Накопление фрагментированных, неправильно упакованных или неправильно локализованных белков препятствует важным биологическим процессам и может приводить нарушению функции клеток. Чтобы предупредить образование потенциально токсичных агрегатов белков все клетки используют молекулярные шапероны и протеазы, чтобы отправить белковые субстраты на повторную укладку, локализацию или пути деградации. Протеазы особенно важны для этих механизмов за контролем качества белков, поскольку они выполняют защитные и регуляторные функции; они оказывают защитный эффект, когда удаляют сомнительные полипептиды посредством деградации и регуляторный эффект, когда они активируют, напр., реакцию на неупакованный белок (unfolded-protein response (UPR)) с помощью протеолитической инактивации негативных регуляторов.
Семейство high temperature requirement A (HTRA) Ser протеаз принадлежит к основному набору протеаз, обнаруженных в клетках и широко законсервировано у одноклеточных и многоклеточных организмов
1. HTRAs можно отличать от др. Ser протеаз с помощью гомологичных последовательностей по присутствию протеазного домена и одного или двух С-терминальных PDZ (postsynaptic density of 95 kDa, Discs large and zonula occludens 1) доменов и по их олигомерной архитектуре. Основными функциями членов семейства HTRA являются ключевые аспекты контроля качества белков
2. Поэтому некоторые HTRA гены, такие как
degS Escherichia coli, важны даже в оптимальных лабораторных условиях
2. В противоположность некоторым др. протеазам контроля качества, некоторые HTRAs также обладают функцией шаперона, которая стабилизирует специфические белки
3. Кроме того, HTRAs могут запускать или модулировать различные сигнальные пути путем расщепления или секвестрации регуляторных белков. Поэтому HTRAs участвуют в важных клеточных процессах, включая бактериальную вирулентность, поддержание фотосинтетического аппарата, пролиферацию, миграцию клеток и приобретение клетками судьбы
2, 4, 5. Потеря активности HTRA у млекопитающих коррелирует с тяжелыми болезнями, включая артриты, рак, семейная ишемическая болезнь малых сосудов головного мозга и связанная с возрастом макулярная дегенерация, а также болезнь Паркинсона и Алцгеймера
6-11. Др. выдающимся свойством HTRAs является то, что их каталитическая активность тонко настроена и может быть обратимо переключаться в состояние вкл. и выкл. , что не характерно для классических Ser протеаз.
The diverse repertoire of HTRA proteins
Сотни различных HTRA протеаз были обнаружены в разных секвенированных геномах. включая те, что у микроорганизмов, грибов, растений, лягушек, птиц, рыб и млекопитающих и многие организмы экспрессируют более одного члена семейства в различных клеточных компартментах. Напр., E. coli экспрессирует три HTRAs; сине-зеленые водоросли от двух до пяти4; Arabidopsis thaliana, 16 (Ref. 4); тополь трехгранный Populus spp., 20 (Ref. 12); а люди четыре2. Большинство HTRAs располагаются вне цитоплазмы, т.е. в клеточной оболочке Gram-отрицательных бактерий и в митохондриях, хлоропластах, ядре и внеклеточном матриксе эукариот. Круг биологических процессов, в которых HTRAs участвуют, разнообразен по их клеточной локализации. Бактериальные HtrAs обычно участвуют в различных аспектах контроля качества белка, включая клеточную реакцию на стресс от упаковки белка и деградацию неправильно упакованных и неправильно локализованных белков клеточной оболочки2. Сходным образом, эукариотические HTRAs элиминируют поврежденные фотосинтетические белки в хлоропластах, удаляют неправильно упакованные белки в разных клеточных органеллах и внеклеточном пространстве, а также регулируют доступность факторов роста в клетках млекопитающих11, 13-17. Кроме того, некоторые HTRAs, такие как бактериальные DegP белки, обладают антагонистическими функциями шаперона и протеазы в одном полипептиде3, 18. Активность шаперона связана с интернализацией субстрата в крупные образования, чтобы защитить субстрат от деградации др. протеазами3.
Bacterial HtrAs as chaperones and proteases. Клеточная оболочка Gram-отрицательных бактерий, таких как E. coli состоит из периплазмы и наружной мембраны. У E. coli DegP, DegQ и DegS располагаются в клеточной оболочке и участвуют в ключевых аспектах контроля качества белков. Периплазматический DegP эффективно защищает клетки от стрессов, связанных с упаковкой белков, поскольку он обладает протеолитической и шапероновой активностями2, 18. Белок DegP это мономер, состоящий из Ser протеазного домена и двух PDZ доменов. В состоянии покоя он собирается в гексамеры, тогда как высокого порядка олигомерные структуры из 12-, 15-, 18- и 24-mers обнаруживаются после активации3, 19, 20. В качестве протеазы, DegP распознает неправильно упакованные белки посредством своего PDZ домена 1 (PDZ1), который представляет субстраты его протеолитическому сайту для последующей деградации. Кроме того, DegP выполняет регуляторные цели. Напр., он вносит вклад в активацию пути на стресс от неправильной упаковки Cpx белка путем деградации комплексов, состоящих из негативного регулятора CpxP и поврежденных белков21 (Fig. 1a). Более того, DegP действует как шаперон разными способами. Он может инкапсулировать уложенные мономеры белков наружной мембраны3 и защитить их от протеолитической деградации во время прохождения их через периплазму (Fig. 1b). Он также способствует укладке периплазматической α-amylase MalS , делая возможным образование критических дисульфидных мостиков18, 22. DegP может также помогать переупаковке химически денатурированной citrate synthase18 и предупреждать агрегацию денатурированной высокой температурой citrate synthase и лизосом, если действует как 'holding' шаперон20, 23. Потенциальная функция в качестве шаперона др. HTRA протеаз не исследовалась систематически, но у почкующихся дрожжей HtrA, Ynm3, (также известна как Nma111) и у Chlamydia trachomatis HtrA обладают функциями шаперона in vitro24, 25, DEG1 растений действует как шаперон in vitro и in vivo26.
В противоположность DegP, DegS является чисто регуляторной протеазой и катализирует скорость-ограничивающую ступень σ E сигнального пути в клеточной оболочке27 (Fig. 1b). PDZ домен DegS соединяется с C концом белков наружной мембраны, которые становятся доступными, когда эти белки неправильно локализуются в периплазме28. Такое связывание DegS переключает его из неактивной в активную конформацию и приводит к протеолитической деградации anti-σ factor RseA, негативного регулятора σ E пути27. Третий член семейства, DegQ, сильно гомологичен DegP и может поэтому осуществлять сходные функции29.
Участие бактериальных HTRAs в контроле качества белков говорит ом то, что эти факторы участвуют в бактериальном патогенезе30, 31. Помимо репарации и деградации поврежденных бактериальных белков, HTRAs специфически вовлекаются в секрецию факторов вирулентности, таких как филаментозный гемагглютинин Bordetella pertussis. В этом случае, активность как шаперона DegP защищает удлиненные филаментозный гемагглютининовый полипептид в периплазме32. Streptococcus мутантный HtrA важен для биогенеза внеклеточных белков, включая гликолитические энзимы, ассоциированные с поверхностью, и тем самым важен для образования биопленок (biofilm)33. Более того, Helicobacter pylori HtrA секретируется в среду, чтобы расщеплять белок клеточной адгезии E-cadherin, это позволяет патогену проникать в клетку хозяина благодаря ослаблению целостности межклеточных адгезий34.
Plant HTRAs maintain the photosynthetic machinery. Из 16 HTRAs у A. thaliana, пять (DEG1, DEG2, DEG5, DEG7 и DEG8) расположены в хлоропластах4, 35 (Fig. 2a). Лучше всего охарактеризованный из них, DEG1, состоит из N-терминального направляющего на цель сигнала, протеазного домена и одного PDZ домена. Он осуществляет контроль качества белков в просвете thylakoid, действуя как шаперон при сборке фотосистемы II и как протеаза при деградации поврежденных реакционных центров13, 26. В качестве шаперона DEG1 взаимодействует с реакционным центром белка D2, который важен для трансляции и сборки реакционного центра белка D1. В качестве протеазы DEG1 участвует вместе с FTSH в деградации D1, который обладает склонностью к фотоповреждениям. FTSH является АТФ-зависимым протеолитическим комплексом, которые экстрагирует и деградирует одиночные трансмембранные спирали D1 белка из тилакоидной мембраны. Собственно предварительная фрагментация субстрата обеспечивается с помощью DEG1, которая вызывает разрезы в регионах петли D1 белка, которые выпячиваются в просвет thylakoid. Интересно, что протеаза DEG1 избирательно активируется в условиях стрессового воздействия светом, во время которого происходит окисление (acidification) просвета thylakoid и повреждения фотосинтетических белков. Кроме того, DEG1, DEG5, DEG7 и DEG8 также участвуют в протеолитическом преобразовании D1 (Refs 36, 37). DEG5 (у которого отсутствует PDZ домен), как было установлено, формирует 12-мерный комплекс с DEG8, представляющий первый пример гетеромерного комплекса HTRA протеаз37.
Human HTRAs in development and disease. Лучше всего изучены члены семейства HTRA человека HTRA1 и HTRA2, которые участвуют в супрессии опухолей и контроле пролиферации, миграции и нейродегенерации. HTRA1, HTRA2, HTRA3 и HTRA4 человека состоят из варьирующих N концов, протеазного домена и одного PDZ домена. Исходя из их доменовой организации, человеческие HTRAs подразделены на две группы. В то время как HTRA2 обладает трансмембранным якорем вблизи своего N конца, которые может быть удален с помощью процессинга, N концы HTRA1, HTRA3 и HTRA4 содержат прогнозируемые способные к отщеплению сигнальные пептиды, сопровождаемые фрагментом insulin growth factor (IGF)-binding protein 7 (IGFBP7); это единственный IGFBP, содержащий одиночный Kazal-типа protease-inhibitor мотив.
Ген HTRA1 (ранее называемый PRSS11) был первоначально идентифицирован в фибробластах человека38. Эпигенетическое замалчивание происходит при разных раковых опухолях, а потеря HTRA1 коррелирует с пониженной чувствительностью к противораковым лекарствам и повышенной миграцией клеток5, 7, 39. Кроме того, избыточная экспрессия HTRA1 ингибирует пролиферацию in vitro и опухолевый рост in vivo40. Эти данные указывают на то, что HTRA1 может действовать как опухолевый супрессор. Более того, некоторые недавние исследования указывают на участие HTRA1 в клеточной пролиферации. Во-первых, HTRA1 специфически расщепляет IGFBP5, высвобождая тем самым IGF1, чтобы стимулировать пролиферацию17. Во-вторых, HTRA1 протеолитически инактивирует transforming growth factor-β (TGF?), контролируя тем самым как созревание, так и жизнеспособность во время развития нейронов41. В-третьих, HTRA1 связывает некоторые белки семейства TGFβ, включая bone morphogenetic protein 4 (BMP4), growth differentiation factor 5 (GDF5) и activin, и негативно влияет на пролиферацию в развивающихся глазах эмбрионов кур16. Наконец, HTRA1 расщепляет tumour suppressor protein tuberous sclerosis 2 (TSC2; также известный как tuberin), вызывая его активацию и последующую регуляцию нижестоящих мишеней, таких как eIF4E-binding protein 1 (4E-BP1) и S6 kinase (S6K), которая инициирует трансляцию42 (Fig. 2b).
Во внеклеточном матриксе, HTRA1 расщепляет многочисленные секретируемые белки, такие как fibronectin, decorin, fibromodulin, aggrecan, type II collagen, biglycan, clusterin, a disintegrin и metalloproteinase domain-containing 9 (ADAM9), vitronectin, α2-macroglobulin и amyloid precursor protein fragment Aβ11, 14, 16, 43, 44. Деградация компонентов внеклеточного матрикса и строгая позитивная регуляция HTRA1 в выборках от пациентов с вовлечением HTRA1 в артритическую болезнь, при которой может обнаруживаться деградация хряща, а также воспаление6. Это и др. сообщения указывают на то, что HTRA1 имеет, по крайней мере, две местоположения в клетке. В то время как большая часть пула HTRA1 секретируется во внеклеточное пространство, около 20% является цитоплазматической и преимущественно связана с микротрубочками и плазматической оболочкой. Однако неизвестно, как регулируется клеточное распределение HTRA1 (Fig. 2b).
HTRA2 человека первоначально была идентифицирована как белок эндоплазматического ретикулума45, но сегодня известно, что это фактор контроля качества в межмембранном компартменте митохондрий10, 46. Многочисленные сообщения постулируют, что преобразованная по N-концу форма HTRA2 высвобождается в цитоплазму во время апоптоза и расщепляет белки, которые блокируют апоптоз, такие как X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP). Однако отсутствие апоптозного фенотипа у XIAP-нокаутных мышей ставит под вопрос физиологическое значение этих данных (rev. HTRA2 and apoptosis, see Ref. 10).
Недавнее открытие функциональных взаимодействий между HTRA2 и антиапоптическим белком HCLS1-associated X1 (HAX1)47 представляет доказательства, что HTRA2 непосредственно участвует в контроле качества митохондрий. Митохондриальный HAX1 является субстратом для HTRA2 (Ref. 48) и обеспечивает процессинг HTRA2 с помощью presenilins-associated rhomboid-like (PARL), др. митохондриальной протеазы49, в укороченную форму, которая лишена трансмембранного якоря. Более того, деградация HAX1 с помощью HTRA2 индуцирует аутофагию, приводя к очистке от поврежденных митохондрий и приводя к увеличению скорости деградации α-synuclein50 (Fig. 2c).
Усиление транскрипции HTRA2 с помощью упаковкой белка вызываемого стресса51 и ассоциация энзима с метаболизмом белка амилоидного предшественника52, 53, также как HTRA2-мутантные мыши, обладающие фенотипом. сходным с болезнью Паркинсона, всё это указывает на участие HTRA2 в нейродегенеративных болезнях, которые обычно базируются на агрегации белков или белковых фрагментов. Эти данные и накопление неупакованных белков в митохондриях HTRA2-дефицитных клеток15 указывает на то, что HTRA2 может выполнять функции. сходные с таковыми бактериальных гомологов DegP и DegS. Кроме того, активность HTRA2 позитивно регулируется посредством фосфорилирования с помощью p38 стресс киназного пути в ответ на взаимодействие с митохондриальным белком PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1), которые ассоциирует с болезнью Паркинсона (rev. Ref. 46) (Fig. 2c).
Мало биохимической и механистической информации получено для HTRA3 и никакой информации о HTRA4. HTRA3 расщепляет компоненты внеклеточного матрикса decorin и biglycan столь же эффективно, что и HTRA1 (Ref. 54), а также расщепляет широко используемый модельный субстрат casein. Исследования экспрессии указывают на участие HTRA3 в беременности и в эндометриальных и овариальных раках
55, 56-58. Также, подобно HTRA1, HTRA3 усиливает токсичность цитостатических лекарств и эпигенетически замалчивается при раках
59, 60.
Overview of HTRA structure
Несмотря на разнообразие их функций, HTRA протеазы обладают общей доменовой архитектурой, которая облегчает эволюцию консервативных гомоолигомерных ансамблей (Fig. 3a,b). Базовым строительным блоком является колоколообразный тример, состоящий из протеазных доменов, которые формируют центральный стержень и наружу выступающие PDZ домены (Fig. 3c). Эти PDZ домены являются модулями белкового взаимодействия, которые соединяются преимущественно с тремя или четырьмя остатками на C конце белков мишеней61. В то время как закрепленные на мембране DegS и HTRA2 присутствую в виде тримеров в своей неактивной и активной конформациях, некоторые растворимые HTRA протеазы, включая DegP и HTRA1, переключаются с низкого на более высокое олигомерное состояние после связывания субстрата3, 62-64 (Fig. 3d). Поскольку такое событие связывания прямо в сочетается с активацией протеазы, то DegP и HTRA1 могут переключаться тонко регулируемым образом с захвата субстрата, с низкой молекулярной массы олигомера на деградацию субстрата, олигомер высокого порядка.
N-терминальные регионы HTRA протеаз могут предопределять свою субклеточную локализацию; они могут снабжаться классическими способными к отщеплению сигнальными последовательностями для экспорта, сигналами локализации в митохондриях или одиночными трансмембранными доменами. Альтернативно, N конец может включать IGFBP7 фрагменты, структуры и функции, которые еще предстоит охарактеризовать. Протеазный домен всех HTRAs заимствует chymotrypsin складку, которая состоит из двух 6-нитчатых β-barrel субдоменов. Расщелина активного сайта располагается в месте стыковки двух перпендикулярно расположенных barrel доменов
2 и сконструирована за счет нескольких петлей обоих. C-терминальный PDZ домен(ы) HTRA протеаз обнаруживают сходство со многими др. модулями межбелкового взаимодействия, тем самым они маленькие и компактные, имеют глобулярные домены и имеют N и C концы, которые находятся в тесной близости др. к др. PDZ складка состоит из шести β-strands, образующих два β-sheets и две α-спирали, которые накрывают края β-sheets
65, 66. Сравнимые со складкой PDZ присутствуют домены в каркасных белках эукариот, PDZ домены HTRA протеаз имеют циклическую перестановку (circular permutation), при которой N-терминальные и C-терминальные нити обмениваются. Поэтому, carboxylate-связывающая петля законсервированной PDZ последовательности, часто обозначаемая как GLGF петля, является непосредственным N концом домена, который соединен с помощью короткой связи с протезным доменом в HTRA белках. Carboxylate-связывающая петля сопровождается β-strand A, которая формирует вместе со спиралью αB, канонический пептид-связывающий сайт из PDZ домена. βA служит средством закрепления пептида в процессе β-augmentation, в то время как связывающий карман для C-терминального остатка определяет специфичность субстрата, отбираемую для пептидов с гидрофобным С-терминальным остатком. Сравниваемый с классическими PDZ доменами, PDZ домен HTRA протеаз обладает несколькими дополнительными структурными свойствами, которые важны для сборки олигомеров и локализации в клетке.
Common mechanisms of Ser proteases
HTRA протеазы принадлежат к большому семейству трипсин-подобных Ser протеаз, каждая из которых обладает общей базовой полипептидной складкой и активным сайтом, содержащим каталитическую триаду, oxyanion отверстие и карманы субстратной специфичности. Они действуют как мономеры за небольшим исключением: тетрамерные tryptases67 и тримерные HTRA протеазы. В tryptases и HTRA протеазах, олигомеризация ограничивает доступ к субстрат-связывающим сайтам, обращенных лицом в просвет частицы. Более того, trypsin-подобные протеазы отличаются дополнительными элементами, пептидными петлями или доменами. которые взаимодействуют с др. белковыми компонентами и кофакторами, это делает возможным разные способы функциональной регуляции.
Общий способ регуляции Ser протеаз был открыт
68 путем сравнения структур трипсина и трипсиногена, неактивного проэнзима. Домен модуля, скомпанован из петель 142-152, 184a-193 и 216-223 (нумерация chymotrypsin; соответствует петлям LD, L1 и L2 в HTRA) и назван доменом активации, принимает два разных структурных состояния: беспорядочный и гибкий (в trypsinogen), и упорядоченный и ригидный (в trypsin) (Fig. 4a). Границы домена формируются остатками Gly, это облегчает барьерам конформационные переходы. Переход запускается расщеплением пропептида и вставкой нового N конца в карман активации (классическая активация), или за счет мимикрии этого процесса с помощью кофактора
69 или с помощью сильных субстрат-подобных лигандов
70, 71. Хотя субстрат и N конец пространственно разделены, оба предопределяют активационный домен и их связывание представляет первый пример аллостерии и кооперативности в белке из одной субъединицы. Изучение семейства trypsin-подобных протеаз и дополнительных взаимодействующих и сигнальных кофакторов выявило разнообразие молекулярных сигналов и сайтов взаимодействия
72-74. Однако основные влияния на конформацию и стабильность обычно наблюдаются для активационного домена, который получает сигналы с разных направлений, интегрирует их и отвечает соотв. структурным изменением. В семействе HTRA эта общая схема была тщательно разработана далее путем добавления петли L3, которая обеспечивает коммуникации между протеазными доменами тримера и PDZ доменами.
Controlled activation of HTRA proteases
HTRA протеазы существуют в виде олигомеров, это делает возможными коммуникации между соседними субъединицами, чтобы регулировать протеазную функцию обратимым и тонко контролируемым образом (Fig. 4b). Активационный каскад инициируется с помощью сенсорной петли L3, которая специфически перестраивается на восприятие определенного биологического сигнала. Перестроенная петля L3 может теперь взаимодействовать с активационной петлей LD соседнего промотора (обозначаемая здесь как LD*) в HTRA тримере, тем самым индуцируется собственно приведение в соответствие активационного домена. Конструкция этого домена, который состоит из активного сайта петель L1, L2 и LD, также как и из его от беспорядка к порядку перехода после активации, законсервирована у trypsin-подобных и HTRA протеаз, и подчеркивает их общий каталитический механизм. Однако в HTRA протеазах переключение к активности непосредственно обеспечивается с помощью лиганд-зависимого взаимодействия петель L3 и LD* скорее, чем с помощью расщепление пропептида во время активации зимогена, и поэтому обратимо (Fig. 4b). Более того, активация олигомерных HTRA протеаз часто высоко кооперативный процесс, как это показано для DegS and DegP75, 76. Hill коэффициент равный 3, определенный для трех активных сайтов, кооперируемых при процессинге субстрата (напр., использующий межмолекулярную L3-LD* передачу сигналов), тогда как Hill коэффициент равный 5, определенный для DegP подтверждает структурные находки, что протеазный и PDZ1 домены внутри одного DegP тримера кооперируют при связывании и расщеплении субстрата, чтобы создать сложное устройство для деградации76, 77. Кстати, три механизма известны того, как петля L3 ощущает сигнал специфической биологической активации и передает эту информацию к элементам активационного домена.
Binding of an allosteric activator to the PDZ domain. первый механизм активации HTRA был выявлен в деталях для бактериальной DegS62, 78. В отсутствие стресса от неправильно уложенного белка PDZ домен ингибирует активность DegS, поскольку он непосредственно захватывает петлю L3 и предупреждает её взаимодействие с петлей LD*. Стрессовые сигналы в форме пептидов от C конца неправильно расположенных в периплазме белков наружной мембраны, соединяются с PDZ доменом и непосредственно взаимодействуют с сенсорной петлей L3 протеазного домена (Fig. 4c). Происходит индуцированная пептидом переориентациия в L3 позиций Arg остатка, расположенного в stem сегменте L3, чтобы взаимодействовать с активационной петлей LD* соседней субъединицы. Это взаимодействие индуцирует ремоделирование активационного домена в его активную конформацию.
Недавние данные по различным DegS мутантам показали, что во время активации петля L3 взаимодействует непосредственно с PDZ доменом скорее, чем с о стрессовым сигнальным пептидом79. Это исследование ставит вопрос о механизме, ранее установленным для активации DegS62, 78, но также важно иметь в виду, что такие мутации, которые изменяют фундаментальные функции, напр., путем индукции постоянной активности, могут иметь структурную основу, включая измененную позицию петли L3. Известно, что петля L3 может принимать разные эффективные конформации в дикого типа и мутантной DegS, и это указывает на то, что процесс активации надежный. Кроме того, петля L3 в дикого типа DegS предоставляет сайты связывания для различных остатков активатора, чтобы интегрировать разнообразные неправильно локализованные в периплазме белки наружной мембраны в UPR путь78. Др. важное наблюдение получено при наложении из 12 DegS кристаллических структур, которое было выявлено в 4-х разных кристаллических системах с и без активирующего пептида. Этот анализ показал, что относительная позиция PDZ домена и в частности сайта связывания для аллостерического эффектора, в основном фиксированы. Т.о., уникальным свойством DegS протеазы, по-видимому, является точное позиционирование PDZ домена, которое обеспечивается добавочными взаимодействиями с протеазным доменом, гарантируя эффективную передачу сигналов от с PDZ доменом связанного эффекторного белка.
Activation by substrate-induced oligomer conversion. Система шаперона DegP протеазы регулируется с помощью превращения олигомеров из покоящегося гексамера в каталитически активный 12-mer и 24-mer, который отлавливает и переваривает неправильно упакованные белки3 (Figs 3d, 4c). Изменения в олигомерном состоянии запускаются за счет связывания субстрата с PDZ1, вызывая конформационную перестройку связей между PDZ1 и PDZ2, это в конечном итоге ведет к дестабилизации гексамера и образованию функциональных 12- или 24-мерных частиц76, 77. Наиболее важно, что при формировании 12- или 24-меров остальные гибкие PDZ домены оказываются иммобилизованы в олигомерном каркасе, т.к. они осуществляют контакты между соседними DegP тримерами. После иммобилизации PDZ1 оказывается соотв. образом ориентированным, чтобы взаимодействовать с сенсорной петлей L3 и стабилизировать активную конформацию, которая необходима для взаимодействия с активационной петлей LD* соседней субъединицы и для индукции ремоделирования протеолитического сайта в активное состояние. Поскольку позиция PDZ1 различается между гексамером и 12- или 24-мером, то сенсорная петля L3 оказывается критической для выявления различий между пустыми и нагруженными субстратом олигомерами и тем самым гарантируется. что связывание субстрата, олигомерные превращения и активация протеазной активности непосредственно связаны.
HTRA1 activation by induced-fit substrate binding. HTRA1 человека обладает уникальным механизмом активации. В противоположность DegP и DegS, домен PDZ у HTRA1 не нужен для активации, т.к. делеционные конструкции, лишенные этого домена, имеют такие же свойства, что и энзим дикого типа
64. Структурные данные показывают, что петля L3 не взаимодействует с доменом PDZ или его лигандом. Вместо этого, L3 непосредственно взаимодействует со способным к расщеплению белковым субстратом (Fig. 4c). Соотв., HTRA1, по-видимому, обратимо переключается между активным и неактивным состояниями, при этом первое способствует соединению пептида с протеолитическим сайтом. Вместе и изменением ориентации петли L3, связанный субстрат завершает активационный домен и стабилизирует протеолитический сайт в его функциональном состоянии. Следовательно, активность HTRA1 человека может регулироваться с помощью связывания induced-fit субстрата и не нуждается в привлечении аллостерического механизма. Более того, этот механизм аутоактивации указывает на то. что протеолитическая функция HTRA1 д. контролироваться с помощью дополнительных мероприятий (measures), включая. напр., ограничение её активности за счет определенной субклеточной локализации.
The PDZ domain as a protease cofactor
Большинство PDZ доменов HTRA протеаз связаны с протеазными доменами посредством гибких линкерных областей, что обеспечивает существенную подвижность. Эта подвижность (впервые наблюдаемая в DegP гексамере, которые мог формировать как открытые, так и закрытые частицы) важна не только для контроля доступа к протеолитической камере, но и также для механизма активации протеазы76, 77, 80, 81. Чтобы гарантировать эффективное взаимодействие с сенсорной петлей L3, домен PDZ д. быть позиционирован соотв. образом. В случае DegP, позиционирование и иммобилизация PDZ домена достигаются после субстратом индуцированной олигомерной конверсии3. Напротив, у DegS домен PDZ удерживается в фиксированной позиции за счет дополнительных взаимодействий с протеазным доменом62. В этом случае домен PDZ точно и стабильно располагается в месте закрепления (docking site), это гарантирует взаимодействие аллостерических активаторов с петлей L3. В дополнение к этой регуляторной функции домены PDZ протеаз HTRA влияют на расщепление субстрата множественными способами, благодаря своим различающимся сайтам взаимодействия (Fig. 5).
Используя канонический сайт связывания пептида, PDZ домены HTRA протеаз действуют как сенсоры разных белковых сигналов и интегрируют эти сигналы разными путями. Во-первых, у DegS домен PDZ является критическим для восприятия стрессов от неправильной укладки белка. Он выявляет С-концы неправильно локализованных белков наружной мембраны за счет специфического соединения с белками с экспозиционированным Phe в C-терминальном положении. Во-вторых, у DegP домены PDZ используются в качестве сайтов связывания для неправильно упакованных белков. Путем отбора по малым гидрофобным остаткам на С конце домены PDZ позволяют DegP распознавать многие неправильно упакованные белки клеточной оболочки. Наконец, у HtrA2 из Mycobacterium tuberculosis домен PDZ важен для купирования аутопротеолиза с активацией протеазы82. Домен PDZ выявляет продукт протеолиза HtrA2, который, по-видимому, и активирует функцию протеазы.
Кроме того, канонический пептид-связывающий сайт может непосредственно влиять на реакцию расщепления неправильно упакованных белков. Напр., у DegP, которая является членом разных семейств руководящих (ruler) энзимов83, молекулярный руководитель образуется двумя пептид-связывающими сайтами, расположенными в PDZ и протеазном доменах, соотв., он действует посредством 'hold-and-cut' механизма (Fig. 6a). Домен PDZ закрепляет молекулу субстрата, гарантируя эффективный перенос нижестоящего сайта расщепления к месту протеолиза. Более того, DegP деградирует неправильно упакованные белки поступательным образом, удерживая белковые субстраты вплоть до тех пор, пока они не будут расщеплены на олигопептиды. Удивительно, этот поступательный механизм также базируется на тесной кооперации между доменом PDZ и местом расщепления белка. Поскольку оба элемента обладают значительным сходством по связыванию субстрата - закрепление главной цепочки лиганда с помощью β-sheet augmentation и обладание предпочтением к малым гидрофобным остаткам на С конце - то пептидные фрагменты, которые высвобождаются с места протеолиза, улавливаются соседним PDZ доменом по их вновь сгенерированным С концам (Fig. 6b). После этого PDZ домены не только распознают соотв. субстратные белки, но и также, что более важно, отлавливают промежуточные образования после расщепления, предупреждая их преждевременное высвобождение и подготавливая их для следующего цикла деградации. Наконец, необходимо отметить, что PDZ1 у DegP купирует связывание субстрата с повторной сборкой олигомера. Соединение пептида с доменом PDZ гексамера DegP переделывает GLGF петлю и соседнюю PDZ1-PDZ2 связующую область, приводя к перестройке доменов, что способствует образованию функциональных, более высокого порядка DegP олигомеров (Fig. 6c).
PDZ домены HTRA протеаз являются не только местами межбелковых взаимодействий, но и также способны взаимодействовать с биологическими мембранами3, 20. Соединение с фосфолипидами, скорее всего, происходит посредством позитивно заряженных участков в PDZ домене, которые взаимодействуют с негативно заряженными головками (Fig. 5). мутация Lys в Ala или Glu в предполагаемых связывающих регионах DegP PDZ домена снижают или устраняют, соотв., взаимодействия с мембраной3. Было бы интересно посмотреть степень, с которой PDZ-обеспечиваемое связывание с биологическими мембранами, имеет отношение к др. HTRA протеазам.
PDZ домены HTRA белков обладают и др. уникальным структурным мотивом: фиксатором (clamp) взаимодействия, который представлен инсерцией в 10-30 остатков после первой β-нити (Fig. 5). Было показано для некоторых отличных DegP кристаллических структур, что этот инсерционный мотив является критическим для сборки олигомера и составляет основную часть интерфейса между соседними тримерами
3. Безусловно фиксатор взаимодействия позволяет HTRA PDZ домену осуществлять два разных межбелковых взаимодействия. Домен PDZ ассоциирует с др. HTRA молекулами посредством фиксатора взаимодействий и также распознает и отлавливает полипептидные субстраты или аллостерические эффекторы посредством канонической борозды связывания пептида.
Conclusions and perspectives
The HTRA family of Ser proteases has evolved to perform key aspects of protein quality control, which is a task that requires rapid sensing of misfolded proteins and tight regulation of HTRA catalytic activity. These features are mediated by unique domain architecture: the combination of a protease domain and a C-terminal PDZ domain. In contrast to other PDZ domains with prominent roles in signalling cascades, the PDZ domains of HTRA proteases do not function as passive protein–protein interaction modules. They are enzymatic cofactors that sense a specific protein signal and subsequently trigger allosteric activation by multiple mechanisms. Therefore, HTRA proteases use a novel mechanism to detect a signal through their PDZ domain and directly couple this with allosteric protease activation; this can even include a conversion to larger cage-forming oligomers that reach sizes of 1.2 MDa and display strong cooperativity. Although it is now well understood how peptides serving as activation signals trigger cascades of molecular events that govern regulated proteolysis, it is of great interest to study how other signals, including pH, ions, propeptide cleavage and post-translational modifications, are sensed.
In addition, little is known about the interaction partners of mammalian HTRAs. It will be important to identify proteins that function as determinants of the cellular localization, substrate specificity and regulation of HTRA proteases.
Another emerging topic is the epigenetic control of HTRA expression in mammalian cells7, 84, 85. As all human HTRA genes contain CpG islands, their epigenetic silencing might be not only relevant for cancer biology but also critical for developmental processes and regulatory events in stem cells. Furthermore, we expect that future studies will address key questions about the biological roles of mammalian HTRA proteases, including their contribution to the prevention of toxic protein aggregates that cause neurodegeneration, their precise functions as tumour suppressors during processes such as cell division, and their involvement in the biogenesis and protein quality control of mitochondrial membranes. Chemical biology approaches will be essential in such studies (Box 1).
Box 1 | Chemical biology approaches
Full box
Given the similarities and sometimes strikingly different mechanistic and functional features of HTRA proteases, this protease family provides an excellent example of how nature uses the combinatorial composition of individual domains and rather subtle subsequent modulations to evolve polypeptides with distinct functional and regulatory properties.
Сайт создан в системе
uCoz 
