Координация между клеточной пролиферацией и дифференцировкой важна в нормальном развитии. Подобно многим, если не всем, тканям млекопитающих этот процесс, по-видимому, следует антагонистическому динамическому процессу, в котором дифференцировка блокируется в пролиферирующих клетках
, а дифференцирующиеся клетки становятся постмитотическими и больше не делятся. В некоторых примерах cyclins, cyclin-dependent kinases (CDKs),
их ингибиторы (CDKNs) (Chen et al., 2002, Chen and Segil, 1999, Chen et al., 2003, Harper and Elledge, 1996, Takebayashi et al.,2005), также как и pRB (Mantela et al. , 2005, Sage et al. , 2005, Sage
et al. , 2006) и члены семейства E2F белков играют важные роли в этой антагонистической регуляции; однако, ничего не известно об этом последнем компоненте во внутреннем ухе. Информация, полученная в исследованиях рака, показывает, что D-типа циклины, ассоциированные с CDK4 или CDK6, являются критическими во время G
фазы, как и CCNE-CDK2. Будучи активированными за счет связывания cyclin, эти CDKs фосфорилируют pRBs. Активированные карманные белки непосредственно регулируют
SELECTION OF PHENOTYPES OBSERVED IN MICE DEFICIENT FOR SOME CELL CYCLE CONTROL GENES
фазу клеточного цикла и затем переход в S фазу путем взаимодействия с и регуляции активности транскрипционных факторов семейства E2F (Figure 1) (Dulic et al., 1994, Elledge and Harper, 1994, Harper et al. , 1993, Harper and Elledge, 1996, Matsuoka et al. , 1995, Sanchez et al. , 1997, Skowyra et al. , 1997, Takebayashi et al. , 2005, Zhang et al., 1997, Zhang et al., 1998, Zhang et al., 1999). Дополнительный уровень регуляции CDK осуществляется с помощью CDKNs, которые подразделяются на два CDKN1 (ранее Cip/Kip) семейство, сегодня состоящие из CDKN1A (p21 Cip1), CDKN1B (p27Kip1) и CDKN1C (p57Kip2) и CDKN2 (ранее Ink4) семейство, которое включает CDKN2A (p16 Ink4a), CDKN2B (p15Ink4b), CDKN2C (p18Ink4c) и CDKN2D (p19 Ink4d). Оба семейства CDKNs, по-видимому, участвуют в аресте клеточного цикла во внутреннем ухе, т.к. потеря некоторых из членов обоих семейств приводит к дерегуляции клеточного цикла в HCs и SCs (Chen and Segil, 1999, Chen et al., 2003, Laine et al. , 2007). Эти данные подтверждают роль как CDKN1, так и CDKN2 генов в скоординированном обеспечении выхода из клеточного цикла и в достижении постмитотического состояния в HCs и SCs (Laine et al., 2007).
Распространение влияния CDKs и CDKNs сети во внутреннем ухе было объектом нескольких недавних публикаций (Chen and Segil, 1999, Chen et al., 2003, Laine et al., 2007, White et al., 2006). Мы сфокусировались здесь на механизмах, с помощью которых карманные белки участвуют и контролируют пролиферацию и дифференцировку путем взаимодействия с разными членами семейства E2F и предоставляют дополнительную информацию для аппарата клеточного цикла во внутреннем ухе.
Pocket protein and E2F protein interactions constitute
one of the main nodes in cell cycle regulation
С тех пор как была осуществлена первая идентификация в качестве клеточных факторов, которые связываются и активируются аденовирусным E2 промотором (Kovesdi et al. , 1986a, Kovesdi et al., 1986b), E2Fs рассматриваются как ключевые медиаторы активности карманных белков, осуществляющие функции, которые выходят за пределы G1-S перехода и включают клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Индивидуальные E2Fs обладают самостоятельными механизмами действия и регуляции и ассоциируют с определенными типами биологических активностей (Cobrinik, 2005, Dimova
and Dyson, 2005). Эти транскрипционные факторы могут действовать путем образования гетеродимерных белковых комплексов с DP членами семейства транскрипционных факторов (TFDP1 and TFDP2) и работать как в качестве транскрипционных активаторов, так и репрессоров генной экспрессии, когда соединяются с разными членами семейства карманных белков (Cobrinik,
2005, DeGregori et al. , 1997). 'Активирующие' E2F комплексы максимально экспрессируются в поздней G
1 и регулируют ход клеточного цикла в пролиферирующих клетках. 'Репрессирующие' E2F комплексы экспрессируются в течение всего клеточного цикла и, как полагают, необходимы для выхода из клеточного цикла и дифференцировки. 8 членов семейства E2F были идентифицированы подобным образом и отнесены к активаторам (E2F1, E2F2 и E2F3a), репрессорам (E2F3b, E2F4 и E2F5) и RB-независимым репрессорам (E2F6, E2F7 и E2F8) (Adams et al., 2000, Leone et al., 2000). RB1 может взаимодействовать и регулировать активность обеих групп, но преимущественно он взаимодействует с 'активирущими' E2F1, E2F2, E2F3a; тогда как RBL1 и
RBL2 обычно ассоциируют и контролируют 'репрессирующие' E2Fs, напр., E2F4 и E2F5 (Dimova and Dyson, 2005, Dyson, 1998, Leone et al., 2000, Li et al. , 1997). Др. члены семейства, E2F6, E2F7 и E2F8 не соединяются с карманными белками и репрессируют E2F-чувствительные гены благодаря др. механизмам (Cobrinik, 2005, Cobrinik et al. , 1992, Dannenberg et al. , 2004, Dimova and Dyson, 2005, Dyson, 1998, Li et al. , 1997, Logan et al. , 2005, Maiti
et al., 2005). В постмитотических клетках инактивация функции E2F обеспечивается за счет соединения с нефосфорилированными pRBs. Более того, карманные белки действуют как транскрипционный репрессорный комплекс путем рекрутирования histone deacetylase (HDAC) и ремоделирования хроматина. Когда
Fig. 2. Hypothetical relative expression of pRB family of
proteins throughout the cell cycle. (A) Cell cycle progression
is regulated by a series of temporally coordinated phosphoryla-
tion events that target members of the pRB family. Progressive
increasing in phosphorylated RB1 levels stimulate cell prolifera-
tion, whereas coordinated variation in RBL1 and RBL2 expres-
sion provide extra mechanisms for the control of cell cycle
progression and duration. Moreover, pRB phosphorylation is
often reverted by dephosphorylation, which normally occurs in
late mitoses. Conversely, as the cell cycle progresses over
time, dephosphorylated form of pocket proteins, particularly
RB1, accumulate over time what seems to precede G1/G0
transition (Dailey et al. , 2003, Ludlow et al. , 1993, Moreno et al. ,
2004). In post mitotic cells, including the HCs, RB1 levels tend
to stabilize and become relatively steady throughout the cell life
(Mantela et al., 2005, Spencer et al., 2005); nevertheless, the
remaining pocket proteins levels seems to be variable and
dependent on the cell type (MacLellan et al., 2005, Spencer et
al., 2005). Microarray analysis of the pocket protein genes
expression in the inner ear suggest RB1 and RBL1 as the
predominant pocket proteins in the post-mitotic cells of the OC;
whereas RBL2 levels seems to be lower (Detail in figure A).
Immunofluorescence analyses of RBL1 expression in the OC of
a P21 wild type (B) and Pax2-Cre/Rb1-/- (C) mice. Note that
RBL1 is predominantly expressed in the multiple rows of out
hair cells. Scale bar, 10 µm.
клетки переходят в транскрипционно активное состояние, то фосфорилирование карманных белков с помощью G
1 cyclins и CDKs ведет к неспособности соединяться с E2F, который высвобождается и становится транскрипционно активным (Figure 1) (Cobrinik, 2005, Dannenberg et al. , 2004, Dyson, 1998, Li et al., 1997).
Среди группы членов семейства E2F, которые взаимодействуют с карманными белками (Figure 3), E2F1, E2F2 and E2F3a рассматриваются как мощные активаторы транскрипции, соединяясь, согласно нашим представлениям, исключительно с RB1 и достигая пика в экспрессии во время G
1-S перехода (Dyson, 1998). Соответственно, как и ожидалось, комбинированное устранение всех трех активаторов E2Fs приводит к тяжелой дерегуляции экспрессии генов E2F-мишеней, нарушению способности клеточной пролиферации и это подчеркивает важность активирующих комплексов для хода клеточного цикла (Wu et al., 2001). Напротив, репрессорные E2Fs экспрессируются в молчащих клетках и, по-видимому, участвуют в выходе из клеточного цикла и дифференцировке (Dimova and Dyson, 2005). Учитывая критическую роль активаторных E2Fs в регуляции клеточного цикла и непосредственном взаимодействии с RB1, можно предсказать, что сходная потеря Rb1 или любого из оставшихся карманных белков (Table 1), будет приводить к специфической потере любого из активаторов и будет вызывать разрушительные эффекты на развитие и органогенез. Однако, условная делеция активирующих E2Fs неспособна продемонстрировать уникальную потребность в каком-либо отдельном E2F, указывая тем самым, что потеря индивидуальных E2Fs или специфических комбинаций может быть функционально скомпенсирована за счет др. родственных членов семейства (Wu et al. , 2001). Единственным исключением стало наблюдение эмбрионов с отсутствием E2F3, которые обнаруживали пониженную жизнеспособность возможно из-за дефекта в пролиферации определенных типов клеток, таких как фибробласты (Humbert et al., 2000, Saavedra et al., 2002). Др. противоречием является то, что большинство двойных нулевых мышей по Rb1 и любому из активаторов E2Fs доживают до рождения (Table 1), особенно при комбинации Rb
-/-E2F2
-/-, по-видимому, за счет устранения части вредных эффектов потери Rb1 в ЦНС, сетчатке и хрусталике без последующей апоптической реакции. Эти последние данные указывают на существование 'backup system' в этой ткани. способной нормализовать и компенсировать комбинированную потерю этих генов (Saavedra et al., 2002). Хотя это кажется парадоксальным, все вместе, эти доказательства во внутреннем ухе и др. системах указывают на то, что наилучшим способом манипуляций с экспрессией Rb1 является избегание непосредственной элиминации Rb1. Вместо этого др. компоненты Rb1 регуляторной сети д. использоваться для оказания влияния на контролируемый Rb1 ход клеточного цикла во внутреннем ухе, или выше (CDKN's) или ниже (E2F's) или посредством др. карманных белков. Это д. сопровождаться использованием DNA tumor virus белка, SV40 large tumor antigen (LT), который соединяется с pRBs и вытесняет E2Fs (Moreno et al. , 2004), за счет несоответствующего фосфорилирования RB1 из-за избыточной экспрессии CCNDs, в результате потери CDKNs, потери CDKN2A или в результате мутации или амплификации CDK4 или CDK6 генов (Chen and Segil, 1999, Chen et al. , 2003, Cheng et al. , 2000, Jin et al., 2001, Laine et al. , 2007, Sherr, 1996, Sherr and McCormick, 2002, White et al., 2006). Др. альтернатива д. заключаться во временном манипулировании с некоторыми pRB-специфическими партнерами по связыванию, E2F1, E2F2 и E2F3a. Все три активирующие E2Fs способны взаимодействовать специфически с Rb1 но не с др. карманными белками; подобно pRBs они тонко регулируются во время клеточной пролиферации и накапливаются по ходу клеточного цикла (Cobrinik, 2005, Saavedra et al. , 2002). Имеются экспериментальные доказательства, показывающие, что эктопическая экспрессия любого из этих E2Fs может эффективно индуцировать вхождение в S фазу постмитотических клеток. Избыточная экспрессия E2F1 достаточна, чтобы реактивировать синтез ДНК в клетках, которые во всем остальном имеют арестованный клеточный цикл. Более того, микроинъекции E2F1 кДНК в постмитотические клетки могут индуцировать вхождение в S-фазу (Johnson et al., 1994, Johnson et al., 1993). Однако, как E2F1, так и E2F3, но не E2F2, как известно, играют важные роли в контроле апоптоза, а дерегуляция их взаимодействия с RB1 ведет к сильно увеличенной клеточной гибели (DeGregori and Johnson, 2006, DeGregori et al. , 1997, Hou et al. , 2002, Saavedra et al., 2002). Очень важно, что E2F2 эффективно активирует синтез ДНК в молчащих фибробластах в той же степени, что и E2F1, но без индукции апоптоза, указывая тем самым, что E2F1
-/-/E2F3
-/- индуцированный апоптоз не является просто обычной реакцией, запускаемой индукцией неправильного вступления в S фазу, а скорее может представлять собой прирожденное свойство этих специфических транскрипционных факторов (DeGregori and Johnson, 2006, DeGregori
et al., 1997, Dimova and Dyson, 2005, Hou et al. , 2002, Pan et al. , 1998, Saavedra et al. , 2002). В самом деле, недавние доказательства подтвердили, что E2F2 может быть использован для индукции образования новых сердечных мышечных клеток без индукции апоптоза (Ebelt et al., 2006).
Cell cycle mechanisms in the organ of Corti
Считается, что отсутствие пролиферативной способности является частью характеристик взрослых HC и SC млекопитающих, общих большинству нейронов ЦНС и сердечным мышечным клеткам. Лишь немногие исследования изучали процесс регуляции клеточного цикла во взрослых HCs/SCs из OC, т.к. считается, что после терминальных митозов их поиск бесполезен. Сегодня растут доказательства, указывающие на способность HCs и SCs высвобождаться от своего 'перманентного' постмитотического ареста, вступать в клеточный цикл и пролиферировать (Laine et al., 2007, Mantela et al.,2005, Sage et al. , 2005, Sage et al. , 2006, White et al. , 2006). Ключевые регуляторы клеточного цикла были идентифицированы в клетках внутреннего уха, особенно Cdkn1b (Endo et al., 2002, Kanzaki et al., 2006, Kim and Raphael, 2007, Lee et al. , 2006, White et al. , 2006), Cdkn2d (Chen et al. , 2003, Laine et al. , 2007) and Rb1 (Mantela et al. , 2005, Sage et al., 2005, Sage et al., 2006). Считается, что эти регуляторы играют критическую ролль в поддержании постмитотического состояния в HCs и SCs. Экспрессия CDKN1B индуцируется в эмбриональном кортиевом органе между E12 и E14, коррелируя с концом клеточных делений в предшественниках HC и SC (Chen and Segil, 1999). Во время развития постмитотических клеток предшественников экспрессия CDKN1B подавляется в HCs, но сохраняется на высоких уровнях в SCs и спиральном ганглии зрелого органа Корти (Chen and Segil, 1999, Endo et al., 2002). Мыши, несущие целенаправленную делецию гена Cdkn1b обнаруживают пролиферацию предшественников сенсорных клеток после E14, что ведет к появлению избыточного количества HCs и SCs и тяжелой потере слуха (Chen
and Segil, 1999, Kanzaki et al., 2006). Сходным образом целенаправленные нарушения гена Cdkn2d gene (Chen et al., 2003) ведут к аномальному синтезу ДНК в постнатальных HCs улитки, приводя к паттерну аберрантной пролиферации, сопрсождаемому апоптозом и прогрессивной потерей слуха (Chen et al. , 2003, Laine et al. , 2007). Мутации в Cdkn1a не вызывают альтераций в структуре внутреннего уха, хотя одновременная делеция Cdkn2d и Cdkn1a запускает профузное вступление в S фазу постнатальных HCs, что сопровождается p53-обусловленным апоптозом (Laine et al. , 2007). Всё это подчеркивает критическую роль CDKNs в поддержании постмитотического состояния клеток OC и подтверждает, что потеря специфических ингибиторов клеточного цикла в OC ведет к патологии и дисфункции (Kanzaki et al., 2006).
в дополнение к CDKNs, Rb1 играет существенную роль в выходе из клеточного цикла, созревании и выживании сенсорных HCs и SCs. Экспрессия RB1 , по-видимому, позитивно регулируется в HCs развивающегося OC, но она ограничивается IHCs и на низких уровнях и SCs зрелого OC (Mantela et al. , 2005). Потеря Rb1 в постнатальных
HCs дает аберрантные HCs and, и до некоторой степени, пролиферацию SCs (Mantela et al. , 2005, Sage et al. , 2005, Sage et al. , 2006). Несмотря на это апоптическая потеря избыточных HCs у Rb1 нулевых мышей, по-видимому, пространственно и во времени контролируется в пределах от 'легкой', как в кохлеарной и вестибулярной системах ранних постнатальных Rb1 нулевых мышей (Mantela et al. , 2005) и в вестибулярных чувствительных элементах взрослых Rb1 нокаутов (Sage et al., 2006), до массивной, как это обнаруживается в OC как условных Tg(Pou4f3-Cre)/Rb1tm(loxP)/tm(loxP), так и у tamoxifen-индуцибельных условных Tg(Atoh1-CreER)/Rb1tm(loxP)/tm(loxP) взрослых мышей (Sage et al. , 2006, T. Weber and J. Zuo, Personal communication). В целом эти исследования выявляют критические, всё же самостоятельные роли RB1 в клетках внутреннего уха, которые могут зависеть от присутствия и уровня экспрессии остальных карманных белков, указывая тем самым, что теперь мы знаем больше о регуляции клеточных циклов клеток сенсорного эпителия внутреннего уха, чем только о cyclins, CDKs, CDKNs и RB1 самих по себе. Если и в самом деле HCs и SCs постоянно выходят из клеточного цикла, то как объяснить ограниченную способность взрослых вестибулярных поддерживающих клеток млекопитающих пролиферировать and замещать потерянные волосковые клетки (Roberson and Rubel, 1994, Warchol et al., 1993)? Сходным образом, ка объяснить способность не-сенсорных клеток OC плоского эпителия вступать снова в клеточный цикл и пролиферировать (Kim and Raphael, 2007)? Чтобы ответить на эти вопросы, необходимо лучше понимать механизмы, лежащие в основе регуляции клеточного цикла клеток внутреннего уха. Как уже отмечалось альтернативные подходы уже успешно применяются в др. постмитотических системах (Ebelt et al., 2006) и могут быть в принципе перенесены на ухо с соотв. поправками.
Fig. 3. Interaction of the pRBs with the E2F family of transcription factors make
up one of the major features distinguishing the three pocket proteins from each
other. Eight E2F family members have been identified to date, which are divided in two subgroups: E2F1-E2F3a are considered transcriptional “activators”, while E2F3b-E2F8 act by “repressing” the cell cycle continuity. RB1 can interact with both activating and repressor E2Fs, but generally bind activating E2Fs to promote cell cycle progression. RBL1 and RBL2 associate with but may not be limited to the repressing E2F4s and E2F5s and are believed to be required for cell cycle exit and differentiation. The remaining E2Fs form transcriptional repressor complexes in a pocket protein independent manner. Modified after Cobrinik (2005).
Future perspectives
Cancer cells and developmental abnormalities that occur in pocket protein depleted mice models have provided key lessons to be learned on their function that should be extrapolated to their role in the inner ear (Table 1) (Gallie et al., 1992, Gallie et al. , 1990). During the development of the inner ear Rb1 has been shown to be important in both maturation and survival of HCs and SCs (Mantela et al., 2005, Sage et al., 2005, Sage et al., 2006), manipulating RB1 or another pRB signal molecule(s) (either upstream through CDKN’s or downstream through E2Fs) may provide the answer for the development of appropriate alternatives for the new proliferation of lost sensory HCs. Available data suggests that complete elimination of Rb1
in the inner ear results in massive proliferation of HCs and to some extent SCs, followed by massive apoptotic death of all sensory HCs (Mantela et al., 2005, Sage et al. , 2005, Sage et al. , 2006, T. Weber and J. Zuo, personal communication). A
more transitory and possibly incomplete, inactivation of Rb1 should be a more promising approach for HC regeneration. Such approaches may be possible using siRNA to transiently knockdown RB1 mRNA and should be safe if driven by SC-specific promoters such as Gfap or Plp1 (Morris and Dyson, 2001, Rio et al. , 2002). Based on these insights and those derived from other systems, we predict that the inhibition of mammalian hair cell division is a life-long process in these cells.
Reinforcement for this assumption comes from the fact that abnormal proliferation of hair cells precedes the activation of DNA damage response and TP53-dependent apoptosis (Laine et al., 2007). Although safe manipulation and re-initiation of the
cell cycle of the post mitotic inner ear HCs may be difficult if not impossible to achieve, these results suggest that more specific strategies need to be developed which target other cells and different cell cycle components than the ones that were targeted so far. Indeed, the combination of experimental evidence of the role of RB1 role in the inner ear and the fact that all three activating E2Fs are expressed in the developing organ of Corti (Table 2) suggest that, comparable to RB1, the cell cycle control and progression in the inner ear’s sensory epithelia is E2F-dependent and offers new opportunities to manipulate RB1 activity in the HCs and SCs.
Сайт создан в системе
uCoz
, and KIRK W. BEISEL
Fig. 1. Simplified schematic representation of the Rb1 pathway in the cell cycle regulation.
Regulation of cell proliferation is dependent on integration of positive regulatory systems that are activated by external signal molecules such as the growth factors. The complex formed by the pocket proteins and their associated E2Fs block cells in
G 1 phase of the cell cycle. Dissociation of these complexes is regulated by the action of cyclins, CDKs and CDKNs; phosphorylated pRBs are unable to bind and inhibit E2F positive continuation of the cell cycle and cells progresses into S phase. Dependent on the correct interaction between the different components of this signaling cascade, the fate of the cells is determined in G0 phase either by going back in the G 1 phase of the cycle to continue proliferating or alternatively being arrested out of the cell cycle and induced to differentiate, become senescent, or to undergo apoptosis. Note that under certain circumstances cell cycle arrested cells may re-enter the cell cycle. Modified after Cobrinik (2005). 