Посещений:
Внутреннее Ухо

Нейрональная Дифференцировка

A network of growth and transcription factors controls neuronal differentation and survival in the developing ear
АHORTENSIA SANCHEZ-CALDERON, MARTA MILO, YOLANDA LEON and ISABEL VARELA-NIETO
Int. J. Dev. Biol. 51: 557-570 (2007) doi: 10.1387/ijdb.072373hs

Inner ear neurons develop from the otic placode and connect hair cells with central neurons in auditory brain stem nuclei. Otic neurogenesis is a developmental process which can be separated into different cellular states that are characterized by a distinct combination of molecular markers. Neurogenesis is highly regulated by a network of extrinsic and intrinsic factors, whose participation in auditory neurogenesis is discussed. Trophic factors include the fibroblast growth factor, neurotrophins and insulin-like peptide families. The expression domains of transcription factor families and their roles in the regulation of intracellular signaling pathways associated with neurogenesis are also discussed. Understanding and defining the key factors and gene networks in the development and function of the inner ear represents an important step towards defeating deafness.


Otic neurogenesis


Развитие внутреннего уха из отической плакоды, участка эктодермы, расположенного вблизи нервной трубки, который инвагинируется, чтобы сформировать временную структуру отический бокал. Этот бокал постепенно закрывается и отшнуровывается от эктодермы давая отический пузырек (Figure 1). Отический пузырек является автономной структурой, которая содержит информацию, необходимую для генерации большинства типов клеток и структур взрослого внутреннего уха (Bissonnette and Fekete, 1996; Bever et al., 2003; rev. Varela-Nieto et al., 2004). Внутреннее ухо млекопитающих состоит из 6 самостоятельных сенсорных органов: трех гребешков (cristae) из полукружных каналов, двух maculae из saccule и utricle и кортиева органа в улитке. Гребешки и maculae являются вестибулярными органами, тогда как кортиев орган является органом слуха (rev. Moller, 2006). Кохлеарный ганглий внутреннего уха формируется биполярными нейронами, которые связывают периферические сенсорные рецепторы или волосковые клетки с центральными нейронами слуховых ядер ствола мозга. Корректный органогенез внутреннего уха связан с динамическим балансом клеточной пролиферации, дифференцировки, жизнеспособности и гибели, процессов четко регулируемых с помощью сети внешних и внутренних факторов (Frago et al., 2000; Varela-Nieto et al., 2003 and 2004; Leon et al., 2004).
Процесс отического нейрогенеза может быть подразделен на отдельные клеточные состояния, каждое из которых характеризуется самостоятельной комбинацией молекулярных маркеров (summarized in Figure 1A). Первым видимым результатом отического нейрогенеза является вычленение нервных клеток (отических нейробластов) из отического бокала (Fig. 1B). Эти нейробласты предетерминированы, чтобы генерировать отические нейроны и они занимают cochleo-vestibular ganglion (CVG). этот ганглий генерируется из области эпителия отического пузырька, названной проспективным neural-sensorial доменом, и которые предопределяется с помощью домена, в котором ко-экспрессируются Ngn1 и Delta1 на ранних стадиях (Adam et al., 1998; Abu-Elmagd et al., 2001). Считается, что как нейроны, так и сенсорные клетки происходят из общих мультипотентных клеток предшественников (MPe, in Figure 1A) (Brigande et al., 2000; Lang and Fekete, 2001). В самом деле, отмечается потеря ганглиолярных нейронов и уменьшение количества волосковых клеток у мышей Ngn1 null-мутантов (Ma et al., 2000). Интересно, что Notch и его лиганды Delta1, Serrate1 и Serrrate2 (Ser у кур, Jag у мышей) экспрессируются в отической плакоде (Adam et al., 1998; Eddison et al., 2000; Cole et al., 2000). В то время как Ser1 экспрессируетсяна переднем и заднем полюсах отического бокала, Ser2 перекрывается с нейральным сенсорным доменом, определяемым с помощью Delta1 (Lang and Fekete, 2001). Путь Delta-Notch также существенен на более поздних ступенях, когда принимается решение о судьбах клеток стать волосковыми или поддерживающими клетками (Lanford et al., 1999; Lang and Fekete,

Fig. 1. Early inner ear neurogenesis. (A) Scheme representing the different steps and factors implicated in otic neuron development. (B) Early inner ear neurogenesis. The inner ear arises from the otic placode, which invaginates to form the otic cup (oc) and then the otic vesicle (ov), from which the adult inner ear ultimately derives (C,D). (A-D) Fgf19 transcripts were detected in delaminating neuroblasts by in situ hybridization, while 3A10 inmunoreactivity identifies otic axons (Modified from Sanchez-Calderon et al., 2007). Islet-1 and G4 expression in ganglion neuroblasts (E,F) and Islet-I and IGF1R expression in the otic vesicle (G). Abbreviations: CVG, cochlear-vestibular ganglion; HC, hair cell; INP, immature neural precursor; MPe, multipotent progenitor; NBe epithelial neuroblast; NBg, ganglionar neuroblast; NP, neuronal precursor; OC, otic cup; OCE: otic cell epithelial; ON, otic neuron; OV, otic vesicle; SC, stem cell; ZN, neurogenic zone. Orientation: A, anterior; D, dorsal; M, medial. Scale bars: A, 50µm; B-D, 100µm.

2001; Brooker et al., 2006).
Др. набор пронейральных генов, NeuroD и NeuroM, экспрессируется а эпителии отического бокала и отделяющихся нейробластах (Liu et al., 2000; Abu-Elmagd et al., 2001), указывая тем самым что они действуют после выбора и спецификации нейральных предшественников. У мышей, нулевых по NeuroD обнаруживается дефицит отделяющихся нейробластов, но это не вызывает изменений в генерации нейрональных предшественников (Liu et al., 2000; Kim et al., 2001; rev. Chae et al., 2004). Следовательно, экспрессия NeuroD предопределяет второе клеточное состояние в нейральном клоне после спецификации нейральной судьбы, эпителиальных нейробластов (NBe, Figure 1A).
Вычленение отических нейральных предшественников активно исследовали у эмбрионов кур (D'Amico-Martel and Noden, 1983; Alvarez et al., 1989; Hemond and Morest, 1991). Это выделение начинается на ст. отического бокала, а пик их миграции приходится на период закрытия отического бокала, когда формируется ранний отический пузырек. Вычленяющиеся клетки являются популяцией детерминированных к нейральной судьбе клеток, способных пролиферировать, которые и составляют переходную умножающуюся клеточную популяцию (Adam et al., 1998; Begbie et al., 2002). Мы можем идентифицировать третье состояние как ганглиолярные нейробласты (NBg, Figure 1A).
Семейство LIM-гомеодоменовых генов для транскрипционных факторов является критическим для спецификации качественных особенностей нейронов, происходящих из нервной трубки (Hobert and Westphal, 2000). Islet-1 является членом этого семейства, который экспрессируется в немногих клетках внутри эпителия, но он интенсивно экспрессируется в клетках, локализованных в местах вычленения и в тех, которые уже выделились (Figure 1B, and Adam et al., 1998; Camarero et al., 2003; Li et al., 2004b). В дополнение к NeuroD и Islet-1, мышиные эпителиальные нейробласты экспрессируют также alpha6 интегриновую субъединицу, которая. что интересно, не экспрессируется в выделившихся нейробластах (Davies, 2007). Ганглиолярные нейробласты создают популяцию, характеризующуюся экспрессией NeuroD, Islet-1, нейрон-специфического βIII-tubulin, Tuj1 (Memberg and Hall, 1995; Camarero et al., 2003) и маркеров пролиферации, таких как proliferating cell nuclear antigen (PCNA) и phospho-histone 3 (Camarero et al., 2003). Хотя существуют и др. фундаментальные элементы, участвующие в этом, ганглиолярные нейробласты зависят от insulin-like growth factor I (IGF-I) в отношении жизнеспособности, экспансии и дифференцировки (Camarero et al., 2003). Транскрипционный фактор мышей Eya1 модулирует экспрессию транскрипционных факторов Tbx1 и пронейральных генов Ngn 1 и NeuroD, также как и генов нейротрофинов, brain derived neurotrophic growth factor (BDNF) and neurotrophin 3 (NT-3) (Friedman et al., 2005). Т.к. Tbx1 экспрессируется в эпителии отоциста, но исключен из проспективного эндолимфатического протока и пронейральных регионов, то было постулировано, что этот ген д. ингибировать нейральную судьбу путем супрессии Ngn1 и экспрессии Delta1 (Raft et al., 2004; Xu et al., 200
После последнего цикла клеточных делений нейробласты становятся постмитотическими незрелыми нейронами, которые затем дифференцируются и испускают проекции в направлении своих периферических и центральных мишеней (Whitehead and Morest, 1985). Эти клетки являются immature neuronal precursors (INP, Figure 1A), четвертым клеточным состоянием, характеризующимся постмитотическим, но ещё не дифференцированным состоянием. Соответственно, эти предшественники подавляют экспрессию большинства ранних нейральных генов и начинают экспрессировать др. набор маркеров, связанных с выпячиваниями нейритов и жизнеспособностью. Эти маркеры включают fasciculin G4 (Fig. 1B; Camarero et al., 2003), ассоциированый с нейрофиламентами антиген 3A10 (Adam et al., 1998; Camarero et al., 2003) и TrkB и TrkC neurotrophin рецепторы (Brumwell et al., 2000; Kim et al., 2001, Sanchez- Calderon, unpublished observations). Финальным клеточным состоянием является состояние зрелых отических нейронов (ON, Figure 1A), которые генерируют потенциалы действия и экспрессируют синаптические рецепторы и нейротрансмиттеры (Raphael and Altschuler, 2003).
Клетки взрослого внутреннего уха сохраняют некоторую способность пролиферировать. Естественная регенерация сенсорного слухового эпителия обнаруживается у teleosts, амфибий и птиц. Напротив, нет доказательств регенерации cochlear сенсорного эпителия или cochlear ганглиолярных нейронов у млекопитающих и только вестибулярные волосковые клетки сохраняют некоторую способность к регенерации. Это отсутствие регенерации во взрослом внутреннем ухе делает заместительную клеточную терапию путем трансплантации чужеродных стволовых клеток во внутреннее ухо или за счет активации внутренних стволовых клеток, находящихся во внутреннем ухе, интересным проектом для противодействия дегенерации и потере сенсорных и нейральных клеток (Hu and Ulfendahl, 2006). Некоторые ростовые факторы, включая epidermal growth factor (EGF), IGF-I и basic fibroblast growth factor (bFGF), способствуют пролиферации эмбриональных стволовых клеток, чтобы продуцировать предшественники внутреннего уха (Li et al., 2003a and 2003b; Hu et al., 2005), в соответствии с наблюдениями, указывающими на участие этих факторов в пролиферации, дифференцировке и жизнеспособности клеток развивающегося внутреннего уха (Leon et al., 1995; Zheng et al., 1997; Hossain and Morest, 2000; Ladher et al., 2000; Varela-Nieto et al., 2004). В частности, IGF-I как было показано, способствует пролиферации и выживанию нейральных стволовых клеток в разных контекстах и индуцирует дифференцировку в комбинации с нейротрофинами (Arsenijevic and Weiss, 1998; Arsenijevic et al., 2001) (Figure 1A).
Очевидно, что волосковые клетки могут генерироваться из эмбриональных и взрослых стволовых клеток млекопитающих и что в некоторых случаях они могут интегрироваться в развивающееся сенсорное поле у эмбрионов кур (Malgrange et al., 2002; Tateya et al., 2003; Li et al., 2003a, 2003b and 2004a). Напротив, существуют лишь ограниченные доказательства присутствия нейрональных стволовых клеток в ухе млекопитающих (Rask-Andersen et al., 2005). Следовательно, альтернативой замещению нейронов, потерянных из кохлеарного ганглия является трансплантация нейральных стволовых клеток (Okano et al., 2005). Эти стволовые клетки играют важную роль в развитии эмбриональной центральной нервной системы, а их экспансия зависит от сигналов от микросреды, в которой они находятся, включая ряд ростовых факторов, таких как IGF-I и bFGF (reviewed in Merkle and Alvarez-Buylla, 2006; Doetsch, 2003). Нейральные стволовые клетки взрослых мышей дифференцируются в нейральные судьбы, но лишь немногие выживают во внутреннем ухе. Тем не менее является многообещающим то, что выжившие мигрируют в спиральный ганглий, тракт слухового нерва и орган Корти, где они дифференцируются и выпускают нейриты в слуховой системе взрослых млекопитающих (Hu et al., 2005; Hu and Ulfendahl, 2006).

Otic neurogenesis is regulated by trophic factors


The Fibroblast Growth Factor family


Семейство FGF представлено 25 членами, которые участвуют в различных клеточных функциях, включая клеточную дифференцировку, пролиферацию, подвижность, выживаемость (Wright and Mansour, 2003). Два из них FGF24 и FGF25, идентифицированы у рыбок данио (Fischer et al., 2003; Katoh and Katoh, 2005). FGF's действуют посредством специфических FGF рецепторов. продуцируемых 4 генами у млекопитающих, которые генерируют множество различных белковых изоформ посредством альтернативного сплайсинга (Wright and Mansour, 2003). FGF2, FGF3, FGF8, FGF10 и FGF19 участвуют в отическом нейрогенезе (Table 1), a FGF16 присутствует в эпителии отического пузырька в областях, не связанных с нейрогенезом, и скорее связан со спецификацией сенсорного органа (Chapman et al., 2006). Fgf2 (bFGF) экспрессируется у мышей и кур в отических плакодах и отическом пузырьке (Vendrell et al., 2000). Этот FGF усиливает миграцию и дифференцировку CVG нейронов (Hossain et al., 1996; Zheng et al., 1997; Adamska et al., 2001) и он участвует в

TABLE 1

DIFFUSIBLE FACTORS INVOLVED IN INNER EAR NEUROGENESIS






Fig. 2. IGF-I and neurogenesis: intracellular pathwaysand their implications in CVG generation, proliferation, neuronal differentiation and survival of otic neuroblasts. (A) Proposed signalling pathways involved in IGF-I-mediated neurogenesis and related process. Binding of IGF-I to the extracellular a-subunits of its high affinity receptor (IGF1R) provokes its auto-phosphorylation on tyrosine residues in the Я-subunits and the subsequent docking and phosphorylation of intracellular signalling proteins. The figure shows the two main pathways specifically activated by IGF-binding to IGF1R, the PI-3K/Akt pathway and the Raf/MAPK pathway and their general role in neurogenesis (summarized from Feldman et al., 1997; Varela-Nieto et al., 2003; Russo et al., 2005; Ye and D'Ercole, 2006). Abbreviations: IRS, insulin-receptor substrate; PI3K, phosphoinositide-3 kinase; MAPK, mitogen-activated protein kinase. (B) Endogenous IGF-I is involved in chicken CVG generation. The function of IGF-I was explored in explants of otic vesicles by assessing the formation of the CVG in medium without additives (control) or in the presence of anti-IGF-I antibodies (a-IGF-I) or the competitive receptor antagonist JB1. The scheme to the left represents the process of neuroblast delamination from the ventromedial part of the otic vesicle. The middle part illustrates representative photomicrographs of otic vesicles at the start of culture (0 h) and after 24 hours in culture with serum-free medium (Control), with a-IGF-I antibodies and with JB1. The histogram to the right, presents the size distribution of ganglia generated from otic vesicle explants cultured under different conditions. Scale bar, 150 µm. Modified from Camarero et al., 2003. (C) Exogenous IGF-I promotes chicken neuroblast differentiation and survival. Photomicrographs show the effect of IGF-I on survival (TUNEL, left) and on differentiation in cultured CVG explants (G4, right). Scale bar: C, Control, 150 µm. Modified from Camarero et al., 2003.



дифференцировке сенсорных клеток у эмбрионов кур. Однако, внутреннее ухо формируется нормально у мышей, лишенных Fgf2 и не обнаруживается аномалий у взрослых (Carnicero et al., 2004; Sliwinska-Kowalska et al., 2005). Интересно, что FGF2 способствует активности BDNF путем позитивной регуляции его TrkB рецептора высокого сродства в культивируемых слуховых нейронах мыши (Brumwell et al., 2000). Существенно, что последовательное взаимодействие между FGF2, BDNF, NT-3 и их рецепторами предопределяет критические периоды развития слуховых нейронов (Hossain et al., 2002). Более того, совместное воздействие FGF2 и glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) поддерживает жизнеспособность cochlear нейронов взрослых мышей in vitro, тогда как только FGF2 способствует генерации нейритов (Wei et al., 2006). В самом деле, или FGF2 или FGF1 индуцируют биполярное образование нейритов в культурах US/VOT-N33 (N33) клеток, которые происходят из cochlear нейробластов, давая характерные зрелые кохлеарные нейроны (Nicholl et al., 2005).
У мышей и Xenopus, Fgf3 (Int2) мРНК ограничена сенсорным эпителием отического пузырька и CVG (Wilkinson et al., 1989; Tannahill et al., 1992), но не у эмбрионов кур (Mahmood et al., 1995). CVG ганглий уменьшен у мышей, несущих нулевую мутацию по Fgf3, на фоне морфогенетических дефектов (Mansour et al., 1993). В самом деле, мышиные эмбрионы, лишенные как Fgf3, так и Fgf10 не способны формировать отические пузырьки, эти два гена явно участвуют в отической индукции (Wright and Mansour, 2003; Alvarez et al., 2003). Недавно было показано, что человеческий синдром, характеризующийся type I microtia, microdontia и выраженной врожденной глухотой, обусловлен полным отсутствием структур внутреннего уха, вызванных с помощью каких-либо трех различных гомозигоных мутаций в FGF3 (Tekin et al., 2007).
Fgf8 (AIGF) экспрессируется в отическом пузырьке кур и позднее в CVG (Colvin et al., 1999) и он участвует в отической индукции у рыбок данио, кур и мышей (Leger and Brand, 2002; Ladher et al., 2005; Hans et al., 2007). И потеря функции Fgf8 у рыбок данио и нокдаун Fgf3 с помощью антисмысловых morpholinos вызывают выраженные изменения в индукции и формировании отического пузырька (Phillips et al., 2001; Hans et al., 2007). Однако, мало известно о сенсорных нейронах или сенсорных рецепторах в этих условиях. Образование отической плакоды у кур и мышей нуждается, по крайней мере, в двух сигналах, одном от мезодермы и одном от эктодермы. У эмбрионов кур мезодермальным сигналом является FGF19, тогда как у мышей это FGF10. Более того, сигнал от энтодермы необходим для Fgf8, чтобы индуцировать отическое развитие у мышей и кур (Ladher et al., 2005). Предыдущие исследования на курах показали, что эктопическое применение FGF2 и FGF8 усиливает транскрипцию некоторых паттерн-формирующих отических генов и увеличивает CVG (Adamska et al., 2001), подтверждая тем самым роль FGF8 в генерации CVG (Hossain et al., 1996). Более того вычленение нейробластов наблюдается на границе между доменами экспрессии куриных Fgf8 и Otx2 (Hidalgo-Sanchez et al., 2000; Sanchez-Calderon et al., 2004).
Fgf10 мРНК экспрессируется в отической плакоде и отическом пузырьке кур и мышей, внутри пронейрального-сенсорного эпителия. В самом деле, Fgf10 у мышей также экспрессируется в нейронах CVG (Pirvola et al., 2000; Alsina et al., 2004; Lillevдli et al., 2006), а избыточная экспрессия Fgf10 кур увеличивает количество клеток, экспрессирующих NeuroD и NeuroM, но не Delta1 (Alsina et al., 2004). Количество отических нейронов снижается у нулевых мутантов мышей по Fgf10, а дефекты выявляются в сенсорном эпителии (Pauley et al., 2003). Базируясь на исследованиях по связыванию, FGFR-2IIIb , как полагают, находится FGF10, хотя этот фактор также соединяется с FGFR-1 (Powers et al., 2000). Fgfr-2 экспрессируется дорсально в проспективном не-сенсорном эпителии отоциста, в то время как Fgf10 и Fgf3 ко-экспрессируются с neurotrophins в вентральном домене, указывая тем самым, что FGFs и FGFRs могут действовать паракринным способом (Pirvola et al., 2000). FGFR-2IIIb нулевые мутанты неспособны формировать CVG на ранних стадиях и хотя детальный механизм остаются неизвестным, по-видимому, затронуты нейральные предшественники. Разрушение FgfR1, др. потенциального рецептора FGF10, вызывает дефекты в органе Корти, ассоциированные с пониженной пролиферацией пула предшественников, который генерирует слуховой сенсторный эпителий (Pirvola et al., 2002). Более того, передача сигналов FGF10, как предполагают, регулируется с помощью GATA3, a zinc finger транскрипционного фактора (Ohuchi et al., 2005; Lillevali et al., 2006).
Наконец, мышиный FGF15 является гомологом куриного и человеческого FGF19 (Wright et al., 2004). Мезодермальный куриный Fgf19 участвует в отической индукции (Ladher et al., 2000; Wright et al., 2004) и экспрессируется как в ганглиолярных нейробластах, вычленяющихся из отического эпителия, так и в CVG (Figure 1B). Транскрипты FGF19 остаются в CVG вплоть до ст. E8, подтверждая взаимосвязь между этим фактором и нейральной дифференцировкой (Figure 1B) (Sanchez-Calderon et al., 2007). Экспрессия Fgf19 и Fgf8 мРНК предопределяет два субдомена внутри Fgf10-позитивной proneural-sensory территории (Sanchez-Calderon et al., 2007). FGF19 человека, по-видимому, соединяется только с FGFR4 (Xie et al., 1999), который экспрессируется в нейроэктодерме кур и мышей и мезодерме кур (Wright et al., 2004). У мышей Fgf15 не экспрессируется в CVG и соотв., Fgf15 нулевые мутанты не обнаруживают четких отических аномалий (Wright et al., 2004). Т.о., передача сигналов FGF определенно играет важную роль в ранних аспектах развития и иннервации уха. Следовательно, было бы интересно исследовать FGF-кооперацию или петлеобразование и взаимодействия этих факторов с др. факторами роста во время отического нейрогенеза.

Nerve growth factor and neurotrophins


Семейство neurotrophin (NT) состоит из небольших, щелочных , секретируемых белков: nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3) и neurotrophin-4/5 (NT-4/5). Эти белки являются важными для жизнеспособности и дифференцировки нейронов (rev. Bibel and Barde, 2000; Huang and Reichardt, 2001; Pirvola and Ylikoski, 2003) и они осуществляют сыои эффекты посредством рецепторов двух типов: низкого сродства p75 neurotrophin receptor (p75NTR), модулятора клеточной жизнеспособности и клеточной гибели; и Trk тирозин киназных рецепторов, которые взаимодействуют специфически с NGF (TrkA), BDNF (TrkB) и NT3 (TrkC) (Casaccia-Bonnefil et al., 1999; Barrett, 2000; Lee et al., 2001; Chao and Bothwell, 2002). И NT-3 и BDNF, но не NGF или NT-4/5, экспрессируются в сенсорном эпителии внутреннего уха и в вычленяющихся нейробластах, указывая на ранний источник нейротрофной поддержки для новорожденных клеток CVG (Farinas et al., 2001; Friedman et al., 2005). Рецепторы высокго сродства TrkB (BDNF) и TrkC (NT3) экспрессируются в отических сенсорных нейронах и при этом нейроны улитки зависят от NT-3, а вестибулярные нейроны зависят от BDNF ошении жизнеспособности и дифференцировки у кур, мышей и человека (Table 1) (rev. Fritzsch et al., 2004). В самом деле, большинство нейронов улитки теряется во время развития внутреннего уха между E13.5 и E15.5 у NT3-/- мутантных мышей. Двойные BDNF и TrkB мутанты в основном теряют вестибулярные нейроны, а у BDNF/NT-3 или TrkB/TrkC двойных гомозиготных мутантов теряются все нейроны улитки и преддверия (Bianchi et al., 1996; Fritzsch et al., 1998 and 2004; and rev. Pirvola and Ylikoski, 2003). Специфическое связывание NGF с TrkA рецептором участвует в росте, выживаемости и дифференцировке нейронов в ЦНС (Williams et al., 2006). NGF не экспрессируется во внутреннем ухе, но TrkA локализуется в рано развивающемся CVG (Pirvola et al., 1994; Schecterson and Bothwell, 1994; Farinas et al., 2001) и в кортиевом органе взрослых мышей и крыс. Следовательно, NGF может осуществлять специфический эффект на периферическую слуховую систему (Dai et al., 2004). Развитие и жизнеспособность нейронов спирального ганглия зависит от нейротрофных факторов, таких как NT-3 и GDNF (rev. Roehm and Hansen, 2005). В стволовых клетках, полученных из спиральных ганглиев взрослых людей и морских свинок, нейральная дифференцировка и рост нейритов индуцируются с помощью BDNF, GDNF и NT-3 (Rask-Andersen et al., 2005). Нейроны, дифференцированные из предшественников у людей, ко-экспрессируют рецепторы для нейротрофных факторов, таких как TrkB и TrkC (Rask-Andersen et al., 2005), что согласуется с ко-экспрессией этих рецепторов с слуховых нейронах (Pirvola et al., 1992; Farinas et al., 2001). На этом основании было предположено, что нейротрофные факторы могут выступать в качестве кандидатов для фармакологического лечения, чтобы предупредить вторичную дегенерацию слухового нерва и способствовать возобновлению роста нейритов после потери слуха (rev. Atar and Avraham, 2005; Holley, 2005).
Все нейротрофины соединяются с p75NTR, который также взаимодействует с Trk рецепторами, чтобы модулировать специфичность связывания, сродство и функцию лиганда в определенных типах клеток (Benedetti et al., 1993; Bibel et al., 1999). Зрелые нейротрофины преимущественно соединяются с Trk рецепторами, в то время как незрелые "проформы" этих белков имеют более высокое сродство к p75NTR, который выполняет критическую роль в контроле баланса между жизнеспособностью/гибелью клеток. Sortilin действует в качестве ко-рецептора для p75NTR, он существенен для pro-neurotrophin-индуцированной клеточной гибели (Nykjaer et al., 2004). Рецептор p75NTR кодирует два белка, полной длины (FL-p75NTR) и короткую (S-p75NTR) изоформу p75 (Von Schack et al., 2001). В самом деле, NGF индуцирует апоптическую гибель клеток в органотипических культурах отических пузырьков и в CVG благодаря связыванию p75NTRу кур (Table 1) (Frago et al., 1998; Sanz et al., 1999a). Более того, NGF-индуцированная клеточная гибель происходит только в специфических областях отического пузырька и CVG. присутствие p75NTR описано и на др. стадиях развития внутреннего уха у разных видов животных, а экспрессия p75NTR ассоциирует с ранней спецификацией вестибулярных сенсорных участков у эмбрионов кур (von Bartheld et al., 1991; Schecterson and Bothwell, 1994; Wu and Oh, 1996; Frago et al., 2003 and 2006). Точные сигнальные пути, используемые p75NTR , чтобы активировать клеточную гибель, неизвестны. Они могут использовать генерацию ceramide (Frago et al., 1998 and 2006; Hirata et al., 2001) и активацию Jun-N-terminal kinase (Sanz et al., 1999a; Harrington et al., 2002), каскад каспаз (Gu et al., 1999; Troy et al., 2002; Frago et al., 2003) и циклин=завитсимые киназы (Frade, 2000). Про-апоптическая активность NGF/p75NTR во время раннего нейрогенеза у кур четко контролируется с помощью факторов жизнеспособности, таких как IGF-I (Frago et al., 2003). У мышей, несущих нулевую мутации FL-p75NTR, но всё ещё экспрессирующих S-p75NTR, наблюдается прогрессивная потеря слуха спустя 4 мес. после рождения, это ассоциирует с дегенерацией нейронов улитки и потерей волосковых клеток в базальных витках улитки. Было предположено, что p75NTR может играть существенную роль в поддержании функции улитки и что мыши, несущие мутацию в гене p75 , д. представлять собой новую животную модель прогрессивной потери слуха с ранним началом (Sato et al., 2006). Эти данные контрастируют с теми, которые указывают, что активация p75NTR ассоциирует с клеточной гибелью во взрослой улитке. В нормальной улитке волосковые и поддерживающие клетки кортиева органа продуцируют зрелый BDNF, который активирует TrkB рецепторы на cochlear нейронах, обеспечивая их жизнеспособность. После воздействия aminoglycoside сенсорные клетки кортиева органа прогрессивно дегенерируют, снижая пригодность зрелого BDNF и вызывая снижение экспрессии TrkB. Параллельно, экспрессия p75NTR и фосфорилирование c-Jun вызывают прибавление кохлеарных нейронов, подтверждая активацию апоптических путей, когда pro-survival нейротрофная поддержка снижается (Tan and Shepherd, 2006).
Новая информация об активности профакторов и транскрипционной регуляции генов, кодирующих нейротрофины и их рецепторы, возобновила интерес к этим элементам. Т.о., путем контроля клеточной гибели и решений о жизнеспособности семейство NGF нейротрофинов вносит вклад в развитие внутреннего уха и поддержание его активности. Следовательно, эти элементы могут быть интересны для защиты и восстановления слуха.

The insulin-like growth factor system in inner ear neurogenesis


Семейство генов инсулине производит инсулин, insulin-like growth factors (IGF) I, II, relaxin и некоторые инсулин-подобные пептиды у разных видов (rev. Russo et al., 2005). В самом деле, ген, кодирующий IGF-I, высоко консервативен у млекопитающих, птиц и амфибий (rev. Russo et al., 2005). Insulin-подобные пептиды соединяются со специфическими рецепторами в плазматической мембране клеток мишеней, которые могут быть сгруппированы в две категории, тирозин киназные рецепторы (insulin receptor и IGF1R) и mannose-6-phosphate IGF2R. Кроме того. активность IGF модулируется семейством плазматических транспортеров, наз. IGF binding proteins (IGFBP). Действие IGF-I обеспечиваются с помощью IGF1R, чьи гены также высоко законсервированы во время эволюции (Fig. 2A). IGF1R гетеротетрамерным трансмембранным белком, содержащим 2 α (внеклеточные лиганд-связывающие) и 2 β (внутриклеточные) субъединицы с протеин тирозин киназной активностью (LeRoith et al., 1995). Proinsulin и insulin также способны связывать свои рецепторы с высоким сродством и оба обильны в сыворотке, обычно маскируя активность IGF-I. Белок IGF-I обнаруживает сходство аминокислот в 91% в домене, кодирующем тирозин киназу, у животных, таких различных как Xenopus, рыбы, куры, крысы и люди (Russo et al., 2005). У эмбрионов рыбок данио, Igf1r экспрессируется обильно, особенно в зачатках хвоста. глаз, ушей и головном мозге (Ayaso et al., 2002). Ингибирование передачи сигналов IGF1R во время эмбриогенеза рыбок данио вызывает существеннные дефекты во внутреннем ухе, которые сопровождаются снижением эмбрионального роста, остановкой развития, повышенной летальностью и индукцией апоптоза нейронов (Schlueter et al., 2007).
Во время эмбриогенеза, Igf-1 и Igf1r мРНК экспрессируются в регионах головного мозга, где осуществляется активное врастание нервов в спинальные и сенсорные ганглии, а также в краниальных и спинальных нервах (rev.Varela-Nieto et al., 2003). Однако, транскрипция IGF-I и IGF1R генов существенно снижается постнатально и достигает очень низкого уровня у взрослых, это снижение коррелирует со степенью созревания клеток (rev. Varela-Nieto et al., 2003). Тем не менее оба белка всё ещё присутствуют в нейронах и Шванновских клетках автономной и периферической нервной системы, а также в структурах ЦНС, которые подвергаются обновлению клеток у взрослых, в таких как обонятельные луковицы, хороидное сплетение и dentate gyrus гиппокампа (rev. Varela- Nieto et al., 2003). Как IGF-I , так и IGF-II , по-видимому, способны увеличивать количество нейральных клеток головного мозга и предупреждать апоптоз нейронов (rev. Varela-Nieto et al., 2003; Russo et al., 2005; Ye and D'Ercole, 2006). IGF индуцирует рост и синтез ДНК в разнообразных типах нервных клеток in vitro, включая нейроны CVG (Leon et al., 1995). IGF-I укорачивает продолжительность клеточного цикла нейрональных предшественников во время эмбриональной жизни и влияет на рост всех типов нервных клеток (rev. Varela- Nieto et al., 2003; Ye and D'Ercole, 2006). IGF-I может также действовать как фактор компетентности, т.е. фактор. необходимый для действия др. факторов роста. Напр., в отсутствие IGF-I ни EGF, ни FGF-2 не способны стимулировать пролиферацию культивируемых нейральных стволовых клеток у E14 мышиных эмбрионов (Arsenijevic et al., 2001). Однако, роль IGF-I в спецификации клеточных клонов остается противоречивой, возможно из-за видо-специфичной активности.
IGF-I необходим также для ранней дифференцировки и жизнеспособности нейробластов в отическом пузырьке кур (Table 1; Fig. 2B) (Camarero et al., 2003). IGF-I и IGF1R экспрессируются в отическом эпителии кур и CVG (Camarero et al., 2003) , а также в постнатальной улитке и вестибулярных ганглиях (Camarero et al., 2001 and 2002; reviewed in Varela-Nieto et al., 2003 and 2004). В органотипических культурах отических пузырьков кур добавление экзогенного IGF-I вызывает повышение количества клеток в отическом пузырьке и ассоциированном с ним CVG, воспроизводя нормальный паттерн морфогенеза in vivo (Leon et al., 1995). Добавление экзогенного IGF-I к изолированным CVG кур увеличивает пролиферацию клеток, вызывая рост нейритов и повышенную экспрессию маркера нейрональной дифференцировки G4 (Camarero et al., 2003) (Fig. 2C). Блокада активности эндогенного IGF-I ингибирует формирование CVG в среде, лишённой фактора роста, и увеличивает клеточную гибель, указывая тем самым, что активность эндогенного IGF-I важна для генерации и жизнеспособности ганглия (Camarero et al., 2003). Эти исследования подтверждают, что пролиферация, дифференцировка и выживаемость нейрональных предшественников и нейронов внутреннего уха зависят от IGF-I. Несмотря на существенный прогресс, пути внутриклеточной передачи сигналов, которые обеспечивают орган-специфичную активность IGF-I еще предстоит установить. Реакция клеток мишеней на IGF-I обеспечивается за счет его высокого сродства рецептора, IGF1R, классического трансмембранного тирозин киназного рецептора. IGF1R экспрессируется во многих нейральных тканях эмбрионов и его активация играет важную роль как в пролиферации, так и дифференцировке нейронов во время эмбрионального развития, а также в регенерации (rev. Varela-Nieto et al., 2003). Соединение IGF-I с IGF1R активирует разные сигнальные каскады, которые в свою очередь обеспечивают трофические эффекты IGF. Тирозин киназная активность приводит к автофосфорилированию IGF1R и запускает активацию двух основных внутриклеточных сигнальных путей: phosphatidylinositol-3 kinase/Akt (PI-3K/Akt) путь жизнеспособности; и Raf/mitogen-activated protein kinase (Raf/MAPK), который активирует пролиферацию нервных клеток во время развития (rev. Varela-Nieto et al., 2003; Russo et al., 2005). Недавно было продемонстрировано, что воздействие IGF-I способствует нейральному фенотипу стволовых клеток обонятельных луковиц мышей за счет регуляции пути PI-3K/Akt (Otaegi et al., 2006; Kalluri et al., 2007) и достоверно, что, IGF-I может активировать эти пути во время развития отических пузырьков (Sanz et al., 1999b; Frago et al., 2003). Активация каскада Raf/MAPK участвует в пролиферации эпителиальных клеток внутреннего уха, в то время как активация пути PI3-kinase/Akt контролирует жизнеспособность отических клеток (Sanz et al., 1999b; Frago et al., 2003; Leon et al., 2004). В дополнение к каноническим внутриклеточным путям, ceramide kinase , как полагают, может служить ключевой мишенью в IGF-I защитном пути (Sugiura et al., 2002; Frago et al., 2003 and 2006).
Информация о роли IGFs в нейрогенезе кохлеарного ганглия внутреннего уха получена в исследовании генетически модифицированных мышей. Тогда как имеется увеличение размера клеток и уменьшение апоптоза у трансгенных мышей, с избыточной экспрессией IGF-I (rev. Varela-Nieto et al., 2003 and 2004), напротив обнаруживается задержка роста, уменьшение размеров головного мозга, избирательная потеря популяций нейронов, гипомиэлинизация и снижение скорости периферического проведения импульсов у мышей, лишенных IGF-I (Igf1-/-) (Figure 3) (rev. Varela-Nieto et al., 2003 and 2004). Кроме того, постнатальное развитие улитки тяжело нарушается у мышей Igf1-/-, которые формируют маленькие улитки и кохлеарные ганглии, незрелую текториальную мембрану и они обнаруживают также достоверное снижение количества и размера слуховых нейронов (Camarero et al., 2001 and 2002). Заметное уменьшение количества нейральных клеток, по-видимому, обусловлено множественными процессами, включая повышенную клеточную гибель (Camarero et al., 2001). Эти результаты демонстрируют, что IGF-I вносит вклад в созревание и поддержание кохлеарных нейронов. Кроме того миэлиновая оболочка, которая покрывает биполярные нейроны постнатального кохлеарного нерва позвоночных, тяжело повреждена (Camarero et al., 2002). Итак, отсутствие IGF-I у мышей затрагивает постнатальные жизнеспособность, дифференцировку и созревание клеток кохлеарного ганглия и вызывает аномалии иннервации сенсорных клеток органа Корти. Интересно, что мутации в ген, кодирующем IGF-I человека вызывают синдром нейросенсорной потери слуха (Woods et al., 1996 and 1997; Walenkamp et al., 2005; Walenkamp and Wit, 2006). Более того, IGF-I дефицит у мышей вызывает двухстороннюю сенсоронейральную потерю слуха на всех частотах и задержанную реакцию на акустические стимулы (Cediel et al., 2006) (Figure 3N). В больной или поврежденной нервной системе инфузии IGF-I улучшают регенерацию нервов и in vitro, стимулируют регенерацию взрослых чувствительных нейронов (Varela-Nieto et al., 2003). Следовательно, IGF-I может быть использован в качестве лечебного кофактора для борьбы с потерей слуха.

Transcription factors and gene networks


Во время развития внутреннего уха имеется несколько семейств транскрипционных факторов, которые участвуют в предопределении границ и полярности и в регуляции внутриклеточной передачи сигналов (Table 2).
Zinc finger transcription factors


2 из 6 членов семейства GATA zinc finger транскрипционных факторов экспрессируются во внутреннем ухе, GATA3 и GATA2 (Lillevali et al., 2004). Их экспрессия перекрывается в отических пузырьках мышей на ст. E9.5-10.5 , но во время последующего развития они существенно дивергируют. GATA3 ограничивается сенсорными доменами,

TABLE 2

TRANSCRIPTION FACTORS IMPLICATED IN OTIC NEUROGENESIS




эпителиальными клетками, слуховыми сенсорными нейронами (нейроны спирального ганглия) и периотической мезенхимой (Lawoko-Kerali et al., 2002) и на ст.E18.5 он ограничивается улиткой. GATA3 формируются маленькие отические пузырьки, тогда как канал улитки, полукружные каналы и слуховой ганглий не развиваются (Karis et al., 2001). Его экспрессия особенно высока в нейронах спирального ганглия во время миграции и дифференцировки (Lawoko-Kerali et al., 2004) и он специфически подавляется в волосковых клетках. когда они начинают дифференцироваться внутри сенсорного поля (Rivolta and Holley, 1998). Имеются доказательства, что GATA3 регулирует экспрессию транскрипционного фактора NeuroD (Lawoko-Kerali, 2004), а также Fgf10 в отическом эпителии (Lillevali et al., 2006).
Роль GATA2 во внутреннем ухе ещё неясна и не обнаружено аномалий раннего отического развития у дефицитных по Gata2 эмбрионов (Lillevali et al., 2004). Однако, недавние исследования микромассивов GATA2 функционально родственных генов, базирующиеся на сходстве паттернов экспрессии в клеточных линях внутреннего уха выявили интересные ко-регулируемые гены, такие как signal transducer and activator of transcription, Stat3 (Holley et al., 2007). Др. zinc finger транскрипционный фактор, который экспрессируется во внутреннем ухе, это growth factor independence 1 (Gfi1), который важен для дифференцировки и жизнеспособности волосковых клеток (Wallis et al., 2003; Hertzano et al., 2004).

POU domain transcription factors


Известны два члена, экспрессируемые во внутреннем ухе: Brn3a и Brn3c. Brn3a необходим для собственно роста и миграции во внутреннем ухе и для вкусовых сенсорных нейронов и он является критическим для иннервации мишеней и наведения аксонов нейронов спирального и вестибулярного ганглиев. Brn3a контролирует жизнеспособность и дифференцировку сенсорных нейронов путем регулирования различных нижестоящих генов. Потеря Brn3a приводит к тяжелой задержке в развитии проекций аксонов в улитку и заднюю часть вертикального канала со ст. E13.5. Кроме того, эфферентные аксоны, которые используют афферентные волокна в качестве поддержки во время нахождения пути, также обнаруживают тяжелые нарушения маршрутов (Huang et al., 2001).
Brn3c специфически экспрессируется волосковыми клетками во взрослом внутреннем ухе мышей; более того, Brn3c нулевые мутантные мыши содержат незрелые волосковые клетки, но обнаруживают нормальное развитие иннервации улитки (Xiang et al., 1997 and 2003). Эктопическая избыточная экспрессия Brn3c не ведет к продукции волосковых клеток, указывая тем самым. что он необходим только для поздних аспектов дифференцировки волосковых клеток (Zheng and Gao, 2000).

bHLH transcription factors


Во время развития отоциста слуховые и вестибулярные нейробласты находятся среди первых специфицированных клеточных типов (Hemond and Morest, 1991; Hossain and Morest, 2000; Fekete and Wu, 2002). Они мигрируют из проспективного neural-sensorial домена эпителия на ст. E9.5-10.5, одновременно подавляя эпителиальный cytokeratin. Их дифференцировка зависит от двух basic helix-loop-helix (bHLH) транскрипционных факторов, neurogenin 1 (Ngn1) и NeuroD. У нулевых по Ngn1 мутантов и слуховые и вестибулярные нейроны отсутствуют, демонстрируя, что этот ген, является важным для дифференцировки всех нейронов внутреннего уха (Ma et al., 1998). В самом деле, было подтверждено, что NeuroD и βIII-tubulin являются частью того же самого регуляторного каскада, стоящего ниже Ngn1 (Ma et al., 1998). У нулевых мутантов по NeuroD, миграция и слуховых и вестибвлярных нейробластов нарушена, хотя отмечается более значительное истощение нейронов слуховых ганглиев (Liu et al., 2000; Kim et al., 2001). Др. bHLH гены необходимы, чтобы реализовать полностью пролиферативную способность предшественников нейронов: Hes1, Hes3, Hes5 (Kageyama et al., 2005). Hes5 и Hes1 имеют отношение к гистогенезу уха (Zine et al., 2001), т.к. они, по-видимому, взаимодействуют с передачей сигналов Notch в поддерживающих клетках и с Atoh 1 в волосковых клетках (Zheng et al., 2000; Lanford et al., 2000). Atoh1 является bHLH транскрипционным фактором и он 'необходим и достаточен' для дифференцировки волосковых клеток (Bermingham et al., 1999).

LIM-HD transcription factors


Islet-1 (Isl-1) является транскрипционным фактором, относящимся к LIM homeodomain (LIM-HD) семейству. В нервной системе кооперация между bHLH и LIM-HD транскрипционными факторами ответственна за генерацию клеточного разнообразия. Как описывалось ранее, Islet-1 экспрессируется в отической нейрогенной зоне (Li et al., 2004b). Его экспрессия позднее сохраняется в отических нейронах, но теряется в сенсорном клоне (Radde-Gallwitz et al., 2004).

Microarrays and gene networks


Одним из очень уникальных аспектов уха является сложная комбинация форм и функций, обеспечивающих рецепцию и трансдукцию специфических физических ощущений. Как дополнительный уровень сложности, точная геометрия внутреннего уха делает возможной интерпретацию только определенных механических стимулов. Очень мало известно о молекулярных взаимодействиях и генетических иерархиях, которые контролируют морфогенез такого специализированного эпителия. В попытке выяснить сети регуляторных генов, которые характеризуют развитие и созревание органов внутреннего уха, были разработаны новые техники анализа микромассивов.
Микромассивы предоставляют практический способ для измерения экспрессии тысяч генов одновременно (Schena et al., 1995; Lockhart et al., 1996). Они успешно использовались для изучения паттернов экспрессии генов в дифференцировке клеток внутреннего уха in vitro (Rivolta et al., 2002) и сравнительно недавно в исследованиях изменений экспрессии генов в улитке после воздействия шумами и старения (Kirkegaard et al., 2006; Gong et al., 2006). Очень ранние попытки предпринимались для анализа изменений в экспрессии генов во время дифференцировки эмбриональных стволовых клеток по пути клеток внутреннего уха (De Silva et al., 2006). Однако, эти технологии были связаны со множеством существенных источников экспериментальной неопределенности, которые делали анализ данных очень затруднительным. При изучении сложных биологических систем, подобных внутреннему уху, сигнал генной экспрессии фундаментального процесса часто может быть тотго же самого порядка величин, что и фоновые шумы и сд трудны для выявления. По этой причине неопределенности, генерируемые экспериментальными и биологическими шумами нужно было тщательно анализировать и оценивать количественно, чтобы извлечь ценную информацию из данных. Оценка неопределенности удавалась не полностью за счет повторных экспериментов, т.к выпадающие показатели часто обусловлены пятнами (flaws) в технике микромассивов или проблемами с гибридизацией биологического материала. Наиболее широко используемые микромассивы - это массивы высокой плотности олигонуклеотидов, такие как Affymetrix GeneChip®. Они характеризуются множественными зондами, ассоциированными с каждой мишенью, спаривающимися в качестве perfect match (PM) зондов и mismatch (MM) зондов. Набор зондов, используется для измерения уровней генной экспрессии и эти измерения затем



Fig. 3. Cochlear ganglion abnormalities in the Igf1-/- mutant mouse. Normal Igf-1+/+ ganglia are shown in (A-D) and mutant Igf-1-/- ganglia in (E-H). (A) Aspect of a normal P20 cochlear ganglion. (B) Toluidine blue staining of the cochlear ganglion. (C) Electron micrographs of the normal aspect of ganglion cells (GC), with their intact myelin sheaths. (D) Detail of the myelin sheath of a normal neuron with the external compact myelin (CM) and the internal loose myelin (LM). (E) Aspect of a mutant P20 cochlear ganglion. (F) Toluidine blue staining of the cochlear ganglion in mutant mice. Note the pyknotic cells (arrows) that are probably degenerating neurons. (G) Electron micrograph of an apparently normal group of ganglion cells. (H) Detail of the myelin sheath of a mutant mouse neuron. Note the thinner compact myelin and the non-compacted sheath (asterisk). (I) Schematic drawing of the cochlea in which the squares indicate the apical and basal turn cochlear ganglia. (J-M) TUNEL labelling from normal (Igf-1+/+) and mutant (Igf-1-/-) mice at postnatal days 8 and 20. The number of apoptotic neurons increases in the cochlear ganglion of Igf-1-/-. (N) Average ABR thresholds for click stimulus of Igf-1+/+ (n = 21), Igf-1+/- (n = 29) and Igf-1-/- (n = 11) mice. Data are presented as mean ± SEM. The difference was statistically significant (**P менее 0.01) between the null group and the wild-type and heterozygous groups. Scale bars: (A,E) 30 µm; (B,F) 30 µm; (C,G) 10 µm; (D,H) 0.5 µm. Modified from: Camarero et al., 2001 and 2002; Cediel et al., 2006.

используются для детекции генов, дифференциально экспрессируемых в разных условиях, чтобы сделать видимыми кластеры или определенную сеть генов. Чтобы оценить уровни экспрессии генов необходимо суммирование этих значений уровней зондов. Уровень неопределенности, ассоциированный с сигналами низкой экспрессии генов очень высок и необходимо суммирование, что он менее чувствителен к шумам. Наиболее популярные методы анализа probe-levels в настоящее время предоставляют лишь единственную точку оценки уровней генной экспрессии, но большинство из них неспособно предоставить надежные интервалы для каждого измерения (Affymetrix, Microarray Suite User Guide version 5.0., 2001, Affymetrix Inc.) (Irizarry et al., 2003). Вероятностные модели недавно были введены, они описывают набор данных зондов в терминах вероятностных функций. The Bayesian Gene Expression (BGX, http://www.bgx.org.uk/; Hein et al., 2005) разработали Hierarchical Bayesian модель для probe-level анализа, но он в вычислительном отношении очень дорог и поэтому не осуществим в отношении очень баольших баз данных. Допустимыми альтернативами являются модели, разработанные PUMA group (Propagating Uncertainty in Microarray Analysis, http://www.bioinf.man.ac.uk/resources/puma/) и gMOS models (gamma model of oligonucleotide signal), обнаруживающими улучшения как в отношении аккуратности, так и компьютерной эффективности по сравнению с BGX моделью. Они подсчитывают уровни экспрессии генов с доверительными интервалами, которые определяют количественно измерения варианс, ассоциированных с подсчетами target концентрации внутри выборки. Это внутри выборки варианс является достоверным источником неопределенности в массивах олигонуклеотидов, особенно для слабо экспрессируемых генов. Эти модели также действуют эффективно и аккуратно оценивают данные разных типов, включая данные для внутреннего уха (Milo et al., 2003; Liu et al., 2005; Holley et al., 2007). Проведенные пока исследования микромассивов на Igf1-/- нулевых мутантах Sanchez-Calderon et al., показали, что использование селективного анализа probe-level, такого как gMOS, и родственных моделей, могут быть выявлены сигналы очень низкой экспрессии в сильно варьирующих биологических выборках. Такого типа анализ генной экспрессии оказался безуспешным, когда касался моделей, которые не оценивают количественно вариансы на probe-level. Большое количество ложно позитивных показателей делает детекцию действительных позитивных показателей почти невозможной. Однако, результаты, полученные анализом генной экспрессии сегодня оцениваются in vivo.
Хотя технология микромассивов становится всё доступной всё ещё существует потребность в сильных биоинформационных инструментах для анализа крупномасштабных данных по экспрессии генов. Высокая цена массивов и ограничения в осуществлении биологических экспериментов, обусловленные отсутствием биологического материала и/или сложностью систем, делают более важным существование надежных предсказаний in silico прежде осуществления экспериментов in vitro или in vivo. Разработка математических моделей, которые интегрируют экспериментальные данные со статистически логическими выводами, полезны для идентификации и описания динамических изменений в сети интересующих генов и в конечном итоге для заключения об изменениях в ключевых сигнальных путях. В органе, подобном внутреннему уху, где имеется несколько разных биологических процессов, регулируемых очень точно, боле информативно посмотреть на эти процессы как динамические сети генов, ключевыми компонентами которых являются транскрипционные факторы и паттерны их генной экспрессии.
Нейросенсорная потеря слуха является наиболее широко распространенным заоблеванием по всему миру, большая пропорция которых связана с потерей волосковых клеток и ассоциированных с ними нейронов. Понимание и выявление сети ключевых генов в развитии и функции внутреннего уха млекопитающих представляет важную ступень в направлении борьбы с глухотой.

A Spatial and Temporal Gradient of Fgf Differentially Regulates Distinct Stages of Neural Development in the Zebrafish Inner Ear
Shruti Vemaraju, Husniye Kantarci, Mahesh S. Padanad, Bruce B. Riley
PLoS Genet 8(11): e1003068. doi:10.1371/journal.pgen.1003068

Нейробласты статоакустического ганглия (SAG) первоначально образуются в нижней части слухового пузырька во время относительно небольшого окна в ходе развития. Они вскоре отсоединяются и подвергаются продолжительной фазе пролиферации и миграции (transit-amplification). Нейробласты в конечном счете дифференцируются и выпускают свои отростки в двух направлениях, чтобы сформировать синапсы с волосковыми клетками во внутреннем ухе и с разными мишенями в заднем мозге. Исследование на рыбках данио показало, что передача сигналов Fgf контролирует многие фазы этого сложного процесса развития. Умеренные уровни Fgf в градиенте, исходящем от формирующейся utricular macula, специфицируют нейробласты SAG в боковом соседнем отическом эпителии. На более поздней стадии дифференцирующиеся нейроны SAG экспрессируют Fgf5, который выполняет две функции: во-первых, когда SAG нейроны накапливают увеличивающиеся уровни Fgf, которые превышают верхнюю границу порога, то это ведет к завершению инициальной фазы спецификации нейробластов. Во-вторых, повышенные уровни Fgf задерживают дифференцировку пролиферирующих и мигрирующих клеток, обеспечивая баланс между скоростью обновления предшественников и дифференцировкой нейронов. Устранение с помощью лазера зрелых SAG нейронов устраняет ингибирование по типу обратной связи и вызывает преждевременную дифференцировку нейронов. Сходные эффекты получены при нокдауне Fgf5 или глобальном нарушении передачи сигналов Fgf, тогда как эктопическая экспрессия Fgf оказывает противоположный эффект. Т.о., передача сигналов Fgf обеспечивает SAG развитию саморегулировку, гарантируя устойчивую продукцию соотв. количества нейронов по мере роста личинок.


Рисунки к статье

Сайт создан в системе uCoz