Клетки Печени и Поджелудочной Железы

Generation and Regeneration of Cells of the Liver and Pancreas Kenneth S. Zaret and Markus Grompe SCIENCE VOL 322, No.5907, P.1490-1494, 2008
Liver and pancreas progenitors develop from endoderm cells in the embryonic foregut. Shortly after their specification, liver and pancreas progenitors rapidly acquire markedly different cellular functions and regenerative capacities. These changes are elicited by inductive signals and genetic regulatory factors that are highly conserved among vertebrates. Interest in the development and regeneration of the organs has been fueled by the intense need for hepatocytes and pancreatic β cells in the therapeutic treatment of liver failure and type I diabetes. Studies in diverse model organisms have revealed evolutionarily conserved inductive signals and transcription factor networks that elicit the differentiation of liver and pancreatic cells and provide guidance for how to promote hepatocyte and β cell differentiation from diverse stem and progenitor cell types.	Печень и поджелудочная железа скоординировано контролируют метаболизм тела, включая модификации переваренных питательных веществ с помощью гепатоцитов в печени и регуляции уровня глюкозы в крови с помощью инсулина, секретируемого β клетками поджелудочной железы. Печеночные гепатоциты являются крупными, часто полиплоидными клетками, которые секретируют сывороточные белки, экспрессируют энзимы, которые нейтрализуют токсиканты, продуцируют желчные кислоты, предназначенные для переваривания и контролируют общую массу промежуточного обмена веществ. Желчные протоки из холангиоцитов, др. эпителиальные типы клеток печени, служат прежде всего как проводники секретируемой желчи. Напротив, характерные панкреатические функции подразделены между большим количеством типов клеток. Панкреатические клетки включают insulin (P), glucagon (a), somatostatin, ghrelin и панкреатические полипептид-секретирующие эндокринные типы, каждый из которых продуцирует одиночный гормон. Поджелудочная железа содержит также клетки экзокринного типа, которые составляют основную массу ткани и включают ацинарные клетки, которые продуцируют переваривающие энзимы, и клетки протоков, которые обеспечивают путь энзимам в кишечник. Огромное разнообразие клеточных типов поджелудочной железы обеспечивается огромным набором регуляторных факторов и клональными решениями во время органогенеза. Клинические исследования показали, что трансплантация гепатоцитов могут поддерживать функцию поврежденной печени и корректировать метаболические печеночные болезни в течение длительных сроков. Сходным образом, островки умерших могут в течение нескольких лет поддерживать гомеостаз глюкозы у пациентов с type I диабетом. Two Progenitor Domains for Each Tissue Печень и панкреас наземных животных каждая развиваются из двух разных пространственных доменов эмбриональной передней кишки. Эксперименты по картированию судеб показали, что печень возникает из латеральных доменов энтодермы развивающейся вентральной части передней кишки (3, 4) , а также из небольшой группы энтодермальных клеток, прослеживаемых ниже вентральной срединной линии (4) (Fig. 1A). Во время закрытия передней кишки медиальный и латеральный домены приходят в соприкосновение (Fig. 1A, green arrows) когда специфицируется печеночная энтодерма. Поджелудочная железа также индуцируется из доменов латеральной энтодермы, соседствующей и более каудальной по отношению к боковым доменам печени, и клетки дорсальной срединной линии передней кишки (5, 6) (Fig. 1A). Эти Fig. 1. Cell domains and signals for embryonic liver and pancreas specification. (A) Fate map of progenitor cell domains before tissue induction; view is into the foregut of an idealized mouse embryo at E8.25 (three- to four-somite stage). Green arrows indicate movement of lateral progenitor regions toward the ventral-medial region. (B) Sagittal view of a mouse embryo several hours later than in (A) showing the positions of the newly specified liver and pancreas tissue domains. Signals and cell sources that pattern the endoderm are shown. Dashed blue line indicates plane of view in (A). события происходят на 8.5 день беременности у мышей (E8.5), что соответствует примерно 3 неделям беременности у людей. После того, как домены специфицированы и начинают морфогенетическое отпочкование, дорсальный и вентральный панкреатические зачатки сливаются, чтобы создать железу. Не смотря на различия того, как разные домены предшественники специфицируются, производные обоих панкреатических доменов предшественников продуцируют эндокринные и экзокринные клетки, а производные обоих печеночных доменов предшественников вносят вклад в клетки дифференцирующихся зачатков печени (3-6). Генетические клон-маркирующие исследования необходимы для определения степени, с которой разные производные внутри каждой ткани могут отличаться в отношении функционального и регенеративного потенциала. Signals Specifying Hepatic and Pancreatic Progenitors Эксперименты по рекомбинации эмбриональных тканей и генетические подходы на курах, лягушках, мышах и рыбках данио показали, что домены печени и поджелудочной железы специфицируются в энтодермальном эпителии под действие индуктивных сигналов от соседних мезодермальных клеток (7, 8). Мало известно о том, как сигнальные гены в мезодерме контролируются, но удивительно как хорошо индуктивные сигналы законсервированы среди животных позвоночных моделей. Первоначально широкая супрессия передачи сигналов мезодермальных Wnt и fibroblast growth factor 4 (FGF4) в передней кишке делает возможной индукцию печени и панкреас, тогда как активная передача сигналов Wnt в задней кишке супрессирует эти тканевые судьбы (9,10) (Fig. IB). Передача сигналов ретиноевой кислоты, по-видимому, от параксиальных мезодермальных клеток, помогает ещё больше предопределить передне-заднюю позиции, которых печень и поджелудочная железа будут развиваться из энтодермы кишки (11-14). В дальнейшем в вентральной части передней кишки FGF от кардиальной мезодермы и bone morphogenetic protein (BMP) от мезенхимных клеток septum transversum скоординированно индуцируют печеночную программу и супрессируют программу панкреас (15-18). Mitogen-activated protein kinase (MAPK) активируется в ответ на FGF в латеральных печеночных предшественниках и ещё до активации MAPK в медиальных печеночных предшественниках, это отражается в очевидных различиях в формировании паттерна (19). Во время закрытия передней кишки клетки латеральной вентральной энтодермы, которые движутся каудально к кардиальному домену, избегают FGF и могут инициировать развитие вентральной части панкреас (20). В дорсальной части передней кишки сигналы от хорды, которые включают activin и FGF супрессируют передачу сигналов sonic hedgehog (shh) внутри энтодермы и это делает возможной панкреатическую программу (21, 22). Все представленные выше события происходят в течении неск. часов у эмбрионов позвоночных. Вновь специфицированные печеночные клетки у эмбрионов, обозначаются как гепатобласты. Эти клетки экспрессируют гены сывороточных белков, специфичные для гепатоцитов, такие как albumin (alb) и transthyretin (ttr), они, по-видимому, бипотентны и позденее дают гепатоциты и cholangiocytes (23); однако формально генетические клональные исследования ещё предстоит сделать. Ген Tbx3 помогает расширению популяции гепатобластов путем супрессии p!9ARF (24). Вновь специфицированная панкреатическая энтодерма первоначально маркирована экспрессией генов транскрипционных факторов Pdx1 и затем Ptfla (25,26), которые являются критическими для развития поджелудочной железы; Pdx1 экспрессируется также в соседних предшественниках двенадцатиперстной кишки (27, 28). Changes in Signal Responses as Development Proceeds Клеточные реакции на индуктивные сигналы включают активацию и репрессию генов транскрипционных факторов, которые, в свою очередь, вызывают новые программы генной экспрессии, необходимые для клеточной дифференцировки. Программы новых типов клеток могут изменять клеточные реакции на экзогенные сигналы. Как это в случае с FGFs, которые необходимы только временно. чтобы помочь формированию паттерна энтодермы передней кишки (19, 29), а позднее способствуют экспансии вновь специфицированных популяций клеток предшественников (16, 30). Передача сигналов Shh первоначально способствует развитию дорсальной части панкреас у рыбок данио (31, 32) , а позднее, по-видимому, супрессирует её (33). передача сигналов Wnt первоначально ингибирует индукцию печени (9) , но вскоре после этого способствует росту и дифференцировке зачатка печени (9, 34, 35). Каждое из этих изменений в клеточных реакциях на индуктивные сигналы происходит менее чем за день эмбриогенеза позвоночных. Лежащий в основе механизм неизвестен. Organ Morphogenesis and Cell-Type Differentiation После того как гепатобласты и панкреатические предшественники специфицированы осуществляется соотв. переход энтодермальных клеток от кубовидной формы к цилиндрической и затем они становятся псевдо-стратифицированными в эпителии (Fig. 2). Этот процесс сходен с таковыми морфогенетическими характеристиками развития нервного эпителия и контролируется в передней кишке с помощью гена гомеобоксного транскрипционного фактора Hhex (36). Панкреатический эпителий затем ветвится в строму, чтобы создать панкреатический зачаток; в то время как базальная ламина печеночного эпителия разрывается и клетки пролиферируют в окружающую строму. Эти последние морфологические изменения контролируются с помощью генов гомеобоксных транскрипционных факторов Prox1 (37), Hnf6/OC-1 и OC-2 (38) (Fig. 2). Hnf6 и OC-2 регулируют E-cadherin, thrombospondin-4 и Sppl, которые контролируют клеточную адгезию и миграцию в разных контекстах. Печень плода служит в качестве места перехода для гематопоэза у амниот. Поэтому жизнеспособность плода зависит от собственно роста печени. Т.к. предшественники обеих тканей отпочковываются в строму, то они оказываются по соседству с и получают стимулирующие сигналы от ближайших эндотелиальных клеток (39-41). Эндотелиальные клетки способствуют также регенерации печени после повреждения ткани, по-видимому, за счет передачи сигналов hepatocyte growth factor (HGF) (42). Специфические молекулярные сигналы, продуцируемые эндотелиальными клетками в эмбриональном контексте не описаны, но sphingosine-1-phosphate в кровообращении, высвобождаемый эндотелием, способствует отпочкованию дорсальной части панкреас (43). Возникающие сосудистые системы в печеночных и панкреатических зачатках снабжают кислородом и питательными веществами и в конечном итоге делают возможной эндокринную функцию (44). Клетки нервного гребня мигрируют в развивающуюся поджелудочную железу и т.к. они развиваются в нейроны, то влияют на количество P клеток (45). Стимулирующие роли эндотелиальных клеток и клеток нервного гребня иллюстрируют насколько критической является совместная дифференцировка стромального окружения с таковой печеночных и панкреатических предшественников. Внутри зачатков печени и панкреас компоненты передачи сигналов Notch важны для создания собственно баланса количества гепатоцитов и cholangiocytes из гематобластов (46, 47) и эндокринных и экзокринных клеток из клеток панкреатических предшественников (48-50). Потеря передачи сигналов Notch создает преимущества эндокринному клону, который метится и нуждается в гене транскрипционного фактора Ngn3 (25, 48,51). в Элегантные генетические клональные исследования показали, что панкреатический зачаток развивается в орган, Cpal-позитивные клетки на дистальных кончиках ветвящегося эпителия являются мультипотентными предшественниками, которые дают протоки и эндокринные производные вдоль ствола веточек, практически приблизительно до ст. E14 у мышей (52). После того, как Cpal-позитивные клетки дают ацинарные клетки, это соответствует времени "вторичного перехода", когда дефинитивные β-клетки возникают под действием Mafa транскрипционного фактора (53, 54). Дальнейшие исследования генетических клонов, генов транскрипционных факторов, которые выявляют дифференцировку панкреатических и печеночных клеток, и параметров, которые влияют на рост, продемонстрированы на Fig. 3 и были рассмотрены в др. обзорах (23, 55-57). Существуют заметные различия в том, как специфицируются дорсальные и вентральные панкреатические предшественники (Fig. 3)(47), это указывает на гибкость способов, с помощью которых панкреатические клетки могут быть специфицированы из стволовых клеток. Liver Regeneration Регенерация печени после повреждений не связана со стволовыми клетками или клетками предшественниками, а связана с митозами зрелых клеток (58). Регенеративная способность гепатоцитов может быть оценена на животных моделях повторного заселения печени, при котором трансплантированные клетки обнаруживают селективные преимущества пред клетками хозяина (59). При использовании таких моделей было показано, что зрелые полиплоидные гепатоциты обладают схожей со стволовыми клетками регенеративной способностью, что гематопоэтические стволовые клетки, и способны делиться более 100 раз без потери функции (60). Гепатоциты человека также высоко регенеративны (61) и эта способность к регенерации устанавливается на самых ранних эмбриональных стадиях (36). К сожалению, пока ещё не доказана возможность расти и расширяться для популяций гепатоцитов в культуре клеток или поддерживать свою дифференцировку. Даже при наиболее сложной ростовой среде гепатоциты активно дедифференцируются в течение нескольких часов после помещения (62). Т.о., функции взрослых гепатоцитов, включая клеточные деления, по-видимому, зависят от сложных взаимодействий с др. клетками в трехмерном матриксе. Системы совместного культивирования, пытающиеся воспроизвести эту организацию подают надежды решения этих проблем (63). Взрослая печень также обладает факультативными предшественниками, которые может быть активированы в ответ на специфические повреждения (Fig. 4), обычно в условиях нарушенной репликации гепатоцитов. Предшественники дают промежуточный тип клеток, часто наз. "oval cells,"которые, как полагают, дифференцируются как в желчный эпителий, так и гепатоциты (58). Однако, овальные клетки не являются гомогенной популяцией (64), и их кажущаяся мультипотентность не была продемонстрирована с помощью отслеживания дефинитивных клонов. У крыс овальные клетки напоминают эмбриональные гепатобласты, которые экспрессируют маркеры как желчных протоков, так гепатоцитов, а также α -fetoprotein (58). Т.о., активация клеток предшественников у взрослых использует некоторые из тех же самых генетических программ, используемых во время развития (65). Детали точного происхождения взрослых печеночных предшественников и сигналы. которые управляют их активацией неясны. Pancreas Regeneration В то время как гепатоциты способны к значительной регенерации, способность β клеток распространяться более ограничена, особенно у взрослых. Некоторая степень регенерации может происходить у молодых животных после физиологических стимулов, таких как беременность (66) или повреждение (частичная pancreatectomy) (67). Однако, эта частичная способность к росту недостаточна, чтобы позволить восстановиться от потери клеток при типа I диабете, пока это возможно за счет подавления аутоиммунитета (68). Ограниченная регенеративная способность эндокринной части панкреас может быть связана с ограниченным количеством панкреатических предшественников, которые неспособны к компенсаторному росту в ответ на потерю клеток (69). Напротив, гепатобласты могут увеличивать свою пролиферативную скорость в ответ на дисфункциональные клетки в их середине(36). Отсутствие регенерации β клеток вызывает существенный интерес к потенциалу тканевой репарации с помощью резидентных стволовых клеток. Остается спорным, существуют ли предшественники во взрослой поджелудочной железе. Ясно, что большинство новых β клеток происходит из предсуществующих инсулин-экспрессирующих клеток после хирургических повреждений (67, 70), но недавняя работа показала, что перевязка протока может активировать Ngn3-позитивные β клетки Liver lineages Fig. 3. Regulatory factors controlling cell type lineages within the liver and pancreas. Transcription factor genes are shown in bold; their functions have been reviewed in the text and elsewhere (23, 55-57), except for vHnfl in hepatic development (81). Pdxl initially marks duodenum and caudal stomach progenitors (not shown) as well as the pancreatic domains (28). Fig. 4. Progenitor lineage relationships in adult liver and pancreas. The thickness of the arrows indicates the dominant mode of regeneration. Dashed lines delineate rare or hypothetical cell-fate transitions that occur only under specific experimental conditions. предшественники в эпителии протоков (71). Т.о., предшественники взрослой поджелудочной железы существуют и их активация зависит от специфических повреждений, как это происходит с инициацией овальных клеток в печени (Fig. 4). Creating Hepatocytes and β Cells de Novo Современная неспособность размножать человеческие гепатоциты in vitro является помехой не только для клеточной терапии, но и также для разработки фармацевтических лекарств, т.к. клетки важны для оценки метаболизма ксенобиотиков. Т.о., генерация гепатоцитов из способных к увеличению предшественников может представлять существенный интерес. Клетки со свойствами действительно идентичными тем, что у печеночных овальных клеток, могут также появляться в поджелудочной железе, особенно после устранения ацинарных клеток (72). После трансплантации эти происходящие из панкреас овальные клетки могут дифференцироваться в функциональные гепатоциты и желчные протоки (73). Некоторые сообщения предполагают, что реципрокная трансдифференцировка также возможна; т.е. превращение печеночных клеток в направлении панкреатической эндокринной судьбы (74). Форсированная экспрессия панкреатических транскрипционных факторов выявляет экспрессию инсулина в печеночных клетках и корректирует экспериментальный диабет (75). Итак, эти находки указывают на то, что как взрослая печень, так и панкреас содержат клетки с эпигенетической памятью об их общем эмбриональном происхождении. Существование потенциальных предшественников β клеток во взрослой печени представляет интерес для медицины. Т.к. панкреатические экзокринные клетки сильно превосходят в числе β клетки, то интересно бы знасть, можно ли их перепрограммировать, чтобы получить функциональные β клетки in vivo с помощью доставки вирусами онтогенетических транскрипционных факторов Pdxl, Ngn3, and Mafa (76). Плюрипотентные стволовые клетки, включая embryonic stem cells (ESCs) и induced pluripotent stem cells (iPSCs), являются потенциально обильным источником для гепатоцитов и β клеток. Многочисленные группы разрабатывают протокол дифференцировки ESC, которые могли бы воспроизвести нормальное эмбриональное развитие. Первой ступенью панкреатического и печеночного развития является индукция дефинитивной энтодермы с помощью activin A (77). Дальнейшая обработка с помощью BMP-4 и bFGF может затем направить клетки в направлении печеночного клона (78). В протоколе, разработанном для дифференцировки в направлении эндокринных панкреатических клеток, дефинитивная энтодерма обрабатывалась последовательно keratinocyte growth factor (KGF), retinoic acid, Noggin и cyclopamine (79, 80). Несмотря на удивительный прогресс возникающие клетки часто неспособны достичь полной функциональности, достаточной для регенеративной терапии, остаются лишь "hepatocyte- or β cell-like." Пока неясно, насколько точно известные онтогенетические сигналы могут быть организованы, чтобы запускать собственно программу печеночных или панкреатических клеток по желанию, но детальные исследования активируемых сигнальных путей и их перекрестно-регуляторных взаимодействий во время эмбриогенеза м. оказаться информативными. Future Prospects Two basic opportunities for medical application of the knowledge of the developmental biology of the liver and pancreas have emerged. The first is the application of the precise conditions that exist within the embryo to differentiate pluripotent stem cells. The sequential and exactly timed use of extracellular factors and accessory cell types (such as endothelium and mesenchyme) is predicted to mimic embryogenesis and thus yield highly functional derivatives for transplantation and other applications. In this setting, competent cells respond to extrinsic signals that act on their epigenome. The second approach is to use genetic reprogramming to directly change cell fates by taking advantage of transcriptional activators, repressors, and chromatin modifiers. This method can work in vivo as well as in culture and can be applied to adult epigenetic relatives of the desired cell type. Thus, it may be possible to enhance tissue regeneration in situ without the complications of cell engraft-ment and immunological rejection. However, it will be important to overcome the potential problems of insertional mutagenesis, in which stable gene integration is involved, as well as undesired transgene expression changes and physiologic responses to viral gene delivery. Emphasis is required on both approaches to use the signals and regulatory factors from developmental biology to sculpt the differentiation of progenitor and stem cells to liver and pancreas cell fates.

Печень и поджелудочная железа скоординировано контролируют метаболизм тела, включая модификации переваренных питательных веществ с помощью гепатоцитов в печени и регуляции уровня глюкозы в крови с помощью инсулина, секретируемого β клетками поджелудочной железы. Печеночные гепатоциты являются крупными, часто полиплоидными клетками, которые секретируют сывороточные белки, экспрессируют энзимы, которые нейтрализуют токсиканты, продуцируют желчные кислоты, предназначенные для переваривания и контролируют общую массу промежуточного обмена веществ. Желчные протоки из холангиоцитов, др. эпителиальные типы клеток печени, служат прежде всего как проводники секретируемой желчи. Напротив, характерные панкреатические функции подразделены между большим количеством типов клеток. Панкреатические клетки включают insulin (P), glucagon (a), somatostatin, ghrelin и панкреатические полипептид-секретирующие эндокринные типы, каждый из которых продуцирует одиночный гормон. Поджелудочная железа содержит также клетки экзокринного типа, которые составляют основную массу ткани и включают ацинарные клетки, которые продуцируют переваривающие энзимы, и клетки протоков, которые обеспечивают путь энзимам в кишечник. Огромное разнообразие клеточных типов поджелудочной железы обеспечивается огромным набором регуляторных факторов и клональными решениями во время органогенеза.

Клинические исследования показали, что трансплантация гепатоцитов могут поддерживать функцию поврежденной печени и корректировать метаболические печеночные болезни в течение длительных сроков. Сходным образом, островки умерших могут в течение нескольких лет поддерживать гомеостаз глюкозы у пациентов с type I диабетом.

Two Progenitor Domains for Each Tissue

Печень и панкреас наземных животных каждая развиваются из двух разных пространственных доменов эмбриональной передней кишки. Эксперименты по картированию судеб показали, что печень возникает из латеральных доменов энтодермы развивающейся вентральной части передней кишки (3, 4) , а также из небольшой группы энтодермальных клеток, прослеживаемых ниже вентральной срединной линии (4) (Fig. 1A). Во время закрытия передней кишки медиальный и латеральный домены приходят в соприкосновение (Fig. 1A, green arrows) когда специфицируется печеночная энтодерма. Поджелудочная железа также индуцируется из доменов латеральной энтодермы, соседствующей и более каудальной по отношению к боковым доменам печени, и клетки дорсальной срединной линии передней кишки (5, 6) (Fig. 1A). Эти

Fig. 1. Cell domains and signals for embryonic liver and pancreas specification. (A) Fate map of progenitor cell domains before tissue induction; view is into the foregut of an idealized mouse embryo at E8.25 (three- to four-somite stage). Green arrows indicate movement of lateral progenitor regions toward the ventral-medial region. (B) Sagittal view of a mouse embryo several hours later than in (A) showing the positions of the newly specified liver and pancreas tissue domains. Signals and cell sources that pattern the endoderm are shown. Dashed blue line indicates plane of view in (A).

события происходят на 8.5 день беременности у мышей (E8.5), что соответствует примерно 3 неделям беременности у людей. После того, как домены специфицированы и начинают морфогенетическое отпочкование, дорсальный и вентральный панкреатические зачатки сливаются, чтобы создать железу. Не смотря на различия того, как разные домены предшественники специфицируются, производные обоих панкреатических доменов предшественников продуцируют эндокринные и экзокринные клетки, а производные обоих печеночных доменов предшественников вносят вклад в клетки дифференцирующихся зачатков печени (3-6). Генетические клон-маркирующие исследования необходимы для определения степени, с которой разные производные внутри каждой ткани могут отличаться в отношении функционального и регенеративного потенциала.

Signals Specifying Hepatic and Pancreatic Progenitors

Эксперименты по рекомбинации эмбриональных тканей и генетические подходы на курах, лягушках, мышах и рыбках данио показали, что домены печени и поджелудочной железы специфицируются в энтодермальном эпителии под действие индуктивных сигналов от соседних мезодермальных клеток (7, 8). Мало известно о том, как сигнальные гены в мезодерме контролируются, но удивительно как хорошо индуктивные сигналы законсервированы среди животных позвоночных моделей. Первоначально широкая супрессия передачи сигналов мезодермальных Wnt и fibroblast growth factor 4 (FGF4) в передней кишке делает возможной индукцию печени и панкреас, тогда как активная передача сигналов Wnt в задней кишке супрессирует эти тканевые судьбы (9,10) (Fig. IB). Передача сигналов ретиноевой кислоты, по-видимому, от параксиальных мезодермальных клеток, помогает ещё больше предопределить передне-заднюю позиции, которых печень и поджелудочная железа будут развиваться из энтодермы кишки (11-14). В дальнейшем в вентральной части передней кишки FGF от кардиальной мезодермы и bone morphogenetic protein (BMP) от мезенхимных клеток septum transversum скоординированно индуцируют печеночную программу и супрессируют программу панкреас (15-18). Mitogen-activated protein kinase (MAPK) активируется в ответ на FGF в латеральных печеночных предшественниках и ещё до активации MAPK в медиальных печеночных предшественниках, это отражается в очевидных различиях в формировании паттерна (19). Во время закрытия передней кишки клетки латеральной вентральной энтодермы, которые движутся каудально к кардиальному домену, избегают FGF и могут инициировать развитие вентральной части панкреас (20). В дорсальной части передней кишки сигналы от хорды, которые включают activin и FGF супрессируют передачу сигналов sonic hedgehog (shh) внутри энтодермы и это делает возможной панкреатическую программу (21, 22). Все представленные выше события происходят в течении неск. часов у эмбрионов позвоночных.

Вновь специфицированные печеночные клетки у эмбрионов, обозначаются как гепатобласты. Эти клетки экспрессируют гены сывороточных белков, специфичные для гепатоцитов, такие как albumin (alb) и transthyretin (ttr), они, по-видимому, бипотентны и позденее дают гепатоциты и cholangiocytes (23); однако формально генетические клональные исследования ещё предстоит сделать. Ген Tbx3 помогает расширению популяции гепатобластов путем супрессии p!9ARF (24). Вновь специфицированная панкреатическая энтодерма первоначально маркирована экспрессией генов транскрипционных факторов Pdx1 и затем Ptfla (25,26), которые являются критическими для развития поджелудочной железы; Pdx1 экспрессируется также в соседних предшественниках двенадцатиперстной кишки (27, 28).

Changes in Signal Responses as Development Proceeds

Клеточные реакции на индуктивные сигналы включают активацию и репрессию генов транскрипционных факторов, которые, в свою очередь, вызывают новые программы генной экспрессии, необходимые для клеточной дифференцировки. Программы новых типов клеток могут изменять клеточные реакции на экзогенные сигналы. Как это в случае с FGFs, которые необходимы только временно. чтобы помочь формированию паттерна энтодермы передней кишки (19, 29), а позднее способствуют экспансии вновь специфицированных популяций клеток предшественников (16, 30). Передача сигналов Shh первоначально способствует развитию дорсальной части панкреас у рыбок данио (31, 32) , а позднее, по-видимому, супрессирует её (33). передача сигналов Wnt первоначально ингибирует индукцию печени (9) , но вскоре после этого способствует росту и дифференцировке зачатка печени (9, 34, 35). Каждое из этих изменений в клеточных реакциях на индуктивные сигналы происходит менее чем за день эмбриогенеза позвоночных. Лежащий в основе механизм неизвестен.

Organ Morphogenesis and Cell-Type Differentiation

После того как гепатобласты и панкреатические предшественники специфицированы осуществляется соотв. переход энтодермальных клеток от кубовидной формы к цилиндрической и затем они становятся псевдо-стратифицированными в эпителии (Fig. 2). Этот процесс сходен с

таковыми морфогенетическими характеристиками развития нервного эпителия и контролируется в передней кишке с помощью гена гомеобоксного транскрипционного фактора Hhex (36). Панкреатический эпителий затем ветвится в строму, чтобы создать панкреатический зачаток; в то время как базальная ламина печеночного эпителия разрывается и клетки пролиферируют в окружающую строму. Эти последние морфологические изменения контролируются с помощью генов гомеобоксных транскрипционных факторов Prox1 (37), Hnf6/OC-1 и OC-2 (38) (Fig. 2). Hnf6 и OC-2 регулируют E-cadherin, thrombospondin-4 и Sppl, которые контролируют клеточную адгезию и миграцию в разных контекстах. Печень плода служит в качестве места перехода для гематопоэза у амниот. Поэтому жизнеспособность плода зависит от собственно роста печени.

Т.к. предшественники обеих тканей отпочковываются в строму, то они оказываются по соседству с и получают стимулирующие сигналы от ближайших эндотелиальных клеток (39-41). Эндотелиальные клетки способствуют также регенерации печени после повреждения ткани, по-видимому, за счет передачи сигналов hepatocyte growth factor (HGF) (42). Специфические молекулярные сигналы, продуцируемые эндотелиальными клетками в эмбриональном контексте не описаны, но sphingosine-1-phosphate в кровообращении, высвобождаемый эндотелием, способствует отпочкованию дорсальной части панкреас (43). Возникающие сосудистые системы в печеночных и панкреатических зачатках снабжают кислородом и питательными веществами и в конечном итоге делают возможной эндокринную функцию (44).

Клетки нервного гребня мигрируют в развивающуюся поджелудочную железу и т.к. они развиваются в нейроны, то влияют на количество P клеток (45). Стимулирующие роли эндотелиальных клеток и клеток нервного гребня иллюстрируют насколько критической является совместная дифференцировка стромального окружения с таковой печеночных и панкреатических предшественников.

Внутри зачатков печени и панкреас компоненты передачи сигналов Notch важны для создания собственно баланса количества гепатоцитов и cholangiocytes из гематобластов (46, 47) и эндокринных и экзокринных клеток из клеток панкреатических предшественников (48-50). Потеря передачи сигналов Notch создает преимущества эндокринному клону, который метится и нуждается в гене транскрипционного фактора Ngn3 (25, 48,51). в

Элегантные генетические клональные исследования показали, что панкреатический зачаток развивается в орган, Cpal-позитивные клетки на дистальных кончиках ветвящегося эпителия являются мультипотентными предшественниками, которые дают протоки и эндокринные производные вдоль ствола веточек, практически приблизительно до ст. E14 у мышей (52). После того, как Cpal-позитивные клетки дают ацинарные клетки, это соответствует времени "вторичного перехода", когда дефинитивные β-клетки возникают под действием Mafa транскрипционного фактора (53, 54). Дальнейшие исследования генетических клонов, генов транскрипционных факторов, которые выявляют дифференцировку панкреатических и печеночных клеток, и параметров, которые влияют на рост, продемонстрированы на Fig. 3 и были рассмотрены в др. обзорах (23, 55-57). Существуют заметные различия в том, как специфицируются дорсальные и вентральные панкреатические предшественники (Fig. 3)(47), это указывает на гибкость способов, с помощью которых панкреатические клетки могут быть специфицированы из стволовых клеток.

Liver Regeneration

Регенерация печени после повреждений не связана со стволовыми клетками или клетками предшественниками, а связана с митозами зрелых клеток (58). Регенеративная способность гепатоцитов может быть оценена на животных моделях повторного заселения печени, при котором трансплантированные клетки обнаруживают селективные преимущества пред клетками хозяина (59). При использовании таких моделей было показано, что зрелые полиплоидные гепатоциты обладают схожей со стволовыми клетками регенеративной способностью, что гематопоэтические стволовые клетки, и способны делиться более 100 раз без потери функции (60). Гепатоциты человека также высоко регенеративны (61) и эта способность к регенерации устанавливается на самых ранних эмбриональных стадиях (36). К сожалению, пока ещё не доказана возможность расти и расширяться для популяций гепатоцитов в культуре клеток или поддерживать свою дифференцировку. Даже при наиболее сложной ростовой среде гепатоциты активно дедифференцируются в течение нескольких часов после помещения (62). Т.о., функции взрослых гепатоцитов, включая клеточные деления, по-видимому, зависят от сложных взаимодействий с др. клетками в трехмерном матриксе. Системы совместного культивирования, пытающиеся воспроизвести эту организацию подают надежды решения этих проблем (63).

Взрослая печень также обладает факультативными предшественниками, которые может быть активированы в ответ на специфические повреждения (Fig. 4), обычно в условиях нарушенной репликации гепатоцитов. Предшественники дают промежуточный тип клеток, часто наз. "oval cells,"которые, как полагают, дифференцируются как в желчный эпителий, так и гепатоциты (58). Однако, овальные клетки не являются гомогенной популяцией (64), и их кажущаяся мультипотентность не была продемонстрирована с помощью отслеживания дефинитивных клонов. У крыс овальные клетки напоминают эмбриональные гепатобласты, которые экспрессируют маркеры как желчных протоков, так гепатоцитов, а также α -fetoprotein (58). Т.о., активация клеток предшественников у взрослых использует некоторые из тех же самых генетических программ, используемых во время развития (65). Детали точного происхождения взрослых печеночных предшественников и сигналы. которые управляют их активацией неясны.

Pancreas Regeneration

В то время как гепатоциты способны к значительной регенерации, способность β клеток распространяться более ограничена, особенно у взрослых. Некоторая степень регенерации может происходить у молодых животных после физиологических стимулов, таких как беременность (66) или повреждение (частичная pancreatectomy) (67). Однако, эта частичная способность к росту недостаточна, чтобы позволить восстановиться от потери клеток при типа I диабете, пока это возможно за счет подавления аутоиммунитета (68). Ограниченная регенеративная способность эндокринной части панкреас может быть связана с ограниченным количеством панкреатических предшественников, которые неспособны к компенсаторному росту в ответ на потерю клеток (69). Напротив, гепатобласты могут увеличивать свою пролиферативную скорость в ответ на дисфункциональные клетки в их середине(36). Отсутствие регенерации β клеток вызывает существенный интерес к потенциалу тканевой репарации с помощью резидентных стволовых клеток. Остается спорным, существуют ли предшественники во взрослой поджелудочной железе. Ясно, что большинство новых β клеток происходит из предсуществующих инсулин-экспрессирующих клеток после хирургических повреждений (67, 70), но недавняя работа показала, что перевязка протока может активировать Ngn3-позитивные β клетки

Liver lineages

Fig. 3. Regulatory factors controlling cell type lineages within the liver and pancreas. Transcription factor genes are shown in bold; their functions have been reviewed in the text and elsewhere (23, 55-57), except for vHnfl in hepatic development (81). Pdxl initially marks duodenum and caudal stomach progenitors (not shown) as well as the pancreatic domains (28).

Fig. 4. Progenitor lineage relationships in adult liver and pancreas. The thickness of the arrows indicates the dominant mode of regeneration. Dashed lines delineate rare or hypothetical cell-fate transitions that occur only under specific experimental conditions.

предшественники в эпителии протоков (71). Т.о., предшественники взрослой поджелудочной железы существуют и их активация зависит от специфических повреждений, как это происходит с инициацией овальных клеток в печени (Fig. 4).

Creating Hepatocytes and β Cells de Novo

Современная неспособность размножать человеческие гепатоциты in vitro является помехой не только для клеточной терапии, но и также для разработки фармацевтических лекарств, т.к. клетки важны для оценки метаболизма ксенобиотиков. Т.о., генерация гепатоцитов из способных к увеличению предшественников может представлять существенный интерес. Клетки со свойствами действительно идентичными тем, что у печеночных овальных клеток, могут также появляться в поджелудочной железе, особенно после устранения ацинарных клеток (72). После трансплантации эти происходящие из панкреас овальные клетки могут дифференцироваться в функциональные гепатоциты и желчные протоки (73). Некоторые сообщения предполагают, что реципрокная трансдифференцировка также возможна; т.е. превращение печеночных клеток в направлении панкреатической эндокринной судьбы (74). Форсированная экспрессия панкреатических транскрипционных факторов выявляет экспрессию инсулина в печеночных клетках и корректирует экспериментальный диабет (75). Итак, эти находки указывают на то, что как взрослая печень, так и панкреас содержат клетки с эпигенетической памятью об их общем эмбриональном происхождении. Существование потенциальных предшественников β клеток во взрослой печени представляет интерес для медицины. Т.к. панкреатические экзокринные клетки сильно превосходят в числе β клетки, то интересно бы знасть, можно ли их перепрограммировать, чтобы получить функциональные β клетки in vivo с помощью доставки вирусами онтогенетических транскрипционных факторов Pdxl, Ngn3, and Mafa (76).

Плюрипотентные стволовые клетки, включая embryonic stem cells (ESCs) и induced pluripotent stem cells (iPSCs), являются потенциально обильным источником для гепатоцитов и β клеток. Многочисленные группы разрабатывают протокол дифференцировки ESC, которые могли бы воспроизвести нормальное эмбриональное развитие. Первой ступенью панкреатического и печеночного развития является индукция дефинитивной энтодермы с помощью activin A (77). Дальнейшая обработка с помощью BMP-4 и bFGF может затем направить клетки в направлении печеночного клона (78). В протоколе, разработанном для дифференцировки в направлении эндокринных панкреатических клеток, дефинитивная энтодерма обрабатывалась последовательно keratinocyte growth factor (KGF), retinoic acid, Noggin и cyclopamine (79, 80). Несмотря на удивительный прогресс возникающие клетки часто неспособны достичь полной функциональности, достаточной для регенеративной терапии, остаются лишь "hepatocyte- or β cell-like." Пока неясно, насколько точно известные онтогенетические сигналы могут быть организованы, чтобы запускать собственно программу печеночных или панкреатических клеток по желанию, но детальные исследования активируемых сигнальных путей и их перекрестно-регуляторных взаимодействий во время эмбриогенеза м. оказаться информативными.

Future Prospects

Two basic opportunities for medical application of the knowledge of the developmental biology of the liver and pancreas have emerged. The first is the application of the precise conditions that exist within the embryo to differentiate pluripotent stem cells. The sequential and exactly timed use of extracellular factors and accessory cell types (such as endothelium and mesenchyme) is predicted to mimic embryogenesis and thus yield highly functional derivatives for transplantation and other applications. In this setting, competent cells respond to extrinsic signals that act on their epigenome. The second approach is to use genetic reprogramming to directly change cell fates by taking advantage of transcriptional activators, repressors, and chromatin modifiers. This method can work in vivo as well as in culture and can be applied to adult epigenetic relatives of the desired cell type. Thus, it may be possible to enhance tissue regeneration in situ without the complications of cell engraft-ment and immunological rejection. However, it will be important to overcome the potential problems of insertional mutagenesis, in which stable gene integration is involved, as well as undesired transgene expression changes and physiologic responses to viral gene delivery. Emphasis is required on both approaches to use the signals and regulatory factors from developmental biology to sculpt the differentiation of progenitor and stem cells to liver and pancreas cell fates.

Generation and Regeneration of Cells of the Liver and PancreasKenneth S. Zaret and Markus Grompe SCIENCE VOL 322, No.5907, P.1490-1494, 2008

Generation and Regeneration of Cells of the Liver and Pancreas
Kenneth S. Zaret and Markus Grompe
SCIENCE VOL 322, No.5907, P.1490-1494, 2008