На поверхности нашего тела эпидермис кожи и его придатки создают защитный барьер, который удерживает микробы и и важные жидкости тела. Он ежедневно противостоит атакам, включая вредную иррадиацию УФЛ солнца и царапинам и ранам. . Он противостоит этим атакам благодаря постоянному самообновлению, чтобы репарировать повреждения ткани и замещать старые клетки. Осуществление этого зависит от стволовых клеток, которы находятся в волсяных фолликулах взрослых, сальных железах и эпидермисе с целью поддержания тканевого гомеостаза, регенерации волос и репарации эпидермиса после повреждений. Где находятся эти своловые клетки взрослых и как они детерминируются во время эмбрионального развития? Как они специфицируют необходимую программу дифференцировки среди др. и как управляются эти клоны? Как стволовые клетки в этой ткани узнают, сколько клеток необходимо пополнить и когда? И, наконец, как клетки кожного эпителия общаются с иммунной системой, чтобы предупредить инфекцию?

Embryonic origins of skin epithelium

После гаструляции поверхность эмбриона выглядит как однослойная нейроэктодерма, которая в конечном итоге специфицирует нервую систему и кожный эпителий. На перекрестках этого решения находится передача сигналов Wnt, которая блокирует способность эктодермы отвечать на fibroblast growth factors (FGFs). В отсутствие передачи сигналов FGF клетки экспрессируют bone morphogenetic proteins (BMPs) и оказываются детерминированными развиваться в эпидермис. Напротив, приобретение нейральной судьбы происходит, если в отсутствие сигнала Wnt, эктодерма способна воспринимать и транслировать активирующие сигналы с помощью FGFs, которые затем ослабляют передачу сигналов BMP посредством ингибирующих сигналов1 (Fig. 1a). Эмбриональный эпидермис, которы возникает в результате этого процесса, состот из одиночного слоя мультипотентных эпителиальных клеток. Он покрывается временно защитным слоем крепко связанных слущивающихся клеток. сходных с энтодермальными, известным как перидерма, которая укрывает эпидермис, пока он не станет стратифицированным и дифференцированным².

Hair formation

Мезенхимные клетки из дермы спины происходят из дермомиотомов, в которых предача сигналов Wnt специфицирует их судьбу³. Т.к. эти мезенхимные клетки занимают кожу, то их взаимодействия с покрывающим эпителием индуцирует образование волосяных плакод, которые выглядят ка небольшие эпидермальные инвагинации в подлежащую дерму. Пионерские исследования с помощью мезенхино-эпителиальных тканевых рекомбинаций у эмббрионов кур и мышей показали, что ранние сигналы от мезенхимы детерминируют положение плакод и специифицируют их предназначение^4,5 (Fig. 1). Ключевые компоненты этих сигналов, способствующих образованию мезенхимных почек, включают FGFs6, 7 и соотв., BMP-ингибирующие факторы^8,9. В присутствии избытка BMPs или отсутствия BMP-ингибитора noggin или FGF10/FGF7 рецептора FGFRIIIb, плотность фолликулов снижается^7,10,11.

В сочетании с этими ранними сигналами эктодермальные Wnt сигналы инструктируют эпидермальные клетки врастать в дерму, чтобы формировать зачаток волоса или плакоду^12-14. Среди ранних генов, экспрессируемых в плакоде, находятся и sonic hedgehog (Shh), который играет ключевую роль в организации дермальных клеток в конденсаты или дермальные сосочки, которые после этого становятся постоянным партнером волосяного фолликула^15-17. Будучи сформированным дермальный сосочек передает сигналы в плакоду, заставляющие её врастать, чтобы сформировать волосяной фолликул, который созревает посредством дополнительных реципрокных мезенхимно-эпителиальных взаимодействий4.

Растут доказательства, помещающие передачу сигналов Wnt во главу формирования плакод. Хотя однослойный эпителий униформно экспрессирует ряд Wnts, включая Wnt10b, плакодные и дермальные конденсаты, по-видимому, отвечают более сильно, исходя из присутствия ядерного beta-catenin, последствия Wnt сигнала^13,14,18,19.Эмбриональные плакоды и дермальные сосочки обнаржуивают также активациюWnt репортерного гена TOPGAL. Он управляет экспрессией beta-galactosidase под контролем энхансера, состоящего из множественных сайтов распознавания для LEF1/TCF семейства ДНК-связывающих белков, которые функионируют одновременно с передачей сигналов Wnt/beta-catenin^13,19,20. LEF1/TCF белки могут действовать как транскрипционные репрессоры, но после ассоциации с beta-catenin действуют как функциональные двухсоставной активатор транскрипции. На базе времени и морфологии активность Wnt в эпителии, по-видимому, предшествует той, что в дермальных конденсатах разивающихся волсяных фолликулов.

Член семейства TCF TCF3 экспресируется рано в эмбриогенезе, когда эпителий кожи существует как одиночный слой неспецифицированных клеток предшественников²¹. Инициация плакод и активность Wnt репортера сопровождаются снижением TCF3 и усилением активности LEF1. LEF1 концентрируется в развивающихся волосяных плакодах и дермальных сосочках. TCF3, по-видимому, поддерживает состояние эпителиальных предшественников: если он поддерживается трансгенно в этих предшественниках, то все три дифференцирующихся клона (эпидермис, волосяной фолликул и сальная железа) репрессируются²¹. Напротив, LEF1 важен для морфогенеза фолликула и если Lef1 подврегается нокауту, то наблюдается уменьшение волосяных фолликулов²².

Мыши, экспрессирующие конституитивно стаблизированную форму beta-catenin в эпидермисе дают избыток волосяных фолликулов^12,23-25. Если beta-catenin условно отключен или если Wntингибитор dickkopf-1 (DKK-1) экспрессируется эктопически, то формирование эпидермальных придатков нарушено26, 27. На базе этих находок передача сигналов Wnt, по-видимому, является интегральной частью раннего эпидермально-дермального общения, которое специфицирует паттерн и морфогенез волос.

В очевидном контрасте с переключением эпидермально/нейральных судеб, активация передачи сигналов Wnt и ингибирование передачи сигналов BMP, по-видимому, находятся на той же самой стороне эпидермис/волосяная плакода переключения. Т.о., beta-catenin/LEF1-чувствительные, TOPGAL-позитивные волосяные плакоды лишены ядерного фосфорилированного (активированного) SMAD1, конечного итога передачи сигналов BMP11. Более того, у мышей, лишенных noggin, эктодермальный LEF1 больше не экспрессируется, а активностьTOPGAL Wnt репортера снижается²⁸. Напротив, экспрессия LEF1 поддерживается в условиях устранения Bmpr1a, который кодирует ключевой BMP рецептор для эпидермиса и для его придатков^29,30. Если ингибирование передачи сигналов BMP способствует накоплению LEF1, то это может объяснить частично, как BMP иибирующий и Wnt-способствующий сигналы сходятся при формировании плакоды.

Hair follicle maturation

После того, как плакода сформирована нижестоящие сигнальные события управляют врастанием и созреванием волосяного фолликула. Мириады изменений имеют место во время морфогенеза фолликулов, напр., возникают различия между профилями транскрипции клеток плакод и их эпидермальных эквивалентов³¹. Очищенные клетки плакод позитивны по TOPGAL и большое количетво генов Wnt пути и Wnt мишеней, составляющих сигнатуру плакод, являются отражением пограмм генной экспрессии, которые появляются как нижестоящие следствия передачи сигналов Wnt.

Одним из ключевых регуляторов ниже Wnt/noggin является SHH. Эмбриональная кожа, дефицитная по SHH всё ещё экспресисрует TOPGAL и LEF1 и обнаруживает формирование плакод^15,16,31. Однако, в отсутствие общее количество плакод уменьшается и они не прогрессируют после стадии волосяного зародыша, хотя небольшое количетство окончательно дифференцированных волосяных клеток всё ещё обнаруживается. Анализ микромассивов развивающихся волосяных плакод дикого типа подтверждает повышенную экспрессию SHH эффекторов, таких как GLI-Kruppel family member 1 (GLI1) и patched homologue 2 (PTC2)³¹. Кроме того, анализ профилей транскрипции выявлет гены, кодирующие возможно SHH-регуляторный circuit с участием транскрипционных факторов FOXC1, TBX1, DACH1, SIX1 и LHX2, чьи члены семейств, как было установлено, обеспечивают развитие глаз³¹. Мутации потери функции, по крайней мере, в дном из этих нижестоящих эффекторов, Lhx2, приводят к редкости фолликул и неспособности поддерживать поведение стволовых клеток фолликулов у мышей. Т.о., функции передачи сигналов SHH, по-видимому, расширяются за пределы только пролиферации и врастания фолликулов.

Курьезно, что за исключением beta-catenin, чья потеря затрагивает формирование всех фолликулов, потеря др. критических индуктивных факторов, таких как SHH, noggin, LEF1 и LHX2, скорее уменьшает, чем устраняет формирование волосяных зародышей и/или фолликулов. Четкое понимание этих различий создается тем фактом, что мыши , дефектные по передаче сигналов ectodysplasin-A receptor (EDAR)/EDA, лишены фолликулов остевых волос, в то время как мыши, лишенные LEF1 имеют остевые волосы, но лишены др. типов волосяных фолликулов^11,32,33. В основе этих отличий, по-видимому, лежат разные пути, в которых ингибирование BMP может быть достигнуто, чтобы позволить трансмиссию фоликулярного Wnt сигнала. Т.о., остевые волосы полагаются на передачу сигналов EDAR/EDA/nuclear factor-kappaB (NF-κB), это ведет к активации BMP ингибитора CTGF (connective tissue growth factor)11; др. типы фолликулов, по-видимому, более зависят от noggin для ингибирования BMP и активации LEF1²².

В то время как различные способы ингибирования BMP затрагивают типы фолликулов, которые специфицируются, активная передача сигналов BMP, по-видимому, влияет на лотность фолликулов после того, как произошла спецификация. Вскоре после формирования плакод, BMP4 уровни увеличиваются, даже по всей эктодерме, а не только в плакодах, которые экспрессируют ядерный phospho-SMAD1 — т.е., распознавание, что клетки отвечают на BMP — происходит в это время³¹. Важность этой молекулярной идиосинкразии, по-видимому, коренится в регуляции с помощью петли обратной связи, что подтверждается тем фактом, что появляющиеся фолликулы всегда возн кают на верхушке hexagon, в центре которого находится фолликул от предыдущей волны морфогенеза фолликулов. Такое расположение помещает фолликул на максимальном расстоянии от др. и , по-видимому, ингибирующий сигнал передается плакодой, чтобы предостеречь её соседей от выдвижения их требований слишком близко. Плакоды экспрессируют также Wnt inhibitory factor 1 (WIF1), указывая тем самым, что негативная петля обратной связи может быть сложной. Дерма также влияет на размеры и плотность фолликулов, а недавние молекулярные различия, найденые в дермальных клетках из разных сторон тела, по-видимому, скорее всего ускорят прогресс в расшифровке этих анатомических различий вэпителиально-мезенхимных взаимодействиях³⁴.

The epidermis

На первый взгляд может показаться, что эпидермис является простым значением по умолчанию на перекрестке сигнальных путей, предназначенных делаь придатки. Однако, важно учитывать, что передача сигналов BMP активна в interfollicular epidermis (IFE), и, как таковая, является наиболее способствующим эпидермису сигналом, т.к. это сигнал, ингибирующий фолликул^11,29,30 (Fig. 1). Кроме того, исследования на эмбрионах кур показали. что передача сигналов через epidermal growth factor receptor (EGFR) происхродит в клетках эпидермиса на границе каждой плакоды пера. Более того, повышение EGF способствует пролиферации и экспансии эпидермальных клеток между зачатками (interbud) , где ингибирование передачи сигналов EGFR приводит к увеличению приобретения судеб зачатков пера35. Играет ли передача сигналов EGFR сходную роль в ингибировании формирования волосяных фолликулов менее ясно, хотя усиление передачи сигналов EGFR в эпителии кожи млекопитающих ассоциирует с усиленной эпидермальной пролиферацией и потерей волосs36. Т.о., плотность фолликулов, по-видимому, управляется за счет конкуренции между placode-стимулирующими (ограничивающими эпидермис) и placode-ограничивающим (стимулирующими эпидермис) сигналами.

Hair follicle maturation and lineage differentiation

Т.к. эмбриональный волосяной фолликул врастает, то это ведет к тому, что фронт (матрикс) оказывается высоко пролиферативным и посредством его длительного контакта с дермальным сосочком, адоптирует программу генной экспрессии, которая отлична от таковой для корня. Outer root sheath (ORS) сохраняет контакт с базальной мембраной, в то время как внутренние слои начинают дифференцироваться, чтобы сформировать inner root sheath (IRS), который д. слуить в качестве канала для роста волоса (Fig. 2a). Приблизитетно на ст. эмбриогенеза (E) 18.5 у мышей появляются самые ранние признаки клеток центрального стержня ости волоса, что совпадает с появлением клеток предшественников сальных желез в верхней части волосяного фолликула. Созревание продолжается еще 7–8 дней, пока сопровождающий слой разделяет ORS и IRS, и пока IRS и ость волоса каждый развиваются в три концентрических слоя слоя клеток (Fig. 2a). Различают самостоятельные стадии развития волосяного фолликула по морфологическим и биохимическим различиям, описанных в др. работе³⁷.

Внутри каждого зрелого волосяного фолликула имеется 7 концентрических колец окончательно дифференцировнаных клеток, происходящих из матричных клеток. Каждое кольцо имеет характерную ультрастуктуру (Fig. 2b). Тщательное исследование волосяной луковицы проливает свет на то, как эти кольца могут формироваться и какие движущие силы могут управлять их дифференцировкой. На высоте фазы роста (full anagen) фолликула дермальный сосочек существует в виде тонкой нити клеток, отделенной от волосяной луковицы базальной мембраной. Некоторые митотические клетки матрикса, чтобы сориентировать плоскости своих веретен под углом относительно базальной мембраны, указывают на то, что могут генерироваться самостоятельные клоны дифференцировки по способу сходному с крайней плотью (onion-skin-like). Эксперименты по отслеживанию клонов предостаии подтверждение в пользу этой модели^17,38,39, которая сходна с той, что постулирована для эпидермиса⁴⁰ (см. ниже).

Hair follicle lineages

В резльтате многолених исследований открыты молекулярные различия, характерные для клонов в волосяном фолликуле. Наиболее характеными структурными белками этих клонов являются кератины (Fig. 2a), которые дифференциально экспрессируются в виде специфических паттернов, которые характерны для большинства, если не для всех, концентрических слоев внутри волосяного фолликула⁴¹. Успехи в понимании того, как эти гены кератинов дифференциально регулируются, привели к открытию, что в стержне волоса гены Ha/Hb keratin являются подлинными генами мишенями для Wnt и что передача сигналов Wnt играет критическую роль в дифференцировке матричных клеток в клонах стрежня волос19. Постоянно активный β-catenin eу юдей и мышей ведет к pilomatricomas — волосяным опухолям, состоящим исключительно из волосяного клона^12,42. Следующими по важности регуляторными белками транскрипции в стрежне волоса являются HOXC13 и FOXN1, оба вызывают в мутантном сотоянии дефекты волос^43,44.

Напротив, мутации в генах, кодирующих GATA-вязывающий фактор (Gata-3) и CCAAT displacement protein (Cdp) вызывают прежде всего дефекты IRS, которые ведут к изменениям в стержне^45,46 (Fig. 2a). GATA-3 и CDP оба способны рекрутировать гистоновую deacetylases (HDACs) и транскрипционно репрессировать её гены мишени. На основании исследований в др. тканях, гены канидаты на CDP-обусловленную репрессию в IRS включают c-myc, N-cam и p21. GATA-3 репрессирует свою собственную экспрессию в IRS, но др. её мишени пока неизветсны. Транскрипционный репрессор BLIMP1 также концентрируется в дифференцирующихс клетках IRS и подобно CDP, одним из генов мишеней для BLIMP's явлется c-myc47-49. Если BLIMP1 ассоциирует с histone arginine methyl transferase, как это имеет место в зародышевых клетках^47,48, то он д. добавлять эпигенетическую метку к хроматину, им репрессируему в коже. Итак, эти наблюдения указывают на то. что эпигенетическое ремоделирование хроматина может играть критическую роль в образовании клона IRS lineage.

Хотя на первый взгляд может показаться, что дифференцировка IRS управляется за счет репрессии и облегчения репрессии, но участвуют также и позитивно действующие сигнальные пути. Одним из них является Notch, трансмембранный рецептор который, если активиован с помощьюсвоего лиганда, может быть расщеплен с помощьюγ-secretase xчтоы генерировать nuclear intracellular cofactor (NICD) для транскрипционного репрессорного белка RBP-J50. Хотя передача сигналов Notch не нужна для спецификации фолликулов, однако клетки IRS фолликула, лишенные γ-secretase, неспособны поддерживать свои судьбы вследствие того, что ORS клетки аномально активируют эпидермальную дифференцировку, и дифференцировка волос нарушается и фолликулы превращаются в эпидермальные кисты^51,52.

Передаыа сигналов через BMP рецептор также участвует и существенна для диффернецировки IRS и стержна волоса. В отсутствие BMPR1A накапливаются массы недифференцированных, высоко пролиферативных клеток, подобных матричным, которые быстро превращаются в опухоли⁵³. Тот факт, что эпидермальные кисты возникают из-за дефектов в передаче сигналов Notch в то время как матрикс-подобные кисты из-за дефектов в предаче сигналов BMP, подчеркивает характерные разичия в способах действия этих путей, влияющих на клоны волосяного фолликула. Анализ лежащих в основе участвующих механизмов и мириадов факторов, которые влияют на спецификацию судеб и дифференцировку матричных клеток фолликулов, является оновной задачей будущего в этой области.

The hair cycle

Волосяной фолликул является одним из немногих органов тела. который подвергается циклическим раундам дегенерации и регенерации в течение жизни (Fig. 3). Матричные клетки, иногда обозначаемые как временно амплифицирующиеся клетки, т.к. они они живут в течение одного цикла фазы роста (anagen). После первых двух недель постнатальной жизни мышей, инициальные запасы матричных клеток снижаются, дифференцировка стежня волос и IRS замедляется и фолликул вступает в деструктивную фазу. известную как catagen54. Во время этой фазы, которая у мышей длится 3-4 дня апоптоз редуцирует фолликул до эпителиального тяжа.. Он тянет дермальный сосочек вверх к покоящейся непосредственно ниже перманентной неделящейся верхней части фолликула.

Идентифицирован ряд молекулярных регуляторов перехода anagen–catagen , хотя как они работают вместе, чтобы способтвовать catagen или завершать anagen и как они экономят клетки предшественницы, необходимые для повторного вступления в anagen пока неясно. Недавно было установлено, что keratin 17 является регулятором этого процесса, по-видимому, чтобы регулировать anagen путем взаимодействия с и секвестрации death adaptor белка, необходимого для tumour-necrosis factor receptor 1 (TNFR1)-зависимой передачи сигналов и индукции апоптоза, чтобы инициировать процесс catagen⁵⁵. Кроме того, генетические доказательства выявляют транскрипционный комплекс, использующий vitamin D-retinoid X receptor-α транскрипционный фактор и взаимодействующий репрессорный белок, hairless. Будучи дефектным этот комплекс вызывает связанные с catagen дефекты в эпителиальном тяже, что оставляет дермальный сосочек на месте и блокируется рост нового волоса⁵⁶. Hairless, который экспрессируется в ORS и межклеточном веществе (matrix), является транскрипионным репресором, который обладает сходными последоваельностями с lysine histone demethylase, энзимом, который удаляет позитивныую эпигенетическую метку с хроматина57.После ст. catagen, фолликул бездействует, находясь в фазе отдыха (telogen). У большинства мышей, первая ст.телогена короткая, длится всего 1-2 дня приблизительно в постнатальный период (P)19 - P21 посредине спины. Вторая ст. telogen, , однако, длится более 2 недель и начинается при мерно на P42 (ref. 37).

Hair follicle stem cells

В начале ст.anagen, делящаяся часть фолликула регенерирует и подвергается новому раунду роста волоса. Этот процесс неизбежно указывает на существование резервуара стволовых клеток, которые располагаются в наиболее низкой перманентной порции фолликула. Новый рост вниз происходит по соседству с существующей луковицей волоса, который в конечном итоге д. выпасть. Этот рост добавляет слой к резервуару стволовых клеток и вызывает образованиие выпячивания ('bulge'), предоставяя тем самым этой области её имя ^58-61 (Fig. 4). Клетки такого выпячивания делятся менее часто, чем др. эпителиальные клетки кожи, но они активируются на ст. anagen, чтобы генерировать новый волосяной фолликул58. Этот процесс активации bulge-клеток подобен тому, что происходит во время морфогенеза эмбрионального волосяного фолликула. Несмотря на многие параллели имеются и отличия и взаимотношения между эмбриональным зачатком волоса и взрослым bulge и зародышем волоса всё ещё нераскрыты.

Чтобы понять специальные свойства, характерные для bulge стволовых клеток, исследователи обратились к выяснению профилей микромассивов, это привело к идентификации около 150 генов, которые преимущественно экспрессируются в bulge по сравнению с пролиферирующими базальными клетками эпидермиса^61-63. Большинство из этих генов — напр., те, что принадлежат к путям BMP и transforming growth factor-β — скорее всего отражают специальную пассивную природу покоящихся bulge клеток, которые, в свою очередь, обнаруживают ядерную локализацию phospho-SMAD1 и phospho-SMAD2, соотв.^11,62. Кроме того, хотя bulge клетки являются чувствительными к Wnt, что следует из их экспрессии TCF3, TCF4 и некоторых Wnt рецепторных белков (FZDs), они экспресисруют также белки, обычно ассоциированные с ингибированием Wnt ^21,62. В этой связи, TCF3 может функционировать как репрессор, когда β-catenin отстствует или слабо экспрессируется ^19,21. Это может объяснить, как bulge клетки поддерживают недифференцированное состояние и почему стабилизация β-catenin и ингибирование BMP необходимы, чтобы активировать морфогенез волосяного фолликула^12,23-25. Некоторые из этих принаков недавно были отмечены и у bulge стволовых клеток человека, что важно для их будущего клинического использования⁶⁴. Эти параллели интерсны, т.к. эпидермальные стволовые клетки кожи человека скорее всего играют основную роль в гомеостазе - т.е., для поддержания плотного эпидермального барьера кожной поверхности - в то время как у мышей более важно поддержание защитного волосяного покрова.

Некоторые др. стимулы функционируют на или слега иерархически ниже активации стволовых клеток фолликула. Одним из таких соединений является minoxidil. Более известен как Rogaine, minoxidil впервые был идентифицирован как сосудорасширяющий фактор и среди клеточных реакций, которые были приписаны ему, находится синтез prostaglandin⁵⁴. Cyclosporin A является ещё одним стимулом роста волос, который по-видимому, способствует anagen или ингибирует catagen^41,54,56. Учитывая. что стабилизация β-catenin nтаке способствует anagen, интересно обсудить, какие фармакологические мишени для minoxidil и cyclosporin A могут стоять ниже стабилизации β -catenin. В этом отношении необходимо отметить, что передача сигналов Wnt является только одним из нескольких путей, которые ведут к стабилизации β -catenin, а активность 'Wnt reporter' отражает по большей части активацию β -catenin/LEF/TCF-регулируемых генов.

Ряд вопросов остается. Хотя эксперрименты по трансплантации и отслеживанию клонов показали. что некоторые bulge клетки являются стволовыми клетками^61,63,65, всё ещё неизвестно, является ли эта ситуация характерной для большинства bulge улетокю Вр время перехода к anagen большинство bulge клеток остаются молчащими и только рнебольшое количество располагающихся в основании этого сегмента, по-видимому, активируется62. Более того, в цикле усов у грызунов дермальный сосочек никогда не достигает пределов bulge прежде, чем стартует новый anagen.Было предположено, что стволовые клетки из bulge мигрируют вдоль ORS в основание фолликула, где они активируются60. Происходит ли этово всех волосяных фолликулах, неизвестно.

Несмотря на множество вопросов, может помочь рассмотрение данных с точки зрения концептуальной модели, ка может достигаться активаия стволовых клеток в цикле волос. После активации стволовых клеток β-catenin/LEF1/TCF оказывается активированным в раннем зародыше волоса и сохраняется в основании фолликла в течение всей фазы anagen. Ассоциаия с дермальным сосочком, по-видимому, является критической для накопления достаточного уровня 'activating factor' чтобы запустить пролиферацию и/или детерминацию клонов этих клеток. Если дермальный сосочек перемещается прочь от bulge, то эпидермальные стволовые клетки остаются молчащими. Клетки в основании фолликула, которые получают длительную стимуляцию со стороны дермального сосочка становятся высоко пролиферативными.Благодаря локальным различиям в своей микросреде они прогрессируют к точке, от которой нет возврата, выполняя терминальные клональные программы, чтобы продуцировать волос и IRS. Таким образом уровни передачи сигналов β-catenin/TCF/LEF предопределяют конечный результат стволовых клеток и их клонов.

Follicle stem-cell maintenance

После того как стволовые клетки фолликула использованы, ваканции в нишах д.быть восполнены. Этот процесс, по-видимому, связан самообновлением, хотя поддержание втволовых клеток всё ещё плохо изучено. Балансирующая экспрессия c-myc , по-видимому, является критической, т.к. у трансгенных мышей избыточная экспрессия заставляет стволовые клетки фолликуле пролиферировать и терминально дифференцироваться и напротив, условное устранение c-myc приводит к алопеции благодаря длительной неспособности поддерживать стволовые клетки фолликула^66-68. LHX2 также, по-видимому, действует для поддержания стволовых клеток фолликула, что подтверждается тем фактом, что LHX2-дефицитные bulge стволовые клетки неспособны сохранять метку и более быстро используют стволовые клетки, чем их аналоги дикого типа²⁷. Т.о., в то время как LHX2 , по-видимому, действует как молекулярный тормоз в регуляции переключения между поддержанием и активацией стволовых клеток фолликула, c-Myc действует как ускоритель.

Идентифицировано несколько др. факторов в качестве кандидатов для поддержания стволовых клеток фолликула, включая telomerase, cell-division cycle 42 (Cdc42) и Rac1 (reviewed in ref. 36). Предполагается, что Rac1 может помогать поддерживать стволовые клетки путем негативной регулировки c-Myc и путем усиления уровней integrin⁶⁹, тогда как Cdc42 может контролировать дифференцировку предшественников за счет стабилизации β-catenin⁷⁰.

Sebaceous gland development

Сальные железы являются придатками волосяных фолликулов, расположены выше bulge и мышцы arrector pili и непосредственно ниже отверстия для стержня волоса на поверхности кожи. Клетки предшественники сальной железы возникают ближе к завершению эмбриогенеза, но железы не созревают вплоть до рождения. Основная роль желез генерировать терминально дифференцированные sebocytes, которые продуцируют липиды и кожное сало. Когда sebocytes дизинтегрируются, то они высвобождают свои масла в канал волоса для смазки и защиты против бактериальной инфекции. Гомеостаз сальных желез неизбежно влечет за собой существование популяции клеток предшественников, которые дают непрерывный приток пролиферирущих, дифференцирующихся и наконец, умерших клеток, которые теряются через канал волоса.

Базальная мембрана, которая демаркирует мезенхимно-эпителиальную границу окружает также железу. Неудивительно, что сальная железа, которая прикреплена к внутренней поверхности этой мембраны, обладает многими общими свойствами эпидермальных кератиноцитов, включая пролиферативную способность и экспрессию c-myc. Избыточная экспрессия c-myc индуцирует гиперплазию сальных желез за счет дифференцировки волосяного фолликула, что подтверждает специальную роль этого транскрипционного фактора в железе^71,72. Дифференцировка себоцитов использует адипогенный транскрипционный фактор peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ ). PPAR-γ -нулевые мыши незизнеспособны, но PPAR-γ -нулевые эмбриональные стволовые клетки, как было установлено, вносят скудный вклад в сальные железы химерных мышей⁴⁷. Кроме того, альтерации Wnt, hedgehog и Notchсигнальных белков и их эффекторов ведут к пертурбациям развития сальных желез, хотя пока неясно, как эти факторы влияют на образование клона сальных желез.

До недавнего времени мало было известно о том. как сальные железы формируются и как они способны поддерживать динамический баланс роста и терминальной дифференцировки. Стволовые клетки участвуют в процессе гомеостаза сальных желез и поддерживают популяцию резидентных клеток предшественников, что подтверждается картированием судеб с помощью мечения ретровирусами эпителиальных клеток in vivo⁷³. BLIMP1 недавно был идентифицирован как маркер, а генетическое изучение клонов выявило способность BLIMP1-позитивных клеток генерировать сальные железы⁴⁷. В культуре, BLIMP1-позитивные клетки дают колонии себоцитов и подвергаются самообновлению. Результаты потери функции и молекулярные исследования показали, что BLIMP1 действует путем репрессии c-myc, так что как только предшественники себацитов выключают BLIMP1 они становятся пролиферативными и инициируют дифференцировку себоцитов⁴⁷.

Когда Blimp1 мутанте или когда кожа повреждена, гомеостаз сальных желез нарушен. Интересно, что в этих условиях bulge клетки могут быть мобилизованы для поддержания сальных желез. Такие взаимоотношения предшественник-продукт были задокументированы с помощью экспериментов по пересадке изолированных bulge стволовых клеток^61,63,65 и с помощью анализа рудиментарных фолликулярных структур или у hairless мутантных мышей⁷⁴ или Blimp1 условно нулевых мышей⁴⁷.

Epidermal development

В конце эмбрионального развития interfollicular epidermis (IFE) достигает зрелости. Эпидермис состоит из слоёв, наиболее наружным из которых является поверхность кожи. После рождения его роль является защитной против инфекции, для предупреждения обезвоживания и для реэпителизации после раневых повреждений. Чтобы обеспечить эти свойства эпидермис постоянно восполняет сам себя с помощьюпроцесса гомеостаза. Во время этого процесса делящиеся клетки в наиболее внутреннем (базальном) слое (basal) постоянно выполняют программу терминальной дифференцировки, перемещаясь кнаружи и слющиваются с поверхности кожи.

Будучи продверженным физической травме или химичесекому нападению эпидермис может защищать себя, путем продукции огромных количеств цитоплазматичеких гетерополимеров, известных как промежуточные филаменты, которые состоят из кератиновых белков. Как только клетка выходит из базального слоя и начинает своё путешествие в направлении кожной поверхности , они переключают экспрессии кератинов с K14 и K5 на K1 и K10 (ref. 75). Это переключение было открытоболее 25 лет тому назад и остается наиболее надежным указанием на то, что эпидермальная клетка детерминирована к терминальной дифференцировке. Первые супрабазальные клетки, известные как spinous клетки, характеризуются цитоскелетом из K1/K10 пучков филамент, соединенных с мощными межклеточными соединениями, известными как десмосомы. Эти соединения создают слипчивую, интегрированную механически сеть поперек и внутри эпидермальных слоев. K6, K16 и K17 также экспрессируются супрабазально, но только в ситуациях гиперпролиферации, таких как заживление ран. Эта кератиновая сеть не только ремоделирует цитоскелет для миграции, но и также регулирует рост клеток путем связывания с адапторным белком 14-3-3σ и стимулирования передачи сигналов Akt/mTOR (мишень для rapamycin у млекопитающих)
76,77.

Когда spinous клетки прогрессируют в гранулярный слой, они продуцируют электон-плотные keratohyalin гранулы, упакованные с белком profilaggrin, который, если подвергается процессингу, то связывает кератиновые промежуточные филаменты и даже более того генерирует крупные макрофибриллярные кабели. Кроме того, белки ороговевающей оболочки, которые богаты glutamine и lysine остатками, синтезируются и откладываются под плазматической мембраной гранулярных клеток. Когда клетки оказываются пронизаны кальцием, они активируют transglutaminase, генерирующую γ-glutamyl ε-lysine gпопречные связи, чтобы создавать устойчивый к разрушению мешок, чтобы удерживать кератиновые микофибриллы. Финальными ступенями терминальной дифференцировки являются деструкция клеточных органелл, включая ядро и изгнание липидных бислоев, упаковка в lamellar гранулы, это создает каркас ороговевающей оболочки. Клетки мертвого stratum corneum создают непроницаемый слой, который постоянно восполняется по мере того как клетки внутренних слоев движутся кнаружи и слющивается с поверхности кожи.

Controlling basal cell behaviour

Рост и пролиферация эпидермиса д. быть тщательно сбалансированы, т.к. слишком низкая пролиферация будет приводить к истончению кожи и потере защиты, а слишком высокая характеризуется гиперпролиферативными нарушениями, включая псориаз (see page 866) и раки. Во время нормального гомеостаза эпидермис д. быть способен ощущать и замещать вакансии базального слоя и если происходят ранения, то клетки д. мигрировать и пролиферировать, но также воспринимать стгнал stop после закрытия раны. Наконец, эпидермис д. иметь систему SOS, чтобы рекрутировать иммунные клетки для борьбы с инфекцией и с целью репарации ран. Как эпидермис осущест вляет всё это?

Пролиферация базальных клеток, расположенных на подлежащей базальной мембране,котрая богата белками внеклеточного матрикса (ECM) и факторами роста. Базальные клетки прикреплены к этой структуре посредством двух типов клетоных адгезивных комплексов, состоящих из integrins. Полудесмосомы содержат трансмембранные стержневые α 6β 4 integrins, которые соединtys внутриклеточно с сетью кератиновых промежуточных филамент и создают механическую силу.. Фокальные адгезии содержат α 3β 1 integrins, rкоторые оединяются с актином и сетью микротрубочек. Оба типа соединений пристают внеклеточно к laminin 5, основному ECM лиганду для эпидермальной базальной мембраны. α β 1 integrins, по-видимому, особенно важны для сборки и организации этой мембраны^78,79.

Интегрины также участвуют в контроле роста и миграции. Хотя эти регулирующие рост петли обратной связи (circuitries) многочисленны и сложны, они участвуют в физических взаимодействиях с регуляторными киназами. Чтобы сделать возможной миграцию в ответ на ранение, соединения между клетками и субстратом д. динамически оборачиваться. Интегрины отличаются по их относительной роли в репарации ран: в то время как клетки, лишенные α β1 integrins меньше способны к миграции, клетки, лиленные α 6β 4 integrins обнаруживают повышенное миграционное поведение^79-81. Позитивная роль β1 integrin в миграции, по-видимому, частично является результатом его способности непосредственно связываться и контролировать активность focal adhesion kinase (FAK). Это не рецепторная тирозин киназа, которая, в свою очередь, деййствует как мастер переключения в негативно регулируемом натяжении (tension), возникающем за счет тщательно разработанной актомиозиновой сети, ассоциировнной с фокальными адгезиями ^80,81.

Чтобы функционировать как ткань, базальные клетки д. также слипаться др. с др. Они делают это не только посредством десмосом, но и также посредством слипчивых соединений (Fig. 5). Слипчивые соединения состоят из трансмембранного стержня в виде E-cadherin, который связан с двумя родственными белками, β-catenin и p120-catenin82. В то время как десмосомы и полудесмосомы формируют интегральную сеть с промежуточными филаментами, слипчивые соединения и фокальные адгезии управляют actin–myosin динамикой посредством клеток ткани. Адгезивные соединения действуют путем ассоциации с рядом белков, регулирующих актин, сюда входят и взаимодействия p120-catenin's с Rho-GTPase белками и β-catenin's ассоциация сα-catenin, неродственным белком, который может связывать vasodilator-стимулированный фосфопротеин (известен также как ENA), formins, ajuba и α-actinin белки⁸². Как в точности слипчивые соединения и фокальные адгезии регулируют actin–myosin сеть, чтобы координировать адгезию и миграцию не совсем ясно, но обычно всякий раз, когда межклеточные соединения усиливаются динамика интегрина снижается. Эта обратная регуляция скорее всего существенна во время репарации ран, при которой эпидермальные выросты д. происходить поляризованным и управляемым способом.

Недавно исследователи начали понимать, что клеточные соединения действуют как сигнальные центры и обладают функциями, которые выходят за пределы их классических ролей в клеточной адгезии и динамике цитоскелета. Уже давно известен пример β-catenin, который теперь хорошо известен благодаря своей двойственной роли в адгезии и транскрипции. p120-Catenin также участвует не только в регуляции Rho GTPases и сборке слипчивых соединений, но и также как транскрипционный кофактор83. Кроме того, посредством механизма, который понятен не до конца, но, по-видимому, использует малые Rho GTPases, p120-catenin и α-catenin могут влиять на транскрипционный статус NF-κB, который в свою очередь управляет продукцией и секрецией цитокинов и хемокинов и рекрутированием иммунных клеток 84, 85. Устранение JunB, нижестоящего ингибитора передачи сигналов EGF, также запускает экспрессию chemokine/cytokine86.

Когда происходит длительная активация NF-κB — напр., при дисфункции p120-catenin, α-cateninи/или JunB — то передача сигналов от эпидермиса к иммунным клеткам искажается. Это запускает молекулярное соперничество между эпидермисом, который выбрасывает cytokines и chemokines, и рекрутируемыми иммунными клетками, которые отвечают сходным образом и посылают пролиферативные сигналы эпидермису. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить контроль этих нормальных путей для репарации эпидермиса в ответ на повреждения, стрессы и инфекцию и чтобы выяснить степень, с которой эти разные пути пересекаются при рекрутировании иммунных клеток в кожу. Регуляция с помощью NF-κB особенно важна, т.к. она также обеспечивает TNFR1-зависимое гиперпролиферативное влияние на здоровый эпидермис⁸⁷.

Следствием потери α-catenin являются особенно тяжелыми и эпидермис прогрессирует к состоянию, напоминающему инвазивные плоскоклетоные карциномы²⁹. Хотя механизмы еще полностью неизвестны, они скорее всего используют позитивную регуляцию активности интегринов и тирозин киназ^85,88,89. Возникающая картина слипчивых соединений такова, как будто они служат молекулярными сенсорами для 'crowd control' и репарации ран.Согласно этой модели, когда плотность базальных клеток низка или когда эпидермис разъединен как в ране, то уменшение слипчивых соединений запускает миграцию клеток и пролиферацию и рекрутируются иммунные клетки, чтобы защитить от возможной инфекции. По достижению соотв. плотности клеток и образование слипчивых соединений становится опитимальным, и система возвращается к норме (Fig. 5). Если же эта схема (circuitry) дефектна — напр., когда α-catenin bkb p120 venfynys — то система становится несбалансированной и может возникнуть хроническое воспаление и гиперпролиферативные наруления, включая и рак.

Maintaining and controlling the epidermis

Межфолликулярный эпителий кожи организован в столбы гексогонально упакованных клеток. Такая организация была выявлена с помощью генетического отслеживания клонов или инфицированных ретровирусом, β-galactosidase-экспрессирующие культивируемые кератиноциты трансплантируются иммунодефицитным мышам или путем непосредственного инфицирования содранной кожи с помощью β-galactosidase-экспрессирующего вируса^73,90,91. Первоначально самостоятельные нагромождения β-galactose-позитивных клеток расширяются со временем примерно на 10 соседних стопок (stacks) , это указывает на то, что epidermal proliferative units (EPUs) могут состоять из одной базальной стволовой клетки, которая случаййно делится латерально, чтобы продуцировать клетки с сильно преходящей пролиферативной способностью^92,93. Независимо от относительной пролиферативной способности индивидуальных базальных клеток, их способность стимулировать постоянный приток терминально дифференцированных клеток помещает эпидермис в устойчивое состояние динамического равновесия. У людей эпидермис замещает сам себя каждые 4 недели в течение всей жизни.

Способность эпидермальных доменов сохраняться индивидуально может быть объяснена двумя разными механизмами, которые не обязательно взаимо исключающие (Fig. 6). In vitro исследования подтвердили модель расслаивания , благодаря чему эпидермальные клетки с наивысшими уровнями integrin также имеют наивысший пролиферативный и attachment потенциал, в то время как клетки с низкими уровнями интегрина отсоединяются и терминально дифференцируются². Исследования развития эмбриональной кожи у мышей показали, что одновременно со стратификацией, базальные клетки также могут ориентировать споси полюса веретен асимметрично относительно базальной мембраны^40,94. Такие деления, по-видимому, асимметричны, ведут к образованию одной пролиферативной базальной дочерней и одной отсоединяющейся, супрабазальной дочерней клентки. Постнатально клеточные деления в черной коже заметно редуцируются, но в др. областях или в др. тканях взрослых, в которые эпителий более толстый, выдны асимметрично ориентированные веретена.

Интересно, что митотические базальные эпидермальные клетки с перпендикулярно расположенными веретенами, по-видимому, используют некоторые из одних и тех же белков, участвуюющих в родоначальных механизмах асимметричного расщепления клеточного содержимого и наделения разными судьбами двух дочерних клеток у Drosophila neuroblasts40. Можно предположить, что прикрепленная базальная дочерняя клетки может преимущественно получать интегрины, рецепторы ростовых факторов и др. ключевые способствующие росту machinery из основания клетки. В качестве дополнительного фактора участвует базальный транскрипционный фактор p63, который не только способствует пролиферации в эпидермисе, но и также, по-видимому, необходим для стратификации эпидермиса^95,96. В отсутствие p63, базальные клетки, по-видимому, делятся лишь симметрично⁴⁰.

В нейробластах мух кухня асимметричного деления преимущественно базируется на передаче сигналов Notch.Хотя пока неясно, используется ли это свойство эпидермисом, кажется интересным, что клетки супрабазального эпидермиса используют NICD, транскрипционный эффектор передачи сигналов Notch, чтобы регулировать свою дифференцировку^51,52. Дополнительные транскрипционные регуляторы эпидермальной дифференцировки включают p21, AP2, C/EBP (CCAAT/enhancer binding protein), Kruppel-подобный фактор и PPAR белки⁴⁴. Др. важным фактором стратификации и дифференцировки эпидермиса является IKK-α (inhibitor of NF-κB kinase-α), который осуществляет сове действие на эпидермис NF-κB-независимым способом⁹⁷. С помощью ещё не установленного механизма устанавливается полярность с помощью базальной мембраны, клеточный субстрат и межклеточныесоединения генерируют архитектуру эпидермиса, которая в свою очерелдь, управляет транскрипционным балансом между пролиферацией и дифференцирровкой.

The future of skin stem cells in regenerative medicine.

Благодаря пониманию основ биологии, мы сегодня знаем, что кожа является богатым источником уже доступных стволовых клеток. Хотя основная причина стволовых клеток в bulgeзаключается в поддержании гомеостаза волосяных фолликулов во время циклов, bulge клетки могут быть мобилизованы для восполнения клеток из сальных желез и эпидермиса, если необходимо^{17,47,59,61,63,65,91}. Могут ли резидентные клетки предшественники в базальном слое эпидермиса , сальных железах и фолликулярном матриксе выбирать альтернативные клоны, если это необходимо, пока неизвестно. Хотя в нормальной коже молекулярные ступени в этих клонах становятся все больше и больше опреденными как во времени, так и пространстве, но их потенциал для изменения выбора своих клонов при воздействии новых микроусловий, напр., при ранении, трансплантации или болезнях у людей, пока не очень ясен.

Уровень пластичности, предоставляемый этим клеткам, становится всё более важным в качестве потенциала стволовых клеток в регенеративной медицине. Биологи развития уже давно убеждены, что эмбриональные эпителиальные клетки являются чувствительными к мезенхиме, которая на них воздействует. Когда происходит конфронтация с мезенхимой их крыла цыпленка с эпидермисом из ног, то продуцируются перья и сходным образом мезенхима ног может заставлять эпидермис крыльев продуцировать чешуйки. Эти специфические признаки, по-видимому, теряются у большинства клеток по мере развития, но сохраняются у мультипотентных стволовых клеток кожи. сохраняющих потенциал. Если bulge стволовые клетки подвергнуть воздействию мезенхимы роговицы, то продукции волосяных фолликулов это не поможет, но они будут продуцировать роговицу, которая может быть использована для для лечения определенных типов слепоты. Др. возможное использование bulge стволовых клеток может быть связано с лечением хронических язв или нарушений волос. Потенциал культивируемых базальных эпидермальных кератиноцитов уже используется для лечения ожоговых пациентов98 (see page 874).

На основании исследований гематопоэтических стволовых клеток кажутся многообещающими slim для генерации неэпителиальных тканей. так, результаты последних исследований указывают на то, что ядра bulge клетокот взрослых мышей могут быть перепрограммированы, если помещаются в энуелеировнный неоплодотворенный ооцит и клонируются мыши, способные получиться с помощью такой технологии⁹⁹. Если сегодня этические и технические ограничения могут быть преодолены, что позволит клонировать гибридные эмбриональные стволовые клетки людей из ооцитов и ядер взрослой кожи, то станет возможным использование их потенциала для более широкого использования в регенеративной медицине в будущем.наконец , в заключение доступность кожи как потенциального источника стволовых клеток не осталась незамеченной широкими кругами исследователей. Учитвывя, что имеется много др. типов клеток в коже, недавняя идентификация melanoblast стволовых клеток, мезенхимных стволовых клеток и нервно-подобных стволовых клеток , по-видимому, является только кончиком айсберга, пригодного для будущего использования.