также играет жизненно важную роль в в очистке от вирусных патогенов. Эти наблюдения показывают сложность механизмов, лежащих в основе дифференциальной передачи сигналов посредством TLRs.

Идентификация MyD88- и TRIF-зависимых путей помогла объяснить некоторые аспекты специфичности передаваемых сигналов от TLRs; однако, дополнительные TIR-содержащие адапторы, TIRAP (TIR domain-containing adaptor protein) и TRAM (TRIF-related adaptor molecule), были охарактеризованы как критические связки между специфическими TLRs и MyD88 и/или TRIF. Генетическое устранение этих адапторов предоставило информацию о их роли в передаче сигналов TLR.

TIRAP/Mal. Отмечая чувствительность к LPS у MyD88-дефицитных клеток, исследователи искали альтернативные TIR домен-содержащие адапторы и в результате были открыт TIRAP, наз. также Mal (MyD88-adaptor-like) (Horng et al. 2001, Yamamoto et al. 2002b). Исследователи первоначально предположили, что TIRAP является адаптором. ответственным за MyD88-независмую передачу сигналов; однако, позднее было установлено, что эта молекула действует как адаптор в MyD88-зависимом пути от TLRs 2 и 4 (Horng et al. 2002,Oshiumi et al. 2003a).

У TIRAP-дефицитных мышей передача сигналов посредством TLR2/1 или TLR2/6 гетеродимеров и TLR4 - но не TLRs 3, 5, 7 или 9 - устраняет раннюю фазу активации NF-κB и, соотв., сильно уменьшает продукцию TNFα, IL-6 и IL-12p40 (Horng et al. 2002, Yamamoto et al. 2002a). Как результат, TIRAP-дефицитные мыши резистентны к цитоксином-обусловленному endotoxin шоку (Yamamoto et al. 2002a). Однако, LPS-индуцированная активация поздней фазы NF-κB и MAPKs, а также продукция IFN-β остаются неповрежденными, указывая тем самым. что TIRAP не участвует в TRIF-зависимой передаче сигналов TLR4 (Fitzgerald et al. 2001, Yamamoto et al. 2002a).

Mansell et al. (2004) показали, что TIRAP обладает предположительно TRAF6 interaction доменом и что TIRAP ко-иммунопреципитируется с TRAF6. Мутация в TIRAP в TRAF6-связывающем мотиве ведет к ингибированию TLR2- и TLR4-обусловленной активации NF-κB, указывая тем самым, что TIRAP может ассистировать соединению TLRs 2 и 4 с TRAF6 и затем с IKK. Следовательно, MyD88 и TIRAP могут действовать перекрываясь в передаче сигналов к NF-κB; однако, эта гипотеза кажется маловероятной, т.к. избыточная экспрессия MyD88, a не TIRAP, в MyD88^-/-TIRAP^-/- ведет к активации NF-κB (Akira & Takeda 2004).

Почему TIRAP специфически взаимодействует с TLR2 и TLR4 и почему это необходимо для связывания MyD88 и TIR доменов у TLRs 2 и 4 остается неясным. Т.к. TLR4 взаимодействует и с MyD88 и с TRIF, то соединение TIRAP с TLR4 может преимущественно рекрутировать MyD88 для ранней фазы активности NF-κB, ведущей к активации про-воспалительных цитокинов, которые могут запрещать TRIF-зависимую позднюю фазу активации NF-κB и продукцию IFN-β.

TRAM/TIRP/TICAM-2. В дополнение к TIRAP, адаптор TRAM, наз. также TIR domain-containing protein (TIRP)/TIR-containing adaptor molecule-2 (TICAM-2), также участвует в передаче сигналов от определенных TLRs. Некоторые противоречивые исследования предположили, что TRAM участвует в TLR4-обусловленной активации IRF3, эффективно соединяя TRIF и TLR4 (Fitzgerald et al. 2003b, Oshiumi et al. 2003b, Yamamoto et al. 2003b). С помощью дрожжевого двугибридного анализа исследователи установили, что TRAM не может связывать TIR домены в TLR2 или TLRs 5-9, но может связываться с TLR4 и более слабо с TLR3 (Oshiumi et al. 2003b). Др. исследование показало, что TRAM необходим для TLR4, но не для TLR3, TRIF-зависимой передачи сигналов, т.к. доминантно-негативный TRAM и siRNA нокдаун ингибируют активацию NF-κB и IRF3 в ответ на LPS, но не poly(I:C)(Fitzgerald et al. 2003b). Сходным образом, клетки от TRAM-дефицитных мышей обнаруживают пониженную продукцию цитокинов в ответ на LPS, однако они продуцируют нормальные уровни цитокинов в ответ на IL-1 и TLR 2, 3, 7 и 9 лиганды (Yamamoto et al. 2003b). MyD88-зависимая LPS передача сигналов не нарушена у TRAM-дефицитных мышей, но TRIF-обусловленная активация NF-κB и продукция IFN-β не происходят, подтверждая тем самым, что TRAM сводит TRIF с TLR4, но не с TLR3. Наконец, доминантно-негативные TRIF, IKKi и TBK-1 предупреждают TRAM-индуцированную активацию IRF3 и NF-κB, указывая тем самым, что TRAM действует выше этих молекул (Oshiumi et al. 2003b).

Остается неясным, почему TRAM специфически используется в передаче сигналов TLR4, несмотря на недавнее исследование, посвященное механизму, с помощью которого TRAM специфически проникает в клеточную мембрану для передачи сигналов TLR4. TRAM содержит N-терминальный сайт myristoylation, который является критическим для ко-локализации с TLR4, a мутация этого остатка устраняет TRAM-индуцированную передачу сигналов к IRF3 и NF-κB (Rowe et al. 2006). Тем не менее, дифференциальное рекрутирование TIRAP или TRAM может помочь определить, осуществляется ли передача сигналов TLR4 посредством MyD88 или TRIF. Варьирующие степени конформационных изменений рецепторов, индуцируемых разными TLR4 лигандами могут специфически рекрутировать TRAM или TIRAP на TIR домен, вызывая отклонение к MyD88-зависимой продукции провоспалительных цитокинов или к TRIF-зависимой продукции IFN-β. Это отклонение может транслироваться в более совершенный врожденный эффекторный ответ, необходимый для затравки благоприобретенного иммунитета и очистки от специфических патогенов. Т.о., TIR-содержащие адапторы обеспечивают инициальный уровень сигнальной специфичности от TLRs.

TLR-Mediated Induction of IRFs

Type I IFNs (IFN-α/β) являются интегральными компонентами врожденной антивирусной реакции и их экспрессия управляется с помощью IRF транскрипционных факторов. Два члена этого семейства, IRF3 и IRF7, абсолютно необходимы для транскрипции IFN-α/β генов. IRF3 является критическим как для не-TLR- (посредством RIG-I/MDA5), так и TLR3/4-обусловленной продукции IFN-β посредством TRIF, и он активируется с помощью вышестоящих киназ TBK1 и IKKi во многих типах клеток (Fitzgerald et al. 2003a, Sato et al. 2000). После вирусной инфекции латентный IRF3 фосфорилируется по C-терминальному остатку serine, это ведет к его димеризации и последующей транслокации в ядро. После вступления в ядро, IRF3 синергично действует с молекулами коактиватора и соединяется с ДНК элементами на промоторе IFN-β, чтобы индуцировать транскрипцию гена. Напротив, IRF7 в постоянно обнаруживает присутствие только в plasmacytoid DCs, которые специфически адаптированы к выявлению вирусов и синтезу IFN-α в ответ на инфекцию, но строго индуцируется во многих клетках после вирусной инфекции и последующей передачи аутокринных/паракринных сигналов type I IFN (Izaguirre et al. 2003, Kerkmann et al. 2003). Plasmacytoid DCs экспрессируют TLRs 7, 8 и 9 в эндосомном компартменте, а после поступления вирусных PAMP и передачи сигналов TLR, IRF7, вместе с α субъединицей IKK, рекрутируется в MyD88/IRAK-1/TRAF6 комплекс (Kawai et al. 2004, Uematsu et al. 2005). Этот комплекс дает разрешение для киназной активности IKKα, которая затем обеспечивает фосфорилирование и активацию IRF7 (Hoshino et al. 2006). Фосфорилированный IRF7 затем димеризуется и транслоцируется в ядро, где он действует, чтобы индуцировать экспрессию IFN-α. Генетическое устранение IRF7 иллюстрирует, что продукция как IFN-α из pDCs и IFN-β из эмбриональных фибробластов в ответ на вирусную инфекцию/PAMPs серьезно повреждена, указывая тем самым, что IRF7 является окончательным регулятором реакции type I IFN как в стромальных, так и гематопоэтических компартментах (Honda et al. 2005). Следовательно, передача специфических TLR сигналов ведет к дифференциальной индукции IRF3 и,или IRF7 для надежной антивирусной реакции.

Два недавних сообщения подтвердили, что TRAF3, а не TRAF6, является критическим для TRIF- и MyD88-зависимой активации IRF3 и 7 посредством TLR3/4 и TLRs 7-9, соотв. (Hacker et al. 2006, Oganesyan et al. 2006). TRAF3 соединяет TRIF с нижестоящими киназами IKKi и TBK1 для TLR3/4-зависимой IRF3 активации и продукции IFN-β, в то же время он ассоциируется с IRAK-1, и возможно с IKKα, lkz TLR7-9-зависимой активации IRF7 и продукции IFN-α (Oganesyan et al. 2006). Т.о., бифуркация на пути передачи сигналов TLR происходит на уровне TRAF белков, т.к. дифференциальное использование TRAF6 или TRAF3 ведет к активации NF-κB для продукции про-воспалительных цитокинов или активации IRF для продукции type I IFN, соотв.

Помимо IRF7, IRF5 рекрутируется на MyD88/TRAF6 комплекс, это обеспечивает его активацию (Schoenemeyer et al. 2005, Takaoka et al. 2005). После активации и транслокации в ядро, IRF5 связывает мотивы в IFN-стимулируемом response элементе в промоторных областях про-воспалительных генов, способствуя тем самым их транскрипции. Поэтому DCs и макрофаги от IRF5 нокаутных мышей обнаруживают заметно сниженную продукцию IL-6, IL-12, и TNF-α dв твет на различные агонисты TLR, в то время как индукция IFN-α в CpG-стимулированных pDCs нормальная (Takaoka et al. 2005). Эти данные указывают на то, что IRF5служит в качестве генерального трансдуктора, который действует синергично с NF-κB и др. транскрипционными факторами для MyD88-зависимой индукции генов про-воспалительных цитокинов.

Chromatin Remodeling and TLR Signaling Specificity

TLR лиганды индуцируют продукцию общих про-воспалительных цитокинов, таких как TNFα и IL-6, но их соединение с TLRs также выявляет продукцию факторов. которые индуцируют специфические иммунные реакции. Напр., IL-12 очень важен для DC/macrophage затравки T-helper type 1 клеток адаптивной иммунной системы и его продукция зависит от передачи сигналов TLR. Т.к. передача сигналов TLR приводи к общей активации транскрипционных факторов, таких как AP-1 и NF-κB, то не очень ясно, как контролируется экспрессия специфических генов, таких как IL-12. Weinmann et al. (2001) пролили некоторый свет на эту дилемму, показав, что LPS стимуляция макрофагов ведет к ремоделированию нуклеосом вокруг промотора IL-12p40. Эта область ДНК обычно замаскирована, когда тесно комплексируется с соотв. гистонами, а передача сигналов LPS/TLR4 инициирует демаскировку, что увеличивет доступность её для транскрипционных факторов, приводя преимущественно к усилению транскрипции гена IL-12p40. В др. исследовании было показано, что стимуляция происходящих из костного мозга линий DCs и макрофаг-подобных клеток с CpG ДНК, с помощью LPS или lipoteichoic кислоты ведет к дифференциальной индукции IL-12p40, если они нормализованы к продукции TNFα (Albrecht et al. 2004). CpG индуцируют существенно более высокую экспрессию IL-12, чем это делает LPS или LTA, хотя активация NF-κB была эквивалентной после воздействия каждого из агонистов. Кроме того, CpG индуцируют сдержанное ремоделирование высших нуклеосом вокруг промотора IL-12p40, это возможно объясняет дифференциальную продукцию цитокинов, наблюдаемую после воздействия лигандом. Следовательно, ремоделирование nucleosome/chromatin может обеспечивать дополнительный уровень специфичности передачи сигналов TLR.

Хотя ни в одном исследовании не идентифицирован точный механизм, с помощью которого происходит ремоделирование нуклеосом, интересно бы обсудить, как дифференциальная передача сигналов TLRs ведет к цитоплазматической активации молекул, которые вступают или передают сигналов в ядро, чтобы индуцировать реструктуирование хроматина, тем самым увеличивая или уменьшая экспрессию генов для специфических иммуномодулирующих факторов. Противоречит этой гипотезе недавнее наблюдение, что передача сигналов TLR4 индуцирует экспрессию ATF3, члена семейства ATF/CREB транскрипционных фаткоров. ATF3 специфически снижает транскрипцию генов про-воспалительных цитокинов Il6 и Il12b путем рекрутирования histone deacetylases, чтобы возможно изменить структуру хроматина на их промоторах (Gilchrist et al. 2006). Это ограничивает доступ NF-κB и AP-1 к промоторным регионам и т.о., служит для негативной регуляции TLR4-обусловленной продукции про-воспалительных цитокинов.

NEGATIVE REGULATION OF TLR SIGNALING

Как обсуждалось выше, распознавание с помощью TLR специфичности лигандов и адпторов ведет к позитивной регуляции специфических про-воспалительных цитокинов и хемокинов для контроля и очистки от патогенов; однако, избыточное воспаление чрезвычайно вредно или даже фатально для хозяина. Бактериальный сепсис, аутоиммунные болезни и хронические воспалительные заболевания являются примерами гипериммунных условий, которые возникают в результате избыточной, нерегулируемой активности врожденной и адаптивной иммунных систем (Liew et al. 2005). TLRs экстенсивно участвуют в иммунопатологии большинства из этих болезней. Поэтому не удивительно, что хозяин использует механизмы, чтобы модулировать TLR-обусловленный ответ врожденного иммунитета. Некоторые из наиболее хорошо охарактеризованных негативных регуляторов передачи сигналов TLR представлены на Рис. 3.

IRAK-M, член семейства IRAK serine/threonine киназ, экспрессируется только в моноцитах и макрофагах и позитивно регулируется после стимуляции агонистами TLR (Wesche et al. 1999). В отличие от др.

Figure 3. Negative regulation of TLR signaling. Negative regulators function to dampen TLR signaling, thus preventing prolonged and potentially harmful innate immune responses. TOLLIP, IRAK-M, and SOCS-1 are cytoplasmic molecules that block IRAK-1 activation and/or IRAK-1-mediated TRAF6 activation. SOCS-1 may also mediate TIRAP degradation and/or act indirectly by downmodulating type I IFN signaling induced by TLRs. Transmembrane receptors such as SIGRR and ST2L also downregulate TLR signaling by either blocking MyD88/IRAK-1/4 activation or sequestering MyD88, respectively

членов семейства IRAK, IRAK-1 и IRAK-4, IRAK-M лишен киназной активности, т.к. ключевой остаток внутри предполагаемого киназного домена отсутствует (Muzio et al. 1997). Хотя ингибирующий механизм IRAK-M не совсем ясен, эта молекула, по-видимому, блокирует образование комплекса IRAK-1/TRAF6, но не рекрутирование IRAK-1 на MyD88 (Kobayashi et al. 2002). Следовательно, IRAK-M может ингибировать диссоциацию IRAK-1 и IRAK-4 от TLRs путем или блокирования их фосфорилирования или стабилизации TLR/MyD88/IRAK-4 комплекса, так что TRAF6 исключается и передача сигналов к NF-κB и/или MAPKs не происходит. Как таковой IRAK-M может действовать, чтобы регулировать передачу сигналов в целом от MyD88-зависимых TLRs.

SOCS-1 является членом SOCS семейства белков, которые играют важную роль в супрессии передачи сигналов цитокинов посредством JAK-STAT пути (Alexander 2002). Макрофаги от SOCS-1-дефицитных мышей продуцируют повышенные уровни про-воспалительных цитокинов в ответ на LPS и CpG ДНК как результат усиления фосфорилирования STAT1, IκBα, p38 и JNK в этих клетках (Kinjyo et al. 2002, Nakagawa et al. 2002). SOCS-1 может действовать, блокируя активацию IRAK-1, но недавние данные указывают на то, что он негативно регулирует передачу сигналов посредством TLRs 2 и 4 , за счет деградации TIRAP (Mansell et al. 2006). В ответ на передачу сигналов TLR2/4 TIRAP фосфорилируется с помощью Bruton's tyrosine kinase и затем взаимодействует с SOCS-1, это обусловливает его polyubiquitination и последующую протеосомную деградацию. Альтернативно, два недавних исследования показали, что SOCS-1-зависимое ингибирование предачи сигналов TLR является косвенным и происходит в результате блока или снижения передачи аутокринных/паракринных сигналов type I IFN вследствие TLR-обусловленной секреции IFN-α/β (Baetz et al. 2004, Gingras et al. 2004).

Адапторный белок TOLLIP (Toll-interacting protein) первоначально был охарактеризован благодая своей способности взаимодействовать с IL-1R акцессорным белком (Burns et al. 2000). Последующие исследования показали, что TOLLIP взаимодействует с некоторыми TLRs, включая TLRs 2 и 4, и блокирует активацию ими NF-κB (Bulut et al. 2001, Zhang & Ghosh 2002). Избыточная экспрессия TOLLIP ведет к образованию комплекса с IRAK-1, вызывая снижение аутофосфорилирования IRAK-1 (Zhang & Ghosh 2002). Следовательно, TOLLIP прежде всего действует на уровне IRAK-1, поддерживая покоящееся состояние не стимулированных иммунных клеток и облегчая окончание индуцированной IL-1R/TLR передачи сигналов во время воспаления и инфекции. Анализ TOLLIP-дефицитных мышей, однако, показал, что негативный регуляторный механизм TOLLIP более сложен, чем первоначльно предполагалось, т.к. активация NF-κB и MAPK в нокаутных клетках нормальная (Didierlaurent et al. 2006).

Наконец, в добавление к цитоплазматическим молекулам, ассоциированные с мембранами белки. такие как SIGIRR/TIR8 и ST2/T1 также могут играть роль в модуляции передачи сигналов TLR. Single immunoglobulin IL-1R-related protein (SIGIRR) является орфановым рецептором, который не индуцирует активацию NF-κB, т.к. он обладает внутриклеточным TIR доменом, который лишен двух аминокислот, важных для передачи сигналов с помощью IL-1RI (Thomassen et al. 1999, Wald et al. 2003). SIGIRR экспрессируется в различных типах клеток, от эпителиальных клеток до незрелых DCs, но он не экспрессируется в макрофагах, фибробластах или эндотелиальных клетках. DCs от SIGIRR-дефицитных мышей обнаруживают усиленную активность NF-κB в ответ на LPS и CpG, но не poly(I:C), и хотя точный механизм, с помощью которого функционирует SIGIRR, неясен, он, по-видимому, рекрутируется на TLR4, чтобы блокировать передачу сигналов путем секвестрации IRAK-1 и TRAF6 (Garlanda et al. 2004, Wald et al. 2003). Сходным образом, ST2/T1, связанный с мембраной член семейства IL-1 рецепторов. может ингибировать IL-1R- и TLR4-обусловленную передачу сигналов, но не передачу сигналов TLR3, путем секвестрации TIR-содержащих адапторов MyD88 и TIRAP (Brint et al. 2004).

FINAL THOUGHTS

Врожденная иммунная система обеспечивает инициальную защиту от патогенов до тех пор, пока не будет отвечать соответ. образом лицензированная и разработанная благоприобретенная иммунная система. Область исследования врожденного иммунитета возрождается с открытием TLRs млекопитающих. TLRs обнаруживают PAMPs от разнообразных микроорганизмов и вирусов и используется законсервированный набор адапторных молекул для сигнальной трансдукции, это ведет к позитивной регуляции ко-стимулирующих молекул и к продукции про-воспалительных цитокинов, хемокинов, антимикробных пептидов и типа I IFNs. Сложные механизмы связывания и передачи сигналов от TLRs к четким реакциям эффекторов, чтобы бороться с большинством патогенных атак, а дополнительная специфичность обеспечивается за счет дифференциальной экспрессии различных адапторов, транскрипционных факторов и TLRs. В последнее время получена важная информация о специфичности лигандов, структуре и сигнальных каскадах TLRs, хотя многие фундаментальные вопросы ещё остаются нерешенными. Продолжающаяся характеризация TLR- и adaptor-дефицитных мышей в комбинации с углубленным биохимическим анализом сигнальных путей безусловно повысят наши знания биологии TLR. Полное понимание молекулярных механизмов, управляющих TLR распознаванием и передачей сигналов позволит разработать терапевтические подходы, которые будут нацелены на реакции от определенных TLRs, оставляя при этом основную реакцию врожденной иммунной системы интактной, позволяя модулировать потенциально вредные нарушения, такие как сепсис и хроническое воспаление.

SUMMARY POINTS

1. TLRs are critically important innate immune receptors. Thirteen mammalian TLRs that bind a variety of conserved bacterial, viral, fungal, and protozoan PAMPs have been identified.
2. The N termini of TLRs comprise multiple LRRs, which provide ligand specificity. Multiple-residue insertions in nonconsensus LRRs likely diversify the PAMP binding potential of TLRs.
3. Heterodimeric TLR pairs, as well as non-TLR accessory molecules, may increase and diversify ligand recognition and/or lead to the recruitment of different adaptors for varied signaling.
4. Signaling through TLRs 1, 2, 5–9, and 11 proceeds exclusively through the MyD88, resulting in the recruitment ofIRAK/TRAF6complexes and the subsequent activation of NF-κB and MAPKs for proinflammatory cytokine production.
5. TLR4 differentially utilizes MyD88 and TRIF, and the TRIF-dependent pathway leads to the activation of IRF3 for IFN-? production and delayed NF-κB activation. In addition, TLR3 signaling is mediated exclusively by TRIF.
6. TIRAP and TRAM, two additional TIR-containing adaptors, bridge TLR4 as well as MyD88 and TRIF, respectively. TIRAP also links TLR2 to MyD88.
7. Type I IFN production from both stromal and hematopoietic cells is regulated by the activation of the transcription factors IRF3 and IRF7, whereas IRF5 functions with NF-κB to induce the expression of proinflammatory genes.
8. To limit potent inflammatory responses induced by TLRs, negative regulatory molecules exist to downregulate TLR signaling.

FUTURE ISSUES

1. Crystallographic analyses of complexes of PAMPs and their respective TLRs do not exist. Therefore, it remains unclear whether all TLRs bind their ligands directly, or whether other binding components are required. Structural studies of additional TLRectodomains, possibly complexed with other TLRs or their ligands, may provide insight into the exact binding mechanisms of these receptors.
2. Still unclear is whether signaling molecules, such as MyD88 and IRAK, are recruited to TLRs after PAMP binding, or whether they are always bound to their receptors. Knowledge of the exact nature of resting and active TLR complexes is critical for a complete understanding of signaling specificity.
3. Adaptors TIRAP andTRAMare mainly required for signal transduction from TLR4, and why this receptor utilizes these molecules in addition to MyD88 and TRIF is unclear. A thorough understanding of the functional significance of these adaptors should yield additional information about the signaling specificity of TLRs.
4. The extent to which TLR signaling induces chromatin/nucleosome remodeling, and thus promoter accessibility, at cytokine loci is unclear. Future work should characterize molecules that potentially signal to chromatin remodeling complexes.

Recognition and Signaling by Toll-Like ReceptorsA. Phillip West, Anna Alicia Koblansky, and Sankar GhoshAnnu. Rev. Cell Dev. Biol. 2006. 22:409–37

Recognition and Signaling by Toll-Like Receptors
A. Phillip West, Anna Alicia Koblansky, and Sankar Ghosh
Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2006. 22:409–37