Опасность прионных болезней стала очевидной после вспышки коровьего бешенства в середине 1980-х гг. в Великобритании. Необычные свойства прионов заставили ученых искать новые способы борьбы с эпидемией. Выяснилось, что прионы попадают в организм коров вместе с добавками к кормам, изготавливаемыми из костей и мяса овец, крупного рогатого

Прионы существуют в двух разных формах – нормальной (PrPC ) и видоизмененной (PrPSc ). По неустановленной пока причине патогенный прион изменяет конформацию нормального приона по своему образу и подобию. Обычно организм уничтожает видоизмененные прионы прежде, чем они успевают накопиться. Но если процесс уничтожения нарушен, то аномальных прионов становится слишком много и возникает болезн/

скота, свиней или кур. Патогенные прионы не разрушались при тепловой обработке, обычно уничтожающей все болезнетворные агенты, и таким образом инфицировали животных. В результате ГЭДС стала быстро распространяться в популяции коров, и в 1992 г. в Великобритании было зарегистрировано 37280 случаев заболевания. Начиная с 1989 г. были введены некоторые ограничения на добавки к кормам, но только в 1996 г. после полного их запрета ситуацию удалось взять под контроль, и в прошлом году в стране заболели лишь 612 животных. Всего в Великобритании от ГЭДС пострадали более 180 тыс. коров, а еще у 1,9 млн., согласно эпидемиологическим моделям, инфекция просто не была выявлена.

Однако меры были приняты с большим опозданием. Вопреки заверени- ям властей, ГЭДС поражает не только животных, но и людей. В марте 1996 г. Роберт Уилл (Robert Will), Джеймс Айронсайд (James Ironside) и Джин Белл (Jeanne Bell) из Национального центра по наблюдению за распространением БКЯ сообщили о смерти 11 молодых людей от вариантной болезни Крейтцфельдта–Якоба (вБКЯ). Обнаруженный в их головном мозге PrPSc существенно отличался от аномального приона, обычно присутст- вующего у больных спорадической формой БКЯ.

Многие ученые поначалу сомневались в наличии связи между ГЭДС и вБКЯ, но в конце концов, под давлением неоспоримых фактов, сомнения были развеяны. Майкл Скотт (Michael Scott) и Стивен д’Армон (Stephen DeArmond) из Калифорнийского университета встроили в геном мышей PrP-ген крупного рогатого скота, а затем ввели им прионы, полученные от животных с ГЭДС или от людей, страдающих вариантной формой БКЯ. Спустя 9 месяцев после инъекции мыши заболели, причем симптомы были одинаковыми независимо от источника аномальных прионов. В феврале этого года появились сообщения о 146 случаях заболевания вариантной формой БКЯ в Англии и 10 случаях в других странах. Сколько еще людей стали носителями аномальных прионов (возбудителей вБКЯ), не знает никто. По прогнозам, основанным на эпидемиологических моделях, их не больше 30 человек, но беда в том, что сами модели основываются на допущениях, которые вполне могут оказаться неверными. Так, одно из них состоит в том, что вБКЯ развивается только у людей с определенным генетическим статусом. Поскольку у прионных болезней очень большой ин- кубационный период, должно пройти немалое время, пока проявятся все случаи носительства вБКЯ-прионов и можно будет сравнить генетические особенности больных.

У больных вБКЯ PrPSc накапливаются не только в тканях головного мозга, но и в лимфоидных тканях, что может быть вызвано их попаданием в кровоток из внешнего источника, например, при переливании крови. Это побудило правительства многих стран ввести более строгие требования к донорам. Так, в Великобритании людям, родившимся после 1996 г., когда вступили в силу жесткие ограничения на добавки к кормам для скота, можно переливать кровь только от доноров из других стран (считается, что те, кто родились раньше, уже могли получить аномальные прионы). В США же донорами не могут быть люди, проведшие в Великобритании более трех месяцев в период с 1980 по 1996 гг. Принятые меры дали результаты, хотя и привели к тому, что время от времени в стране возникал дефицит крови. В декабре прошлого года в Великобритании умер один из 15 больных вБКЯ, которым была перелита кровь от доноров, заболевших позже. При этом гемотрансфузия была проведена пациенту за 7,5 лет до его смерти. Можно было бы предположить, что источником инфекции были пищевые продукты, содержащие аномальные прионы, но этому противоречил возраст умершего: ему было 69 лет, а возраст большинства больных вБКЯ не превышает 29 лет. Все это наводит на мысль, что зараженное прионами мясо – вовсе не единственный источник инфекции.

Коровье бешенство затронуло не только Великобританию, но и США и Канаду. В мае 2003 г. канадские власти сообщили о случае заболевания ГЭДС 8,5-летней коровы из провинции Саскачеван, которая была привезена из Великобритании 10 лет назад. Животное было забито в январе 2003 г., а соответствующие тесты были проведены лишь в апреле. А между тем коровью тушу уже переработали в корма для домашних животных и экспортировали их в США. Спустя семь месяцев министерство сельского хозяйства США сообщило о первом случае коровьего бешенства в стране – произошло это в штате Вашингтон. Больная 6,5-летняя дойная корова была привезена в страну в возрасте четырех лет. Теперь власти США не могут утверждать, что никакого коровьего бешенства в стране нет и населению не о чем беспокоиться.

В Америке, как и в Канаде, многие заинтересованы в том, чтобы проблемы не существовало – ведь это грозит огромными убытками. В первую очередь они связаны с ограничением экспорта: 58 стран уже объявили о закрытии своих рынков для американской говядины до тех пор, пока не будут получены гарантии ее безопасности. Методы диагностики Самый прямой способ предоставления таких гарантий – проверка на присутствие аномальных прионов туш забитых животных и отбраковка тех из них, которые содержат прионы. До сих пор для тестирования министерство сельского хозяйства США использовало иммуногистохимические методы. Это трудоемкая процедура, занимающая несколько дней и малопригодная для широкого применения. Нужно было разработать альтернативные способы проверки. В середине 1980-х гг. в нескольких лабораториях были получены новые типы антител, обеспечивающие более эффективную идентификацию аномальных при- онов в тканях мозга. Они распознавали любые прионы – как нормальные, так и патогенные, и чтобы идентифицировать именно PrPSc, нужно было прежде всего удалить из образца абсолютно все нормальные прионы. Для этого мы использовали протеиназы – ферменты, разрушающие белки. PrPSc устойчив к действию протеиназ и после обработки ими образца оставался

Сегодня для посмертного обнаружения патогенных прионов (PrPSc) в тканях головного мозга домашнего скота используют четыре мето- да. К сожалению, у них есть недостатки: трудоемкость, невысокая чувствительность, обязательное использование для тестирования препаратов головного мозга. Поэтому ученые работают над созда- нием таких способов тестирования, которые позволили бы прово- дить прижизненные экспресс-анализы на основе проб крови или мочи и выявлять патогенные прионы при минимальной их концентра- ции. Это необходимо для обнаружения инфекции на самых ранних стадиях и предотвращения ее распространения.

интактным. Затем мы инкубировали образец с антителами и определяли количество присутствующих в нем PrPSc. Используя аналогичный подход, целый ряд компаний разработал собственные варианты антител и набор необходимых для тестирования реактивов. Вся процедура занимает несколько часов и применяется для массового обследования животных в Европе и Японии. (Первый случай коровьего бешенства в Японии был отмечен в 2001 г., а к апрелю этого года число инфицирован- ных коров достигло 11.) Однако методы быстрого тестирования имеют свои ограничения: их можно применять только когда аномальные прионы присутствуют в головном мозге животного в большом количестве. А поскольку инкубационный период ГЭДС составляет 3–5 лет, у большинства предназначенных на убой коров (как правило, это животные моложе двух лет), даже если они инфицированы, прионы не успевают накопиться до необходимого для проверки уровня. Следовательно, упомянутые тесты пригодны для скрининга коров только старше определенного возраста, при этом в первую очередь тестированию подлежат вялые, апатичные животные, а затем и те, которые выглядят вполне здоровыми. До января нынешнего года, когда в США были введены новые правила контроля, из 200 тыс. туш ослабленных коров, ежегодно отправляемых на мясоперерабатывающие комбинаты, исследовали на наличие прионов лишь небольшую часть. Теперь, согласно новым требованиям министерства сельского хозяйства, проверке подлежат все забиваемые животные. (Вопрос о том, может ли коровье молоко служить источником прионов, остается открытым.) Но поскольку даже новые методы тестирования не удовлетворяют всем необходимым требованиям, первоочередной задачей становится разработка новых подходов к идентификации аномальных прионов.

Один из таких способов мог бы состоять в амплификации аномальных прионов, присутствующих в исследуемом образце, до концентрации, поддающейся измерению. В случае успеха можно было бы использовать для анализа пробы крови, а не головной мозг животного (нынешние методы недостаточно чувствительны, чтобы обнаружить следовые количества PrPSc в крови). Клаудио Сото (Claudio Soto) из Serono Pharmaceutical в Италии уже попытался реализовать эту идею. Он смешал образцы тканей мозга двух хомяков (здорового и больного скрепи) и обработал смесь ультразвуком, с тем чтобы дезинтегрировать сгустки PrPSc. Высвободившиеся молекулы аномального приона тут же трансформировали нормальные молекулы, и в результате доля нечувствительных к протеиназам PrPSc в образце увеличивалась в 10 раз. В основе альтернативного подхода лежит использование особенностей конформации аномальных прионов, а не их амплификация. Так, в одном из тестов мы с моими коллегами применили антитела, способные связываться либо с PrPC, либо с PrPSc, но не с обоими прионами. Мишенью антитела служила часть прионовой молекулы, доступная при одной ее конформации и недоступная при другой. Такой способ тестирования не требует этапа протеиназной обработки, что очень важно, поскольку, как оказалось, одна из форм PrPSc чувствительна к протеиназам, и, обрабатывая ими образец для разрушения PrPС, мы разрушали и аномальные прионы и тем самым недооценивали их количество.

Наш тест, который мы назвали конформационно-чувствительным имму- нологическим анализом (conformationdependent immunoassay, CDI), был разрешен к применению в Европе в 2003 г., и не исключено, что его чувствительности будет достаточно для определения PrPSc в пробах крови. Уже доказана возможность применения нового теста для проверки молодых коров. Так, из Японии осенью 2003 г. поступило сообщение о возможном заболевании ГЭДС двух коров в возрасте 21 и 23 месяцев, не проявляющих никаких признаков неврологических нарушений. Подтвердить диагноз у второй из них удалось только с помощью CDI-теста – в стволе мозга у нее были обнаружены скопления аномальных прионов. Обычные тесты на PrPSc дали неоднозначные результаты.

В Европе проверке на наличие аномальных прионов подлежит крупный рогатый скот в возрасте более 30 месяцев, если он предназначается на убой (в Германии порог ниже – 24 месяца), поэтому случай, аналогичный произошедшему в Японии, там был бы невозможен. Вначале правительство Японии намеревалось ввести у себя в стране правила тестирования, принятые Европейским союзом, но адвокаты потребителей настояли на том, чтобы проверку проходило каждое забитое животное.