
Смадар Коэн и Джонатан Лиор В МИРЕ НАУКИ, - 2005, № 2, С 24-
Биологи и инженеры, специализи-рующиеся в тканевой инженерии, вплотную приблизились к заветной цели – выращиванию функциональных лоскутов сердечной мышцы. ОБ АВТОРАХ: Смадар Коэн и Джонатан Лиор шесть лет работали над выращиванием функциональной ткани сердечной мышцы. Коэн, профессор в области биотехнологической инженерии Университета Бен-Гуриона в пустыне Негев (Израиль), исследует реакции клеток на внешние сигналы. Кроме того, она синтезирует полимерные биоматериалы для тканевой инженерии и контролируемого высвобождения лекарственных препаратов. Лиор – врач-кардиолог в Медицинском центре в Шебе и директор Института новых проблем кардиологии при Тель-Авивском университете. Круг его научных интересов – регенерация сердечной мышцы с использованием клеточных трансплантантов, методов тканевой инженерии и генной терапии. Дополнительная Литература: Tailoring the Pore Architecture in 3-D Alginate Scaffolds by Controlling the Freezing Regime during Fabrication. Sharon Zmora, Rachel Glickis and Smadar Cohen in Biomaterials, Vol. 23, pages 4087ЁC4094; October 2002. Myocardial Tissue Engineering: Creating a Muscle Patch for a Wounded Heart. Jonathan Leor and Smadar Cohen in Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 1015, pages 312ЁC319; May 2004.	Сердце, разбившееся от несчастной любви, в конце концов оправляется от жестокого удара. Другое дело – рана, нанесенная сердцу при инфаркте. В отличие от печени или кожи, сердечная мышца не восстанавливается, на месте ее повреждения остается обширный рубец, неспособный к сокращениям. Нарушение синхронности в сокращении сердечной мышцы при инфаркте приводит к повышению нагрузки на здоровые области сердца, их преждевременному изнашиванию и деформации стенки миокарда. Результатом таких процессов может стать еще одно более обширное поражение сердечной мышцы в ближайшие семь месяцев. Благодаря врачам большинство людей, перенесших инфаркт, возвращается к нормальной жизни. Но серия повторных инфарктов ослабляет сердце, оно перестает выполнять свои функции в полном объеме, и в конце концов остается один способ спасения жизни больного – трансплантация. Эта сложнейшая хирургическая операция зависит от наличия подходящего донора. В США в 2003 г. было зарегистрировано 550 тыс. новых случаев острой сердечной недостаточности, а трансплантацию удалось провести лишь 2 тыс. больным. Если бы врачи умели ликвидировать последствия поражения сердечной мышцы, это облегчило бы жизнь миллионам больных. В связи с этим перед специалистами в области тканевой инженерии встала неотложная и чрезвычайно трудная задача – выращивание лоскутов функционально активной ткани сердца, способных заменить омертвевшую ткань. Чтобы обеспечить проведение электрического сигнала и синхронное сокращение новой ткани, должна произойти параллельная самоорганизация волокон сердца, а затем должна образоваться физические контакты и нервные связи. Гораздо проще вырастить in vitro кожу и хрящевую ткань, поскольку эти органы не такие сложные и не нуждаются во внутренней сосудистой сети. Интегрирование же кровеносных сосудов в такую объемную структуру, как сердечная мышца, серьезно услож-няет ее получение in vitro. Конструирование любой ткани (простой или сложной) вне живого организма еще 15 лет назад считалось абсолютно нереальным. Однако за последние годы в области клеточной биологии и тканевой инженерии произошли большие изменения. Используя инженерные методы, мы создали некий каркас, который помогает расти клеткам сердечной мышцы и кровеносным сосудам даже в зоне обширного инфаркта.Закладка фундаментаИнфаркт миокарда возникает в результате острого поражения коронарных артерий сердца, снабжающих левый желудочек кровью. Часть сердечной мышцы перестает получать кровь и содержащийся в ней кислород, что приводит к гибели сокращающихся мышечных клеток (кардиомиоцитов) и омертвению целой области сердца. Размер пораженного участка зависит от того, насколько обширной была область, питаемая вышедшим из строя сосудом. Миоциты относятся к числу редко делящихся клеток и не успевают «заштопать» поредевшую ткань. Стволовые клетки (источник новых клеток) в сердце отсутствуют. В результате отмершие миоциты заменяются неспособными к сокращениям фиброзными клетками. Более того, здоровые миоциты, примыкающие к пораженному участку, тоже могут погибнуть, что приведет к еще большему расширению последнего. В ходе ремоделирования происходит истончение стенки желудочка в области инфаркта и постепенное ее растяжение или даже разрыв.В последние несколько лет ученые не раз пытались восстановить ткань сердечной мышцы в области инфаркта, трансплантировав в нее стволовые клетки из других тканей – костного мозга или скелетных мышц. Они надеялись, что клетки либо адаптируются к чуждому для них окружению и начнут продуцировать новые кардиомиоциты, либо подтолкнут естественные регенеративные процессы. Однако клинические испытания показали бесперспективность такого подхода. Большинство стволовых клеток погибало, а оставшиеся в живых скапливались по краям пораженной области, но не вступали в физический контакт с соседними здоровыми клетками и не проводили электрических сигналов, обеспечивающих синхронные сердечные сокращения. Имплантированные клетки не могли расти и размножаться в пораженной ткани, прежде всего потому, что в ней отсутствовала инфраструктура, в норме поддерживающая живые клетки. В здоровых тканях имеется внеклеточный матрикс, состоящий из структурных белков (таких как коллаген) и молекул сложных сахаров – полисахаридов (например, гепарансульфата). Матрикс не только посылает химические сигналы, запускающие рост, но и служит механической опорой для клеток.Осознавая важность внеклеточного матрикса, специалисты в области тканевой инженерии уже давно задумываются над созданием его искусственного заменителя – некой структуры, поддерживающей растущие живые ткани. Она служила бы опорой для клеток, структурировав образующиеся из них ткани – так, как это происходит in vivo. Решалась бы проблема нежелательной миграции трансплантированных клеток из зарубцевавшейся области. А после того как новые клетки стали бы секретировать вещества для внеклеточного матрикса, искусственные «подпорки » разрушились бы, не оставив следа участия в строительстве здоровой ткани «наемных рабочих». Пожалуй, наиболее ценное в искусственном каркасе то, что он способствует васкуляризации новой ткани. Снабжение трансплантированных клеток кислородом и питательными веществами, а также удаление ненужных продуктов жизнедеятельности совершенно необходимо для их выживания.В конце 1980-х гг. одному из нас (Коэну) посчастливилось работать с Робертом Лангером (Robert Langer), пионером в области тканевой инженерии. В те годы идея конструирования живых тканей казалась несбыточной мечтой. К тому же клетки всегда оставались прерогативой биологов, а мы были инженерами-химиками. Но в это время в обеих дисциплинах произошли большие перемены: биологи преуспели в разгадке механизма взаимодействия клеток с различными материалами, а химики-технологи научились синтезировать новые полимеры. За 20 лет Сердечная недостаточность, сопровождающая инфаркт миокарда, может обусловливаться омертвением обширной области сердечной мышцы, но гораздо чаще к ней приводит прогрессирующее изменение структуры самого сердца. ЗДОРОВОЕ СЕРДЦЕ Левый желудочек сердца выталкивает богатую кислородом кровь в артерии, по которым она направляется к разным частям тела. Толстую стенку желудочка образуют мышечные клетки – кардиомиоциты. ИНФАРКТ Когда кровеносный сосуд, питающий сердечную мышцу, по какой-то причине закупоривается, миоциты погибают от недостатка кислорода и часть сердечной мышцы отмирает. Это явление называется инфарктом. РУБЦЕВАНИЕ Ферменты разрушают внеклеточный матрикс в области инфаркта. Макрофаги поглощают погибшие миоциты, и их место занимают фибробласты, вырабатывающие коллаген. Стенка желудочка истончается и становится менее эластичной. Если здоровые миоциты по границам зарубцовывающейся ткани тоже погибают, пораженная область увеличивается. За несколько месяцев она может стать больше в два раза. РЕМОДЕЛИРОВАНИЕ ЖЕЛУДОЧКА После инфаркта на здоровую часть мышцы падает дополнительная нагрузка, и вначале она утолщается. Но затем некоторые клетки не выдерживают чрезмерного напряжения и погибают. Стенки желудочка истончаются и растягиваются, а сам желудочек увеличивается в объеме. Развивается сердечная недостаточность прошедших с тех пор, специалисты по тканевой инженерии, работая над созданием оптимального каркаса, поддерживающего клетки в процессе формирования из них функциональной ткани, перепробовали самые разные материалы, как синтетические,так и природные. Среди синтетических материалов чаще всего применялись деградируемые полиэфиры, состоящие из остат-ков лактида или гликолида либо из их комбинаций. Они безопасны для человека, хотя и не лишены некоторых недостатков. Большинство из них, будучи гидрофобными, не слишком охотно связывают живые клетки, а сделанный из них каркас не разлагается, а постепенно крошится. «Крошки», обладающие кислотными свойствами, вызывают локальное воспаление и отрицательно влияют на жизнеспособность клеток. У созданных недавно гелей на водной основе нет подобных недостатков, к тому же по текстуре они напоминают природный внеклеточный матрикс. Однако они не обладают важными химическими свойствами, которые есть, например, у коллагена, и не могут передавать клеткам важные сигналы. Помимо коллагена в качестве материала для строительства искусственного каркаса был использован другой белок внеклеточного матрикса – фибронектин. Он содержит аминокислоты, с которыми охотно взаимодействуют клетки, но у него недостает механической прочности, чтобы поддерживать нарастающую клеточную массу. К тому же коллаген слишком быстро разрушается ферментами,присутствующими в организме, и может провоцировать иммунную КОНСТРУИРОВАНИЕ КАРКАСА ДЛЯ ТКАНИ Каркас служит опорой для образующейся ткани и структурирует ее. В идеале это должна быть пористая конструкция с тонкими стенками, в которой поры образуют густую переплетающуюся сеть и имеют диаметр 200 мкм (примерно таков диаметр капилляра). Это обеспечивает взаимодействие между клетками и позволяет сосудам пронизывать образующуюся ткань.В качестве материала для каркаса мы выбрали альгинат, продукт жизнедеятельности водорослей, поскольку по своим химическим свойствам он напоминает природный внеклеточный матрикс. Но нам пришлось прибегнуть к некоторым ухищрениям, чтобы превратить водный раствор альгината в жесткую конструкцию со строго контролируемыми формой (левый рисунок) и текстурой (правый рисунок).Учитывая то, что при замерзании вода в альгинатном гидрогеле кристаллизуется и что при разных режимах охлаждения можно получить кристаллы самой разной формы, для создания каркасов мы использовали метод замораживания – сублимации. Замерзший гидрогель образовал губчатую структуру, состоящую из кристаллов льда, отделявшихся друг от друга тонкой альгинатной стенкой. После сублимации кристаллов льда вместо них в структуре оставались поры самых разных размеров, форм и ориентации в зависимости от скорости и направления роста кристаллов (внизу). В масляной бане при температуре –35oС лед образуется быстрее всего на дне сосуда. Структура имеет крошечные, густо расположенные пересекающиеся поры. Ближе к поверхности поры расширяются. При температуре жидкого азота, –196oС, в емкости образуется аналогичный температурный градиент. Формирование у поверхности пор самых разных форм, размеров и направлений может быть связано с интенсивным испарением азота и образованием холодного фронта переменного направления. При замораживании в морозильнике при температуре –20oС раствор альгината вначале охлаждается до –10oС, затем резко нагревается до –2oС и далее медленно охлаждается до –20oС. Температурный скачок связан с отдачей тепла водой и началом кристаллизации по всему объему, о чем свидетельствует образование одинаковых пересекающихся пор. СТРУКТУРА ПОР Возможность контролировать архитектуру каркаса, изменяя режим замораживания, имеет большое значение, потому что структура пор принципиальна для создания функционирующей ткани. Так, протяженные поры способствуют образованию в них кровеносных сосудов. Когда мы использовали жидкий азот для создания каркаса с длинными каналами и «заселили» его флуоресцентно меченными клетками (зеленый цвет), которые в течение двух недель образовали структуры, напоминающие капилляры. реакцию пациента, и без того ослабленного перенесенным инфарктом.Мы решили использовать природный полимер другого типа – полисахарид под названием альгинат, продуцируемый водорослями и не вызывающий у человека нежелательного иммунного ответа. Один из альгинатов при растворении в воде присоединяет положительно заряженные ионы Са2+ , и его молекулы образуют между собой поперечные связи. Гидрогель желатинообразной консистенции обладает эластичностью природного внеклеточного матрикса. Прежде чем использовать альгинатный гидрогель в качестве опоры, его необходимо было структурировать и придать ему механическую прочность, так, чтобы он сохранял форму под грузом нараставших на нем клеток. Для этого мы использовали новый метод затвердевания альгината, основанный на инженерных принципах. Вначале мы залили раствор альгината в различные формы, а затем заморозили его в трех разных режимах. Во всех случаях образовались кристаллики льда, разделенные тонкими альгинатными стенками. Когда лед сублимировали, обнаружилась губчатая конструкция с крошечными порами. Варьируя условия замораживания, можно было получать различную степень пористости, размер пор, их направление, а также густоту пересечения.Пересекаемость пор влияет на свободное распространение растущих клеток по всей структуре, на снабжение их питательными веществами и выведение продуктов жизнедеятельности. Мы обнаружили, что чем гуще сеть пор, тем легче имплантированные кровеносные сосуды проникают во все уголки формирующейся ткани. Уникальная внутренняя архитектура подобных каркасов, напоминающих соты, достаточно устойчива. Даже если 95% их объема занимают поры, они выдерживают большие внутренние нагрузки. Итак, мы научились создавать каркасы нужной формы и структуры, которые не отторгаются организмом, состоят из природных нетоксичных материалов, обладают высокой механической прочностью и в то же время разлагаются в организме, когда приходит время. Остается выяснить, сочтут ли живые клетки наш каркас адекватной заменой утраченному во время инфаркта внеклеточному матриксу. Выращивание ткани Прежде чем имплантировать каркас в организм лабораторного животного, мы решили проверить, как воспримут альгинат клетки сердечной мышцы in vitro. Мы суспендировали в питательной среде кардиоциты эмбриона крысы (в отличие от зрелых кардиоцитов они могли делиться) и инфузировали их в круглый каркас диаметром 6 мм и высотой 1 мм. Приложив небольшую центробежную силу, мы способствовали быстрому проникновению клеток в поры каркаса и окончательному распределению их там менее чем за 30 мин. Ускорение процесса проникновения клеток в поры способствует сохранению жизнеспособности клеток, плохо переносящих дефицит кислорода, а гомогенизация распределения обеспечивает максимальное заполнение пор. В результате нам удалось достичь плотности клеток 108 на 1 см3, что характерно для здоровой сердечной мышцы. Затем мы перенесли «заселенный» клетками каркас в биореактор. В нем поддерживались оптимальная влажность и атмосферное давление, осуществлялась циркуляция питательной среды, проводился непрерывный мониторинг клеточного метаболизма. Через 48 часов было зарегистрировано сокращение миоцитов, и на восьмые сутки мы приступили к имплантации конструкции в сердце подопытной взрослой крысы, перенесшей семь дней назад инфаркт левого желудочка. Пораженная область была хорошо заметна: она представляла собой бледную несокра-щающуюся зарубцевавшуюся ткань. Мы поместили имплантант прямо на нее, зашили разрез и стали ждать.Через два месяца мы вновь обнажили сердце и с изумлением увидели пучок новых кровеносных сосудов, проросших из здоровой ткани в имплантант. Сконструированный трансплантант хорошо интегрировался с пораженной тканью, альгинатный остов начал рассасываться и заменяться обычным внеклеточным матриксом. Из эмбриональных кардиомиоцитов сформировались зрелые мышечные волокна, некоторые из которых были организованы в такие же параллельные структуры, как в нормальной сердечной мышце. Между волокнами образовались механические контакты, обеспечивающие их синхронное сокращение, а синапсы проводили электрические сигналы. Все крысы, перенесшие инфаркт (и те, кому предстояла операция, и грызуны из контрольной группы), прошли электрокардиографическое обследование. Спустя два месяца обе группы животных вновь были обследованы. У контрольных крыс Микросферы, крошечные образования диаметром 3 мкм, высвобождают факторы роста и ускоряют рост кровеносных сосудо наблюдалась типичная для постинфарктного периода картина: значительная дилатация левого желудочка и ухудшение работы сердца. У прооперированных же грызунов состояние было примерно таким же, как сразу после инфаркта: объем желудочка,толщина стенки и работа сердца не изменились. Итак, первая цель была достигнута: мы защитили сердце, пострадавшее от инфаркта, от дальнейшего повреждения, которое могло привести к его полному выходу из строя. Но остался ряд вопросов, на которые мы не могли получить ответа. Каков механизм защиты ткани сердечной мышцы трансплантантом – ведь сокращения последнего никак не влияли на работу сердца? Складывалось впечатление, что, препятствуя расширению пораженной области и содей-ствуя утолщению стенки желудочка, трансплантант блокировал обычный при инфаркте процесс ремоделирования. Вполне вероятно, что дальнейшему омертвению ткани препятствовал рост новых кровеносных сосудов в области инфаркта. Их число и размер были больше, чем раньше. Но что самое удивительное, они образовывались даже в тех случаях, когда в имплантированный каркас не инфузировали новые клетки. Для роста кровеносным сосудам было достаточно той опоры, которую им обеспечивал альгинатный каркас. Мы надеемся, что сам альгинат мобилизует стволовые клетки на участие в регенерации, поскольку по химическому строению он сходен с гепарансульфатом, полисахаридом – важным компонентом природного внеклеточного матрикса. Чтобы проверить гипотезу, мы инъецировали альгинатный гидрогель непосредственно в пораженную область сердца крысы. Даже находясь в форме гидрогеля, альгинат способствовал сохранению структуры и функции желудочка, выполняя роль заменителя внеклеточного матрикса и тем самым способствуя ангиогенезу. Серьезная проблема – поиск источника сердечных клеток, которые можно было бы использовать при трансплантации. Взрослые кардиомиоциты самого больного для подобных целей не годятся, поскольку они не реплицируются. Есть надежда, что к образованию кардиомиоцитов удастся подтолкнуть эмбриональные стволовые клетки и «взрослые» стволовые клетки костного мозга или клетки крови из пупочного канатика. Не исключено, что донорные клетки будут восприняты реципиентом как чужеродные тела и иммунная система их отвергнет. Альтернативой могут служить собственные клетки организма – стволовые клетки или их предшественники, взятые из костного мозга, мышц или жировой ткани, либо эмбриональные стволовые клетки, полученные из клеток пациента методом терапевтического клонирования. Возможно, со временем удастся идентифицировать стволовые клетки самой сердечной ткани. Альтернативные пути возвращения сердца к жизни Полученные результаты воодушевили исследователей. Мы наметили несколько возможных путей использования альгинатного каркаса для регенерации ткани сердечной мышцы после ее обширного поражения. В ближайшие три года мы собираемся испытать альгинатный каркас, не заселенный клетками, на больных, перенесших инфаркт. Эксперименты, проведенные на свиньях, подтвердили то, что мы наблюдали ранее на крысах: альгинатный каркас сдерживает расширение пораженной области и предотвращает ремоделирование стенок желудочка.Способность альгината ускорять ангиогенез позволяет предположить, что мы можем повысить выживаемость трансплантированных клеток, имплантировав вначале один каркас, выждав какое-то время и лишь затем «заселив» его клетками. Мы провели подобные эксперименты на грызунах и получили обнадеживающие результаты. Васкуляризация значительно ускоряется при включении в альгинатную сеть микросфер, из которых контролируемым образом высвобождаются факторы роста. К сожалению, предварительная васкуляризация каркаса уменьшает пространство, которое могло бы быть занято клетками, поэтому мы работаем над упорядоченностью процесса, используя различные факторы роста. Сегодня in vitro в полной мере удается контролировать размер выращиваемой ткани, ее состав и функции. И если при инфаркте происходит перфорация ткани, то мы можем заменить весь пораженный участок сердца. При этом для заполнения образовавшейся бреши используются не альгинатный пористый каркас, а полноценный лоскут ткани. Вновь возникает вопрос, как сохранить жизнеспособность трансплантированной ткани до образования системы кровеносных сосудов. Опираясь на предыдущий опыт, мы склоняемся к идее создания предварительно васкуляризованного трансплантанта. Мы уже создали капиллярное русло in vitro, «заселив» альгинатный остов эндотелиальными клетками, которые в норме выстилают стенки кровеносных сосудов, и поместили конструкцию в биореактор. Теперь мы намереваемся культивировать вместе эндотелиальные клетки и кардиомиоциты в составе альгинатного остова, с тем, чтобы создать капиллярную сеть внутри кусочка миокарда. В случае удачи мы проверим, будет ли капиллярное русло функционировать после трансплантации. Если новые сосуды быстро воссоединятся со старыми, то трансплантированная ткань приживется с большой вероятностью. Обнадеживает, что мы не одни занимаемся инженерией сердечной мышцы, ведь успех любого из нас послужит прогрессу во всей области. Возможно, от достижения цели нас отделяют долгие годы, но она уже не кажется нереальной.

Сердце, разбившееся от несчастной любви, в конце концов оправляется от жестокого удара. Другое дело – рана, нанесенная сердцу при инфаркте. В отличие от печени или кожи, сердечная мышца не восстанавливается, на месте ее повреждения остается обширный рубец, неспособный к сокращениям.

Нарушение синхронности в сокращении сердечной мышцы при инфаркте приводит к повышению нагрузки на здоровые области сердца, их преждевременному изнашиванию и деформации стенки миокарда. Результатом таких процессов может стать еще одно более обширное поражение сердечной мышцы в ближайшие семь месяцев.

Благодаря врачам большинство людей, перенесших инфаркт, возвращается к нормальной жизни. Но серия повторных инфарктов ослабляет сердце, оно перестает выполнять свои функции в полном объеме, и в конце концов остается один способ спасения жизни больного – трансплантация. Эта сложнейшая хирургическая операция зависит от наличия подходящего донора. В США в 2003 г. было зарегистрировано 550 тыс. новых случаев острой сердечной недостаточности, а трансплантацию удалось провести лишь 2 тыс. больным. Если бы врачи умели ликвидировать последствия поражения сердечной мышцы, это облегчило бы жизнь миллионам больных. В связи с этим перед специалистами в области тканевой инженерии встала неотложная и чрезвычайно трудная задача – выращивание лоскутов функционально активной ткани сердца, способных заменить омертвевшую ткань. Чтобы обеспечить проведение электрического сигнала и синхронное сокращение новой ткани, должна произойти параллельная самоорганизация волокон сердца, а затем должна образоваться физические контакты и нервные связи. Гораздо проще вырастить in vitro кожу и хрящевую ткань, поскольку эти органы не такие сложные и не нуждаются во внутренней сосудистой сети. Интегрирование же кровеносных сосудов в такую объемную структуру, как сердечная мышца, серьезно услож-няет ее получение in vitro.

Конструирование любой ткани (простой или сложной) вне живого организма еще 15 лет назад считалось абсолютно нереальным. Однако за последние годы в области клеточной биологии и тканевой инженерии произошли большие изменения. Используя инженерные методы, мы создали некий каркас, который помогает расти клеткам сердечной мышцы и кровеносным сосудам даже в зоне обширного инфаркта.Закладка фундаментаИнфаркт миокарда возникает в результате острого поражения коронарных артерий сердца, снабжающих левый желудочек кровью. Часть сердечной мышцы перестает получать кровь и содержащийся в ней кислород, что приводит к гибели сокращающихся мышечных клеток (кардиомиоцитов) и омертвению целой области сердца. Размер пораженного участка зависит от того, насколько обширной была область, питаемая вышедшим из строя сосудом.

Миоциты относятся к числу редко делящихся клеток и не успевают «заштопать» поредевшую ткань. Стволовые клетки (источник новых клеток) в сердце отсутствуют. В результате отмершие миоциты заменяются неспособными к сокращениям фиброзными клетками. Более того, здоровые миоциты, примыкающие к пораженному участку, тоже могут погибнуть, что приведет к еще большему расширению последнего. В ходе ремоделирования происходит истончение стенки желудочка в области инфаркта и постепенное ее растяжение или даже разрыв.В последние несколько лет ученые не раз пытались восстановить ткань сердечной мышцы в области инфаркта, трансплантировав в нее стволовые клетки из других тканей – костного мозга или скелетных мышц. Они надеялись, что клетки либо адаптируются к чуждому для них окружению и начнут продуцировать новые кардиомиоциты, либо подтолкнут естественные регенеративные процессы. Однако клинические испытания показали бесперспективность такого подхода. Большинство стволовых клеток погибало, а оставшиеся в живых скапливались по краям пораженной области, но не вступали в физический контакт с соседними здоровыми клетками и не проводили электрических сигналов, обеспечивающих синхронные сердечные сокращения.

Имплантированные клетки не могли расти и размножаться в пораженной ткани, прежде всего потому, что в ней отсутствовала инфраструктура, в норме поддерживающая живые клетки. В здоровых тканях имеется внеклеточный матрикс, состоящий из структурных белков (таких как коллаген) и молекул сложных сахаров – полисахаридов (например, гепарансульфата). Матрикс не только посылает химические сигналы, запускающие рост, но и служит механической опорой для клеток.Осознавая важность внеклеточного матрикса, специалисты в области тканевой инженерии уже давно задумываются над созданием его искусственного заменителя – некой структуры, поддерживающей растущие живые ткани. Она служила бы опорой для клеток, структурировав образующиеся из них ткани – так, как это происходит in vivo. Решалась бы проблема нежелательной миграции трансплантированных клеток из зарубцевавшейся области. А после того как новые клетки стали бы секретировать вещества для внеклеточного матрикса, искусственные «подпорки » разрушились бы, не оставив следа участия в строительстве здоровой ткани «наемных рабочих». Пожалуй, наиболее ценное в искусственном каркасе то, что он способствует васкуляризации новой ткани. Снабжение трансплантированных клеток кислородом и питательными веществами, а также удаление ненужных продуктов жизнедеятельности совершенно необходимо для их выживания.В конце 1980-х гг. одному из нас (Коэну) посчастливилось работать с Робертом Лангером (Robert Langer), пионером в области тканевой инженерии. В те годы идея конструирования живых тканей казалась несбыточной мечтой. К тому же клетки всегда оставались прерогативой биологов, а мы были инженерами-химиками. Но в это время в обеих дисциплинах произошли большие перемены: биологи преуспели в разгадке механизма взаимодействия клеток с различными материалами, а химики-технологи научились синтезировать новые полимеры. За 20 лет

Сердечная недостаточность, сопровождающая инфаркт миокарда, может обусловливаться омертвением обширной области сердечной мышцы, но гораздо чаще к ней приводит прогрессирующее изменение структуры самого сердца.

ЗДОРОВОЕ СЕРДЦЕ

Левый желудочек сердца выталкивает богатую кислородом кровь в артерии, по которым она направляется к разным частям тела. Толстую стенку желудочка образуют мышечные клетки – кардиомиоциты.

ИНФАРКТ

Когда кровеносный сосуд, питающий сердечную мышцу, по какой-то причине закупоривается, миоциты погибают от недостатка кислорода и часть сердечной мышцы отмирает. Это явление называется инфарктом.

РУБЦЕВАНИЕ

Ферменты разрушают внеклеточный матрикс в области инфаркта. Макрофаги поглощают погибшие миоциты, и их место занимают фибробласты, вырабатывающие коллаген. Стенка желудочка истончается и становится менее эластичной. Если здоровые миоциты по границам зарубцовывающейся ткани тоже погибают, пораженная область увеличивается. За несколько месяцев она может стать больше в два раза.

РЕМОДЕЛИРОВАНИЕ ЖЕЛУДОЧКА

После инфаркта на здоровую часть мышцы падает дополнительная нагрузка, и вначале она утолщается. Но затем некоторые клетки не выдерживают чрезмерного напряжения и погибают. Стенки желудочка истончаются и растягиваются, а сам желудочек увеличивается в объеме. Развивается сердечная недостаточность

прошедших с тех пор, специалисты по тканевой инженерии, работая над созданием оптимального каркаса, поддерживающего клетки в процессе формирования из них функциональной ткани, перепробовали самые разные материалы, как синтетические,так и природные.

Среди синтетических материалов чаще всего применялись деградируемые полиэфиры, состоящие из остат-ков лактида или гликолида либо из их комбинаций. Они безопасны для человека, хотя и не лишены некоторых недостатков. Большинство из них, будучи гидрофобными, не слишком охотно связывают живые клетки, а сделанный из них каркас не разлагается, а постепенно крошится. «Крошки», обладающие кислотными свойствами, вызывают локальное воспаление и отрицательно влияют на жизнеспособность клеток. У созданных недавно гелей на водной основе нет подобных недостатков, к тому же по текстуре они напоминают природный внеклеточный матрикс. Однако они не обладают важными химическими свойствами, которые есть, например, у коллагена, и не могут передавать клеткам важные сигналы.

Помимо коллагена в качестве материала для строительства искусственного каркаса был использован другой белок внеклеточного матрикса – фибронектин. Он содержит аминокислоты, с которыми охотно взаимодействуют клетки, но у него недостает механической прочности, чтобы поддерживать нарастающую клеточную массу. К тому же коллаген слишком быстро разрушается ферментами,присутствующими в организме, и может провоцировать иммунную

КОНСТРУИРОВАНИЕ КАРКАСА ДЛЯ ТКАНИ

Каркас служит опорой для образующейся ткани и структурирует ее. В идеале это должна быть пористая конструкция с тонкими стенками, в которой поры образуют густую переплетающуюся сеть и имеют диаметр 200 мкм (примерно таков диаметр капилляра). Это обеспечивает взаимодействие между клетками и позволяет сосудам пронизывать образующуюся ткань.В качестве материала для каркаса мы выбрали альгинат, продукт жизнедеятельности водорослей, поскольку по своим химическим свойствам он напоминает природный внеклеточный матрикс. Но нам пришлось прибегнуть к некоторым ухищрениям, чтобы превратить водный раствор альгината в жесткую конструкцию со строго контролируемыми формой (левый рисунок) и текстурой (правый рисунок).Учитывая то, что при замерзании вода в альгинатном гидрогеле кристаллизуется и что при разных режимах охлаждения можно получить кристаллы самой разной формы, для создания каркасов мы использовали метод замораживания – сублимации. Замерзший гидрогель образовал губчатую структуру, состоящую из кристаллов льда, отделявшихся друг от друга тонкой альгинатной стенкой. После сублимации кристаллов льда вместо них в структуре оставались поры самых разных размеров, форм и ориентации в зависимости от скорости и направления роста кристаллов (внизу).

В масляной бане при температуре –35oС лед образуется быстрее всего на дне сосуда. Структура имеет крошечные, густо расположенные пересекающиеся поры. Ближе к поверхности поры расширяются.

При температуре жидкого азота, –196oС, в емкости образуется аналогичный температурный градиент. Формирование у поверхности пор самых разных форм, размеров и направлений может быть связано с интенсивным испарением азота и образованием холодного фронта переменного направления.

При замораживании в морозильнике при температуре –20oС раствор альгината вначале охлаждается до –10oС, затем резко нагревается до –2oС и далее медленно охлаждается до –20oС. Температурный скачок связан с отдачей тепла водой и началом кристаллизации по всему объему, о чем свидетельствует образование одинаковых пересекающихся пор.

СТРУКТУРА ПОР

Возможность контролировать архитектуру каркаса, изменяя режим замораживания, имеет большое значение, потому что структура пор принципиальна для создания функционирующей ткани. Так, протяженные поры способствуют образованию в них кровеносных сосудов. Когда мы использовали жидкий азот для создания каркаса с длинными каналами и «заселили» его флуоресцентно меченными клетками (зеленый цвет), которые в течение двух недель образовали структуры, напоминающие капилляры.

реакцию пациента, и без того ослабленного перенесенным инфарктом.Мы решили использовать природный полимер другого типа – полисахарид под названием альгинат, продуцируемый водорослями и не вызывающий у человека нежелательного иммунного ответа. Один из альгинатов при растворении в воде присоединяет положительно заряженные ионы Са2+ , и его молекулы образуют между собой поперечные связи. Гидрогель желатинообразной консистенции обладает эластичностью природного внеклеточного матрикса.

Прежде чем использовать альгинатный гидрогель в качестве опоры, его необходимо было структурировать и придать ему механическую прочность, так, чтобы он сохранял форму под грузом нараставших на нем клеток. Для этого мы использовали новый метод затвердевания альгината, основанный на инженерных принципах. Вначале мы залили раствор альгината в различные формы, а затем заморозили его в трех разных режимах. Во всех случаях образовались кристаллики льда, разделенные тонкими альгинатными стенками. Когда лед сублимировали, обнаружилась губчатая конструкция с крошечными порами. Варьируя условия замораживания, можно было получать различную степень пористости, размер пор, их направление, а также густоту пересечения.Пересекаемость пор влияет на свободное распространение растущих клеток по всей структуре, на снабжение их питательными веществами и выведение продуктов жизнедеятельности. Мы обнаружили, что чем гуще сеть пор, тем легче имплантированные кровеносные сосуды проникают во все уголки формирующейся ткани. Уникальная внутренняя архитектура подобных каркасов, напоминающих соты, достаточно устойчива. Даже если 95% их объема занимают поры, они выдерживают большие внутренние нагрузки.

Итак, мы научились создавать каркасы нужной формы и структуры, которые не отторгаются организмом, состоят из природных нетоксичных материалов, обладают высокой механической прочностью и в то же время разлагаются в организме, когда приходит время. Остается выяснить, сочтут ли живые клетки наш каркас адекватной заменой утраченному во время инфаркта внеклеточному матриксу.

Выращивание ткани

Прежде чем имплантировать каркас в организм лабораторного животного, мы решили проверить, как воспримут альгинат клетки сердечной мышцы in vitro. Мы суспендировали в питательной среде кардиоциты эмбриона крысы (в отличие от зрелых кардиоцитов они могли делиться) и инфузировали их в круглый каркас диаметром 6 мм и высотой 1 мм. Приложив небольшую центробежную силу, мы способствовали быстрому проникновению клеток в поры каркаса и окончательному распределению их там менее чем за 30 мин.

Ускорение процесса проникновения клеток в поры способствует сохранению жизнеспособности клеток, плохо переносящих дефицит кислорода, а гомогенизация распределения обеспечивает максимальное заполнение пор. В результате нам удалось достичь плотности клеток 108 на 1 см3, что характерно для здоровой сердечной мышцы. Затем мы перенесли «заселенный» клетками каркас в биореактор. В нем поддерживались оптимальная влажность и атмосферное давление, осуществлялась циркуляция питательной среды, проводился непрерывный мониторинг клеточного метаболизма. Через 48 часов было зарегистрировано сокращение миоцитов, и на восьмые сутки мы приступили к имплантации конструкции в сердце подопытной взрослой крысы, перенесшей семь дней назад инфаркт левого желудочка. Пораженная область была хорошо заметна: она представляла собой бледную несокра-щающуюся зарубцевавшуюся ткань. Мы поместили имплантант прямо на нее, зашили разрез и стали ждать.Через два месяца мы вновь обнажили сердце и с изумлением увидели пучок новых кровеносных сосудов, проросших из здоровой ткани в имплантант. Сконструированный трансплантант хорошо интегрировался с пораженной тканью, альгинатный остов начал рассасываться и заменяться обычным внеклеточным матриксом. Из эмбриональных кардиомиоцитов сформировались зрелые мышечные волокна, некоторые из которых были организованы в такие же параллельные структуры, как в нормальной сердечной мышце. Между волокнами образовались механические контакты, обеспечивающие их синхронное сокращение, а синапсы проводили электрические сигналы.

Все крысы, перенесшие инфаркт (и те, кому предстояла операция, и грызуны из контрольной группы), прошли электрокардиографическое обследование. Спустя два месяца обе группы животных вновь были обследованы. У контрольных крыс

Микросферы, крошечные образования диаметром 3 мкм, высвобождают факторы роста и ускоряют рост кровеносных сосудо

наблюдалась типичная для постинфарктного периода картина: значительная дилатация левого желудочка и ухудшение работы сердца. У прооперированных же грызунов состояние было примерно таким же, как сразу после инфаркта: объем желудочка,толщина стенки и работа сердца не изменились.

Итак, первая цель была достигнута: мы защитили сердце, пострадавшее от инфаркта, от дальнейшего повреждения, которое могло привести к его полному выходу из строя. Но остался ряд вопросов, на которые мы не могли получить ответа. Каков механизм защиты ткани сердечной мышцы трансплантантом – ведь сокращения последнего никак не влияли на работу сердца? Складывалось впечатление, что, препятствуя расширению пораженной области и содей-ствуя утолщению стенки желудочка, трансплантант блокировал обычный при инфаркте процесс ремоделирования. Вполне вероятно, что дальнейшему омертвению ткани препятствовал рост новых кровеносных сосудов в области инфаркта. Их число и размер были больше, чем раньше. Но что самое удивительное, они образовывались даже в тех случаях, когда в имплантированный каркас не инфузировали новые клетки.

Для роста кровеносным сосудам было достаточно той опоры, которую им обеспечивал альгинатный каркас. Мы надеемся, что сам альгинат мобилизует стволовые клетки на участие в регенерации, поскольку по химическому строению он сходен с гепарансульфатом, полисахаридом – важным компонентом природного внеклеточного матрикса. Чтобы проверить гипотезу, мы инъецировали альгинатный гидрогель непосредственно в пораженную область сердца крысы. Даже находясь в форме гидрогеля, альгинат способствовал сохранению структуры и функции желудочка, выполняя роль заменителя внеклеточного матрикса и тем самым способствуя ангиогенезу.

Серьезная проблема – поиск источника сердечных клеток, которые можно было бы использовать при трансплантации. Взрослые кардиомиоциты самого больного для подобных целей не годятся, поскольку они не реплицируются. Есть надежда, что к образованию кардиомиоцитов удастся подтолкнуть эмбриональные стволовые клетки и «взрослые» стволовые клетки костного мозга или клетки крови из пупочного канатика. Не исключено, что донорные клетки будут восприняты реципиентом как чужеродные тела и иммунная система их отвергнет. Альтернативой могут служить собственные клетки организма – стволовые клетки или их предшественники, взятые из костного мозга, мышц или жировой ткани, либо эмбриональные стволовые клетки, полученные из клеток пациента методом терапевтического клонирования. Возможно, со временем удастся идентифицировать стволовые клетки самой сердечной ткани.

Альтернативные пути возвращения сердца к жизни

Полученные результаты воодушевили исследователей. Мы наметили несколько возможных путей использования альгинатного каркаса для регенерации ткани сердечной мышцы после ее обширного поражения. В ближайшие три года мы собираемся испытать альгинатный каркас, не заселенный клетками, на больных, перенесших инфаркт. Эксперименты, проведенные на свиньях, подтвердили то, что мы наблюдали ранее на крысах: альгинатный каркас сдерживает расширение пораженной области и предотвращает ремоделирование стенок желудочка.Способность альгината ускорять ангиогенез позволяет предположить, что мы можем повысить выживаемость трансплантированных клеток, имплантировав вначале один каркас, выждав какое-то время и лишь затем «заселив» его клетками. Мы провели подобные эксперименты на грызунах и получили обнадеживающие результаты. Васкуляризация значительно ускоряется при включении в альгинатную сеть микросфер, из которых контролируемым образом высвобождаются факторы роста. К сожалению, предварительная васкуляризация каркаса уменьшает пространство, которое могло бы быть занято клетками, поэтому мы работаем над упорядоченностью процесса, используя различные факторы роста.

Сегодня in vitro в полной мере удается контролировать размер выращиваемой ткани, ее состав и функции. И если при инфаркте происходит перфорация ткани, то мы можем заменить весь пораженный участок сердца. При этом для заполнения образовавшейся бреши используются не альгинатный пористый каркас, а полноценный лоскут ткани. Вновь возникает вопрос, как сохранить жизнеспособность трансплантированной ткани до образования системы кровеносных сосудов. Опираясь на предыдущий опыт, мы склоняемся к идее создания предварительно васкуляризованного трансплантанта.

Мы уже создали капиллярное русло in vitro, «заселив» альгинатный остов эндотелиальными клетками, которые в норме выстилают стенки кровеносных сосудов, и поместили конструкцию в биореактор. Теперь мы намереваемся культивировать вместе эндотелиальные клетки и кардиомиоциты в составе альгинатного остова, с тем, чтобы создать капиллярную сеть внутри кусочка миокарда. В случае удачи мы проверим, будет ли капиллярное русло функционировать после трансплантации. Если новые сосуды быстро воссоединятся со старыми, то трансплантированная ткань приживется с большой вероятностью. Обнадеживает, что мы не одни занимаемся инженерией сердечной мышцы, ведь успех любого из нас послужит прогрессу во всей области. Возможно, от достижения цели нас отделяют долгие годы, но она уже не кажется нереальной.