Роль Стволовых Клеток Внутреннего Уха

Stem cells for the replacement of inner ear neurons and hair cells RODRIGO MARTINEZ-MONEDERO and ALBERT S.B. EDGE Int. J. Dev. Biol. 51: 655-661 (2007) doi: 10.1387/ijdb.072372rm
Stem cells in the nervous system have some capacity to restore damaged tissue. Proliferation of stem cells endows them with self-renewal ability and accounts for in vitro formation of neurospheres, clonally derived colonies of floating cells. However, damage to the nervous system is not readily repaired, suggesting that the stem cells do not provide an easily recruited source of cells for regeneration. The vestibular and auditory organs, despite their limited ability to replace damaged cells, appear to contain cells with stem cell properties. These inner ear stem cells, identified by neurosphere formation and by their expression of markers of inner ear progenitors, can differentiate to hair cells and neurons. Differentiated cells obtained from inner ear stem cells expressed sensory neuron markers and, after co-culture with the organ of Corti, grew processes that extended to hair cells. The neurons expressed synaptic vesicle markers at points of contact with hair cells. Exogenous stem cells have also been used for hair cell and neuron replacement. Embryonic stem cells are one potential source of both hair cells and sensory neurons. Neural progenitors made from embryonic stem cells, transplanted into the inner ear of gerbils that had been de-afferented by treatment with a toxin, differentiated into cells that expressed neuronal markers and grew processes both peripherally into the organ of Corti and centrally. The regrowth of these neurons suggests that it may be possible to replace auditory neurons that have degenerated with neurons that restore auditory function by regenerating connections to hair cells.	Эндогенные стволовые клетки наделяют регенеративной способностью взрослые ткани путем их способности постоянно само-обновляться и дифференцироваться и эти свойства позволяют им замещать потерянные клетки путем обчного оборота или после потери ткани. В ряде исследований было продемонстрировано появление стволовых клеток в ЦНС (Doetsch et al., 1999, Gage, 2000, Kondo and Raff, 2000, Lie et al., 2004, Pevny and Rao, 2003, Rietze et al., 2001, Temple, 2001), и хотя имеется небольшой постояный оборот, стволовые клетки могут быть рекрутированы для замещения потерянных нейронов (Bauer et al. , 2003, Kempermann et al. , 2004, Ohori et al. , 2006). Нейральные стволовые клетки присутствуют в субвентрикулярной зоне латеральных желудочков и в dentate gyrus (Taupin and Gage, 2002, Watts et al. , 2005) и как было показано, также в периферической нервной системе (Dromard et al., 2007, Hjerling-Leffler et al., 2005). Предшественники периферических нейронров возникают из нейрального гребня (Crane and Trainor, 2006, Greenwood et al. , 1999, Tomita et al. , 2005) , а производные нервного гребня, которые дают автономные и сенсорные нейроны, персистируют во взрослой ткани. Существование стволовых клеток в периферической и ЦНС демонстрируется исследованиями in vivo с использованием генетических трассеров для выявления источника дифференцированных клеток и с помощью критериев in vitro, таких как экспрессия маркеров стволовых клеток и способности их формировать нейросферы (Reynolds and Weiss, 1992). Однако, способность к регенерации с помощью стволовых клеток в нервной системе ограничена и следовательно, редко обнаруживается после повреждений в ЦНС. Даже в местах, где стволовые клетки подвергаются клеточным делениям in vitro, регенерация умеренная (Kempermann et al. , 2004, Taupin and Gage, 2002). В разделе эндогенных стволовых клеток мы ограничим обсуждение генерацией клеток из предшественников и не затронем регенерации с помощью делений предсуществующих волосковых клеток (Sage et al. , 2005) или с помощью дифференцировки др. зрелых, определенных клеток улитки в волосковые клетки (Izumikawa et al., 2005, White et al., 2006). Возможно, что эти два способа регенерации волосковых клеток - из предшественников стволовых клетоек и из др. типов клеток - могут оказаться очень сходными процессами, когда станет больше известно об характеристиках клеток предшественников. Во втором разделе по трансплантации клеток мы рассмотрим недавние доказательства замещения клеток в улитке. Репарация поврежденных периферических нервов также может сопровождаться регенерацией моторных и сенсорных отростков (Brushart, 1993, Mi et al. , 2007). Взаимодействия с растущими аксонами показали влияние на возобновление роста этих отростков и образование новых синапсов (Fraher, 2000, Harel and Strittmatter, 2006, Hata et al., 2006, Pasterkamp and Verhaagen, 2006). Formation of inner ear cells from endogenous stem cells Образование сфер из индивидуальных клеток, диссоциированных из utricular эпителия используется для демонстрации, что стволовые клетки присутствуют во внутреннем ухе (Li et al. , 2003a). Сферы были клональными (Li et al., 2003a) и дифференцировались в клеточные типы, соответствующие всем трем зародышевым слоям, энтодерме, мезодерме и эктодерме (Li et al. , 2003a), указывая тем самым, что стволовые клетки были плюрипотентны (Fig. 1). Мы генерировали сферы из сенсорного эпителия улиток и спиральных ганглиев мышей (Oshima et al., 2007). Стволовые клетки в сферах пролиферировали, как и требовалось для самообновления и они обладали способностью дифференцироваться в нейроны и волосковые клетки (Martinez-Monedero et al., 2007, Oshima et al., 2007). Демонстрация, что клетки предшественники внутреннего уха могут дифференцироваться в волосковые клетки и нейроны in vitro открывает возможность, что они могут быть индуцированы к дифференцировке in vivo как быза для будущей терапии по замещению клеток во внутреннем ухе. Способность формировать сферы как кохлеарного, так и вестибулярного органов уменьшается после раннего постнатального периода (Oshima et al., 2007), это согласуется с идеей,что они теряю свою способность пролиферировать. В вестибулярном органе клетки, которые сохраняют свою способность делиться и дифференцироваться в более специализированные клетки сохраняется дольше, чем в улитке. Постнатальная потеря стволовых клеток наблюдалась и во взрослых глазах со сходной временной рамкой, что и во внутреннем ухе. Ретинальные стволовые клетки, которые дают клетки ретинальных ганглиев обнаруживаются постнатально, но уменьшаются в числе во время постнатальной жизни у грызунов (Reh and Fischer, 2006). Напротив, др. демонстрируют присутствие клеток нейральных предшественников в слуховом нерве взрослых людей, с экспрессией nestin-позитивных нейральных предшественников, которые делятся и экспрессируют маркеры, обнаруживаемые в сенсорных нейронах внутреннего уха, подобные TrkB и TrkC (Rask-Andersen et al., 2005). Возможно, что некоторые стволовые клетки теряются по мере созревания животных, во всяком случае они пролиферируют менее быстро у взрослых. Несмотря на плюрипотентную дифференцировку потенциала этих клеток, однако, восстановление не происходит в какой-либо достоверной степени после повреждения волосковых клеток или нейронов в улитке млекопитающих. Это Fig. 1. Fig. 1. Neurons differentiated from inner ear stem cells. (A) Stem cells isolated by sphere formation from the vestibular organs of a mouse. Clonal spheres are observed after 7-14 days in nonadherent culture. (B) Spheres derived from the inner ear differentiate into nestin and -III tubulin-positive neurons upon culture as attached progenitor cells in a dish. (C)Schematic of an inner ear sphere in culture with an organ of Corti showing growth of neural processes to contact hair cells. (D) Spiral ganglion neurons (stained for -III tubulin) placed in culture with an explant of the organ of Corti that had been denervated with -bungarotoxin (green hair cells from a Math1-nGFP mouse). The neurons isolated from a newborn mouse grow processes that appear to be attracted by and form contacts with hair cells. контрастирует во взрослыми вестибулярными органами, где некоторые клетки обладают способностью делиться и дифференцироваться в волосковые клетки (Forge et al., 1993, Warchol et al. , 1993). Регенерация улитковых нейронов не обнаруживается после денервации (Carnicero et al., 2002, Sekiya et al. , 2003) и повреждения нейронов, что ведет к перманентной глухоте. Даже если клеточные тела и центральные аксоны выживают, потеря слуха всё ещё остается результатом дегенерации периферических отростков (Nadol, 1997). Первичная дегенерация нейронов улитки была описана при разных патологиях (Starr et al. , 1996, Varga et al. , 2003) и она может появиться в результате повреждения улитки, таких как воздействие давления уровней звуков, которые не вызывают потери волосковых клеток (Kujawa and Liberman, 2006). Вторичная дегенерация обычно следует за дегенерацией сенсорного эпителия, а гибель нейрональных клеток возникает из=за отсутствия трофической поддержки (Fritzsch et al., 1997). Исследования нарушений функции у мышей показали, что жизнеспособность нейронов спирального ганглия зависит от количества генов, таких как neurotrophins (Ernfors et al. , 1995, Hossain et al. , 2002),компоненты пути erbB (Stankovic et al., 2004) и cAMP-зависимой протеин киназы (Bok et al., 2003). Защита слуховых нейронов с помощью разнообразных вмешательств продемонстрирована, а нейротрофины, как было показано, усиливают жизнеспособность нейронов во внутреннем ухе (Miller et al. , 1997, Wise et al. ,2005). Хотя нейроны не регенерируют, когда они теряются, нейроны спирального ганглия, как было установлено, обнаруживают возобновление выроста волокон в различной степени после повреждения у разных моделей животных. Некоторые исследования подтвердили, что окончания повторно соединяются с волосковыми клетками (Puel et al., 1997, Sekiya et al., 2003) и что эти новые соединения функциональны (Puel et al., 1997). Экспериментальные разрезы слухового нерва у мышей приводили к экстенсивному повторному росту волокон в улитку (Sugawara et al., 2005). Однако, у людей степень возобновления роста не является клинически достоверной (Nadol, 1997). Возобновление роста этих отростков может быть усилено с помощью NT-3 и BDNF, которые, как известно, усиливают периферические соединения у морских свинок, даже если применяются спустя 33 дня после воздействия kanamycin бдля повреждения нейронов и волосковых клеток (Wise et al., 2005). Существование эндогенных стволовых клеток в улитке млекопитающих открывает дверь для новых подходов для репарации повреждений в улитках за счет клеточной пролиферации и дифференцировки. Мощный новый подход д. быть предусмотрен, если плюрипотентность этих клеток предшественников может быть использована. Стволовые клетки или клетки со свойствами, подобными стволовым клеткам, могут быть направлены в сторону дифференцировки волосковых клеток или нейронального фенотипа, чтобы замещать дегенерировавшие нейроны и волосковые клетки и восстанавливать функцию внутреннего уха. Характеристика стволовых клеток внутреннего уха показывает, что пролиферирующие клетки, которые позитивны в отношении окраски BrdU, экспрессируют маркеры нейральных стволовых клеток, Musashi и nestin и маркеры эмбриональных стволовых клеток (Ivanova et al., 2006), Sox2, Tbx3 и Tcl1 (Martinez-Monedero et al., 2007). Эти клетки могут быть получены из улитки и вестибулярных органов и давать волосковые клетки, базируясь на маркерах и электрофизиологии, которая демонстрирует взаимоотношения электрический ток - напряжение, характерное для E16 волосковых клеток из utriculal (Oshima et al., 2007). Присутствие клдеток внутреннего уха, которые м. давать волосковые клетки было продемонстрировано на улитках новорожденных мышах и крысах (Doetzlhofer et al., 2004, Malgrange et al., 2002, White et al., 2006, Yerukhimovich et al., 2007, Zhai et al., 2005), а поддерживающие клетки могут действовать как предшественники волосковых клеток in vitro во время их раннего постнатального периода (Doetzlhofer et al. , 2004, Malgrange et al., 2002, White et al., 2006). Волосковые клетки внутреннего уха, продуцируемые линией клеток из улитки обнаруживают реакцию на механические вибрации (Liu et al. , 2006). Эти предшественники обладают сопособностью давать широкий круг нейрональных типов. Т.о., стволовые клетки могут превращаться в dopamine нейроны, cholinergic нейроны и seritonergic нейроны (Martinez-Monedero et al. , 2007). Однако, огромное количество происходящих из стволовых клеток внутреннего уха нейронов было glutamatergic и обладало рецепторами glutamate. Эти нейроны экспрессируют маркеры сенсорных нейронов, как незрелых (Brn3a , Ngn1 и NeuroD ), так и зрелых ( TrkB, TrkC и peripherin ) и маркеры развивающихся слуховых нейронов, подобно GATA3. Они также экспрессируют гены, ассоциированные с эмбриональным внутренним ухом, такие как Pax2 и islet1 . Дифференцировка этих клеток в функциональные нейроны подтверждена электрофизиологической активностью (Martinez-Monedero et al., 2007). Иммортализованные линии клеток улитки также, как было установлено, дифференцируются в клетки со многими характеристиками слуховых нейронов (Nicholl et al., 2005). Эти клетки могут воспроизводить ранние ступени формирования спирального ганглия и могут размножаться неопределенно долго, делая их потенциально пригодными для экспериментов с трансплантациями во внутреннем ухе. Нейроны, происходящие путем дифференцировки стволовых клеток внутреннего уха, выпускают отростки, которые контактируют с волосковыми клетками в эксплантах кортиева органа, который был денервирован с помощью β-bungarotoxin (Martinez-Monedero et al., 2007). Это сходно с тем, что наблюдалось ранее в этой in vitro модельной системе с использованием нейронов спирального ганглия новорожденных (Martinez-Monedero et al. , 2006) (Fig. 1). Нейроны, что не было показано ранее, регенерируют синапсы с волосковыми клетками, но мы установили, что нейроны спирального ганглия новорожденных мышей контактируют с волосковыми клетками и экспрессируют synapsin и SV2 в месте контакта. Образование новых афферентных соединений является ключевой ступенью в регенерации сенсорного органа и эти новые контакты подтверждают, что первичные афферентные нейроны могут реформировать эти соединения. Новые нейроны появляются, обладая некоторыми свойствами пресинаптических нейронов во время синаптогенеза: экспрессия синаптических маркеров локализуется на нейрональной стороне действительного контакта с волосковой клеткой (Martinez-Monedero et al., 2006). Отростки нейронов спирального ганглия, которые распространяются к волосковым клеткам во время развития, окрашиваются на synapsin и synaptophysin (Scarfone et al., 1991) и возможно, что характеристика этих периферических отростков как дендритов приобретается только после образования ими соединений с волосковыми клетками. Выросты нейритов. как было показано, появляются до приобретения характеристик аксонов и дендритов. Одиночный отросток может затем приобретать аксональные характеристики и экспрессировать аксональные маркеры (Jiang et al. , 2005, Schwamborn and Puschel, 2004). после установления первого контакта передача сигналов от волосковых клеток может предоставлять ключ для дальнейшего развития нейрона. Влияние синаптического контакта на дальнейшую дифференцировку нейрона, также как и электрофизиология синапсов, формируемых этими новыми отростками ещё предстоит исследовать. Образование соединений требует, чтобы нейроны были способны находить свои мишени. Способность нахождения пути нейронами может зависеть от распознавания сигналов наведения растущими аксонами так, что нервный отросток может отвечать на сигналы от волосковых клеток или эти сигналы д. быть из глиальных или др. не-нейрональных клеток, которые предупреждают рост к неправильным мишеням путем экспрессии отталкивающих сигналов (Dickson, 2002). Так, наблюдаемый целенаправленный рост в этой системе указывает на важность молекул наведения, которые могут быть определены по эффекту избыточной или недостаточной функции гена кандидата. Замещение нейронов может становиться всё важнее, если попытки регенерации волосковых клеток окажутся успешными. Отростки нейронов спирального ганглия образуют новые соединения с волосковыми клетками, которые генерируются из поддерживающих клеток после избыточной экспрессии Math1 используя аденовирус (Kawamoto et al., 2003), подтверждают, что нейральные отростки могут привлекаться новыми клетками. Возбуждения волосковых клеток, которые возникают в клеточной линии, полученной из отоцистов, in vitro вызывают реакцию совместно культивируемых нейронов, указывая на функциональную связь возобновления роста с соединением с волосковыми клетками (Liu et al., 2006). Regeneration of auditory neurons and hair cells from exogenous stem cells При попытке получения как слуховых нейронов, так и волосковых клеток из ES клеток мышей, получали волосковые клетки при добавлении EGF, bFGF и IGF-1 (Li et al. , 2003b). Эти клетки экспрессировали маркеры развивающихся и зрелых волосковых клеток, Math1, Brn3c и myosin VIIa и имели пучки стереоцилий, которые метились по espin и F-actin. Сенсорные нейроны или нейроны с характеристиками слуховых нейронов также продуцировались ES клетками (Coleman et al. , 2007, Corrales et al. , 2006). ES клетки человека могут быть превращены в предшественники, которые обладают теми же самыми маркерами, что и эмбриональные предшественники сенсорных нейронов в нервном гребне и сенсорных плакодах, и эти клетки могут быть дифференцированы в нейроны со многими характерными маркерами сенсорных нейронов (Shi et al., 2007). Волосковые клетки могут также генерироваться путем воздействия ростовыми факторами на мезенхимные стволовые клетки из костного мозга, которые ко-культивируются с отоцистом кур (Jeon et al., 2007). Экспрессия Math1 в клетках предшественниках, получаемых из мезенхимных стволовых, приводит к их превращению в волосковые клетки (Jeon et al. , 2007). Недавно использовались и др. взрослые стволовые клетки в качестве источника волосковых клеток, Экспрессия маркеров волосковых клеток описана после совместного культивирования обонятельных предшественников с supernatants от культур улиток (Doyle et al., 2007). Стволовые клетки костного мозга были использованы для генерации нейронов со многими характеристиками слуховых афферентных нейронов (Kondo et al., 2005). Нейроны экспрессировали транскрипционные факторы сенсорных нейронов, GATA3 и Sox10, а также AMPA рецепторы после воздействия ретиноевой кислотой и sonic hedgehog. Маркер сенсорных нейронов, Brn3a, обнаруживался только после того, как нейроны были культивированы в среде, кондиционированной E10 hindbrain/somite/otocyst, и эти нейроны испускали отростки в направлении волосковых клеток. Экзогенные стволовые клетки были использованы для замещения дегенерировавшего слухового нерва. Было установлено, что клетки предшественники, происходящие из экзогенных стволовых клеток оказались эффективными для замещения нейронов спирального ганглия в животной модели первичной нейрональной дегенерации (Fig. 2) и что эти нейроны направляют свои отростки в кортиев орган, где они, по-видимому, контактируют с волосковыми клетками (Corrales et al., 2006). Клеточные тела трансплантированных нейронов оказывались внутри тракта, обычно занимаемого аксонами спирального ганглия и распространяли свои отростки к центру и периферии. Периферические волокна росли в апикальном направлении в нервном стволе и в пучках фасцикул нейритов, которые покидали ось улитки в радиальном направлении к каналу Rosenthal's и посредством костной спиральной ламины кортиева органа. Волокна, т.о., росли периферически от эктопического местоположения (нервного ствола улитки) к месту оригинальных клеточных тел и от туда к волосковым клеткам, а центральные волокна росли в ствол головного мозга (Shi et al., 2007). Могут ли эти нейроны восстанавливать функцию, не установлено. Нейриты от клеток ганглиев дорсальных корешков, трансплантированные в крыс не росли в направлении сенсорных клеток (Hu et al., 2005a) и нет доказательств Fig. 2. Transplantation of neural progenitors derived from ES cells into the cochlea. When stem cell derived neural progenitors are injected into an ear that has had its auditory nerve removed by a toxin, the cells form a graft at the base of the cochlea and differentiate into neurons. The engrafted cells can be identified by endogenous EYFP and processes extending from these cells can be followed both apically within the modiolus of the cochlea and radially to the organ of Corti. They can be labeled for neuronal markers by immunofluorescence. The black circles indicate the location of Rosenthal's canal where the cell bodies of the afferent neurons are located in the normal animal. в пользу роста нейритов в направлении волосковых клеток от нейральных стволовых клеток, трансплантированных во внутреннее ухо морских свинок (Hu et al., 2005b). Однако, нейроны хозяина не были удалены, а клетки, помещенные в scala tympani, делают трудной оценку регенерируют ли центральные или периферические отростки спирального ганглия. Нейральные стволовые клетки были использованы для трансплантаций в улитку мышей, которые были обработаны cisplatin, чтобы удалить эндогенные нейроны и клетки присутствовали в улитке две недели после трансплантации (Tamura et al., 2004). Происходящие из ES клеток нейральные предшественники образуют контакты как с вестибулярными волосковыми клетками (Kim et al., 2005) , так и трансплантации ES клеток в улитку морских свинок вызывали рост отростков, хотя отростки, казалось что растут не в направлении кортиевого органа (Okano et al., 2005). ES клетки, трансплантированные в cochlear modiolus животных с поврежденными нейронами спирального ганглия направляли рост волокон вдоль оставшихся нейронов и кортиев орган (Sekiya et al., 2006). Цель замещения волосковых клеток трансплантированными клетками трудна для достижения. Имеется мало информации об интеграции или функции стволовых клеток, трансплантированных в сенсорный эпителий, несмотря на то, что сообщалось о клетках, восстановленных в кортиевом органе, но д. быть преимущества в путях получения волосковых клеток из стволовых клеток, которые бы приводили к прогрессу за счет их доступности (Jeon et al., 2007, Minoda et al., 2004, Tateya et al., 2003). Possible approaches to future regeneration of neurons and hair cells Как можно возобновить рост нейронов к своим мишеням в улитке и стволе мозга? Один ключ к возобновлению роста может лежать в преодолении ингибирования, наложенного факторами во внеклеточном пространстве улитки. При регенерации нейронов в глазу, обонятельной системе и спинном мозге ингибиторы роста аксонов, как было установлено, предупреждают регенерацию нейронов путем испускания отростков к своим мишеням (Fraher, 2000, Pasterkamp and Verhaagen, 2006, Shirvan et al., 2002). Блокирование ингибирующих молекул частично оказалось успешным для достижения повторного роста этих аксонов. Напр., ингибитор semaphorin 3a, репульсивный эффект которого преодолевается, увеличивает аксональный рост в поврежденном спинном мозге (Kaneko et al., 2006), a антитела к semaphorin 3a усиливают регенерацию зрительного нерва (Shirvan et al., 2002) , а siRNAs, которые блокируют передачу сигналов semaphorin 3a, предупреждают коллапс ростовых конусов аксонов (Hengst et al., 2006). Антитела к Nogo или доминантно-негативная форма рецептора Nogo также оказывают эффект на регенерацию нейронов спинного мозга (Liebscher et al., 2005) и нейроны зрительной системы (Fischer et al., 2004). Антитела к RGMa ведут к регенерации кортикоспинальных нейронов в поврежденном спинном мозге (Hata et al., 2006). Многие факторы, которые блокируют возобновление роста, обладают функцией наведения во время развития, что предупреждает от выбора неправильного пути эмбриональных аксонов. В обонятельной системе semaphorin 3a выполняет эту же функцию, его экспрессия в глиальных рубцах предупреждает регенерацию аксонов (Pasterkamp et al. , 1998, Pasterkamp and Verhaagen, 2006, Schwarting et al., 2004). Определение, каке молекулы наведения экспрессируются во взрослом внутреннем ухе мышей может позволить протестировать эффект на аксональную регенерацию в случае преодоления подобного ингибирования. Благодаря тому, что эндогенные стволовые клетки улитки и вестибулярной системы могут дифференцироваться в сенсорные нейроны и эти нейроны могут создавать новые соединения с волосковыми клетками, возможно предположить, что эти эндогенные стволовые клетки могут использоваться in vivo для замещения нейронов спирального ганглия. Формируемые синапсы можно охарактеризовать по записи активности волосковых клеток и синапсов вновь сформированных нейронов. Если клетки могут быть индуцированы к дифференцировке в сенсорные нейроны, как это происходит in vitro, то они могут репарировать поврежденные ткани. Можно будет манипулировать этими клетками так, чтобы они стали чувствительными к сигналам от дегенерирующих клеток и вступали в клеточный цикл. Активация эндогенных стволовых клеток может оказаться наиболее многообещающим путем к замещению волосковых клеток. Недавно было показано, что молчание гена или избыточная экспрессия могут приводить к формированию волосковых клеток in vivo. Манипуляции с путями развития, которые ведут к образованию избыточных волосковых клеток у мышей (Chen and Segil, 1999; Izumikawa et al., 2005; Sage et al., 2005) указывают на способы дифференцировки волосковых клеток, которые могут быть изучены, используя стволовые клетки внутреннего уха. Генетические манипуляции и лекарственная терапия являются двумя возможными путями активации избранных клеток, ведущими к регенерации волосковых клеток. Клеточные трансплантации, обещают много больше, но существует критическая проблема, которую необходимо решить: выбор клеточных типов, времени инфузии относительно времени повреждения и стадии дифференцировки трансплантируемых клеток. Стадия, на которой предшественники волосковых клеток трансплантируются, будет оказывать существенный эффект на их способность взаимодействовать с собственно клетками в сенсорном эпителии, так, чтобы они могли регенерировать правильные межклеточные контакты. Для возобновления роста нейронов помещение клеток, чтобы устранить рубцы и позволить нейронам расти к периферическим и центральным мишеням, может стать проблемой, особенно для клеток. которые помещаются на периферию и д. расти центрально через Schwann-glial границу (Fraher, 2000, Pasterkamp et al. , 1998). Результаты регенерации нейронов подтверждают. что нейроны могут быть способны возобновлять соединения с волосковыми клетками и следовательно, возможно восстановить функцию, если регенерация нейронов комбинируется с терапией по замещению волосковых клеток.

Эндогенные стволовые клетки наделяют регенеративной способностью взрослые ткани путем их способности постоянно само-обновляться и дифференцироваться и эти свойства позволяют им замещать потерянные клетки путем обчного оборота или после потери ткани. В ряде исследований было продемонстрировано появление стволовых клеток в ЦНС (Doetsch et al., 1999, Gage, 2000, Kondo and Raff, 2000, Lie et al., 2004, Pevny and Rao, 2003, Rietze et al., 2001, Temple, 2001), и хотя имеется небольшой постояный оборот, стволовые клетки могут быть рекрутированы для замещения потерянных нейронов (Bauer et al. , 2003, Kempermann et al. , 2004, Ohori et al. , 2006). Нейральные стволовые клетки присутствуют в субвентрикулярной зоне латеральных желудочков и в dentate gyrus (Taupin and Gage, 2002, Watts et al. , 2005) и как было показано, также в периферической нервной системе (Dromard et al., 2007, Hjerling-Leffler et al., 2005). Предшественники периферических нейронров возникают из нейрального гребня (Crane and Trainor, 2006, Greenwood et al. , 1999, Tomita et al. , 2005) , а производные нервного гребня, которые дают автономные и сенсорные нейроны, персистируют во взрослой ткани. Существование стволовых клеток в периферической и ЦНС демонстрируется исследованиями in vivo с использованием генетических трассеров для выявления источника дифференцированных клеток и с помощью критериев in vitro, таких как экспрессия маркеров стволовых клеток и способности их формировать нейросферы (Reynolds and Weiss, 1992). Однако, способность к регенерации с помощью стволовых клеток в нервной системе ограничена и следовательно, редко обнаруживается после повреждений в ЦНС. Даже в местах, где стволовые клетки подвергаются клеточным делениям in vitro, регенерация умеренная (Kempermann et al. , 2004, Taupin and Gage, 2002).

В разделе эндогенных стволовых клеток мы ограничим обсуждение генерацией клеток из предшественников и не затронем регенерации с помощью делений предсуществующих волосковых клеток (Sage et al. , 2005) или с помощью дифференцировки др. зрелых, определенных клеток улитки в волосковые клетки (Izumikawa et al., 2005, White et al., 2006). Возможно, что эти два способа регенерации волосковых клеток - из предшественников стволовых клетоек и из др. типов клеток - могут оказаться очень сходными процессами, когда станет больше известно об характеристиках клеток предшественников. Во втором разделе по трансплантации клеток мы рассмотрим недавние доказательства замещения клеток в улитке. Репарация поврежденных периферических нервов также может сопровождаться регенерацией моторных и сенсорных отростков (Brushart, 1993, Mi et al. , 2007). Взаимодействия с растущими аксонами показали влияние на возобновление роста этих отростков и образование новых синапсов (Fraher, 2000, Harel and Strittmatter, 2006, Hata et al., 2006, Pasterkamp and Verhaagen, 2006).

Formation of inner ear cells from endogenous stem cells

Образование сфер из индивидуальных клеток, диссоциированных из utricular эпителия используется для демонстрации, что стволовые клетки присутствуют во внутреннем ухе (Li et al. , 2003a). Сферы были клональными (Li et al., 2003a) и дифференцировались в клеточные типы, соответствующие всем трем зародышевым слоям, энтодерме, мезодерме и эктодерме (Li et al. , 2003a), указывая тем самым, что стволовые клетки были плюрипотентны (Fig. 1). Мы генерировали сферы из сенсорного эпителия улиток и спиральных ганглиев мышей (Oshima et al., 2007). Стволовые клетки в сферах пролиферировали, как и требовалось для самообновления и они обладали способностью дифференцироваться в нейроны и волосковые клетки (Martinez-Monedero et al., 2007, Oshima et al., 2007). Демонстрация, что клетки предшественники внутреннего уха могут дифференцироваться в волосковые клетки и нейроны in vitro открывает возможность, что они могут быть индуцированы к дифференцировке in vivo как быза для будущей терапии по замещению клеток во внутреннем ухе. Способность формировать сферы как кохлеарного, так и вестибулярного органов уменьшается после раннего постнатального периода (Oshima et al., 2007), это согласуется с идеей,что они теряю свою способность пролиферировать. В вестибулярном органе клетки, которые сохраняют свою способность делиться и дифференцироваться в более специализированные клетки сохраняется дольше, чем в улитке.

Постнатальная потеря стволовых клеток наблюдалась и во взрослых глазах со сходной временной рамкой, что и во внутреннем ухе. Ретинальные стволовые клетки, которые дают клетки ретинальных ганглиев обнаруживаются постнатально, но уменьшаются в числе во время постнатальной жизни у грызунов (Reh and Fischer, 2006). Напротив, др. демонстрируют присутствие клеток нейральных предшественников в слуховом нерве взрослых людей, с экспрессией nestin-позитивных нейральных предшественников, которые делятся и экспрессируют маркеры, обнаруживаемые в сенсорных нейронах внутреннего уха, подобные TrkB и TrkC (Rask-Andersen et al., 2005). Возможно, что некоторые стволовые клетки теряются по мере созревания животных, во всяком случае они пролиферируют менее быстро у взрослых.

Несмотря на плюрипотентную дифференцировку потенциала этих клеток, однако, восстановление не происходит в какой-либо достоверной степени после повреждения волосковых клеток или нейронов в улитке млекопитающих. Это

Fig. 1. Fig. 1. Neurons differentiated from inner ear stem cells. (A) Stem cells isolated by sphere formation from the vestibular organs of a mouse. Clonal spheres are observed after 7-14 days in nonadherent culture. (B) Spheres derived from the inner ear differentiate into nestin and -III tubulin-positive neurons upon culture as attached progenitor cells in a dish. (C)Schematic of an inner ear sphere in culture with an organ of Corti showing growth of neural processes to contact hair cells. (D) Spiral ganglion neurons (stained for -III tubulin) placed in culture with an explant of the organ of Corti that had been denervated with -bungarotoxin (green hair cells from a Math1-nGFP mouse). The neurons isolated from a newborn mouse grow processes that appear to be attracted by and form contacts with hair cells.

контрастирует во взрослыми вестибулярными органами, где некоторые клетки обладают способностью делиться и дифференцироваться в волосковые клетки (Forge et al., 1993, Warchol et al. , 1993). Регенерация улитковых нейронов не обнаруживается после денервации (Carnicero et al., 2002, Sekiya et al. , 2003) и повреждения нейронов, что ведет к перманентной глухоте. Даже если клеточные тела и центральные аксоны выживают, потеря слуха всё ещё остается результатом дегенерации периферических отростков (Nadol, 1997). Первичная дегенерация нейронов улитки была описана при разных патологиях (Starr et al. , 1996, Varga et al. , 2003) и она может появиться в результате повреждения улитки, таких как воздействие давления уровней звуков, которые не вызывают потери волосковых клеток (Kujawa and Liberman, 2006). Вторичная дегенерация обычно следует за дегенерацией сенсорного эпителия, а гибель нейрональных клеток возникает из=за отсутствия трофической поддержки (Fritzsch et al., 1997). Исследования нарушений функции у мышей показали, что жизнеспособность нейронов спирального ганглия зависит от количества генов, таких как neurotrophins (Ernfors et al. , 1995, Hossain et al. , 2002),компоненты пути erbB (Stankovic et al., 2004) и cAMP-зависимой протеин киназы (Bok et al., 2003). Защита слуховых нейронов с помощью разнообразных вмешательств продемонстрирована, а нейротрофины, как было показано, усиливают жизнеспособность нейронов во внутреннем ухе (Miller et al. , 1997, Wise et al. ,2005).

Хотя нейроны не регенерируют, когда они теряются, нейроны спирального ганглия, как было установлено, обнаруживают возобновление выроста волокон в различной степени после повреждения у разных моделей животных. Некоторые исследования подтвердили, что окончания повторно соединяются с волосковыми клетками (Puel et al., 1997, Sekiya et al., 2003) и что эти новые соединения функциональны (Puel et al., 1997). Экспериментальные разрезы слухового нерва у мышей приводили к экстенсивному повторному росту волокон в улитку (Sugawara et al., 2005). Однако, у людей степень возобновления роста не является клинически достоверной (Nadol, 1997). Возобновление роста этих отростков может быть усилено с помощью NT-3 и BDNF, которые, как известно, усиливают периферические соединения у морских свинок, даже если применяются спустя 33 дня после воздействия kanamycin бдля повреждения нейронов и волосковых клеток (Wise et al., 2005).

Существование эндогенных стволовых клеток в улитке млекопитающих открывает дверь для новых подходов для репарации повреждений в улитках за счет клеточной пролиферации и дифференцировки. Мощный новый подход д. быть предусмотрен, если плюрипотентность этих клеток предшественников может быть использована. Стволовые клетки или клетки со свойствами, подобными стволовым клеткам, могут быть направлены в сторону дифференцировки волосковых клеток или нейронального фенотипа, чтобы замещать дегенерировавшие нейроны и волосковые клетки и восстанавливать функцию внутреннего уха.

Характеристика стволовых клеток внутреннего уха показывает, что пролиферирующие клетки, которые позитивны в отношении окраски BrdU, экспрессируют маркеры нейральных стволовых клеток, Musashi и nestin и маркеры эмбриональных стволовых клеток (Ivanova et al., 2006), Sox2, Tbx3 и Tcl1 (Martinez-Monedero et al., 2007). Эти клетки могут быть получены из улитки и вестибулярных органов и давать волосковые клетки, базируясь на маркерах и электрофизиологии, которая демонстрирует взаимоотношения электрический ток - напряжение, характерное для E16 волосковых клеток из utriculal (Oshima et al., 2007). Присутствие клдеток внутреннего уха, которые м. давать волосковые клетки было продемонстрировано на улитках новорожденных мышах и крысах (Doetzlhofer et al., 2004, Malgrange et al., 2002, White et al., 2006, Yerukhimovich et al., 2007, Zhai et al., 2005), а поддерживающие клетки могут действовать как предшественники волосковых клеток in vitro во время их раннего постнатального периода (Doetzlhofer et al. , 2004, Malgrange et al., 2002, White et al., 2006). Волосковые клетки внутреннего уха, продуцируемые линией клеток из улитки обнаруживают реакцию на механические вибрации (Liu et al. , 2006).

Эти предшественники обладают сопособностью давать широкий круг нейрональных типов. Т.о., стволовые клетки могут превращаться в dopamine нейроны, cholinergic нейроны и seritonergic нейроны (Martinez-Monedero et al. , 2007). Однако, огромное количество происходящих из стволовых клеток внутреннего уха нейронов было glutamatergic и обладало рецепторами glutamate. Эти нейроны экспрессируют маркеры сенсорных нейронов, как незрелых (Brn3a , Ngn1 и NeuroD ), так и зрелых ( TrkB, TrkC и peripherin ) и маркеры развивающихся слуховых нейронов, подобно GATA3. Они также экспрессируют гены, ассоциированные с эмбриональным внутренним ухом, такие как Pax2 и islet1 . Дифференцировка этих клеток в функциональные нейроны подтверждена электрофизиологической активностью (Martinez-Monedero et al., 2007).

Иммортализованные линии клеток улитки также, как было установлено, дифференцируются в клетки со многими характеристиками слуховых нейронов (Nicholl et al., 2005). Эти клетки могут воспроизводить ранние ступени формирования спирального ганглия и могут размножаться неопределенно долго, делая их потенциально пригодными для экспериментов с трансплантациями во внутреннем ухе.

Нейроны, происходящие путем дифференцировки стволовых клеток внутреннего уха, выпускают отростки, которые контактируют с волосковыми клетками в эксплантах кортиева органа, который был денервирован с помощью β-bungarotoxin (Martinez-Monedero et al., 2007). Это сходно с тем, что наблюдалось ранее в этой in vitro модельной системе с использованием нейронов спирального ганглия новорожденных (Martinez-Monedero et al. , 2006) (Fig. 1). Нейроны, что не было показано ранее, регенерируют синапсы с волосковыми клетками, но мы установили, что нейроны спирального ганглия новорожденных мышей контактируют с волосковыми клетками и экспрессируют synapsin и SV2 в месте контакта. Образование новых афферентных соединений является ключевой ступенью в регенерации сенсорного органа и эти новые контакты подтверждают, что первичные афферентные нейроны могут реформировать эти соединения. Новые нейроны появляются, обладая некоторыми свойствами пресинаптических нейронов во время синаптогенеза: экспрессия синаптических маркеров локализуется на нейрональной стороне действительного контакта с волосковой клеткой (Martinez-Monedero et al., 2006). Отростки нейронов спирального ганглия, которые распространяются к волосковым клеткам во время развития, окрашиваются на synapsin и synaptophysin (Scarfone et al., 1991) и возможно, что характеристика этих периферических отростков как дендритов приобретается только после образования ими соединений с волосковыми клетками. Выросты нейритов. как было показано, появляются до приобретения характеристик аксонов и дендритов. Одиночный отросток может затем приобретать аксональные характеристики и экспрессировать аксональные маркеры (Jiang et al. , 2005, Schwamborn and Puschel, 2004). после установления первого контакта передача сигналов от волосковых клеток может предоставлять ключ для дальнейшего развития нейрона. Влияние синаптического контакта на дальнейшую дифференцировку нейрона, также как и электрофизиология синапсов, формируемых этими новыми отростками ещё предстоит исследовать.

Образование соединений требует, чтобы нейроны были способны находить свои мишени. Способность нахождения пути нейронами может зависеть от распознавания сигналов наведения растущими аксонами так, что нервный отросток может отвечать на сигналы от волосковых клеток или эти сигналы д. быть из глиальных или др. не-нейрональных клеток, которые предупреждают рост к неправильным мишеням путем экспрессии отталкивающих сигналов (Dickson, 2002). Так, наблюдаемый целенаправленный рост в этой системе указывает на важность молекул наведения, которые могут быть определены по эффекту избыточной или недостаточной функции гена кандидата.

Замещение нейронов может становиться всё важнее, если попытки регенерации волосковых клеток окажутся успешными. Отростки нейронов спирального ганглия образуют новые соединения с волосковыми клетками, которые генерируются из поддерживающих клеток после избыточной экспрессии Math1 используя аденовирус (Kawamoto et al., 2003), подтверждают, что нейральные отростки могут привлекаться новыми клетками. Возбуждения волосковых клеток, которые возникают в клеточной линии, полученной из отоцистов, in vitro вызывают реакцию совместно культивируемых нейронов, указывая на функциональную связь возобновления роста с соединением с волосковыми клетками (Liu et al., 2006).

Regeneration of auditory neurons and hair cells from exogenous stem cells

При попытке получения как слуховых нейронов, так и волосковых клеток из ES клеток мышей, получали волосковые клетки при добавлении EGF, bFGF и IGF-1 (Li et al. , 2003b). Эти клетки экспрессировали маркеры развивающихся и зрелых волосковых клеток, Math1, Brn3c и myosin VIIa и имели пучки стереоцилий, которые метились по espin и F-actin. Сенсорные нейроны или нейроны с характеристиками слуховых нейронов также продуцировались ES клетками (Coleman et al. , 2007, Corrales et al. , 2006). ES клетки человека могут быть превращены в предшественники, которые обладают теми же самыми маркерами, что и эмбриональные предшественники сенсорных нейронов в нервном гребне и сенсорных плакодах, и эти клетки могут быть дифференцированы в нейроны со многими характерными маркерами сенсорных нейронов (Shi et al., 2007).

Волосковые клетки могут также генерироваться путем воздействия ростовыми факторами на мезенхимные стволовые клетки из костного мозга, которые ко-культивируются с отоцистом кур (Jeon et al., 2007). Экспрессия Math1 в клетках предшественниках, получаемых из мезенхимных стволовых, приводит к их превращению в волосковые клетки (Jeon et al. , 2007). Недавно использовались и др. взрослые стволовые клетки в качестве источника волосковых клеток, Экспрессия маркеров волосковых клеток описана после совместного культивирования обонятельных предшественников с supernatants от культур улиток (Doyle et al., 2007).

Стволовые клетки костного мозга были использованы для генерации нейронов со многими характеристиками слуховых афферентных нейронов (Kondo et al., 2005). Нейроны экспрессировали транскрипционные факторы сенсорных нейронов, GATA3 и Sox10, а также AMPA рецепторы после воздействия ретиноевой кислотой и sonic hedgehog. Маркер сенсорных нейронов, Brn3a, обнаруживался только после того, как нейроны были культивированы в среде, кондиционированной E10 hindbrain/somite/otocyst, и эти нейроны испускали отростки в направлении волосковых клеток.

Экзогенные стволовые клетки были использованы для замещения дегенерировавшего слухового нерва. Было установлено, что клетки предшественники, происходящие из экзогенных стволовых клеток оказались эффективными для замещения нейронов спирального ганглия в животной модели первичной нейрональной дегенерации (Fig. 2) и что эти нейроны направляют свои отростки в кортиев орган, где они, по-видимому, контактируют с волосковыми клетками (Corrales et al., 2006). Клеточные тела трансплантированных нейронов оказывались внутри тракта, обычно занимаемого аксонами спирального ганглия и распространяли свои отростки к центру и периферии. Периферические волокна росли в апикальном направлении в нервном стволе и в пучках фасцикул нейритов, которые покидали ось улитки в радиальном направлении к каналу Rosenthal's и посредством костной спиральной ламины кортиева органа. Волокна, т.о., росли периферически от эктопического местоположения (нервного ствола улитки) к месту оригинальных клеточных тел и от туда к волосковым клеткам, а центральные волокна росли в ствол головного мозга (Shi et al., 2007). Могут ли эти нейроны восстанавливать функцию, не установлено. Нейриты от клеток ганглиев дорсальных корешков, трансплантированные в крыс не росли в направлении сенсорных клеток (Hu et al., 2005a) и нет доказательств

Fig. 2. Transplantation of neural progenitors derived from ES cells into the cochlea. When stem cell derived neural progenitors are injected into an ear that has had its auditory nerve removed by a toxin, the cells form a graft at the base of the cochlea and differentiate into neurons. The engrafted cells can be identified by endogenous EYFP and processes extending from these cells can be followed both apically within the modiolus of the cochlea and radially to the organ of Corti. They can be labeled for neuronal markers by immunofluorescence. The black circles indicate the location of Rosenthal's canal where the cell bodies of the afferent neurons are located in the normal animal.

в пользу роста нейритов в направлении волосковых клеток от нейральных стволовых клеток, трансплантированных во внутреннее ухо морских свинок (Hu et al., 2005b). Однако, нейроны хозяина не были удалены, а клетки, помещенные в scala tympani, делают трудной оценку регенерируют ли центральные или периферические отростки спирального ганглия. Нейральные стволовые клетки были использованы для трансплантаций в улитку мышей, которые были обработаны cisplatin, чтобы удалить эндогенные нейроны и клетки присутствовали в улитке две недели после трансплантации (Tamura et al., 2004). Происходящие из ES клеток нейральные предшественники образуют контакты как с вестибулярными волосковыми клетками (Kim et al., 2005) , так и трансплантации ES клеток в улитку морских свинок вызывали рост отростков, хотя отростки, казалось что растут не в направлении кортиевого органа (Okano et al., 2005). ES клетки, трансплантированные в cochlear modiolus животных с поврежденными нейронами спирального ганглия направляли рост волокон вдоль оставшихся нейронов и кортиев орган (Sekiya et al., 2006).

Цель замещения волосковых клеток трансплантированными клетками трудна для достижения. Имеется мало информации об интеграции или функции стволовых клеток, трансплантированных в сенсорный эпителий, несмотря на то, что сообщалось о клетках, восстановленных в кортиевом органе, но д. быть преимущества в путях получения волосковых клеток из стволовых клеток, которые бы приводили к прогрессу за счет их доступности (Jeon et al., 2007, Minoda et al., 2004, Tateya et al., 2003).

Possible approaches to future regeneration of neurons and hair cells

Как можно возобновить рост нейронов к своим мишеням в улитке и стволе мозга? Один ключ к возобновлению роста может лежать в преодолении ингибирования, наложенного факторами во внеклеточном пространстве улитки. При регенерации нейронов в глазу, обонятельной системе и спинном мозге ингибиторы роста аксонов, как было установлено, предупреждают регенерацию нейронов путем испускания отростков к своим мишеням (Fraher, 2000, Pasterkamp and Verhaagen, 2006, Shirvan et al., 2002). Блокирование ингибирующих молекул частично оказалось успешным для достижения повторного роста этих аксонов. Напр., ингибитор semaphorin 3a, репульсивный эффект которого преодолевается, увеличивает аксональный рост в поврежденном спинном мозге (Kaneko et al., 2006), a антитела к semaphorin 3a усиливают регенерацию зрительного нерва (Shirvan et al., 2002) , а siRNAs, которые блокируют передачу сигналов semaphorin 3a, предупреждают коллапс ростовых конусов аксонов (Hengst et al., 2006). Антитела к Nogo или доминантно-негативная форма рецептора Nogo также оказывают эффект на регенерацию нейронов спинного мозга (Liebscher et al., 2005) и нейроны зрительной системы (Fischer et al., 2004). Антитела к RGMa ведут к регенерации кортикоспинальных нейронов в поврежденном спинном мозге (Hata et al., 2006). Многие факторы, которые блокируют возобновление роста, обладают функцией наведения во время развития, что предупреждает от выбора неправильного пути эмбриональных аксонов. В обонятельной системе semaphorin 3a выполняет эту же функцию, его экспрессия в глиальных рубцах предупреждает регенерацию аксонов (Pasterkamp et al. , 1998, Pasterkamp and Verhaagen, 2006, Schwarting et al., 2004). Определение, каке молекулы наведения экспрессируются во взрослом внутреннем ухе мышей может позволить протестировать эффект на аксональную регенерацию в случае преодоления подобного ингибирования.

Благодаря тому, что эндогенные стволовые клетки улитки и вестибулярной системы могут дифференцироваться в сенсорные нейроны и эти нейроны могут создавать новые соединения с волосковыми клетками, возможно предположить, что эти эндогенные стволовые клетки могут использоваться in vivo для замещения нейронов спирального ганглия. Формируемые синапсы можно охарактеризовать по записи активности волосковых клеток и синапсов вновь сформированных нейронов. Если клетки могут быть индуцированы к дифференцировке в сенсорные нейроны, как это происходит in vitro, то они могут репарировать поврежденные ткани. Можно будет манипулировать этими клетками так, чтобы они стали чувствительными к сигналам от дегенерирующих клеток и вступали в клеточный цикл.

Активация эндогенных стволовых клеток может оказаться наиболее многообещающим путем к замещению волосковых клеток. Недавно было показано, что молчание гена или избыточная экспрессия могут приводить к формированию волосковых клеток in vivo. Манипуляции с путями развития, которые ведут к образованию избыточных волосковых клеток у мышей (Chen and Segil, 1999; Izumikawa et al., 2005; Sage et al., 2005) указывают на способы дифференцировки волосковых клеток, которые могут быть изучены, используя стволовые клетки внутреннего уха. Генетические манипуляции и лекарственная терапия являются двумя возможными путями активации избранных клеток, ведущими к регенерации волосковых клеток.

Клеточные трансплантации, обещают много больше, но существует критическая проблема, которую необходимо решить: выбор клеточных типов, времени инфузии относительно времени повреждения и стадии дифференцировки трансплантируемых клеток. Стадия, на которой предшественники волосковых клеток трансплантируются, будет оказывать существенный эффект на их способность взаимодействовать с собственно клетками в сенсорном эпителии, так, чтобы они могли регенерировать правильные межклеточные контакты. Для возобновления роста нейронов помещение клеток, чтобы устранить рубцы и позволить нейронам расти к периферическим и центральным мишеням, может стать проблемой, особенно для клеток. которые помещаются на периферию и д. расти центрально через Schwann-glial границу (Fraher, 2000, Pasterkamp et al. , 1998). Результаты регенерации нейронов подтверждают. что нейроны могут быть способны возобновлять соединения с волосковыми клетками и следовательно, возможно восстановить функцию, если регенерация нейронов комбинируется с терапией по замещению волосковых клеток.

Stem cells for the replacement of inner ear neurons and hair cells RODRIGO MARTINEZ-MONEDERO and ALBERT S.B. EDGE Int. J. Dev. Biol. 51: 655-661 (2007) doi: 10.1387/ijdb.072372rm

Stem cells for the replacement of inner ear neurons and hair cells
RODRIGO MARTINEZ-MONEDERO and ALBERT S.B. EDGE
Int. J. Dev. Biol. 51: 655-661 (2007) doi: 10.1387/ijdb.072372rm