Кислород необходим для жизни, однако парадокс заключается в том, что в качестве побочного продукта своего метаболизма он образует высокотоксичные для клеток реактивные кислородные производные (РКП) (reactive oxygen species - ROS) (BOX 1). Аутопсия ткани мозга больных с нейродегенеративными расстройствами (болезнью Паркинсона (PD), болезнью Альцгеймера (AD), и амиотрофическим боковым склерозом (ALS)) AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS) четко показала присутствие повышенного числа ROS в пораженных областях мозга. Однако из этого наблюдения невозможно сделать вывод о том, что оксидативный (окислительный) стресс является основной причиной, а не следствием утраты нервных клеток. Что является «спусковым крючком» наблюдаемого усиления оксидативного стресса при этих расстройствах? При этих заболеваниях имеются и другие аномалии клеточных процессов, но как они соотносятся с оксидативным стрессом? В данном обзоре автор проанализировал факты участия оксидативного стресса в этиологии этой группы заболеваний, обсудил связь оксидативного стресса с другими клеточными феноменами, сравнил данные, полученные в результате аутопсии, и данные, полученные при исследовании in vitro и in vivo моделей.

Oxidative stress in neurodegeneration

Из-за высокой скорости метаболизма и сниженной способности к клеточной регенерации по сравнению с другими органами, мозг особо чувствителен к повреждающим эффектам ROS. В случаях AD, PD и ALS сообщалось о разных уровнях повреждений в отдельных областях мозга, подвергшихся нейродегенерации. Например, маркеры липидной пероксидации, включая 4-HYDROXYNONENAL (4-HNE) и malondialdehyde (MDA), были идентифицированы в коре и гиппокампе больных AD, в черной субстанции SUBSTANTIA NIGRA больных с PD и в спинномозговой жидкости больных ALS. Белковая нитрация,– маркер окисления белка, оказалась повышенной в гиппокампе и коре больных AD, в тельцах Леви у больных PD и в двигательных нейронах у больных ALS. Интерес представляет тот факт, что некоторые из этих оксидативных событий имеют специфические мишени. К примеру, нитрация остатков тирозина в α-synuclein белке аккумулируется в тельцах Леви у больных PD и при других синуклеинопатиях (Giasson, B.I. et al. Oxidative damage linked to neurodegeneration by selective -synuclein nitration in synucleinopathy lesions. Science 290, 985–989, 2000), а также в tau белке при AD. Т.е. оксидативный стресс постоянно сопутствует этим заболеваниям.

Тем не менее, эти данные еще не означают, что оксидативный стресс участвует в нейродегенерации при этих заболеваниях. В клетках имеются защитные и репарационные механизмы для борьбы с оксидативным стрессом и оксидативными повреждениями. Вероятно, при этих патологиях активность антиоксидантных защитных молекул, в норме противодействующих вредным эффектам ROS, снижена. Например, антиоксидантные ферменты супероксид дисмутаза (SOD), каталаза, глутатион-пероксидаза (GSHPx) и глутатион-редутаза (GSHRd) имеют сниженную активности в пораженных областях мозга при AD. Концентрация мочевой кислоты, – потенциального «сборщика» ONOO-, – и активность фермента метионин-сульфоксид редуктазы (methionine sulfoxide reductase), которая реверсирует окисление в метиониновых остатках белка, также снижена у этих больных. PD характеризуется и уменьшением количества тиол-редуцирующего агента глутатиона (GSH) в черной субстанции, в том числе в дофаминергических нейронах этой области мозга. GSH (и oxidized glutathione–GSSG) являются наиболее ранними из известных биохимических индикаторов нигральной дегенерации, а размеры истощения GSH коррелируют со степенью тяжести заболевания. Концентрации железа, которое может действовать как катализатор нежелательных оксидативных реакций, увеличены в черной субстанции мозга больных с PD. Этот факт представляет интерес для разработки терапевтических методов лечения различных нейродегенеративных заболеваний, используя хелатирование металлов (BOX2).

BOX 2

Metal chelation therapy

Increased iron levels in the affected midbrain of patients with PD, coupled with iron's ability to catalyze the production of cytotoxic ROS, indicates that iron might be involved in disease pathology. Iron is the most abundant metal in the brain, and some degree of accessible reactive iron is necessary for brain viability, because it is needed as a co-factor in DNA, RNA and protein synthesis, for heme enzymes and nonheme enzymes that are involved in both mitochondrial respiration and neurotransmitter synthesis, and in myelin formation95. Furthermore, iron deficiencies early in life are known to result in impairments in brain development96. However, when iron is present in high concentrations, it can result in cellular toxicity. We recently demonstrated in the 1-methyl-4-phenyl-2,3,4,6-tetrahydropyridine (MPTP) intoxication model of PD that chelation of iron in a form that cannot participate in oxidative events, either through transgenic expression of the iron-binding protein ferritin or oral administration of the bioavailable metal chlelator clioquinol (CQ), prevented subsequent toxin-induced oxidative stress, midbrain dopaminergic cell loss and motor dysfunction in young adult animals97. Oral administration of CQ was previously reported also to inhibit -amyloid accumulation in an AD transgenic mouse model, probably through its ability to chelate copper, which has been suggested to accelerate -amyloid deposition and protein oxidation by the peptide98. CQ has recently been reported to delay the course of AD on the basis of conclusions from a small double-blind human phase 2 clinical trial99. Copper chelation therapy has also proved to be effective in ALS-SOD transgenic mouse models100. Taken together, these data indicate that metal chelation through the judicious use of bioactive chelating agents in conditions such as AD and PD might prevent or delay disease progression by reducing metal overload and generation of oxidative stress.

Мутации в copper- и zinc-содержащих цитоплазматических формах SOD, SOD1 имеются в 20 % всех семейных случаев ALS, хотя этот факт связывают скорее с усилением токсических функций SOD1, а не с утратой ее активности. Эти данные могут свидетельствовать о том, что сниженный антиоксидантный потенциал может способствовать усилению оксидативного стресса, ассоциирующегося с этими заболеваниями.

В последние годы было сконструировано несколько линий мышей, у которых имеются оксидативные изменения идентичные наблюдаемым при различных нейродегенеративных болезнях. Эти мыши были использованы для изучения их способности моделировать патологические состояния у человека. У мышей трансгенных линий, экспрессирующих различные мутации SOD1 семейной формы ALS (ALS-SOD1), обнаружена не только дегенерация двигательных нейронов, но и усиленные пероксидация липидов, оксиление ДНК и нитрирование белка в пораженных клетках. Исследования, проведенные на мышах этих трансгенных линий, показали, что эти мутации ведут к токсическому gain of function, которое не имеет отношения к способности SOD1 редуцировать O2β- в Н2О2. Некоторые исследователи предполагают, что токсические эффекты мутаций могут быть косвенно связаны с усилением оксидативного повреждения из-за способности мутантного ALS-SOD1 работать как пероксидаза, супероксид редуктаза или увеличивать уровни ONOO- как следствие усиленного образования O2β с последующей реакцией с NOβ (BOX3).

BOX 3

Proposed mechanisms of ALS-SOD toxic gain of function

Transgenic mice expressing human ALS-SOD1 mutations display pathology that is reminiscent of the disease. This does not occur in mice that express wild-type SOD1 or in SOD1-null mice, implying that the ALS-SOD mutations represent a toxic gain of function. In addition to its normal activity as a superoxide dismutase, SOD1 can also act in some instances as a peroxidase. A modest increase in this activity is observed in connection with ALS-SOD1 mutations101, 102, and expression of membrane-bound glutathione peroxidase 4 (GSHPx-4) but not cytoplasmic GSHPx-1 was found to be protective103, 104. Mutant forms of ALS-SOD1 have also been proposed to have reduced zinc-binding capacity105, and removal of zinc from wild-type SOD1 increases the toxicity of the enzyme to motor neurons106. The recent identification of a sporadic ALS-SOD1 mutation within the zinc-binding site of the enzyme strengthens the argument for zinc depletion as a possible mechanism of action in at least some of the ALS-SOD1 mutations107. Decreased zinc binding has been proposed to increase either superoxide reductase activity or production of O2 -, leading to increased ONOO-. The former might be due to reduction of the active-site copper by a cellular component such as ascorbate, followed by its re-oxidation by O2- (ref. 106). This could result in its depletion or its conversion to a toxic free-radical species. The latter would involve auto-oxidation of the enzyme so that it produces rather than consumes O2 -. The role of copper-mediated oxidative stress has been recently challenged by experiments in which loading of active-site copper is decreased by knocking out the copper chaperone (CCS) gene. This does not seem to delay the onset or progression of motor neuron degeneration in ALS-SOD1 transgenics108. However, CCS can only add copper to SOD1 that contains zinc, and the residual SOD1 activity that is observed in these animals indicates that copper could theoretically be incorporated into zinc-depleted enzyme by another source. The net results would be generation of the form of the enzyme that has been shown to be toxic. The nature of the gain of function in these proteins therefore remains to be definitely explained and will doubtless continue to be an intense research area in the ALS field.

GSHx- и SOD1-дефицитные мыши, а также мыши, являющиеся null-мутантами по митохондриальному марганец содержащему SOD2 гену, более чувствительны к токсическим эффектам PD-индуцирующего агента 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6, tetrapyridine (MPTP), тогда как трансгеннные животные с мутациями в SOD1 и SOD2 являются более резистентными. Экспрессия iNOS – индуцибельной формы nitric oxide synthase (NOS) – которая обнаруживается преимущественно в глии мозга, способствует нейродегенерации, ассоциированной с экспрессией человеческих ALS-SOD1 мутаций и введением MPTP, тогда как и iNOS-null мыши и мыши, дефицитные по нейрональной форме NOS (nNOS), более чувствительны к MPTP токсичности. Эти результаты стали основанием для тестирования фармакологических агентов, блокирующих окислительные процессы в клетках и участвующих в последующей дегенерации. Minocycline, который, как предполагают, действует и как блокатор активности iNOS, по некоторым данным препятствует нейродегенерации как у ALS-SOD трансгенных мышей, так и у мышей дикого типа после введения им MTPT. Однако это заключение не подтвердилось в более поздних работах. Было также показано, что хелаторы металлов препятствуют образованию бляшек у AD мышиных моделей, у которых экспрессируются амилоидный белок-предшественник (amyloid precursor protein – APP), и предотвращают утрату дофаминергических клеток у MPTP-обработанных мышей (BOX2) Это лишь несколько примеров из множества находок последнего времени, обнаруженных при исследовании животных, моделирующих нейродегенеративные состояния человека. Эти находки прежде всего способствуют пониманию роли оксидативного стресса в утрате нервных клеток.

Данные, полученные, главным образом, на культивируемых клетках и модельных животных, стали базой для поиска рациональной терапии этих заболеваний, направленной на снижение вредных эффектов оксидативного стресса. Оказалось. что антиоксиданты оказывали разные эффекты у больных. Например, несмотря на то, что витамин Е дает некоторый эффект при лечении больных с AD, он не эффективен при лечении PD. Незначительный лечебный эффект наблюдали при введении витамина Е больным с ALS, которые уже принимали ингибитор глутаминовых рецепторов рилузол (rilusole) – вещество, чья эффективность в присутствии и отсутствии витамина Е была проверена впервые на мышиных моделях ALS. Результаты, полученные на клеточных и животных моделях, будут и далее служить фундаментом для проведения клинических испытаний антиоксидантов при лечении этой группы заболеваний.

ROS and aberrant protein interactions

Значительные оксидативные изменения таких белков как α-synuclein при PD, β-AMYLOID при AD и SOD1 при ALS могут вести к увеличению мисфолдинга (misfold) белков и нарушенной деградации. Это, в свою очередь, может вызвать накопление токсических растворимых протофибрилл или нерастворимых агрегатов в мозге, что способствует нейродегенерации. Каким образом это происходит? С возрастом происходит усиление оксидативного стресса в мозге, в результате которого могут повреждаться нейроны, поскольку они находятся в постмитотическом состоянии. Способность клеток реагировать на оксидативные белковые повреждения также снижается с возрастом, что способствует белковому накоплению. Снижение индукции термошоковых белков (HSPs), например, может вести к увеличению оксидативно поврежденных белков, которые могут оказаться резистентными к ubiquitinylation и деградации 26S протеосомой. Предполагают, что истощение растворимых HSPs оказывает важное влияние на клеточную нейродегенерацию, ассоциирующуюся с ALS. Во всяком случае, фармакологическая индукция HSPs агентом arimoclomol задерживает прогрессирование заболевания у ALS–SOD1 мышиных моделей. Подтверждается также, что усиление экспрессии HSPs защищает клетки от токсического эффекта, ассоциированного с PD мутациями в генах α-synuclein и parkin человека, включая оксидативные повреждения, которые приводят к нарушению упаковки белка.

Каждое из этих заболеваний может иметь специфические признаки, вносящие свой вклад во взаимодействие между оксидативным стрессом и нарушением белковой упаковки. Например, при PD в результате метаболизма дофамина вырабатываются побочные продукты – такие как O2β-, H2O2 и дофаминергические quinines, которые могут участвовать, наряду с железом, в окислении α-synuclein (РИС.1). Подтверждается, что α-synuclin связывается с пермеабилизованными синаптическими пузырьками, что увеличивает количество дофамина в относительно кислой среде цитоплазмы, где он скоре всего окисляется. Следовательно, α-synuclin может сам инициировать события, ведущие к его собственному оксидативному повреждению. Дофаминергическая клеточная гибель в эмбриональной культуре среднего мозга, трансфицированного мутантной формой человеческого A53T α-synuclein гена, ослабляется при истощении внутриклеточного дофамина, при ингибировании его синтеза или при воздействии антиоксидантов. Это указывает на то, что утрата жизнеспособности клеток из-за экспрессии α-synuclein ведет к утрате клеточной жизнеспособности, являющейся результатом dopamine-driven окислительных событий. Synuclein-null мыши более резистентны к MPTP токсическому эффекту, вероятно, из-за ослабления синаптического высвобождения дофамина. Окисление α-synuclein может, в свою очередь, быть не распознанным точно ubiquitin-proteasome protein degradation системой, что ведет к его увеличению в клетке. GSH истощение в культивируемых дофаминергических клетках, мимикрирующих PD, может вести к подавлению окисления E1 и Е2 ubiquitin pathway enzymes, приводя к снижению ubiquitinylation окисленных белков, которые могут способствовать повышению их количества в цитоплазме и подавлять протеосомальные функции. Увеличенные концентрации 4-HNE, которые могут продуцироваться истощением GSP при P, и присутствие его в пораженных тканях больных PD, AD и ALS могут и далее усиливать структурообразование поврежденных белков. Коньюгаты 4-HNE и белка подавляют протеосомные функции и сами протеосомы могут стать непосредственными мишенями для повреждений. Окисление ALS-SOD1 мутантных белков и белка SOD1 дикого типа in vitro приводит к усилению агрегации самих белков.

Возможно также, что белки, участвующие в формировании протофибрилл, сами могут вызывать оксидативный стресс. β-amyloid, например, образует Н2О2 в культивируемых клетках. Трансфекция клеток мутантными человеческими генами A53T α-synuclein или parkin ведет к усилению окисления в белках и липидах. Экспрессия человеческих ALS-SOD1 мутантных генов в культуре ведет к увеличению уровня окисления и к повышенной чувствительности к оксидативному стрессу. В первичных культурах двигательных нейронов, изолированных от этих животных, оксидативный стресс усиливается, что коррелирует с повышенной клеточной гибелью, которая предотвращается воздействием разных антиоксидантых соединений. И хотя существующие данные не дают ответа на вопрос, что является инициирующим событием – оксидативный стресс или белковая агрегация, – ясно, что эти два процесса оказывают важное влияние друг на друга.

Oxidative stress and glial inflammation

Активация глиальных клеток в ответ на клеточные повреждения, включая оксидативные повреждения, включает целый комплекс реакций, в том числе повышенную экспрессию генов, участвующих в NO синтезе, и в синтезе цитокинов. Эти вещества могут впоследствии приводить к нейродегенерации. Н2О2, высвобождаемая активированной глией, хотя сама по себе относительно безвредна, может быть изменена пероксидазами и способна образовывать хлорноватистую (гипохлористую) кислоту, высокотоксичную для клеток. ONOO-, образующаяся при взаимодействии NOβ с O2 β- может вызвать нитрацию тирозинов и нитрозилирование цистеинов как в ферментах, так и в структурных белках.