После повреждения д быть активированы различные внутриклеточные и межклеточные пути и скоординированы, если целостность и гомеостаз ткани нарушены. Клеточные компоненты иммунной системы, каскад коагуляции крови и воспалительные пути д. быть активированы.Многие типы клеток - включая иммунные клетки (neutrophils, monocytes, lymphocytes and dendritic cells), эндотелиальные клетки, кератиноциты и фибробласты - подвергаются заметным изменениям генной экспрессии и фенотипически, что ведет к клеточной пролиферации, дифференцировке и миграции^1,2. Если эта реакция успешна и повреждение не вызывает гибели организма, то эти процессы д. прекращать работу в точной последовательности в последующие дни по мере хода восстановления.

Учитывая сложность процессов репарации ран, удивительно, что они редко оказываются неконтролируемыми и что злокачественные новообразования являются редкими событиями в раневой среде^3,4. Для большинства повреждений результаты заживления приводят к тому, что в ткани становится участок из клеток (в основном фибробластов) и дезорганизованного внеклеточного матрикса (в основном коллагена), который обычно обозначают как рубец. Неожиданно у некоторых эукариотических организмов реакция на повреждение м. полностью воспроизводить оригинальную архитектуру ткани, благодаря плохо изученному процессу регенерации. Люди обладают такой способностью во время пренатального развития, но теряют её во взрослой жизни⁵. Как происходит регенерация и почему люди теряют эту способность остается загадкой⁶.

Clinical burden of fibrosis

В целом процесс репарации происходит почти во всех тканях после воздействия повреждающих стимулов. Т.о., последовательность событий, которые происходят при инфаркте миокарда(heart attack), напр., удивительно сходны с тем. что происходит при повреждении спинного мозга, ожогах или огнестрельных ранах, несмотря на разные типы инсульта и различие повреждаемых органов. Сходным образом образование рубца, которое происходит во время заживления ран, ведет к сходной дисфункции ткани, независимо от места.

В случае инфаркта миокарда образование ткани миокардиального рубца приводит к застойной сердечной недостаточности (состояние, при котором сердце не может снабжать ткани тела достаточным количеством крови) и/или аномальным ритмам сердца (аритмиям) (see page 322), которые совместно объясняют почти 100,000 смертей каждый год только в США⁷. Кроме того, цирроз печени и некоторые формы фиброза легких, как полагают, возникают в результате фибротических реакций на обусловленные токсинами повреждения^8,9. Интересно, что в др. условиях, печень является одним из немногих органов в теле человека, которая может регенерировать до 70% само собой без образования рубца. Почему регенеративная способность печени проявляется только в некоторых случаях остается полностью неизвестным. Ведущая гипотеза, что иммунная система участвует в переключении между регенерацией и фибротическим заживлением, т.к. плоды человека, у которых заживление происходит без образования рубца, имеют незрелую иммунную систему¹⁰.

Заживление с помощью фиброза вместо регенерации сказывается огромным бременем для здоровья населения. Общие экономические затраты на болезни, которые ведут к фиброзу, трудно точно определить, но это порядка десятков биллионов долларов¹¹. Важно, что дисфункциональное заживление часто ведет к пожизненной нетрудоспособности, которая существенно влияет на экономику². Т.о., если бы процесс фибротического заживления можно было бы трансформировать в регенеративный, при котором исходная ткань восстанавливалась бы, то это привело бы к существенному улучшению здоровья человека.

Wound repair across phylogeny

Способность отвечать на повреждения и репарировать ткани является фундаментальным свойством всех многоклеточных организмов. Но существует огромное разнообразие того, как этот процесс осуществляется. Изучение репарации ран в разных филетических группах могло бы улучшить наше понимание заживления ран у людей и может помочь идентифицировать молекулы или пути, которые нацелены на восстановление потерянной регенеративной способности.

Наиболее примитивный многоклеточный организм и общий предшественник современных многоклеточных организмов это губки. Хотя репарация ран не была серьезно исследована у губок. Недавнее исследование формирования клеточного паттерна у этих организмов предоставило информацию о происхождении формирования эмбрионального паттерна у metazoans. Формирование паттерна обозначает трехмерную ориентацию клеток в организме и, по-видимому, необходимо для регенерации тканей. Принято считать, что оно не участвует в репарации ткани с образованием рубца. Губки являются сходными организмами без оси тела, множественных слоев клеток или тканей^12-14. Взрослые губки имеют высоко приспособляемую форму тела и лишены симметрии по передне-задней оси, но эмбрионы и личинки губок имеют как передне-заднюю ось, так и радиальную симметрию. Некоторые растворимые факторы - WNT белки и transforming growth factor-β (TGF-β) - совместно необходимы для формирования паттерна клеток эмбриональных губок, а hedgehog-like сигнал клеточной поверхности, hedgling¹⁵, продуцируется также в виде перекрывающегося паттерна с WNT белками и TGF-β.

Сходным образом у Drosophila melanogaster морфологические события. которые происходят во время развития, такие как dorsal closure¹⁶ и слияния трахей¹⁷, обнаруживают удивительное видимое сходство с репарацией ран у людей. В отличие от губок D. melanogaster имеет сложную кранио-каудальную асимметрию на взрослой стадии. Кроме того, у эмбрионов D. melanogaster одна и та же молекулярная система используется в этих морфологических онтогенетических событиях и для закрытия эпителиальных дефектов ран¹⁸. То, что эти внутриклеточные сигнальные пути и пути клеточной адгезии высоко консервативны у разных видов. а компоненты присутствуют после повреждения и у др. многоклеточных организмов, включая и людей, указывает на то. что паттерн-формирующие сигналы для многоклеточной организации присутствуют в раневой среде у взрослых, но не полностью функциональны¹⁹.

Чтобы проверить участие онтогенетических путей в заживлении ран, морфогенетические события, с вовлечением перемещений тканей, д. использоваться в качестве модели заживления ран. Две наиболее часто используемые модели - это dorsal closure у эмбрионов D. melanogaster и вентральное вложение (enclosure) у Caenorhabditis elegans, оба из которых используются для элиминации эпителиальных пробелов. У D. melanogaster, очевидно, что передача сигналов JUN amino-terminal kinase (JNK) и последующая активация транскрипционного фактора activator protein 1 (AP1) на ведущем крае эпителиальных клеток, вместе с четкой регуляцией делений ассоциированных клеток и межклеточной адгезии, являются критическими для успешного замыкания (closure)²⁰. Этот процесс аналогичен ре-эпителизации (восозданию интактного слоя кератиноцитов) ран млекопитающих, что снова подчеркивает общую базу тканевой репарации в филогении.

Репарация ран у амфибий служила предметом исследований недавнего эксперимента из-за относительно близкого родства между этим организмом и млекопитающими и из-за их удивительной способности регенерировать ампутированные придатки через образование бластемы, которая представляет собой массу недифференцированных клеток, способных к регенерации. После ранения дифференцированные клетки зрелой ткани, которые окружают область ампутации, дедифференцируются в моноядерные бластемные клетки, которые могут пролиферировать и обладают потенциалом дифференцироваться во множественные типы клеток^21,22. Эти клетки затем регенерируют конечность посредством процесса, который зеркально отражает эмбриональное развитие. Стимуляция нервов является важной для поддержания этого регенеративного состояния²³. Недавно было показано у саламандр, что nAG, член семейства anterior-gradient белков, продуцируется Шванновскими клетками перерезанныхъ нервов и взаимодействует с Prod 1 на поверхности бластемных клеток, способствуя их пролиферации²¹. Однако, если нервы проксимальнее бластемы (т.е., вблизи спинного мозга) перерезаны, то бластема неспособна к регенерации конечности и клетки неспособны ре-дифференцироваться; поэтому происходит заживление раны вместо регенерации конечности. Сходным образом планарии, являющиеся простейшими организмами, лишенными сложной системы органов, но могут полностью регенерировать интактный организм из небольшого остатка (равного 1/289) исходного организма. И опять же недифференцированные клетки (neoblasts) собираются в месте повреждения и образуют бластему, которая может регенерировать органную систему и ткани²⁵. У планарий, как полагают свыше 20% от всех клеток наделены способностью регенерировать взрослые ткани.

Млекопитающие сохраняют большинство из молекулярных систем, используемых организмами, такими как саламандры, но их регенеративный потенциал довольно ограничен. Частично это очевидно результат быстрого внедрения фибротической ткани, которая предупреждает последующую регенерацию ткани. Напр., если спинной мозг мышей поврежден, то нейроны начинают расти, но глиальные клетки в месте повреждения стимулируют образование рубца, предупреждая восстановление. Однако, если спинной мозг мышей рассекается так, что препятствует образованию рубца, то нейроны восстанавливают соединения^26,27. Это быстрое внедрение рубцовой ткани, по-видимому, обеспечивает преимущества в выживании путем предупреждения инфекции микроорганизмами, вторгающихся в рану и путем ингибирования продолжающейся механической деформации крупных тканей (процесс, который может усугублять инициальный инсульт). Чтобы манипулировать процессом заживления рану млекопитающих так, чтобы он сдвигался в направлении регенерации, необходимо приобретение способности замедления быстрой фибротической реакции, так чтобы мультипотентные клетки, такие как стволовые или клетки предшественники делали возможной регенерацию ткани.

Classic stages of wound repair

Во всех системах органов нормальной реакцией на повреждения является появление трех перекрывающихся, но самостоятельных стадий: воспаления, формирования новой ткани и ремоделирования (Fig. 1). Первая стадия заживления раны - воспаление - происходит непосредственно после повреждения ткани, нужны компоненты коагуляционного каскада, воспалительные пути и иммунная система, чтобы предупредить потерю жидкости и крови, чтобы удалить мертвые и гибнущие (dying) ткани и предупредить инфекцию. Гомеостаз первоначально достигается образованием сгустка тромбоцитов, сопровождаемое образованием матрикса фибрина. который становится каркасом для инфильтрующихся клеток. Нейторофилы затем рекрутируются в рану в ответ на активацию комплемента, дегрануляцию тромбоцитов и продукты деградации бактерий²⁸ (Fig. la). Спустя 2-3 дня в ране появляются моноциты, и дифференцируются в макрофаги. Макрофаги, как полагают, являются критическими для координации последующих событий в ответ на повреждение, но значение нейтрофилов и макрофагов для заживления ран понято не до конца. Недавние данные указывают на то, что недостаток клеток любого из типов может быть компенсирован за счет перекрывания воспалительных реакций²⁹. В отсутствие клеток обоих типов репарация малых ран всё ещё может происходить, а реакция рубцеобразования обычно

Вторая стадия заживления ран - образование новой ткани - происходит спустя 2-10 дня после повреждения и характеризуется пролиферацией клеток и миграцией разных типов клеток. Первым событием является миграция кератиноцитов поверх поврежденного дермиса (внутреннего слоя кожи) (Fig. lb). Затем образуются новые кровеносные сосуды (процесс известный как ангиогенез) а врастание капилляров ассоциирует с фибробластами и макрофагами, замещающими фибриновый матрикс грануляционной тканью. которая формирует новый субстрат для миграции кератиноцитов на более поздних стадиях процесса заживления. Кератиноциты, которые находятся позади ведущего края пролиферируют и созревают и в конечном итоге восстанавливают барьерную функцию эпителия. Наиболее важными позитивными регуляторами ангиогенеза³¹ являются vascular endothelial growth factor A (VEGFA) и fibroblast growth factor 2 (FGF2; известный также как bFGF). Напр., наложение только VEGFA на раны животных, моделирующих диабет (у которых заживление ран разрегулировано) может нормализовать заживление³². Ангиогенез может быть также результатом рекрутирования происходящих из костного мозга клеток эндотелиальных предшественников, хотя величина этого вклада невелика - по крайней мере, в не ишемических ранах (в которых концентрация кислорода нормальная)³³ (Fig. lb). В более поздний период этой стадии фибробласты, которые привлекаются из краев раны или из костного мозга, стимулируемые макрофагами, и некоторые из них дифференцируются в миофибробласты³⁴. Миофибробласты являются контрактильными клетками. которые со временем сводят края раны вместе. Фибробласты и миофибробласты взаимодействуют и продуцируют внеклеточный матрикс в основном из коллагена, который в конце концов составляет основную массу

Третья стадия репарации ран - ремоделирование - начинается спустя 2-3 недели после повреждения и длится год или более. Во время этой стадии все процессы, активированные после повреждения, уменьшаются и затухают. Большинство эндотелиальных клеток, макрофагов и миофибробластов подвергаются апоптозу (т.е. запрограммированной клеточной гибели) или уходят из раны, покидая массу, которая содержит немногие клетки и состоит в основном из коллагена и др. белков внеклеточного матрикса (Fig. lc). Эпителиально-мезенхимные взаимодействия, по-видимому, постоянно регулируют целостность и гомеостаз кожи³⁶. И д. существовать дополнительные петли обратной связи для поддержания др. типов клеток кожи. Кроме того, спустя 6-12 мес. бесклеточный матрикс активно ремоделируется из остова в основном из коллагена типа III у преимущественно состоящий из коллагена типа I³⁷. Этот процесс осуществляется с помощью matrix metalloproteinases, которые секретируются фибробластами. макрофагами и эндотелиальными клетками и это укрепляет репарируемую ткань. Однако, ткань никогда не приобретает свойств неповрежденной ткани. Интересно, что позвоночные, такие как рыбки данио (Danio rerio) и C. elegans не продуцируют этих типов коллагена; их внеклеточный матрикс состоит целиком из коллагенов типа VI и XVIII³⁹. Эти находки указывают на степень эволюционной пластичности, которая не обнаруживается на ранних стадиях заживления ран.

Molecular mechanisms of wound repair

После обнаружения, что гены, которые регулируются в ответ на повреждение кожи, являются функционально важными для процесса заживления ран, исследования массивов ДНК проводили для идентификации таких генов по всему геному^40,41. Эти исследования показали, паттерн экспрессии генов в заживающих ранах кожи строго напоминает таковой у высоко злокачественных опухолей⁴², подчеркивая важность исследований функциональной геномики для изучения заживления ран и рака. Генерация и анализ генетически модифицированных мышей проливает свет на роль некоторых генов, регулируемых во время заживления ран²⁸. Кроме того, наблюдение сходства между клеточными перемещениями, которые происходят во время dorsal closure у эмбрионов D. melanogaster, и заживления ран кожи млекопитающих вместе с разработкой моделей репарации ран у D. melanogaster²⁰, позволили генетически легко управляемую систему D. melanogaster использовать для идентификации и функциональной характеристики молекул, участвующих в репарации ран. особенно в ре-эпителизации. Многие ступени заживления ран пока плохо охарактеризованы на молекулярном уровне, поэтому в данном разделе мы обсудим последние данные, которые проясняют лежащие в основе молекулярные механизмы ре-эпителизации, главного события в фазе формирования новой ткани

Белки, участвующие в ре-эпителизации включают различные белки внеклеточного матрикса и их рецепторы, протеазы (включая matrix metalloproteinases), цитоскелетные белки и энзимы, которые регулируют клеточный redox баланс. Функции этих белков в заживлении ран описаны в недавнем обзоре⁴³. Др. белки, которые как известно, участвуют, включают ростовые факторы и гормоны и мы сфокусировались на роли этих белков и их нижестоящих мишенях в репарации поврежденного эпидермиса (наружный слой кожи) и дермиса (Fig. 2 and Table 1).

Peptide growth factors

Молекула, которая особенно важна в ре-эпителизации - это hepatocyte growth factor (HGF), который осуществляет свою функцию путем соединения с и активации MET, рецепторной тирозин киназы^31,44. Интересно, что мыши, у которых ген, кодирующий MET, был делетирован из кератиноцитов, обнаруживали сильно задержанную ре-эпителизацию в ответ на раны кожи, а клетки, которые в конце концов покрывали раны у таких мышей, как было установлено, избегают события рекомбинации, при котором Met делетируется и, следовательно, всё ещё экспрессируют MET⁴⁴. Этот результат оказался неожиданным, т.к. известно, что др. факторы роста участвуют в ре-эпителизации, но очевидно, что эти факторы не могут компенсировать отсутствие передачи HGF-обеспечиваемых сигналов. Др. ростовые факторы. которые позитивно регулируют ре-эпителизацию, включают членов семейства FGF и семейства epidermal growth factor (EGF). Кроме того, определенные пептиды ростовых факторов, наиболее впечатляющий TGF-β, негативно регулируют

В терминах FGF семейства, лиганды для Illb variant of FGF receptor 2 (FGFR2-IIIb), в особенности, вносит вклад в заживление ран. Это показано с помощью существенной задержки ре-эпителизации, которая происходит у трансгенных мышей, экспрессирующих доминантно-негатитвную мутацию FGFR2-IIIb в кератиноцитах. Мутантный рецептор связывает FGF, но не может передать сигнал⁴⁵. Наиболее важными лигандами для FGFR2-IIIb, функция которых устраняется у таких мышей, скорее всего являются FGF7 и FGF 10 (ref. 46). В подтверждение этой идее, мыши, которые лишены дендритных эпидермальных Т клеток, которые являются мощным источником FGF7 и FGF10 (ref. 47), обнаруживают пониженное закрытие ран после повреждения.

Многие из лигандо для EGF receptor (EGFR) экспрессируются на высоких уровнях после повреждения кожи и один из них, heparin-binding EGF, как было установлено, обладает функциональной ролью в ре-эпителизации⁴⁸ (Fig. 2).Однако большое количество лигандов для EGFR в месте раны, по-видимому, делает возможным функциональное перекрывание; поэтому констатация того, как EGF семейство влияет на процесс заживления ран требует исследований на мышах, у которых Egfr ген нокаутирован непосредственно в кератиноцитах.

Эти позитивные регуляторы ре-эпителизации (т.е., HGF, FGFs и EGFs) являются лигандами рецепторных тирозин киназ, активация которых очень часто стимулирует кератиноциты мигрировать, пролиферировать и выживать. Некоторые из этих процессов опосредуются с помощью членов семейства AP1 и с помощью др. транскрипционного фактора, STAT3. Эти факторы активируются в ответ на передачу сигналов посредством различных рецепторных тирозин киназ, также как и в ответ на активацию цитокиновых рецепторов. Потеря AP1 белков или AP1 компонентов нарушают дорсальное закрытие (closure) и заживление ран у D. melanogaster^{20, 29}. Недавние исследования подтверждают, что AP1 белки выполняют сходную роль в заживлении ран у млекопитающих⁵⁰, хотя некоторые их функции возможно маскируются за счет перекрывания между разными членами семейства AP1 млекопитающих⁴⁹. STAT3, однако безусловно участвует в ре-эпителизации, т.к. специфичная для эпидермиса делеция Stat3 у мышей, как было установлено, задерживает заживление эпителия после ранения⁵¹.

В противоположность этим митогенным ростовым факторам TGF-β является негативным регулятором раневой ре-эпителизации. Ре-эпителизация, как было показано, сильно ускоряется у мышей. экспрессирующих ген, кодирующий доминантно-негативный TGF-β 1 рецептор в эпидермисе⁵² и у мышей, лишенных транскрипционного регулятора SMAD3, одной из главных мишеней TGF-β-обеспечиваемой передачи сигналов⁵³. Неожиданно член семейства TGF-β , activin, который также передает сигналы через SMAD3, не ингибирует пролиферации кератиноцитов на месте ранения, но вместо этого способствует пролиферации. Этот эффект, однако, возможно обеспечивается за счет мезенхимы⁵⁴, это подкрепляет важность эпителиально-мезенхимных взаимодействий в процессе заживления ран.

Hormones and other factors

Помимо пептидов ростовых факторов, некоторые низкомолекулярные медиаторы являются регуляторами ре-эпителизации ран. Напр., гормон acetylcholine и его рецепторы продуцируются кератиноцитами, давая в результате аутокринную петлю, которая позитивно регулирует миграцию (посредством muscarinic acetylcholine рецепторов подтипа M4) и негативно регулирует миграцию (посредством M3 рецепторов)⁵⁵. Кератиноциты также продуцируют гормоны, известные как catecholamines (включая adrenaline) и их рецепторы, приводя к ингибированию ре-эпителизации аутокринным способом⁵⁶.

Неожиданно полиненасыщенные жирные кислоты и производные жирных кислот, которые активируют peroxisome-proliferator-activated receptors (PPARs) , оказались важными регуляторами ре-эпителизации. Экспрессия PPAR-α b PPAR-β (известен также как PPAR-6) увеличивается в кератиноцитах после повреждения кожи⁵⁷ (Fig. 2). Позитивная регуляция экспрессии гена, кодирующего PPAR-β и ещё не идентифицированных лигандов осуществляется посредством действия про-воспалительных цитокинов, которые, в совою очередь, активируют AP1 белки посредством сигнального каскада активируемых стрессом протеин-киназ. Это функционально важно, т.к. мыши, у которых ген, кодирующий PPAR-β был нокаутирован, обнаруживают достоверно сниженную скорость ре-эпителизации и этот дефект возникает в результате снижения миграции и усиления апоптоза кератиноцитов⁵⁸. PPAR-β увеличивает жизнеспособность клеток путем усиления экспрессии генов, кодирующих integrin-linked kinase и 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1, которые в свою очередь фосфорилируют и активируют анти-апоптический белок AKT⁵⁹.

Наконец, неожиданной недавней находкой стало. что электрические сигналы также регулируют ре-эпителизацию ран⁶⁰. Хорошо известно, что разрушение эпителиального слоя генерирует эндогенное электрическое поле в латеральной плоскости. Это поле, как было установлено, важный направляющий сигнал для миграции кератиноцитов в ответ на ранение монослоя ^{in vitro}. Рецепторы и сигнальные молекулы, как было установлено, участвуют, включая EGFR, α β 4-integrin, phosphatidylinositol-3-OH kinase-γ и phosphatase PTEN^43,60. Этот механизм регулирует заживление поврежденной роговицы и может играть сходную роль в раненой коже^43,60.

Следовательно, очевидно, что разнообразные факторы, включая и физические факторы. могут активировать внутриклеточные сигнальные пути, которые в конечном итоге регулируют разные ступени ре-эпителизации ран.

Epithelial stem-cell biology

Во время ре-эпителизации восстановление эпидермиса необходимо за счет доставки кератиноцитов, которые затем мигрируют и покрывают заживающую рану. Сходно с др. выстилающими эпителиями, такими как эпителий поверхности глаз и кишки, эпидермис постоянно и быстро само-обновляется, этот процесс обеспечивает гомеостаз и поддержание соотв. тканевой функции. используется пролиферация эпидермальных стволовых клеток. Стволовые клетки определяются по своей способности само-обновляться в течение длительного периода времени (подобно раковым стволовым клеткам) и их способности дифференцироваться в зрелые, взрослые клетки. Стволовые клетки определяются как плюрипотентные (способные к формированию всех типов клеток тела, включая зародышевые клетки) или мультипотентными (способными к формированию большинства клеточных типов). Так в случае гематопоэза мультпотентные эпителиальные стволовые клетки могут быть отличены от мультипотентных клеток предшественников только с помощью комбинации клонального анализа и серии долговременных трансплантационных экспериментов⁶¹. Используя такой подход, недвусмысленно было подтверждено, что верхняя постоянная область волосяного фолликула ниже сальной железы (обычно означаемая как выпячивание (bulge) или ниша) содержит мультипотентные клетки предшественники^62,63 (Fig. 3). Тот же самый экспериментальный подход также однозначно показал присутствие мультипотентных стволовых клеток вне ниш, подтверждая более ранние результаты, что стволовые клетки локализованы не только в нише ⁶⁴.

Тканевые стволовые клетки могут также расширять свою способность. чтобы формировать различные клоны в ответ на физиологические стимулы или повреждения, свойство, которое обладает огромным потенциалом для подходов регенеративной медицины. Считается, что эпидермис обновляется за счет мультипотентрных клеток предшественников или стволовых клеток, генерируемых в и мигрирующих из bulge волосяных фолликулов⁶². Безусловно мультипотентные стволовые клетки из bulge могут вносить вклад в эпидермальное заживление^61,65, но это происходит только, когда рана не может спонтанно репарировать сама себя за счет миграции эпидермальных клеток из соседнего неповрежденного эпидермиса или из воронки, части волосяного фолликула между эпидермисом и сальной железой (Fig. 3). В самом деле воронка (infundibulum) - которая может распространяться глубоко в эпидермис, на несколько сотен micrometres в волосяном фолликуле человека - содержит характерные эпидермальную и волосяного фолликула территории (Fig. 3). Бтолее того. генетический анализ подтвердил, что эпидермис является само-обновляющимся и что это не зависит от клеток, генерируемых из мультипотентных стволовых клеток волосяного фолликула^65,66. Наконец исследования по отслеживанию клонов у мышей вернули снова к классической концепции, что обновление эпидермиса базируется на иерархии стволовых клеток и временно амплифицирующихся клеток⁶⁷, в подтверждение гипотезы, что обновление эпидермиса базируется на одиночной независимой популяции пролиферативных клеток во время обычного гомеостаза.

Др. соображение заключается в том, что свойства стволовых клеток всё ещё дебатируются и это влияет на экспериментальные проекты и интерпретацию. Покой считается важным свойством всех стволовых клеток, так что сохранение метки (указывающее, что клетки не делятся активно) долгое время было необходимым критерием для идентификации эпителиальных стволовых клеток⁶⁸. Однако сегодня существуют убедительные доказательства, что стволовые клетки ммогут быстро делиться в некоторых тканях, но не в др. Недано было показано, что кишечные стволовые клетки - идентифицируемые по экспрессии Lgr5 (который кодирует leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, трансмембранный белок, стоящий ниже WNT-опосредуемого сигнального пути) - быстро делятся⁶⁹. Вместе с наблюдением, что гематопоэтические стволовые клетки не обязательно сохраняют метку⁷⁰, эти находки привели некоторых исследователей к пересмотру покоя как ключевого свойства 'stermness'; хотя отсутствие клеток, сохраняющих метку, как в случае экспрессии маркеров дифференцировки, не устраняет присутствия стволовых клеток в ткани. В конце концов, функция является единственным признаком, по которому можно собственно идентифицировать стволовость. Это может объяснить, почему роговица мышей может само-обновляться при полном отсутствии лимба, переходной зоны при соединении конъюнктивы и роговицы, которая как полагают, содержит стволовые клетки роговицы⁷¹. Идентификация всех клеток, которые могут действовать как стволовые клетки определенно повлияет на будущие стратегии по заживлению ран и регенерации ткани.

Клетки взрослой роговицы, подвергнутые действию эмбрионального дермиса, могут быть индуцированы к образованию волосяных фолликулов⁷². Эта находка вместе с наблюдением, что NOTCH 1-дефицитных эпителий роговицы формирует эпидермис, если поврежден⁷¹, указывают на то, что эпителиальные клетки обладают некоторой пластичностью, свойством, которое имеет важное клиническое применение. В самом деле, культивируемые трансплантаты эпителия, полученного из ротовой полости, используются для реконструкции роговицы человека⁷³. Успехи в биологии стволовых клеток имеют занчение для улучшения терапии кожи вне традиционного домена репарации ран. Напр, недавно установлено, что стволовые клетки от индивида могут быть генетически переконструированы и затем постоянно трансплантироваться индивиду для лечения выведенной из строя кожи в результате наследственной болезни является существенным шагом вперед⁷⁴. Это показывает, что не только ex vivo генная терапия является осуществимой, но и также дает новую надежду пациентам с хроническими ранами, для которых обычная терапия ран неэффективна. Несмотря на подобные успехи, ещё предстоит многое сделать прежде чем стволовые клетки могут быть использованы для безопасных манипуляций по реконструкции функции кожи и др. многослойных эпителиев.

Кроме того, возможность массивного увеличения мультипотентных эпителиальных клеток в культуре, вместе с лучшим пониманием эпителиально-мезенхимных взаимодействий, которые контролируют морфогенез волосяных фолликулов^75,76, открывает дверь для ex vivo реконструкции кожных придатков. В этом отношении недавнее сообщение о спонтанной генерации волосяных фолликулов в заживающей коже взрослых мышей подчеркивает, что WNT-обеспечиваемая передача сигналов является важной для морфогенеза и репарации кожи⁷⁷ и дает надежду, что волосяные фолликулы могут быть сгенерированы заново. Но морфогенез de novo волосяных фолликулов, который. как известно, происходит у некоторых видов (напр., у оленей во время отрастания рогов), никогда не наблюдался у людей. Столь же важной является индуктивная роль клеток дермальных сосочков в генезе волосяных фолликулов и её взаимосвязь нервным гребнем^78-80. Клетки дермальных сосочков могут экспрессировать маркеры adipogenic, chondrogenic иosteogenic дифференцировки и могут даже формировать neurosphere-подобные сферы (которые экспрессируют маркеры нейрональной дифференцировки, если культивируются в соотв. условиях). Следовательно, клетки дермальных сосочков, по-видимому, функционально связаны с мезенхимными клетками, выделяемыми из др. тканей (напр., жировая ткань или костный мозг). Понимание молекулярного контроля судьбы эпителиальных и мезенхимных стволовых клеток позволит разработать новые стратегии для заживления ран, напр.. стратегии улучшающие миграцию стволовых клеток, чтобы индуцировать образование эпидермальных придатков (таких как волосяные фолликулы и протоки потовых желез) и уменьшать образование рубцов^75,76,81.

Towards tissue regeneration in humans

У людей проблемы с заживлением ран могут проявляться или как задержка заживления (что происходит при диабете или радиационном облучении) или избыточное заживление (как это происходит в случает гипертрофических и келоидных рубцов). Избыточное заживление характеризуется отложением больших количеств внеклеточного матрикса и альтерациями локальной васкуляризации и клеточной пролиферации. Эти избыточные фибротические реакции проявляются у людей в виде 'bad scar'. В большинстве таких примеров избыточное заживление продуцирует обезображивающие массы, которые могут физически нарушать поверхностные структуры (такие как нос или веки). Такое обычно происходит после крупных повреждений, таких как ожоги, в этом случае они обозначаются как гипертрофические рубцы. Они появляются по неизвестным причинам после относительно небольших травм, как в случае келоидных рубцов, которые могут иметь генетическую основу². Наибольший интерес вызвало наблюдение, что увеличение количества TGF-β, обнаруживаемое в ранах, которые заживают путем образования рубца в противоположность регенерации ткани, наблюдается при bad scars^82,83. Эта находка ведет к усилиям клиницистов блокировать образование рубцов антителами и малыми молекулами, направленными против TGF-β и др. про-воспалительных медиаторов⁸⁴. Недавние доказательства также подтверждают, что изменения в физической среде могут приводить избыточному заживлению, за счте воздействия на механическую среду клеток

Хотя были проделаны мощные усилия по вычленению мириадов факторов, участвующих в нормальном и патологическом заживлении тканей, эти находки не привели к существенным успехам при выхаживании пациентов. Очевидно, что лечение единичными агентами, такими как применение ростового фактора, оказывает лишь незначительное влияние на заживление ран в клинических условиях, скорее всего из-за значительной пластичности и перекрываемости компонентов процесса заживления ран или из-за быстрой деградации

Окончательное решение недостаточного или избыточного заживления скорее всего заключается в использовании клеток, которые сохраняют способность вырабатывать всю полноту биологических сигналов вместе со средовыми сигналами, которые необходимы для регуляции дифференцировки и пролиферации этих клеток. Предыдущие попытки использовали частично этот подход (напр., использование культивируемых кератиноцитов или фибробластов, но до сих пор невозможно совместить и 'seed and soil' в одном и том же терапевтическом агенте. Недавние успехи в биологии стволовых клеток и клеток предшественников привели к выделению и характеристике клеток предшественников кожи у млекопитающих. Параллельно успехи в материаловедении сделали возможным доставку внеклеточных или внутриклеточных сигналов точно в определенной временной и пространственной последовательности⁸⁶. Одним из таких подходов является, проиллюстрированы на Fig. 4. Клетки эпидермальных предшественников взрослых (полученных из кожных проб или стардатизированных линий) помещают на biomimetic матрикс, который воспроизводит среду, присутствующую во время пренатального роста и развития, когда происходит регенерация тканей. Компоненты среды включают оптимизированные механические нагрузки и напряжение кислорода, белки внеклеточного матрикса. После трансплантации на поврежденное место, эти клетки предшественники могут сами по себе предоставлять соответствующую последовательность внеклеточных факторов, чтобы ускорить заживление и регенерацию ткани. Использование клеток для интеграции средовых сигналов и передача их биологическим эффекторам скорее всего и будет критическим для новых подходов по устранению проблем фибротической репарации ран.

Wound repair and regeneration Geoffrey C. Gurtner, Sabine Werner, Yann Barrandon & Michael T. Longaker Nature, V.453, No 7193, P. 314-321, 2008

Wound repair and regeneration
Geoffrey C. Gurtner, Sabine Werner, Yann Barrandon & Michael T. Longaker
Nature, V.453, No 7193, P. 314-321, 2008