Большинство известных генов, важных для эмбрионального развития MD, было охарактеризовано или благодаря описанию синдромов человека, затрагивающих образование, регрессию и дифференцировку female reproductive tract (FRT) или благодаря исследованию нокдауна у мышей (Table 1 and Fig. 2). Анализ молекулярных и клеточных механизмов развития MD выявил генетический каскад для этого процесса (Kobayashi and Behringer 2003).
Как упоминалось выше, первые ступени образования MD у обоих полов заключаются в инвагинации целомического эпителия и каудальной элонгации в направлении урогенитального синуса. Эти два механизма зависят от корректной экспрессии различных транскрипционных факторов и сигнальных молекул. Как было описано ранее фаза элонгации, как и последующее поддержание MD,, по-видимому, не только зависит от внутренне присущей природы MD, но и также нуждается в присутствии WD (Roberts et al. 2002). Как следствие, гены, участвующие в развитии WD являются критически важными для последующего начала MD. Среди факторов, необходимых для развития FRT, Lim1 (a.k.a. Lhx1), Pax2, Emx2, Wnt4, Wnt9b, Tcf2, Dach1 и Dach2, по-видимому, существенны для инициального двухфазного процесса образования MD.
Lim1, гомеодомен-содержащий транскрипционный фактор, обнаруживает динамический паттерн экспрессии в эпителии развивающихся MD, начиная со ст. E11.5 у мыши. Это указывает на роль Lim1 на самых ранних ступенях формирования MD. В самом деле, Lim1-нулевые мутантные мыши обнаруживают полное отсутствие структур, происходящих из мезонефросов и парамезонефоросов, фенотип, согласующийся с экспрессией гена в эпителии протоков обоих полов (Kobayashi et al. 2004). Более того, специфическая инактивация Lim1 в эпителии WD вызывает его дегенерацию и ведет к нарушению развития MD, но не влияет на их инициальное образование, подчеркивая WD-зависимость процесса элонгации и поддержания MD, но не инициации (Kobayashi et al. 2005). Pax2, член семейства paired-box генов, кодирующих транскрипционные факторы, также экспрессируется в эпителии Вольфовых и Мюллеровых протоков. Этот ген участвует во множественных онтогенетических процессах, по-видимому, существенен для развития эпителиальных компонентов, происходящих из промежуточной мезодермы. В самом деле, Pax2-нулевые мутантные мыши, которые погибают перинатально из-за отсутствия почек, не имеют производны ни Вольфовых, ни Мюллеровых протоков (Torres et al. 1995). Несмотря на это, в отличие от фенотипа, наблюдаемого у Lim1-нулевых мутантных мышей, оба половых протока первоначально формируются у Pax2-нулевых эмбрионов,
TABLE 1
GENES INVOLVED IN THE DEVELOPMENT OF FEMALE GENITAL TRACT
MD: Mullerian duct; ME: Mullerian epithelium; WD: Wolffian duct; WE: Wolffian epithelium; CE: coelomic epithelium; MMET: Mullerian Mesenchyme-Epithelium Transition; FRT: Female Reproductive Tract; NA: not available; NE: not expressed.
1 Early refers to determination, invagination and elongation steps of MD.
2Late corresponds to E13.5 (time of MD regression in the male) to puberty. * Specific WD genes are indicated since MD growth initially depends on the presence of WD. ** Targeted knock-out, efficient from E15.5. *** Compound Hoxa13+/-;Hoxd13-/--mutant females display severe urogenital and rectal anomalies (Warot, 1997) whereas Hoxd13-/--mutant female are still fertile (Dolle et al. 1993).
но дегенерируют вскоре после этого. Кроме того, гомеобокс-содержащий ген
Emx2, экспрессируется в эпителиальных компонентах мочеполовой системы и играет существенную роль в развитии этого органа. Подобно
Pax2 мутантам, оба пола,гомозиготных нулевых мышей по
Emx2 обнаруживают полное отсутствие мочеполового тракта и погибают вскоре после рождения (Miyamoto et al. 1997). тем не менее, WD развиваются нормально на ст. E10.5 у этих мышей, но дегенерируют спустя день и,как и ожидалось, не обнаруживают позднее MD. Наконец, POU домен содержащий ген
TCF2 (первоначально наз.
v-HNF1 или
HNF1beta) , как было показано, экспрессируется во многих органах во время развития (Coffinier et al. 1999) и, по-видимому, играет генеральную роль в дифференцировке эпителия (Coffinier et al. 1999; KolatsiJoannou et al. 2001). Экспрессия этого гена особенно примечательна с самых ранних ступеней формирования мочеполового тракта и до взрослой стадии у мыши (Coffinier et al. 1999; Reber and Cereghini 2001). Первоначально он был обнаружен в ассоциации с MODY типом диабета (Horikawa et al. 1997) и с diabetes mellitus, почечными кистами и др. нарушениями развития почек (Bingham et al. 2001; Kolatsi-Joannou et al. 2001). Интересно, что половые нарушения, такие как двурогая матка (Bingham et al. 2002), матка didelphys (Bingham et al. 2002) и аплазия Mullerian протоков (Lindner et al. 1999),обнаруживались вместе с почечными аномалиями у пациентов, обнаруживающих дефектный ген, демонстрируя тем самым важную роль гена
TCF2 во время мочеполового развития. Транскрипционные кофакторы, такие как Dach1 и -2, по-видимому, также участвуют в молекулярном каскаде формирования MD. В то время как инактивация каждого из соотв. генов , по-видимому, не влияет на этот путь, комбинированный нокаут ведет к радикальным дефектам Mullerian производных, демонстрируя функциональное перекрывание этих факторов (Davis et al. 2008).
Помимо ключевой роли упомянутых выше гомеодоменовых транскрипционных факторов на ранних ступенях формирования MD, некоторые сигнальные молекулы, также участвуют в этом процессе. Среди них, Wnt9b и Wnt4, два члена семейства генов Wnt, кодирующие секретируемые гликопротеины, гомологичные гену сегментной полярности
Drosophila wingless, являются критическими паракринными факторами. У мышей
Wnt9b экспрессируется в эпителии WD с E9.5 по E14.5 у обоих полов и, по-видимому, необходим для вытягивания MD (Carroll et al. 2005). Интересно, что фенотип мутантов
Wnt9b может быть устранен за счет активации
Wnt1 в WD, это указывает на канонический Wnt путь как на детерминант сигнального процесса при элонгации Мюллеровых протоков. Др. член семейства,
Wnt4, экспрессируется в мезенхимных клетках, окружающих вновь сформированные MD на ст. E12.5 у мыши. Wnt4-нулевые самки мышей обнаруживают полное отсутствие FRT и, что поразительно, оказываются , маскулинизированным возможно из-за эктопической активации биосинтеза тестостерона, как было первоначально предположено (Vainio et al. 1999; Heikkila et al. 2005). Фактически, не наблюдалось Mullerian структур у самцов и самок мутантных мышей на ст. E11.5, до обычной регрессии MD у самцов. Поэтому противоположное половое развитие у мутантных самок указывает на потребность в Wnt4 для инициальных ступеней образования MD у обоих полов, а также для супрессии пути дифференцировки самцов в гонадах самок. Сходным образом мутация в гене
Wnt4 была открыта у 46, XX женщин, имеющих в чем-то сходный фенотип: полное отсутствие структур, производных MD и клинические признаки избытка андрогенов (Biason-Lauber et al. 2004). Интересно, что Wnt4 и Fgf9, по-видимому, производят взаимно антагонистические сигналы в бипотенциальных гонадах, регулируя дифференцировку гонад по женскому или мужскому пути из-за нарушения равновесия между ними (Kim et al. 2006). Др. хорошо изученной сигнальной молекулой в этом контекста является ретиноевая кислота (RA), морфоген, производный витамина А. RA, как известно, участвует в формировании передне-заднего паттерна вдоль осей тела и в развивающихся зачатках конечностей (Dreyer and Ellinger-Ziegelbauer 1996; Robert and Lallemand 2006). Компаундные нулевые мутации соотв. рецепторов (RARs и RXRs) ведут к широкому кругу онтогенетический аномалий, среди которых и тяжелые дефекты мочеполовой системы (Mendelsohn et al. 1994). В частности, RARαβ2 двойные мутанты лишены опознаваемых MD на ст. E12.5, фенотип, не связанный с дефектом формирования WD, это делает передачу сигналов RA специфическим путем, необходимым для гарантии правильного образования MD. Сходным образом, аномалии мочевого и полового трактов недавно были описаны у
Dlgh1-нулевых мутантных мышей обоих полов (Iizuka-Kogo et al. 2007). Наиболее интересным здесь дефектом оказалась аплазия шейки матки и влагалища из-за дефектного бокового слияния и нарушения каудальной элонгации MD (Iizuka-Kogo et al. 2007). На сегодня не установлена связь между ретиноевой кислотой и геном
Dlgh1. Наконец,
Male and female genital tract anlagen in sexually indifferent stage embryo
Fig. 2. Genes involved in the regression or development of the Mullerian ducts. At the so-called sexually indifferent stage (bipotential gonad), both male and female reproductive duct primordials co-exist. Sexual differentiation takes place according to the genetic sex of the embryo, determining its gonadal status and consequently allowing the differentiation into male or female reproductive organs. In female embryos, in the absence of specific male hormones, the WDs degenerate while the MDs ducts develop. In male embryos, the MDs degenerate and the WDs give rise to the male genital tract. Key genes involved in such processes are indicated on the figure.
открыта потребность в сигнальном пути PI3K/AKT для элонгации кончика MD (Fujino et al., 2008), это подчеркивает сложность множественных сигнальных путей в развитии MD.
Regression of Mullerian ducts in the male
Как уже упоминалось зачатки репродуктивных протоков сосуществуют у самцов и самок на т. наз. пол-индифферентной стадии. Затем происходит половая дифференцировка в соответствии с генетическим полом эмбриона, детерминируется статус гонад и затем следует дифференцировка в репродуктивные органы самца или самки. У эмбрионов самок отсутствие андрогенов, по-видимому, достаточно, чтобы вызывать дегенерацию WD, тогда как регрессия MD у эмбрионов самцов является активным процессом, обеспечиваемым с помощью AMH, секретируемого исключительно семенниками плода.
Молекулярные и клеточные исследования, в основном на мышах, показали, что AMH осуществляет свое действие на MD посредством паракринного механизма за счет соединения с его типа II рецептором (AMHRII). Последний первоначально экспрессируется в целомическом эпителии мезонефросов, до регрессии (Zhan et al. 2006). Соединение AMH с AMHRII заставляет AMHRII-экспрессирующие клетки мигрировать в область, соседствующую с MD, и в конечном счете они оказываются вокруг MD на ст. ~E15.5, совпадая т.о., с эпителиально-мезенхимным переходом. У самок, в отсутствие AMH, экспрессия AMHRII остается локализованной в целомическом эпителии вплоть до ст. E15.5 (Zhan et al. 2006). Amh- или AmhrII-мутантные самцы мыши обнаруживают идентичный фенотип: они обладают морфологически нормальной репродуктивной системой самцов, но бесплодны из-за персистенции целого FRT, блокирующего прохождение спермиев (Behringer et al. 1994; Mishina et al. 1996). мутации в AMH или AMHRII генах описаны у пациентов с Persistent Mullerian Duct Syndrome type I и type II соотв. (Di Clemente and Belville 2006). Эти доказательства показывают, что AMHRII является , по-видимому, уникальным типом рецепторов, обеспечивающим передачу сигналов AMH. У мыши Bmpr1a (a.k.a. Alk3) has был идентифицирован в качестве type I рецептора, обязательно ассоциированного с AmhrII, чтобы обеспечить Amh-индуцированную регрессиию Mullerian производных (Jamin et al. 2002). Примечательно, что др. type I рецепторы Tgf-β семейства могут передавать Amh сигнал в отсутствие Bmpr1a (Clarke et al. 2001; Jamin et al. 2003). Интересно, что Alk2 (a.k.a. Acvr1), по-видимому, обеспечивает передачу сигналов Amh путем индукции миграции AmhrII-экспрессирующих эпителиальных клеток из целомического эпителия в MD мезенхиму, объясняя диморфный по полу паттерн экспрессии AmhrII во время регрессии (Zhan et al. 2006). В соответствии с их пространственно-временным паттерном экспрессии, Alk2 и Bmpr1a type I рецепторы, как полагают, действуют последовательно при регрессии MD. Более того, происходящий из эпителия Wnt7a сигнал необходим для индукции или поддержания экспрессии AmhrII в Mullerian мезенхиме обоих полов, а также для чувствительности к передаче сигналов Amh. В самом деле, Wnt7a-дефицитные мыши не экспрессируют AmhrII в мезенхиме протоков и бесплодны из-за персистенции MD у самцов и аномального морфогенеза яйцеводов и матки у самок (Parr et al. 1998; Parr and Mcmahon 1998). Непосредственный эффект инактивации Wnt7a был подтвержден с помощью описания β-catenin/Tcf4 комплекса, связывающегося с промотором AmhrII, чтобы активировать ген (Hossain and Saunders 2003). Эти данные подчеркивают множественные роли передачи сигналов Wnt в молекулярном каскаде, запускающем половое развитие. Одним из самых ранних событий вследствие передачи сигналов Amh, но до регрессии MD, по-видимому, является активация генов Sfrp2 и -5. Однако одиночная или комбинированная инактивация любого из генов не ведет к какой-либо видимой аномалии развития репродуктивного тракта, указывая тем самым, что др. члены семейства генов Sfrp обладают перекрывающей функцией в этом процессе (Cox et al. 2006).
Регрессия MD краниально-каудальный процесс осуществляется с помощью апоптоза эпителиальных клеток и эпителиально-мезенхимного перехода. Позитивная корреляция была установлена между паттерном экспрессии
AmhrII и накоплением в цитоплазме β-catenin в peri-Mullerian мезенхимных клетках и, по-видимому, следует за волной апоптоза, распространяющейся хронологически вдоль кранио-каудальной оси (Allard et al. 2000). Более того, β-catenin локализуется совместно с Lef1 (др. членом ядерного семейства TCF/LEF) в ядре мезенхимных клеток, обработанных Amh, и, следовательно, может изменять генную экспрессию и судьбы клеток, делая β-catenin/Lef1 комплекс возможным медиатором действия Amh. В самом деле, Allard с коллегами наблюдали, что апоптоз эпителиальных клеток происходит только после разрушения базальной мембраны MD и сопровождается вступлением здоровых эпителиальных клеток в мезенхимный компартмент, где они становятся предметом эпителио-мезенхимных трансформаций (Allard et al. 2000). Одной из предполагаемых мишеней для передачи сигналов Amh является ген Matrix metalloproteinase 2 gene (
Mmp2). Этот ген экспрессируется в виде зависимого от пола паттерна с активацией у самцов в Mullerian мезенхиме во время регрессии; этот специфичный для самцов паттерн теряется у
Amh-нулевых мутантных мышей (Roberts et al. 2002). Кроме того, ингибирование активности Mmp2 белка блокирует регрессию MD
in vitro и коррелирует со снижением апоптических клеток в эпителии MD. Хотя
Mmp2-нулевые мутантные мыши формируют нормальный мочеполовой тракт, возможно из-за перекрывания с др. генами (Oppelt et al. 2005b), Mmp2 остается предполагаемым действующим лицом Amh-индуцируемой регрессии (Itoh et al. 1997). Недавно был описан Wilms' tumour suppressor gene (Wt1) в качестве ещё одного регулятора экспрессии
AmhrII (Klattig et al. 2007), это открывает новую функцию Wt1 в процессе полового развития.
Differentiation of Mullerian ducts
У плодов самок дифференцировка MD вдоль передне-задней оси (A-P) зависит от локальных индуктивных взаимодействий между эпителием MD и окружающей мезенхимой. Правильная регионализация FRT, т.е. приобретение тканевых характеристик шейкой, маткой и влагалищем, отражает пространственно-временные регулируемые взаимодействия между транскрипционными факторами и сигнальными молекулами. Большинство из этих генов действующих, чтобы детерминировать судьбы Mullerian клеток и тем самым собственно качественные особенности MD, экспрессируются в течение всей дифференцировки. Среди этих генов, гомеогены, такие как Hox гены, играют критическую роль в спецификации клеточных характеристик вдоль A-P aоси.
Гомеобоксные (Hox) гены принадлежат крупному семейству из 39 генов, организованных в 4 кластера, Hoxa - Hoxd (HOXA-D у человека), каждый на разной хромосоме. Эти основные онтогенетические гены участвуют в формировании паттерна оси тела животного, предоставляя позиционные качественные особенности посредством молекулярного "Hox code", возникающего в результате сложных пространственно-временных комбинаций Hox белков (Hombria and Lovegrove 2003). Некоторые члены Abdominal-B (Abd-B) like Hox семейства генов, Abd-B Hoxa9 - 13 и Hoxd9 - 13, экспрессируются в виде частично гнездных паттернов в мезенхиме развивающегося MD, создавая специфический Hox код вдоль A-P оси (Dolle et al. 1991; Taylor et al. 1997). Доказательства их роли получены, частично за счет инактивации in vivo генов Hoxa10, Hoxa11, Hoxa13 и Hoxd13 у мыши, это приводило к регион-специфическим альтерациям репродуктивного тракта. Hoxa10- нулевые мутантные мыши обнаруживают аномальные utero-tubular соединение и эпителий матки и переднюю гомеозисную трансформацию верхней части матки в яйцевод-подобные структуры (Benson et al. 1996). У Hoxa11-дефицитных мышей, матка тоньше и короче, чем в норме, а эндометриальные железы не развиваются, указывая на антериоризацию фенотипа (Gendron et al. 1997). Более того, замещение гомеодоменового Hoxa11 на Hoxa13 ведет к задней гомеотической трансформации матки в шейка- и влагалище-подобные структуры (Zhao and Potter 2001). Кроме того, Hoxa13-нулевые мыши обнаруживают агенез дистальной части MD, указывая на роль Hoxa13 не только в дифференцировке, но и также в формировании MD (Warot et al. 1997). Позднее, мутации в кодирующей области HOXA13 , как было установлено, вызывают Hand-foot-genital syndrome (HFGS) у человека, характеризующийся дефектами кистей и стоп, гипоспадией у самцов, дефектом слияния Мюллеровых протоков у женщин и уродствами мочевого тракта у обоих полов (Mortlock and Innis 1997; Goodman et al. 2000).
Помимо своего участия в регрессии MD у самцов, Wnt7a также необходим для корректного формирования паттерна FRT у самок мышей. первоначально экспрессируемый по всему эпителию MD, экспрессия Wnt7a становится постнатально ограниченной яйцеводами и эпителием матки, снижаясь в эпителии влагалища (Miller et al. 1998b). Потеря экспрессии Wnt7a в дифференцирующихся MD ведет к частичной гомеотической трансформации яйцеводов в матку и матки во влагалище (Miller and Sassoon 1998). Т.к. Wnt7a не нужен для индукции и поддержания гена Hoxa, то гены Wnt7a и Hoxa скорее всего действуют в параллельных путях во время развития FRT. В самом деле, комбинаторная регуляция с помощью Hox и Wnt генов возможно происходит в большинстве органогенезов, а значит и во время развития FRT (for a review, see Bondos 2006). Более того, Wnt7a мутантная матка у взрослых демонстрирует атрофический аспект, обусловленный неспособностью к постнатальному росту матки, фенотипу, частично связанному с ролью Wnt7a как супрессора клеточной гибели в FRT (Carta and Sassoon 2004). Кроме того, отсутствие закручивания яйцеводов у Wnt7a-нулевых мышей обусловливается специфической инактивацией β-catenin в мезенхиме MD, это показано с использованием Amhr2-cre линии мышей, при отсутствии каких-либо отклонений в паттерне экспрессии Wnt5a и Wnt7a (Deutscher and Hung-Chang Yao 2007). Этот дефект дифференцировки яйцеводов сопровождается общим гипотрофическим аспектом маточных рогов, фенотип, коррелируемый со снижением клеточной пролиферации как в эпителии, так и мезенхиме Mullerian производных. Итак, делеция β-catenin получаемая с помощью Amhr2-cre трансгена ведет к отложению жировой ткани в стенке матки взрослых, возможно из-за переключения в клеточных судьбах с миогенеза на адипогенез (Arango et al. 2005; Deutscher and Hung-Chang Yao 2007), без влияния на фенотип яичников. Тем не менее, недавние исследования in vitro выявили потребность в β-catenin для нормального овариального стероидогенеза (Hernandez-Gifford et al. 2009).
Учитывая специфичность экспрессии Wnt7a в просветном эпителии матки (Miller et al. 1998b), фенотип Wnt7a нулевых мутантных мышей является результатом критических паракринных взаимодействий между эпителием и стромальными клетками матки. Wnt5a, компонент не-канонического сигнального Wnt пути, экспрессируется в мезенхиме матки, шейки и влагалища (Miller et al. 1998b), является предметом таких взаимодействий. В самом деле, Wnt5a необходим для собственно развития задней части FRT и аденогенеза в матке (Mericskay et al. 2004). Следовательно, участие Wnt7a и Wnt5a в генезе желез в матке подчеркивает необходимость кооперации между сигналами, происходящими от эпителия и стромы во время важных процессов цитодифференцировки. В этом контексте реципрокные взаимодействия, p63, гомолога гена опухолевого супрессора p53, рассматриваются как характерные для переключения дифференцировки эпителия MD в маточную и цервико-вагинальную клеточную судьбу (Ince et al. 2002; Kurita et al. 2004). Помимо этого гомеодоменовый транскрипционный фактор Msx2, способствует нормальной дифференцировке вагинального эпителия и, по-видимому, участвует в регрессии каудальной части WD у самок, способствуя апоптозу (Yin et al. 2006).
Итак, дифференцировка MD в функциональный репродуктивный тракт базируется на сложном генетическом каскаде, при этом кооперация между Wnt и Hox генами является фундаментальной для корректного формирования паттерна и созревания FRT. Примечательно, что многие онтогенетические гены, представленные выше, особенно Hox гены, также регулируются с помощью стероидных гормонов во время эмбриогенеза и у взрослых (Daftary and Taylor 2006). Роль этой эндокринной регуляции в репродуктивном тракте хорошо известна во время эмбрионального развития, но, по-видимому, существенна также и для похожих на развитие процессов у взрослых, таких как менструальный цикл, имплантация эмбриона и беременность.
Изучение последствий пренатальной или перинатальной обработки эндокринными дезинтеграторами, такими как diethylstilbestrol (DES) проливают новый свет на гормональную регуляцию этих генов во время критических периодов развития FRT и может быть пригодным для изучения вопросов эпигенетической регуляции Hox генов.
What about epigenetics?
Epigenetics and environment
Термин эпигенетика означает общий молекулярный феномен, который наследуется от родителей и регулирует экспрессию генов без каких-либо изменений геномной ДНК последовательности. Эти наследуемые эпигенетические изменения включают метилирование ДНК, пост-трансляционные модификации гистоновых хвостов (acetylation, methylation, phosphorylation,..) и ремоделирование хроматина. Эпигеном это набор эпигенетических отпечатков (prints), имеющихся в данном геноме, в данное время и данном типе клеток.
Большинство исследований эпигенетической регуляции показало, что среда может играть важную роль в этом отношении. В самом деле, внешнесредовые химические соединения и токсины, как было показано, изменяют паттерны метилирования ДНК, давая эпигенетические фенотипические отклонения (Cisneros 2004; Anway et al. 2005).
Некоторые исследования показали, что во время критических периодов дифференцировки воздействие низкими внешнесредовыми соотв. дозами некоторых химических соединений, может изменить программу развития. В частности, в двух исследованиях было продемонстрировано, что ксенобиотические химические соединения, такие как tributyltin, присутствующие в PVC пластиках, а также некоторые фунгициды, меняют нормальное развитие и гомеостатический контроль во время адипогенеза и энергетического баланса, приводя к тучности (Grun and Blumberg 2006; Tabb and Blumberg 2006). Более того, недавние работы на мышах Newbold с коллегами подтвердили идею, что кратковременное воздействие средовых химикалий, особенно с эстрогенной активностью, может увеличивать вес тела в соотв. с возрастом (Newbold et al. 2007b; Newbold et al. 2007c). Именно, обработка самок diethylstilbestrol не влияет на вес тела во время экспозиции, но провоцирует позднее увеличение веса тела, сопровождаемое накоплением в теле жира. Кроме того, воздействие на взрослых животных металлами, такими как кадмий или никель, ассоциирует с туморогенезом. Фактически, эти металлы, по-видимому, взаимодействуют с эпигеномом и индуцируют канцерогенные эффекты посредством аномального метилирования ДНК (Salnikow and Costa 2000; Poirier and Vlasova 2002).
Среди вредных химических соединений, т. наз. эндокринные disruptors, характеризующиеся сильными эффектами на развитие организмов. В самом деле, различные натуральные или синтетические молекулы могут вмешиваться в эндокринную систему благодаря связыванию членов семейства внутриклеточных стероидных рецепторов. Это вмешательство в конечном итоге нарушает нормальную функцию ткани или органа, в частности и репродуктивного тракта. Воздействие endocrine-disrupting химикалиями, присутствующими во внешней среде, как было установлено, вызывают множественные нарушения у млекопитающих, такие как аномальная функция тироида и иммунитета, изменения развития репродуктивного тракта, такие как de-masculinization и феминизация самцов, ассоциирующая со снижением плодовитости. Эти вредные эффекты были описаны для многих химических соединений, таких как индустриальные отходы и пестициды (rev. Colborn et al. 1993).
Недавно несколько линий доказательств показали, что эпигенетические адаптации в ответ на in utero питательные и средовые факторы играют важную роль в развитии пластичности и чувствительности к болезням. Waterland с коллегами продемонстрировали, что эпигенетическая регуляция импринтированного гена Igf2 может испытывать влияние со стороны ранней постнатальной пищевой диеты у модельных мышей. В самом деле, в нормальных средовых условиях ген Igf2 экспрессируется с отцовского аллеля, тогда как материнский ген репрессирован за счет импринтинг-молчания. Когда используется диета, дефицитная по methyl-донорам, в течение 60 дней после прекращения материнского вскармливания, то наблюдается гипометилирование отцовского гена, сопровождаемое существенной потерей импринтируемой регуляции гена Igf2 (Waterland et al. 2006). Следовательно, пища может изменять эпигеном у этих молодых животных (Waterland et al. 2006).
Помимо экспериментального диетой обусловленного импринтинга, генеральные внешние условия могут также вести к эпигенетической изменчивости у людей. В качестве др. доказательства средовой модификации эпигенома явилось исследование Fraga с сотр. (Fraga et al. 2005). В наборе моногозиготных близнецов разных возрастов и живущих в разных условиях исследовался эпигенетический профиль каждого индивида путем измерения глобального метилирования CpG и ацетилирования H3 и H4 гистонов. Было установлено, что хотя близнецы являются эпигенетически неотличимы во время ранних лет жизни, старые близнецы обнаруживали удивительные различия в отношении общего содержания и геномного распределения метилирования ДНК и ацетилирования гистонов, которые могут вызывать вариации паттерна экспрессии генов у каждого субъекта. Более того, эти данные четко показывают, более важные различия эпигенома у старых близнецов и близнецов. которые жили отдельно более чем 50% своей жизни (Fraga et al. 2005).
Эпигенетические модификации могут, следовательно, вызываться натуральными и синтетическими химическими соединениями, присутствующими во внешней среде. Эти эпигенетические изменения, по-видимому, ведут к некоторым изменениям генетических программ и, следовательно, к серьезным эффектам на развитие и здоровье человека. Среди органов, которые могут быть затронуты этими соединениями, репродуктивный тракт является очень чувствительной мишенью.
Effects of estrogens on female reproductive tract development
Как упоминалось ранее развитие female reproductive tract (FRT) регулируется стероидными гормонами и особенно эстрогенами, действиующими посредством двух разных рецепторов, обозначенных ERα and ERβ. ERα преимущественно экспрессируются в матке, влагалище, молочных железах и thecal клетках яичников, тогда как ERβ в основном экспрессируется в гранулезных клетках оварий (Couse and Korach 1999; Muramatsu and Inoue 2000). Особая роль ERα в развитии FRT выявляется при разрушении соотв. гена у мышей, что приводит к гипопластичности тканей матки и влагалища (Couse and Korach 1999; Hewitt and Korach 2002).
Молекулярный механизм, запускаемый с помощью стероидных гормонов известен довольно хорошо. В самом деле, стероидные гормоны, сцепленные со специфическими ядерными рецепторами, которые способны соединяться с промоторами генов мишеней и тем самым регулировать процессы пролиферации и/или дифференцировки (Groothuis et al. 2007). Учитывая важность стероидных гормонов в развитии FRT, воздействие эндокринных disruptors может оказывать сильное влияние на эту систему органов. Так, аберрантная временная или продолжительная стимуляция пути передачи сигналов эстрогенов во время развития, как известно,ведет к различным долговременным или необратимым аномалиям (Newbold et al. 1990). В последнее время огромные количества различных химикалий с эстрогенной активностью высвобождается во внешнюю среду. Многие из них могут потенциально влиять на эндокринную систему и тем самым модифицировать чувствительность органов к эндокринным сигналам во время пре- и/или постнатальной жизни, за счет нарушения собственно экспрессии эстрогенами регулируемых генов.
Среди этих соединений, genistein, нестероидный фитоэстроген, присутствует в пище, особенно в продуктах из сои. Человеческие плоды т.о., могут подвергаться воздействию этих молекул во время развития in utero, а также детьми посредством лактации. Newbold с коллегами продемонстрировали, что воздействие на новорожденных мышат genistein ведет к повышению аденокарцином матки в поздний период жизни (Newbold et al. 2001). Более того, этот фитоэстроген может вызывать зависимые от дозы побочные эффекты на яичники: воздействие genistein на новорожденных экологически соотв. дозами вызывает изменения дифференцировки и развития яичников и ведет к образованию фолликулов со множественными ооцитами, всё ещё видимыми в поздний период жизни; при более высоких дозах самки становятся бесплодными (Jefferson et al. 2002). Кроме того, при низких дозах самки обнаруживают минорные величины беременностей, связанные с более маленькими и редкими местами имплантации (Jefferson et al. 2002).
Bisphenol A (BPA) является синтетическим соединением, используемым при производстве многих пластиков, включая пищевые контейнеры и зубные композиты. Эта молекула обладает эстрогенной активностью и как таковая способна индуцировать уродства FRT. В самом деле, недавние эксперименты на мышах выявили ассоциацию BPA с деформациями репродуктивного тракта и с гинекологическими раковыми опухолями. В частности, было отмечено, что воздействие BPA ведет к более раннему открытию влагалища (Honma et al. 2002), к изменению морфологии оварий (Markey et al. 2003; Kim et al., 2009), к пролиферативным повреждениям матки (Newbold et al. 2007a) и к более высокому показателю кистоза яичников (Newbold et al. 2007a).
Наиболее драматическое сообщение об уродствах FRT, индуцируемых синтетическими nonsteroidal estrogen-mimetic молекулами, это аномалии, наблюдаемые у женщин, подвергшихся воздействию in utero DES. Хотя было продемонстрировано, что это химическое соединение неэффективно (Dieckmann et al. 1953), ему приписываются неправильное вынашивание и др. осложнения беременности. Некоторые исследования продемонстрировали, что пренатальное воздействие на самок DES ассоциирует с последующим развитием аномалий репродуктивного тракта. Во-первых, женщины пренатально подвергшиеся воздействию DES, имели "T образную" матку и повышенный показатель паренхиматозных клеточных аденокарцином влагалища и шейки. Во-вторых, эти женщины также обнаруживали повышенный риск спонтанных абортов, эктопических беременностей и преждевременных родов (Kaufman et al. 2000). Эти эпидемиологические исследования были подтверждены экспериментальными исследованиями на мышах, обработанных DES вовремя развития. В самом деле, эти мыши обнаруживали множество уродств матки, характеризующиеся сквамозной метаплазией просветного и железистого эпителия и гиперплазией эндометрия и повышенным риском leiomyomas (Kitajewski and Sassoon 2000). Кроме того, у этих мышей выявлена персистирующая кератинизация эпителия влагалища, ассоциирующая с аденокарциномами, и пролиферативные повреждения яйцеводов (Mclachlan et al. 1980; Couse et al. 2001; Couse and Korach 2004).
Всё это четко демонстрирует, что натуральные или синтетические соединения с эстрогенной активностью, могут вызывать вредные эффекты в FRT и соотв. нарушать репродуктивные функции. Более того, вредные эффекты стероидных disruptors обычно не обнаружимы до достижения потомством возраста зрелости или среднего возраста. Такие молекулы, как было показано. обладают долговременными эффектами на репродукцию самок мышей и женщин. В самом деле, эпидемиологические и экспериментальные исследования подчеркивают, что отклонения в развитии репродуктивного тракта могут быть наследуемыми следующими поколениями, указывая тем самым, что воздействие DES могут вызывать долговременные нарушения регуляции генов. Однако молекулярные механизмы, участвующие в таком наследовании измененных генетических признаков далеки от ясности.
Effects of DES on developmental genes
В качестве первой ступени понимания молекулярных механизмов, участвующих в альтерациях половых путей самок, после воздействия DES, необходимо идентифицировать гены мишени для действия таких молекул. Среди таких генов, Hoxa гены находятся под контролем эстрогенов и прогестерона (Ma et al. 1998). Более того, фенотип, ассоциируемый с экспериментальным воздействием DES. сходен с таковым, наблюдаемым при нокауте Hoxa генов у мышей. Фактически, DES-индуцированные аномалии включают потерю границы между яйцеводами и маткой, что связано с потерей соединения между маткой и трубами, фенотип характерный также для Hoxa-10 мутантных мышей. Ma с сотр. продемонстрировали, что экспрессия Hoxa9, Hoxa10 и Hoxa11 репрессируется с помощью DES в развивающихся репродуктивных протоках мыши после обработки плодов и новорожденных DES (Ma et al. 1998). Эта репрессия генов Hoxa дает удовлетворительное объяснение тератогенных эффектов DES на развитие FRT. Др. признаки экспозиции DES, т.e. аденоз влагалища, аномальное открытие уретры во влагалище и неспособность дистальных частей MD формировать общий канал в шейке, коррелируют с таковыми у Hoxa-13 мутантных мышей. С целью дальнейшей корреляции воздействия DES и экспрессии Hoxa генов, Block с сотр. обрабатывали мышей DES с 9 по 16 день беременности (Block et al. 2000). Они выявили сдвиг кзади экспрессии Hoxa9 и Hoxa10 в репродуктивном тракте самок-потомков. Сходное снижение наблюдалось в переднем домене экспрессии Hoxa11. Авт. подтвердили, что DES-индуцируемые гомеотические трансформации репродуктивного тракта могут быть ответственны за морфологические изменения матки более чем у 70% женщин, подвергшихся in utero действию DES ("T-образная" матка). Фактически, снижение экспрессии Hoxa10 и Hoxa11 и увеличение экспрессии Hoxa9 могут заставлять матку давать ткани, обычно детерминируемые с помощью Hoxa9, т.e. ткань яйцеводов. T-образная матка у подвергшихся действию DES женщин, мможет означать трансформацию в яйцевод-подобные структуры (Block et al. 2000).
Помимо исследований с Hox генами, др. исследователи обнаружили, что DES действует посредством множественных генных путей, вызывая структурные изменения в FRT. Напр., экспозиция DES in utero ведет к подавлению гена Wnt7a в матке плодов до рождения; обычно регуляция гена восстанавливается только спустя 5 дней посвле рождения (Miller et al. 1998a). Интересно, что пренатально обработанные DES мыши и мутанты Wnt7a-/- обнаруживают сходные деформации в FRT. Одна из гипотез объясняет это тем, что DES индуцирует временное подавление Wnt7a во время критического промежутка времени, этого достаточно, чтобы объяснить DES синдром. Во время подавления экспрессии гена Wnt7a репродуктивный тракт самок теряет компетентность отвечать на окружающие сигналы. Эта гипотеза согласуется с экспериментами по трансплантации, показавшими, что эпителий влагалища и матки чувствителен к индукции стромой, когда трансплантация осуществляется между P3-P5. Важно, что эпителии более нечувствительны, если эксперименты проводятся на более поздних стадиях (Cunha 1976b).
Экспрессия онтогенетического гена Msx2 также изменяется в репродуктивном тракте самок после воздействия на плодов DES. В самом деле, Msx2 участвует в дифференцировке эпителия влагалища и необходим для экспрессии Tgf-β2 and -и β3 в репродуктивном тракте (Yin et al. 2006). У мышей после воздействия DES, уровень транскриптов Msx2 существенно ниже, чем физиологический уровень в развивающемся эпителии матки (Huang et al. 2005) и влагалища (Yin et al. 2006). Более того, значительно более тяжелый DES-индуцированный фенотип влагалища наблюдается у Msx2/- мутантных мышей после воздействия DES, это указывает на важную роль этого гена во время эстроген-зависимого роста Mullerian производных и, следовательно, для защиты от побочных эффектов DES (Yin et al. 2006). Однако природа этого защитного механизма остается неизвестной.
Многие онтогенетические гены, участвующие в органогенезе FRT дерегулированы вследствие воздействия
in utero или на новорожденных фармакологического эндокринного disruptor DES. Несмотря на это механизм, с помощью которого эта дерегуляция передается через поколения полностью неизвестен. В самом деле, пока не описаны альтерации паттерна метилирования геномной ДНК при этих условиях. В частности, не наблюдалось изменения паттерна метилирования промоторов
Hoxa10 и Hoxa11 в матке мышей после воздействия на новорожденных DES (Li et al. 2001a). Этот перенос фенотипических признаков без изменения меток метилирования на DES-регулируемых генах является очень неожиданным и нуждается в объяснении.
DES and epigenetics
В течении более 30 лет DES широко предписывали беременным женщинам для предупреждения выкидышей и др. проблем беременности. Позднее была открыта корреляция между этим химическим соединением и репродуктивными дисфункциями. Эпидемиологические исследования показали, что структурные аномалии матки, шейки и влагалища м.могут оставлять 33% у женщин подвергшихся действию in utero DES (Kaufman et al. 2000). Более того мелкоклеточные овариальные карциномы обнаруживались у 15-летних девочек, чьи бабушки по материнской линии, подвергались действию DES во время их беременности (Blatt et al. 2003).
Это наблюдение позднее было подтверждено на мышах в экспериментах с целью понять генетические и эпигенетические механизмы побочных и через поколение эффектов воздействия DES. В целом было установлено, что обработка плодов DES ведет к плохим репродуктивным исходам и позднее к гинекологическим опухолям. Более того, стало очевидным, что побочные эффекты DES, такие как чувствительность к опухолям, могут передаваться последующим поколениям, как мужчинами, так и женщинами. Проводились эксперименты по экспозиции мышей разными дозами DES на разных стадиях беременности и у F1 и F2 самок, скрещенных с не подвергшимися действию самцами. Впервые стало ясно, что плодовитость F2 самок на затрагивается в отличие от F1 самок. Однако F2 мыши обнаруживали высокие частоты опухолей, подобно тому, что наблюдалось у F1 (Walker and Haven 1997). Это исследование в дальнейшем было подтверждено, при этом F2 самки обнаруживали показатели опухолей (включая аденокарциномы матки) более высокие, чем в контроле, но более низкие, чем у F1 мышей (Newbold et al. 1998).
Передача специфических повреждений репродуктивного тракта самок, таких как маточные аденокарциномы, последующим поколениям, по-видимому, трудно объяснить без привлечения эпигенетических механизмов. Хотя эпигенетические модификации не были обнаружены в ключевых для развития генах, таких как Hoxa (Li et al. 2001b), но модификации метилирования ДНК были описаны для др. генов после обработки DES (Newbold et al., 1997; Tang et al., 2008). Напр., чувствительный к estrogen ген lactoferrin, по-видимому, активируется в матке мыши после обработки новорожденных DES; эта аномальная экспрессия сохраняется и в более поздний период жизни (Nelson et al. 1994) и может быть связана с аномальным деметилированием промотора гена lactoferrin, которое, по-видимому, осуществляется специфически в ответ на воздействие DES на новорожденных (Li et al. 1997). Более того, это состояние деметилирования постоянно поддерживается в маточных опухолях DES-экспозированных мышей, указывая тем самым, что обработка DES новорожденных может не только индуцировать образование опухолей, но и также ген-специфическое деметилирование посредством обычных клеточных процессов, таких как альтерации экспрессии DNA methyltransferases и метилирования геномной ДНК (Li et al. 1997; Sato et al. 2009). Последующие работы продемонстрировали, что др. онтогенетические гены, активируемые после воздействия DES, также обнаруживают модифицированные паттерны метилирования. Напр., протоонкоген c-fos является одним из рано и постоянно индуцируемых генов в эпителии матки мышей. подвергшихся стимуляции эстрогеном (Loose-Mitchell et al. 1988). Более того, этот ген, как известно, играет важную роль в пролиферации эпителия матки и туморогенезе матки. Установлено, что урожай неметилированных CpGs в exon-4 этого гена выше у новорожденных мышей, подвергшихся действию DES, чем в необработанном контроле (Li et al. 2003). Хотя следствия уровня гипометилирования этих двух генов остаются неясными, предполагается, что паттерн метилирования геномной ДНК может передаваться последующим поколениям (Holliday 1990). Тот факт, что F2 мыши, которые не были подвергнуты действию DES, обнаруживают маточные аденокарциномы, может быть объяснен передачей модифицированного паттерна метилирования генов, участвующих в клеточном гомеозе, таких как протоонкоген c-fos. Кроме того, как упоминалось ранее, genistein является соединением, обладающим эстрогенной активностью и способен индуцировать образование фолликулов со многими ооцитами у обработанных DES новорожденных (Jefferson et al. 2002). Интересно, что комплементарное исследование показало, что F2 самки мыши также обнаруживают мультиооцитарные фолликулы, хотя не подвергались действию genistein (Jefferson et al. 2007).
Передача эпигенетического паттерна трудно воспринималась многими учеными вплоть до недавнего времени. Вся литература по DES, а также др. исследования, осуществленные Cropley с сотр. подтвердили значение трансмиссии эпигенома через последующие поколения (Cropley et al. 2006). Эти авт. показали, что кормление беременных A
vy/a мышей пищей с methyl donor не только сдвигает окраску шерсти у их потомков в направлении коричневого конца спектра (Wolff et al. 1998), но и также затрагивает следующее поколение точно также, показывая, что диета бабушек может влиять на эпигенетический статус её внучат (Cropley et al. 2006) благодаря стабильной модификации эпигенетического состояния зародышевой линии (Cropley et al. 2007).
Conclusion
The venue of epigenetic research has allowed scientists to interpret some inexplicable malformative pathologies or environmental induced diseases such as cancers or allergies. Indeed, epigenetics could explain not only the discordances observed between monozygous twins but also phenomena such as incomplete penetrance, variable expression, sporadic cases and provide a novel viewpoint for understanding normal and aberrant development. The study of epigenetic mechanisms involved in such normal and pathologic processes constitutes thus a new exciting approach of investigation. In addition, considering that most epigenetic alterations are reversible both in vitro and in vivo, it suggests that a new therapy targeting complexes that catalyse epigenetic modifications could be found in the future.
Сайт создан в системе
uCoz
Fig. 1. Model for Mullerian duct development. At E11.75, after a subset of coelomic epithelium cells (represented in green) are specified, they invaginate in the intermediate mesoderm. Then, the invaginating cells form the Mullerian duct (M, represented in pink). Anteriorly, the funnel is opened in the abdominal cavity, and caudally, the growing tip extends to and contacts the Wolffian ducts (W, represented in blue) at E12.0. A phase of elongation allows the Mullerian duct to elongate posteriorly in very close contact with the Wolffian duct. As soon as the Mullerian duct growing tip has deposited cells and elongated caudally, the physical contact between the ducts is lost by the appearance of mesenchymal cells around the Mullerian duct epithelium. At E13.5, the two Mullerian ducts reach the urogenital sinus and fuse together. Developmental stages indicated in this figure correspond to mice stages.