Генетический Контроль

Determinative roles of FGF and Wnt signals in iris-derived lens regeneration in newt eye Toshinori Hayashi, Nobuhlko Mizuno and Hisato Kondoh Develop. Growth Differ. (2008) 50/279-287 doi: 10.1111/J.1440-169X.2008.01005.X
Total regeneration of experimentally excised lens from the dorsal part of the iris-pigmented epithelium of newts has been a key model of tissue regeneration via cells originating from a foreign tissue. Due to the strict spatial restriction of the lens origin in the newt iris, it has often been assumed that only the dorsal iris cells are endowed with an intrinsic potential to give rise to lens tissues. However, our reinvestigation of the process revealed completely different mechanisms underlying lens regeneration and its spatial restriction, comprising the following two steps: (i) Fibroblast growth factor (FGF) 2-dependent proliferation of iris-pigmented epithelium and activation of early lens genes (Pax6, Sox2, MafB) over the entire circumference of the iris; and (ii) dorsal iris-restricted activation of the canonical Wnt signals (involving Wnt2b and Frizzeid4) that leads to localized expression of late lens genes (Proxl, Sox1, f}-crystallin). Injection of FGF2 into normal eyes specifically elicited the second lens development from the dorsal iris, and the administration of recombinant Wnt3a to the cultured iris-pigmented epithelium caused even ventral iris-derived lens development. Thus, it is concluded that the regulation of FGF2 and Wnt signals is a determinative of the iris-derived lens regeneration in the newt eye.	Тритоны обладают удивительной силой регенерации большого репертуара поврежденных тканей, преимущественно из-за того, что они часто подвергаются атакам различных хищников в своей естественной среде обитания и используют это в качестве механизма выживания. Особый интерес представляет регенерация хрусталика из пигментированного эпителия радужки, процесс тканевой регенерации и чужой ткани (Mikami 1941; Reyer 1954; Yamada 1966; Eguchi 1967; Del Rio-Tsonis & Tsonis 2003). Это контрастирует со многими др. случаями тканевой регенерации, происходящей из остатков выживших клеток в поврежденной ткани. Происходящая из радужки регенерация хрусталика рассматривается как пример 'transdifferentiation' и является предметом экспериментальных исследований более 100 лет. Несмотря на значительный интерес и крупные инвестиции в исследования ключевые регуляторные процессы, приводящие к регенерации хрусталика остаются невыясненными. Возникновение трансдифференцировки хрусталиковых клеток из эмбриональной ткани сетчатки (нейральной и пигментной) у кур было продемонстрировано в культуральных условиях (Okada etal. 1975; Itoh & Eguchi 1986). Лежащие в основе молекулярные механизмы, использующие транскрипционные факторы Sox2 и Pax6 и приводящие к дифференцировке хрусталиковых клеток, по-видимому, общие при эмбриональном развитии, регенерации и экспериментальной трансдифференцировке хрусталиковых клеток (Kondoh etal. 2004). Однако процесс регенерации хрусталика в глазах тритона удивителен тем, что он является высоко упорядоченным естественно возникающим процессом, управляемым действием пространственно-временных организованных сигнальных систем. В экспериментах регенерация хрусталика инициируется удалением хрусталика из глаза взрослого тритона. Этот процесс всегда происходит из дорсального края ткани радужки. Регенерирующий хрусталик достигает Fig. 1. Regeneration of the lens from the dorsal iris margin after surgical removal of the lens in adult newt, (A) Surgical operation to remove lens from newt eye. (a) Adult newt under anesthesia is held by fingers, and a sharp slit is made through the cornea using a blade, (b) Then the lens is held by the tip of forceps inserted through the slit, and the lens is pulled out without damaging the iris (Extracts from Kondoh Differentiation Signaling Project video recording 5How a life forms' [Japan Science and Technology Agency]). (B) The scheme of lens regeneration from the dorsal iris after lens removal. Fig. 2, Second lens development from the dorsal ins mimicking the lens regeneration process after injection of FGF2 in the eye chamber. (A) Morphological changes of the iris tissue after Intraocular injection of FGF2 (50 ng). (B) The sequence of events in iris after lens removal, which is very simHar to that after FGF2 injection. Sections were stained with hematoxylin and eosin (HE), for BrdU or for ft-crystailin. Arrows indicate the second (A) or regenerating (B) lenses.. The numbers in parentheses indicate the cases of second iens development or tens regeneration. Bars, 150 pm (Adopted from Hayashi etaf, [2004], FGF2 triggers iris-derived lens regeneration in newt eye. Mechanisms of Development 121, 519-526, fig. 1.) оригинального размера в 40 дней. Хирургическая операция по удалению хрусталика (lentectomy) осуществляется посредством очень чистой обработки ткани. Сначала производится острый разрез роговицы, когда голова тритона находится под анестезией (Fig. 1Aa), затем хрусталик захватывается кончиками тонких щипчиков и достается без нарушения целостности хрусталика и освобождается от прикрепленных др. тканей (Fig. lAb). Хрусталик прикреплен очень рыхло к радужке и к очень жидкому по природе стекловидному телу. Из-за дорсального ограничения возникновения регенерации хрусталика удивительно и, по-видимому, очень стабильное по природе, поэтому было предположено, что все клеточные события, ведущие к регенерации хрусталика, происходят только в дорсальном аспекте ткани радужки, но это противоречит действительным наблюдениям. После удаления хрусталика двухслойный пигментный эпителий радужки утолщается и начинается пролиферация, как показывает включение BrdU или изотопически меченного тимидина, по всей окружности радужки, хотя реакции слегка задерживаются (максимум на 2 дня) в вентральных частях радужки (Fig, 2B) (Eguchi & Shingai 1971; Hayashi etal, 2004). Затем инициируется развитие хрусталика на дорсальном крае радужки. Следовательно, имеется, по крайней мере. две крупных ступени, ведущие к регенерации хрусталика: (i) дезорганизация ткани и клеточная пролиферация по всему пигментному эпителию радужки и (ii) действительное развитие хрусталика на дорсальном крае радужки. Было продемонстрировано, что профили генной экспрессии на второй ступени сходны с теми, что наблюдаются при эмбриональном развитии хрусталика (Mizuno etal. 1999). Выявлены сигнальные системы, ответственные за вычленение этих ступеней (Hayashi etal. 2004; Hayashi et al. 2006). Недавние успехи трансгенной и knockdown технологий сделали возможными исследования регенерации с использованием тритонов (Ueda etal. 2005; Madha-van etal. 2006) и д. предоставить молекулярную информацию о феномене регенерации. FGF2-dependent first step of lens regeneration process that occurs in the entire circumference of iris margin Если растворимый белковый фактор участвует в инициальной активации процесса регенерации хрусталика после его удаления, то инъекции одного и того же фактора в не оперированную нормальную глазную камеру д. активировать процесс даже в присутствие нормального хрусталика. Исходя из этой гипотезы. мы вводили различные факторы роста в нормальные взрослые глаза, среди них только FGF2 оказался эффективным. В сущности одиночного воздействия FGF2 было достаточно для инициации регенерации хрусталика (Fig. 2A) (Hayashi et ai. 2004). Рис. 2 сравнивает время течения клеточных событий, которые происходят после одиночной инъекции 50 ng FGF2, по сравнению с таковым после хирургического удаления хрусталика. Спустя 2 дня после инъекции FGF2 оба слоя пигментного эпителия радужки утолщались, пролиферация инициировалась по всей окружности радужки, что регистрировали по включению BrdU, и сопровождалась продукцией крошечного хрусталика на дорсальном крае радужки на 14-й день и рост этого второго хрусталика в присутствии первого (впервые исходный хрусталик начинал дегенерировать спустя 3 недели) давал хрусталик нормального размера (замещая оригинальный хрусталик) в 40 дней. Это время осуществления клеточных событий после инъекции FGF2 было идентичным тому. что наблюдалось после хирургического удаления хрусталика, за исключением того, что все ступени осуществлялись на два дня раньше Fig. 3. FGF2-specific activity to elicit second lens development after intraocular injection, (A. B), Histological sections of the eyes 18-days after injection of FGF2 (left) or FGF1 (right) at 50 ng/'eye stained with hematoxylin and eosin (HE). FGF2 injection caused thickening of both dorsal and ventral portions of the iris, and the development of the second lens from the dorsal portion, while FGF1 injection caused no morphological change in the iris. Bar, 150 pm (Adopted from Hayashi etal. [2004], FGF2 triggers iris-derived lens regeneration in newt eye. Mechanisms of Development 121, 519-526, fig. 3.) gпосе инъекции FGF2 и что инициальные изменения в пигментном эпителии были идентичны как на дорсальной, так и вентральной стороне радужки, некоторая задержка на вентральной стороне после удаления хрусталика уже отмечалась . Это наблюдение указывает, (i) что активация (или синтез) FGF2 или аналогичного фактора запускает всю цепочку процессов регенерации хрусталика, а после удаления хрусталика требуется два дня для синтеза или накопления активности FGF2 (или аналогичного фактора) выше порога; и (ii) что дорсальное предпочтение источника фактора, по-видимому, и обусловливает задержку в реакции вентральной стороны. Хотя FGF1, как известно, обладает сходным действием, что и FGF2, но он оказался неэффективным в инициации второй фазы регенерации хрусталика (Fig. 3B), несмотря на тот факт, что фосфорилирование с помощью ERK1/2, нижестоящей mitogen-activating protein (MAP) киназы FGF рецепторов сильно стимулировалось в радужке и ткани сетчатки в FGF1-инъецированных глазах до уровня, сравнимого с таковым в FGF2-инъецированных глазах (Hayashi et al. 2004). Др. FGFs (FGF4, 7, 8, 9, 10), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF) или vascular endothelial growth factor (VEGF) не оказывали какого-либо эффекта, характерного для FGF2 (Hayashi etal. 2004). Эти наблюдения подчеркивают специфичность действия FGF2 по вызыванию клеточных реакций регенерации хрусталика. Мы исследовали молекулярные события, которые инициируются и происходят в ткани радужки после Fig. 4. Expression of various genes involved in lens development in the dorsal and ventral halves of iris after lens removal (left) or after a single injection of 50 ng FGF2 (right). Total RNA extracted from 12 iris pieces were analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), and compared with the lens and neural retina tissues. Data in orange rectangles are on the iris tissues already containing the second lens tissue. (A) Expression of endogenous Fgf2 and Fgf1. (B) Expression of early lens genes, Paxfr Sox2 and MafB. Sox2 expression data were photo-recorded with a longer exposure compared with others to show a low Sox2 expression n iris tissues before lens removal. (C) Expression of iate lens genes, Proxl, Soxl and β -crystailin (Adopted from Hayashi etal [2004], FGF2 triggers iris-derived tens regeneration in newt eye. Mechanisms of Development 121. 519-526, fig. 5 инъекции FGF2 в глаз или хирургического удаления хрусталика. Ткань радужки выделяли с определенными интервалами из оперированных тритонов из дорсальной и вентральной половин и анализировали экспрессию мРНК с помощью reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) для Fgf1/2 ранних хрусталиковых генов (т.e. Pax6, Sox2 и MafB) (Kamachi et al. 2001; Shimada et al. 2003), и для поздних хрусталиковых генов (т.e. Prox1, Sox1 b β B1-crystailin) (Nishiguchi et al. 1998: Mizuno et al. 1999) (Fig. 4). Данные, показанные на Рис. 4 демонстрируют несколько важных аспектов процесса регенерации хрусталика, (i) Fgf2 активируется в дорсальной и вентральной половинах радужки как после удаления хрусталика, так и после инъекции FGF2, тогда как экспрессия Fgf1 остается неизменной. Эта активация экспрессии эндогенного Fgf2 может служить основой FGF2-специфического действия. Имеется некоторая задержка активации Fgf2 в вентральной части радужки параллельно с задержкой клеточных реакций в вентральной части радужки рассмотренной выше; подкрепляется мнение, что FGF2 является подлинным эндогенным индуктором процесса регенерации хрусталика, (ii) все ранние хрусталиковые гены активируются в обеих половинках радужки, указывая на то, что состояние pre-!ens достигается по всей окружности радужки. (iii) Тем не менее, спустя 16 дней после удаления хрусталика или 14 дней после инъекции FGF2 , только дорсальная половина радужки экспрессировала поздние хрусталиковые гены и повышала уровни экспрессии ранних хрусталиковых генов параллельно с ограниченной дорсальной радужкой продукцией регенерирующего (или второго) хрусталика. Эта серия наблюдений указывает на то, что существуют две большие ступени регенерации хрусталика, первая FGF2-зависимая ступень, которая происходит во всей радужке и ведет к состоянию pre-lens и вторая ступень, которая ограничивает тканевой источник регенерации хрусталика дорсальной частью радужки Second step that is dependent on the canonical Wnt signaling Было предположено, что если вторая ступень регенерации хрусталика также обеспечивается внеклеточной системой передачи сигналов, то действие системы д. быть коротко действующим, чтобы ограничить передачу FGF и Wnt сигналов при регенерации хрусталика Fig. 5. Wnt signaling in lens regeneration. (A) Expression of Wnt2b, WntSa, Frizzied2 and Frizzled4 in the lens-regenerating iris tissue in comparison with the morphological changes of the iris tissue as schematized on the top, together with the corresponding periods of the two steps of the lens regeneration process. At various times after lens removal (left) or intraocular injection of FGF2 (right) to initiate iens development from the dorsal iris, irises were isolated from eyes, divided into dorsal and ventral halves, pooled, and analyzed by reverse transcription-poiymerase chain reaction (RT-PCR). As the lens-regenerating process proceeds 2 days faster after FGF2 injection, compared with after lens removal, all samples were prepared 2 days earlier after FGF2 injection (right). In the two right-most columns, PCR products derived from an equivalent amount of lens or retina cDNA are shown as references. Only in the dorsal half of the iris did Wn!2b begin to be expressed 8 days after lens removal or 6 days after FGF2 injection, which was prior to the progression of the lens regeneration process into the second step, and the expression level increased gradually. Wnt5a was expressed moderately In both dorsa! and ventral irises from before the treatments, and was activated further in both halves shortly after the lens removal/FGF2 injection. Frizz!ed2 was expressed at a low level in both halves starting before the treatments, and its expression level increased gradually in both halves after the treatments. Frizz!ed4 was expressed at a trace level in both halves of the normal iris, but was activated strongly only in the dorsal half 12 days after iens removal or 10 days after FGF2 injection, when the lens regeneration process proceeds into the second step. Expression of $B1-crystallin indicates lens development (B) The effect of intraocular injection of FGF2 inhibitor FGFR2(lllc)/Fc, which totally shut off morphological and biochemical changes in the iris tissue that normally take after lens removal. (Adopted from Hayashi eta! [2006], Determinative role of Wnt signals in dorsal iris-derived lens regeneration in newt eye. Mechanisms of Development 123, 793-800, fig. 1.) дорсальной частью радужки. Было предположено, что Wnt-сигнальная система оперирует на второй степени процесса регенерации хрусталика, т.к.её характеризует действие на коротком расстоянии (Hayashi et at. 2006). Среди транскриптов семейств Wnt лигандов и Frizzled рецепторов осуществляли поиск с помощью RT-PCR на РНК целых эмбрионов тритонов (Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, WntSa, WntSb, Frizzled2, Frizzled4 и Frizzled10), из них Wnt2b, Wnt5a, Fnzzled2 и Frizzled4 четко выявлялись в радужке, регенерирующей хрусталик (или продуцирующей второй хрусталик) . Рис. 5A сравнивает экспрессию Wnt-receptor генов в дистальной и вентральной частях радужки, Wnt5a and Frizzled2 активировались в обеих половинах радужки, начиная с ранних стадий процесса регенерации хрусталика после удаления хрусталика или инъекции FGF2, указывая тем самым, что экспрессия этих генов относится к первой ступени процесса. Напротив, Wnt2b и Frizzled4 активировались в дорсальной части радужки, это указывает на их вовлечение во вторую ступень процесса регенерации хрусталика. в Когда растворимая форма FGF2 receptor FGFR2(lllc)/Fc, которая действует столь же сильно, как и FGF2 ингибитор инъецировалась ежедневно в глазную камеру, то активации Wnt2b или Wnt5a не происходило (Fig. 5B), это согласуется с моделью, что передача сигналов Wnt участвует во второй ступени процесса регенерации хрусталика. Wnt2b , как известно, действует посредством канонического пути передачи сигналов Wnt и экспрессируется по краю эмбриональной сетчатки, из которого происходит пигментный эпителий радужки (Kubo et al. 2003). Было продемонстрировано с использованием LRP6 нокаутных мышей и в культуре in vitro хрусталикового эпителия, что каноническая передача сигналов Wnt существенна для развития хрусталиковых волокон (Stump et al. 2003; Lyu & Joo 2004). Авт. предприняли несколько попыток манипулировать с передачей сигналов Wnt в глазах in vivo безуспешно. Была использована система тканевой культуры, разработанная для пигментного эпителия радужки, которая воспроизводила ограниченную дорсальной частью радужки регенерацию хрусталика in vitro (Hayashi etal. 2002). Короче, изолированный эпителий радужки очищали от сопровождающей стромы обработкой Dispase, разделяли дорсальную и вентральную части, помещали в чашку, покрытую type I коллагеновым гелем или Matrigel и культивировали в среде. содержащей FGF2. В таких культуральных условиях эпителиальные кусочки радужки формировали клеточные глыбки и из глыбок клеток дорсальной радужки развивалась хрусталиковая ткань по времени, сходном с тем, затрачивается при регенерации хрусталика in vivo (Hayashi et at. 2006). Когда ингибиторы Wnt , sFRP1 (Uren etal. 2000), Dkk1 (Zorn 2001) или их комбинации были добавлены в культуральную среду, Fig. 7. Two early steps of the lens-regenerating process. The first step initiated by the action of FGF2 proceeds over the entire circumference of the iris-pigmented epithelium, involving cell proliferation, thickening of the tissue with some ioss of pigments, and expression of early lens transcription factor genes Pax6, Sox2 and MafB. In normal lens regeneration, the second step involving late lens genes Proxl, Sox1 and p-crystallins proceeds but is confined to the dorsal iris, owing to the dorsai-restricted expression of Wnt2b, as reinforced by the more abundant expression of Wnt receptors in the dorsai sector (Frizzled2 plus Frizzied4) compared with ventral expression of Frizzled2 only. (Adopted from Hayashi eta!. [2006], Determinative role of Wnt signals in dorsal iris-derived lens regeneration in newt eye Mechanisms of Development 123, 793-800, fig. 3.) то они строго ингибировали развитие ткани хрусталика (Fig. 6A), подтверждая прямое участие передачи сигналов Wnt в регенерации хрусталика из радужки. Когда растворимая форма Wnt3a (Shibamoto et al., 1998; Takada et al., 2005) добавлялась к культуральной среде, чтобы активировать канонический путь передачи Wnt сигналов, то ткань хрусталика, развивающаяся из дорсальной части эпителия радужки, драматически увеличивалась (2x в диаметре, 8x в объеме) (Fig. 6B). Более того, та же самая обработка Wnt3a вызывала развитие ткани хрусталика из ткани вентральной части радужки в 31% (5/16) случаев. Напротив, Wnt5a активированный неканонический путь не обнаруживал активности генерировать ткань хрусталика из вентральной части радужки. Отмечено также, что когда FGF2 убирался из культуральной среды, то Wnt3a-зависимое развитие хрусталиковой ткани тотально ингибировалось как дорсальной, так и вентральной частью радужки. Этот результат демонстрирует пригодность Wnt белков детерминировать развитие ткани хрусталика из пигментного эпителия радужки при условиях, что процесс первой ступени активируется с помощью FGF2 и клетки достигают состояния pre-lens. Принимая во внимание ограниченную дорсальной радужкой экспрессию Wnt2b, локальная активация Wnt2b гена после воздействия FGF2 безусловно детерминирует происхождение из дорсальной части радужки регенерации хрусталика. Значительно меньшая реакция ткани вентральной части радужки при культуральных условиях объясняется дифференциальной экспрессией Frizzled2 плюс Frizzled4 в дорсальной части радужки, тогда как в вентральной части радужки экспрессируется только Frizzled2 . Ограниченная дорсальной радужкой экспрессия Frizzled4 может усиливать дорсальное ограничение источника регенерации хрусталика in vivo. Демонстрация способности продуцировать хрусталик тканью вентральной части радужки является Copernican революцией в понимании регенерации хрусталика из радужки. Ранее считалось, что все процессы, связанные с регенерацией хрусталика происходят только в клетках 'dorsal iris' , которые наделены врожденным потенциалом давать хрусталик. Это в основном вопрос доступности канонических Wnt сигналов. В длительной истории экспериментальных манипуляций с тканью радужки тритона известны только два сообщения, указывающие на развитие хрусталика из вентральной части радужки. Первый описанный случай, это введение высокой дозы N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine в глазную камеру (Eguchi & Watanabe 1973), и второе после воздействия на изолированный пигментный эпителий различными комбинациями растворимых факторов (Grogg et al. 2005). В обоих случаях показатель был очень низким и, по-видимому, экспериментальные манипуляции в этих исследованиях в действительности активировали экспрессию Wnt или стабилизировали β-catenin способом, воспроизводящим каноническую передачу сигналов Wnt. Problems solved and to be solved Действие сигнальных систем и активация генов транскрипционных факторов, участвующих в двух инициальных ступенях регенерации хрусталика в глазах тритонов суммированы на Рис. 7. После удаления хрусталика действие FGF2 инициирует первую ступень реакций во всем пигментированном эпителии радужки, включая клеточную пролиферацию и экспрессию ранних хрусталиковых генов, Pax6, Sox2 и MafB. Затем ограниченное дорсальной частью радужки действие Wnt2b активирует поздние гены транскрипционных фаткоров Prox1 и Sox1 и инициирует развитие хрусталика, характеризующееся экспрессией crystallins. Т.о., демонстрация FGF2-зависимой и Wnt(2b)-зависимой ступеней в процессе регенерации хрусталика выявило основные ранние события регенерации хрусталика в глазах тритона. Др. сигнальные системы широко участвующие в развитии и регенерации хрусталиков (e.g. Tsonis etal. 2004) могут быть следующими. Two interesting problems remain to be answered: 1. Как экспрессия Wnt2b (и Frizzied4) ограничивается дорсальной частью радужки? Во время эмбрионального развития сетчатки, Wnt2b первоначально активируется в дорсо=-дистальной порции оптического пузырька, которая позднее вносит вклад в ткани, происходящие из дорсального края сетчатки, которые и становятся дорсальной частью радужки (Zakin etal. 1998; Jasoni etal. 1999; Kubo etal. 2003). Следовательно, оперирует та же самая регуляция гена Wnt2b что и в раннем оптическом пузырьке и это может приводить к ограниченной дорсальной частью радужки активации Wnt2b. Эту модель необходимо протестировать, используя технологию трансгенных тритонов (Ueda et al. 2005) путем вычленения регуляторных регионов Wnt2b и идентификации эмбрионального специфического для оптического пузырька энхансера и путем тестирования, может ли энхансер активироваться в процессе регенерации хрусталика у взрослых трансгенных тритонов. 2. Как и когда инициальный стимул FGF2 задается, который затем инициирует процесс регенерации в целом? Авт. полагают, что он действует на дорсальной стороне глаза. Известно. что после удаления хрусталика многочисленные макрофаги появляются, распределяясь преимущественно в дорсальной части радужки, по-видимому, помогая депигментации эпителия перед тем как начнется развитие хрусталика (Eguchi 1963). Предполагается. что некоторые активности, ассоциированные с макрофагами, запускают экзогенный по отношению к радужке источник FGF2, который затем активирует эндогенную для радужки экспрессию Fgf2. Это чисто гипотеза д. быть протестирована, но предварительные наблюдения, что предупреждение образования fibrin fпосле lentectomy ингибирует регенерацию хрусталика (Imokawa etal. 2004) могут объяснить этот контекст; а именно, что fibrin-ингибирующие воздействия нарушают собственно миграцию макрофагов и их действие. Более того, было бы интересно посмотреть, существует ли аналогичный сценарий в случае регенерации хрусталика из роговицы, которая происходит у лягушачьих головастиков (Mizuno etal. 1999). Conclusions There is no mystery behind the regeneration process. The large parts of cellular processes are very similar io those that take place during embryogenesis. By proper experimentation, signaling systems that trigger the tissue-generating protocol can be identified. An important issue of iris-derived lens regeneration in newts, namely dorsal limitation, is now resolved. Why then is the dorsal delimitation required in nature? An answer may be that the newts want only a single lens to develop to renew the damaged lens; development of multiple lenses for regeneration in an eye would obviously be problematic. By determining the site of occurrence of the second step, a newt can regenerate a single, beautiful lens.

Тритоны обладают удивительной силой регенерации большого репертуара поврежденных тканей, преимущественно из-за того, что они часто подвергаются атакам различных хищников в своей естественной среде обитания и используют это в качестве механизма выживания. Особый интерес представляет регенерация хрусталика из пигментированного эпителия радужки, процесс тканевой регенерации и чужой ткани (Mikami 1941; Reyer 1954; Yamada 1966; Eguchi 1967; Del Rio-Tsonis & Tsonis 2003). Это контрастирует со многими др. случаями тканевой регенерации, происходящей из остатков выживших клеток в поврежденной ткани. Происходящая из радужки регенерация хрусталика рассматривается как пример 'transdifferentiation' и является предметом экспериментальных исследований более 100 лет. Несмотря на значительный интерес и крупные инвестиции в исследования ключевые регуляторные процессы, приводящие к регенерации хрусталика остаются невыясненными.

Возникновение трансдифференцировки хрусталиковых клеток из эмбриональной ткани сетчатки (нейральной и пигментной) у кур было продемонстрировано в культуральных условиях (Okada etal. 1975; Itoh & Eguchi 1986). Лежащие в основе молекулярные механизмы, использующие транскрипционные факторы Sox2 и Pax6 и приводящие к дифференцировке хрусталиковых клеток, по-видимому, общие при эмбриональном развитии, регенерации и экспериментальной трансдифференцировке хрусталиковых клеток (Kondoh etal. 2004). Однако процесс регенерации хрусталика в глазах тритона удивителен тем, что он является высоко упорядоченным естественно возникающим процессом, управляемым действием пространственно-временных организованных сигнальных систем.

В экспериментах регенерация хрусталика инициируется удалением хрусталика из глаза взрослого тритона. Этот процесс всегда происходит из дорсального края ткани радужки. Регенерирующий хрусталик достигает

Fig. 1. Regeneration of the lens from the dorsal iris margin after surgical removal of the lens in adult newt, (A) Surgical operation to remove lens from newt eye. (a) Adult newt under anesthesia is held by fingers, and a sharp slit is made through the cornea using a blade, (b) Then the lens is held by the tip of forceps inserted through the slit, and the lens is pulled out without damaging the iris (Extracts from Kondoh Differentiation Signaling Project video recording 5How a life forms' [Japan Science and Technology Agency]). (B) The scheme of lens regeneration from the dorsal iris after lens removal.

Fig. 2, Second lens development from the dorsal ins mimicking the lens regeneration process after injection of FGF2 in the eye chamber. (A) Morphological changes of the iris tissue after Intraocular injection of FGF2 (50 ng). (B) The sequence of events in iris after lens removal, which is very simHar to that after FGF2 injection. Sections were stained with hematoxylin and eosin (HE), for BrdU or for ft-crystailin. Arrows indicate the second (A) or regenerating (B) lenses.. The numbers in parentheses indicate the cases of second iens development or tens regeneration. Bars, 150 pm (Adopted from Hayashi etaf, [2004], FGF2 triggers iris-derived lens regeneration in newt eye. Mechanisms of Development 121, 519-526, fig. 1.)

оригинального размера в 40 дней. Хирургическая операция по удалению хрусталика (lentectomy) осуществляется посредством очень чистой обработки ткани. Сначала производится острый разрез роговицы, когда голова тритона находится под анестезией (Fig. 1Aa), затем хрусталик захватывается кончиками тонких щипчиков и достается без нарушения целостности хрусталика и освобождается от прикрепленных др. тканей (Fig. lAb). Хрусталик прикреплен очень рыхло к радужке и к очень жидкому по природе стекловидному телу.

Из-за дорсального ограничения возникновения регенерации хрусталика удивительно и, по-видимому, очень стабильное по природе, поэтому было предположено, что все клеточные события, ведущие к регенерации хрусталика, происходят только в дорсальном аспекте ткани радужки, но это противоречит действительным наблюдениям. После удаления хрусталика двухслойный пигментный эпителий радужки утолщается и начинается пролиферация, как показывает включение BrdU или изотопически меченного тимидина, по всей окружности радужки, хотя реакции слегка задерживаются (максимум на 2 дня) в вентральных частях радужки (Fig, 2B) (Eguchi & Shingai 1971; Hayashi etal, 2004). Затем инициируется развитие хрусталика на дорсальном крае радужки. Следовательно, имеется, по крайней мере. две крупных ступени, ведущие к регенерации хрусталика: (i) дезорганизация ткани и клеточная пролиферация по всему пигментному эпителию радужки и (ii) действительное развитие хрусталика на дорсальном крае радужки. Было продемонстрировано, что профили генной экспрессии на второй ступени сходны с теми, что наблюдаются при эмбриональном развитии хрусталика (Mizuno etal. 1999). Выявлены сигнальные системы, ответственные за вычленение этих ступеней (Hayashi etal. 2004; Hayashi et al. 2006). Недавние успехи трансгенной и knockdown технологий сделали возможными исследования регенерации с использованием тритонов (Ueda etal. 2005; Madha-van etal. 2006) и д. предоставить молекулярную информацию о феномене регенерации.

FGF2-dependent first step of lens regeneration process that occurs in the entire circumference of iris margin

Если растворимый белковый фактор участвует в инициальной активации процесса регенерации хрусталика после его удаления, то инъекции одного и того же фактора в не оперированную нормальную глазную камеру д. активировать процесс даже в присутствие нормального хрусталика. Исходя из этой гипотезы. мы вводили различные факторы роста в нормальные взрослые глаза, среди них только FGF2 оказался эффективным. В сущности одиночного воздействия FGF2 было достаточно для инициации регенерации хрусталика (Fig. 2A) (Hayashi et ai. 2004). Рис. 2 сравнивает время течения клеточных событий, которые происходят после одиночной инъекции 50 ng FGF2, по сравнению с таковым после хирургического удаления хрусталика. Спустя 2 дня после инъекции FGF2 оба слоя пигментного эпителия радужки утолщались, пролиферация инициировалась по всей окружности радужки, что регистрировали по включению BrdU, и сопровождалась продукцией крошечного хрусталика на дорсальном крае радужки на 14-й день и рост этого второго хрусталика в присутствии первого (впервые исходный хрусталик начинал дегенерировать спустя 3 недели) давал хрусталик нормального размера (замещая оригинальный хрусталик) в 40 дней. Это время осуществления клеточных событий после инъекции FGF2 было идентичным тому. что наблюдалось после хирургического удаления хрусталика, за исключением того, что все ступени осуществлялись на два дня раньше

Fig. 3. FGF2-specific activity to elicit second lens development after intraocular injection, (A. B), Histological sections of the eyes 18-days after injection of FGF2 (left) or FGF1 (right) at 50 ng/'eye stained with hematoxylin and eosin (HE). FGF2 injection caused thickening of both dorsal and ventral portions of the iris, and the development of the second lens from the dorsal portion, while FGF1 injection caused no morphological change in the iris. Bar, 150 pm (Adopted from Hayashi etal. [2004], FGF2 triggers iris-derived lens regeneration in newt eye. Mechanisms of Development 121, 519-526, fig. 3.)

gпосе инъекции FGF2 и что инициальные изменения в пигментном эпителии были идентичны как на дорсальной, так и вентральной стороне радужки, некоторая задержка на вентральной стороне после удаления хрусталика уже отмечалась .

Это наблюдение указывает, (i) что активация (или синтез) FGF2 или аналогичного фактора запускает всю цепочку процессов регенерации хрусталика, а после удаления хрусталика требуется два дня для синтеза или накопления активности FGF2 (или аналогичного фактора) выше порога; и (ii) что дорсальное предпочтение источника фактора, по-видимому, и обусловливает задержку в реакции вентральной стороны.

Хотя FGF1, как известно, обладает сходным действием, что и FGF2, но он оказался неэффективным в инициации второй фазы регенерации хрусталика (Fig. 3B), несмотря на тот факт, что фосфорилирование с помощью ERK1/2, нижестоящей mitogen-activating protein (MAP) киназы FGF рецепторов сильно стимулировалось в радужке и ткани сетчатки в FGF1-инъецированных глазах до уровня, сравнимого с таковым в FGF2-инъецированных глазах (Hayashi et al. 2004). Др. FGFs (FGF4, 7, 8, 9, 10), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF) или vascular endothelial growth factor (VEGF) не оказывали какого-либо эффекта, характерного для FGF2 (Hayashi etal. 2004). Эти наблюдения подчеркивают специфичность действия FGF2 по вызыванию клеточных реакций регенерации хрусталика.

Мы исследовали молекулярные события, которые инициируются и происходят в ткани радужки после

Fig. 4. Expression of various genes involved in lens development in the dorsal and ventral halves of iris after lens removal (left) or after a single injection of 50 ng FGF2 (right). Total RNA extracted from 12 iris pieces were analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), and compared with the lens and neural retina tissues. Data in orange rectangles are on the iris tissues already containing the second lens tissue. (A) Expression of endogenous Fgf2 and Fgf1. (B) Expression of early lens genes, Paxfr Sox2 and MafB. Sox2 expression data were photo-recorded with a longer exposure compared with others to show a low Sox2 expression n iris tissues before lens removal. (C) Expression of iate lens genes, Proxl, Soxl and β -crystailin (Adopted from Hayashi etal [2004], FGF2 triggers iris-derived tens regeneration in newt eye. Mechanisms of Development 121. 519-526, fig. 5

инъекции FGF2 в глаз или хирургического удаления хрусталика. Ткань радужки выделяли с определенными интервалами из оперированных тритонов из дорсальной и вентральной половин и анализировали экспрессию мРНК с помощью reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) для Fgf1/2 ранних хрусталиковых генов (т.e. Pax6, Sox2 и MafB) (Kamachi et al. 2001; Shimada et al. 2003), и для поздних хрусталиковых генов (т.e. Prox1, Sox1 b β B1-crystailin) (Nishiguchi et al. 1998: Mizuno et al. 1999) (Fig. 4). Данные, показанные на Рис. 4 демонстрируют несколько важных аспектов процесса регенерации хрусталика, (i) Fgf2 активируется в дорсальной и вентральной половинах радужки как после удаления хрусталика, так и после инъекции FGF2, тогда как экспрессия Fgf1 остается неизменной. Эта активация экспрессии эндогенного Fgf2 может служить основой FGF2-специфического действия. Имеется некоторая задержка активации Fgf2 в вентральной части радужки параллельно с задержкой клеточных реакций в вентральной части радужки рассмотренной выше; подкрепляется мнение, что FGF2 является подлинным эндогенным индуктором процесса регенерации хрусталика, (ii) все ранние хрусталиковые гены активируются в обеих половинках радужки, указывая на то, что состояние pre-!ens достигается по всей окружности радужки. (iii) Тем не менее, спустя 16 дней после удаления хрусталика или 14 дней после инъекции FGF2 , только дорсальная половина радужки экспрессировала поздние хрусталиковые гены и повышала уровни экспрессии ранних хрусталиковых генов параллельно с ограниченной дорсальной радужкой продукцией регенерирующего (или второго) хрусталика.

Эта серия наблюдений указывает на то, что существуют две большие ступени регенерации хрусталика, первая FGF2-зависимая ступень, которая происходит во всей радужке и ведет к состоянию pre-lens и вторая ступень, которая ограничивает тканевой источник регенерации хрусталика дорсальной частью радужки

Second step that is dependent on the canonical Wnt signaling

Было предположено, что если вторая ступень регенерации хрусталика также обеспечивается внеклеточной системой передачи сигналов, то действие системы д. быть коротко действующим, чтобы ограничить передачу FGF и Wnt сигналов при регенерации хрусталика

Fig. 5. Wnt signaling in lens regeneration. (A) Expression of Wnt2b, WntSa, Frizzied2 and Frizzled4 in the lens-regenerating iris tissue in comparison with the morphological changes of the iris tissue as schematized on the top, together with the corresponding periods of the two steps of the lens regeneration process. At various times after lens removal (left) or intraocular injection of FGF2 (right) to initiate iens development from the dorsal iris, irises were isolated from eyes, divided into dorsal and ventral halves, pooled, and analyzed by reverse transcription-poiymerase chain reaction (RT-PCR). As the lens-regenerating process proceeds 2 days faster after FGF2 injection, compared with after lens removal, all samples were prepared 2 days earlier after FGF2 injection (right). In the two right-most columns, PCR products derived from an equivalent amount of lens or retina cDNA are shown as references. Only in the dorsal half of the iris did Wn!2b begin to be expressed 8 days after lens removal or 6 days after FGF2 injection, which was prior to the progression of the lens regeneration process into the second step, and the expression level increased gradually. Wnt5a was expressed moderately In both dorsa! and ventral irises from before the treatments, and was activated further in both halves shortly after the lens removal/FGF2 injection. Frizz!ed2 was expressed at a low level in both halves starting before the treatments, and its expression level increased gradually in both halves after the treatments. Frizz!ed4 was expressed at a trace level in both halves of the normal iris, but was activated strongly only in the dorsal half 12 days after iens removal or 10 days after FGF2 injection, when the lens regeneration process proceeds into the second step. Expression of $B1-crystallin indicates lens development (B) The effect of intraocular injection of FGF2 inhibitor FGFR2(lllc)/Fc, which totally shut off morphological and biochemical changes in the iris tissue that normally take after lens removal. (Adopted from Hayashi eta! [2006], Determinative role of Wnt signals in dorsal iris-derived lens regeneration in newt eye. Mechanisms of Development 123, 793-800, fig. 1.)

дорсальной частью радужки. Было предположено, что Wnt-сигнальная система оперирует на второй степени процесса регенерации хрусталика, т.к.её характеризует действие на коротком расстоянии (Hayashi et at. 2006).

Среди транскриптов семейств Wnt лигандов и Frizzled рецепторов осуществляли поиск с помощью RT-PCR на РНК целых эмбрионов тритонов (Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, WntSa, WntSb, Frizzled2, Frizzled4 и Frizzled10), из них Wnt2b, Wnt5a, Fnzzled2 и Frizzled4 четко выявлялись в радужке, регенерирующей хрусталик (или продуцирующей второй хрусталик) . Рис. 5A сравнивает экспрессию Wnt-receptor генов в дистальной и вентральной частях радужки, Wnt5a and Frizzled2 активировались в обеих половинах радужки, начиная с ранних стадий процесса регенерации хрусталика после удаления хрусталика или инъекции FGF2, указывая тем самым, что экспрессия этих генов относится к первой ступени процесса. Напротив, Wnt2b и Frizzled4 активировались в дорсальной части радужки, это указывает на их вовлечение во вторую ступень процесса регенерации хрусталика. в

Когда растворимая форма FGF2 receptor FGFR2(lllc)/Fc, которая действует столь же сильно, как и FGF2 ингибитор инъецировалась ежедневно в глазную камеру, то активации Wnt2b или Wnt5a не происходило (Fig. 5B), это согласуется с моделью, что передача сигналов Wnt участвует во второй ступени процесса регенерации хрусталика. Wnt2b , как известно, действует посредством канонического пути передачи сигналов Wnt и экспрессируется по краю эмбриональной сетчатки, из которого происходит пигментный эпителий радужки (Kubo et al. 2003). Было продемонстрировано с использованием LRP6 нокаутных мышей и в культуре in vitro хрусталикового эпителия, что каноническая передача сигналов Wnt существенна для развития хрусталиковых волокон (Stump et al. 2003; Lyu & Joo 2004). Авт. предприняли несколько попыток манипулировать с передачей сигналов Wnt в глазах in vivo безуспешно. Была использована система тканевой культуры, разработанная для пигментного эпителия радужки, которая воспроизводила ограниченную дорсальной частью радужки регенерацию хрусталика in vitro (Hayashi etal. 2002). Короче, изолированный эпителий радужки очищали от сопровождающей стромы обработкой Dispase, разделяли дорсальную и вентральную части, помещали в чашку, покрытую type I коллагеновым гелем или Matrigel и культивировали в среде. содержащей FGF2. В таких культуральных условиях эпителиальные кусочки радужки формировали клеточные глыбки и из глыбок клеток дорсальной радужки развивалась хрусталиковая ткань по времени, сходном с тем, затрачивается при регенерации хрусталика in vivo (Hayashi et at. 2006).

Когда ингибиторы Wnt , sFRP1 (Uren etal. 2000), Dkk1 (Zorn 2001) или их комбинации были добавлены в культуральную среду,

Fig. 7. Two early steps of the lens-regenerating process. The first step initiated by the action of FGF2 proceeds over the entire circumference of the iris-pigmented epithelium, involving cell proliferation, thickening of the tissue with some ioss of pigments, and expression of early lens transcription factor genes Pax6, Sox2 and MafB. In normal lens regeneration, the second step involving late lens genes Proxl, Sox1 and p-crystallins proceeds but is confined to the dorsal iris, owing to the dorsai-restricted expression of Wnt2b, as reinforced by the more abundant expression of Wnt receptors in the dorsai sector (Frizzled2 plus Frizzied4) compared with ventral expression of Frizzled2 only. (Adopted from Hayashi eta!. [2006], Determinative role of Wnt signals in dorsal iris-derived lens regeneration in newt eye Mechanisms of Development 123, 793-800, fig. 3.)

то они строго ингибировали развитие ткани хрусталика (Fig. 6A), подтверждая прямое участие передачи сигналов Wnt в регенерации хрусталика из радужки.

Когда растворимая форма Wnt3a (Shibamoto et al., 1998; Takada et al., 2005) добавлялась к культуральной среде, чтобы активировать канонический путь передачи Wnt сигналов, то ткань хрусталика, развивающаяся из дорсальной части эпителия радужки, драматически увеличивалась (2x в диаметре, 8x в объеме) (Fig. 6B). Более того, та же самая обработка Wnt3a вызывала развитие ткани хрусталика из ткани вентральной части радужки в 31% (5/16) случаев. Напротив, Wnt5a активированный неканонический путь не обнаруживал активности генерировать ткань хрусталика из вентральной части радужки. Отмечено также, что когда FGF2 убирался из культуральной среды, то Wnt3a-зависимое развитие хрусталиковой ткани тотально ингибировалось как дорсальной, так и вентральной частью радужки. Этот результат демонстрирует пригодность Wnt белков детерминировать развитие ткани хрусталика из пигментного эпителия радужки при условиях, что процесс первой ступени активируется с помощью FGF2 и клетки достигают состояния pre-lens.

Принимая во внимание ограниченную дорсальной радужкой экспрессию Wnt2b, локальная активация Wnt2b гена после воздействия FGF2 безусловно детерминирует происхождение из дорсальной части радужки регенерации хрусталика. Значительно меньшая реакция ткани вентральной части радужки при культуральных условиях объясняется дифференциальной экспрессией Frizzled2 плюс Frizzled4 в дорсальной части радужки, тогда как в вентральной части радужки экспрессируется только Frizzled2 . Ограниченная дорсальной радужкой экспрессия Frizzled4 может усиливать дорсальное ограничение источника регенерации хрусталика in vivo.

Демонстрация способности продуцировать хрусталик тканью вентральной части радужки является Copernican революцией в понимании регенерации хрусталика из радужки. Ранее считалось, что все процессы, связанные с регенерацией хрусталика происходят только в клетках 'dorsal iris' , которые наделены врожденным потенциалом давать хрусталик. Это в основном вопрос доступности канонических Wnt сигналов.

В длительной истории экспериментальных манипуляций с тканью радужки тритона известны только два сообщения, указывающие на развитие хрусталика из вентральной части радужки. Первый описанный случай, это введение высокой дозы N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine в глазную камеру (Eguchi & Watanabe 1973), и второе после воздействия на изолированный пигментный эпителий различными комбинациями растворимых факторов (Grogg et al. 2005). В обоих случаях показатель был очень низким и, по-видимому, экспериментальные манипуляции в этих исследованиях в действительности активировали экспрессию Wnt или стабилизировали β-catenin способом, воспроизводящим каноническую передачу сигналов Wnt.

Problems solved and to be solved

Действие сигнальных систем и активация генов транскрипционных факторов, участвующих в двух инициальных ступенях регенерации хрусталика в глазах тритонов суммированы на Рис. 7. После удаления хрусталика действие FGF2 инициирует первую ступень реакций во всем пигментированном эпителии радужки, включая клеточную пролиферацию и экспрессию ранних хрусталиковых генов, Pax6, Sox2 и MafB. Затем ограниченное дорсальной частью радужки действие Wnt2b активирует поздние гены транскрипционных фаткоров Prox1 и Sox1 и инициирует развитие хрусталика, характеризующееся экспрессией crystallins. Т.о., демонстрация FGF2-зависимой и Wnt(2b)-зависимой ступеней в процессе регенерации хрусталика выявило основные ранние события регенерации хрусталика в глазах тритона. Др. сигнальные системы широко участвующие в развитии и регенерации хрусталиков (e.g. Tsonis etal. 2004) могут быть следующими.

Two interesting problems remain to be answered:

1. Как экспрессия Wnt2b (и Frizzied4) ограничивается дорсальной частью радужки? Во время эмбрионального развития сетчатки, Wnt2b первоначально активируется в дорсо=-дистальной порции оптического пузырька, которая позднее вносит вклад в ткани, происходящие из дорсального края сетчатки, которые и становятся дорсальной частью радужки (Zakin etal. 1998; Jasoni etal. 1999; Kubo etal. 2003). Следовательно, оперирует та же самая регуляция гена Wnt2b что и в раннем оптическом пузырьке и это может приводить к ограниченной дорсальной частью радужки активации Wnt2b. Эту модель необходимо протестировать, используя технологию трансгенных тритонов (Ueda et al. 2005) путем вычленения регуляторных регионов Wnt2b и идентификации эмбрионального специфического для оптического пузырька энхансера и путем тестирования, может ли энхансер активироваться в процессе регенерации хрусталика у взрослых трансгенных тритонов.

2. Как и когда инициальный стимул FGF2 задается, который затем инициирует процесс регенерации в целом? Авт. полагают, что он действует на дорсальной стороне глаза. Известно. что после удаления хрусталика многочисленные макрофаги появляются, распределяясь преимущественно в дорсальной части радужки, по-видимому, помогая депигментации эпителия перед тем как начнется развитие хрусталика (Eguchi 1963). Предполагается. что некоторые активности, ассоциированные с макрофагами, запускают экзогенный по отношению к радужке источник FGF2, который затем активирует эндогенную для радужки экспрессию Fgf2. Это чисто гипотеза д. быть протестирована, но предварительные наблюдения, что предупреждение образования fibrin fпосле lentectomy ингибирует регенерацию хрусталика (Imokawa etal. 2004) могут объяснить этот контекст; а именно, что fibrin-ингибирующие воздействия нарушают собственно миграцию макрофагов и их действие.

Более того, было бы интересно посмотреть, существует ли аналогичный сценарий в случае регенерации хрусталика из роговицы, которая происходит у лягушачьих головастиков (Mizuno etal. 1999).

Conclusions

There is no mystery behind the regeneration process. The large parts of cellular processes are very similar io those that take place during embryogenesis. By proper experimentation, signaling systems that trigger the tissue-generating protocol can be identified. An important issue of iris-derived lens regeneration in newts, namely dorsal limitation, is now resolved. Why then is the dorsal delimitation required in nature? An answer may be that the newts want only a single lens to develop to renew the damaged lens; development of multiple lenses for regeneration in an eye would obviously be problematic. By determining the site of occurrence of the second step, a newt can regenerate a single, beautiful lens.

Determinative roles of FGF and Wnt signals in iris-derived lens regeneration in newt eye Toshinori Hayashi, Nobuhlko Mizuno and Hisato Kondoh Develop. Growth Differ. (2008) 50/279-287 doi: 10.1111/J.1440-169X.2008.01005.X

Determinative roles of FGF and Wnt signals in iris-derived lens regeneration in newt eye
Toshinori Hayashi, Nobuhlko Mizuno and Hisato Kondoh
Develop. Growth Differ. (2008) 50/279-287 doi: 10.1111/J.1440-169X.2008.01005.X