Недавно было показано, что трансплантация нейральных стволовых/ клеток-предшественников может защищать нервную систему от воспалительных повреждений через bystander механизм, который является альтернативой клеточному замещению. Этот новый механизм, который может улучшить процедуру трансплантации, связывают с недифференцированными стволовыми клетками, функциональные характеристики которых регулируются важными регуляторами стволовых клеток, высвобождаемых ЦНС-резидентными и воспалительными клетками, переносимыми с кровью. В данной работе обсуждается альтернативный bystander механизм (bystander – наблюдатель) в контексте атипической эктопической периваскулярной ниши.

Neural stem/precursor cells (NPCs) являются гетерогенной популяцией митотически активных, самовосстанавливающихся и мультипотентных клеток как в развивающейся, так и во взрослой ЦНС. Они имеют сложный паттерн генной экспрессии, который варьирует в зависимости от пространства и времени (1-3) (BOX 1 и РИС.1). Во второй половине 1960-х годов пролиферирующие нервные клетки – возможно представляющие вновь генерированные нейроны - были идентифицированы в мозге взрослых крыс (4,5). С тех пор NPCs были изолированы как из эмбрионов, так и из мозга взрослых организмов. Было показано, что ганглионарный бугорок (бугорки) у эмбриона, субвентрикулярная зона (SVZ) боковых желудочков и субгранулярная зона (SGZ) зубчатой фасции гиппокампа (hippocampal dentate gyrus - DG) у взрослого организма содержат подобные стволовым клеткам предшественники (stem-cell-like precursors), способные к нейрогенезу и глиогенезу (2, 6). Эти области были позже определены как высокоспециализированные герминальные ниши ЦНС (7) (РИС.1а), содержащие низко-пролиферирующие стволовые клетки ЦНС, иммуннореактивные к glial fibrillary acidic protein (GFAP) – nestin и радиальному глиальному маркеру RC2 (8-11, BOX1).

Вскоре после in vivo идентификации стволовых клеток ЦНС, были разработаны различные процедуры, позволяющие увеличивать объем и поддерживать эти клетки в определенных средах в течение многих лет (12). Были разработаны протоколы получения большого числа NPCs in vitro и, т.о., эти клетки могут быть возобновляемым источником готовых для трансплантации клеток (13) (BOX1). Основанная на NPC терапия заболеваний нервной системы (таких как инсульт, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, рассеянный склероз и spinal cord injury - SCI) оказалась довольно успешной. И хотя большинство работ было проведено на экспериментальных моделях, можно предположить, что такая терапия будет иметь положительный результат и у человека. Однако должны быть определены не только наиболее подходящие источники клеток для трансплантации (эмбриональные или клетки взрослого организма), но и наиболее эффективные и безопасные пути введения этих клеток (локально или системно). Однако предполагаемые механизмы, которые поддерживают репаративные способности и долгосрочную функциональную интеграцию NPCs при трансплантации, пока неясны. И хотя имеются сведения, что стволовые клетки могут достигать органа-мишени и дифференцироваться в определенном направлении, доказательств того, что трансплантированные NPCs могут реконструировать трехмерную архитектуру мозга и увеличивать число правильно функционирующих клеток, пока недостаточно.

В данной работе авторы впервые рассмотрели ограничения эффективности эндогенных NPCs взрослого организма в репарации мозга и сфокусировали свое внимание на трансплантации adult NPCs (aNPCs) как терапевтического средства, способного преодолеть ограниченные репарационные способности ЦНС. Острые и хронические воспалительные заболевания мозга характеризуются либо первичным воспалением, ведущим к вторичной нейродегенерации (как при рассеянном склерозе, SCI, травме мозга и инсульте), либо первичной нейродегенерацией, которая сопровождается вторичным реактивным воспалением (как при болезни Паркинсона, Эпилепсии и болезни Гентингтона). Авторы проанализировали оба типа расстройств для того, чтобы обсудить недавно полученные доказательства, поддерживающие концепцию о том, что воспаление мозга с одной стороны представляет механизм, в основе которого лежит ограничение репаративных способностей эндогенных NPCs и, с другой стороны, обеспечивает идеальную средовую структуру, которая способствует репарации через трансплантированные NPCs. Авторы рассматривают клеточное замещение как наилучший способ терапии при трансплантации aNPCs. Обсуждается новая концепция non-conventional восстановления компартиента эндогенных стволовых клеток через создание atypical ectopic (perivascular) ниши после внутривенной aNPC трансплантации.

Endogenous aNPCs for CNS repair

Эндогенное aNPCs расположение в герминальных нишах может быть выгодным для репарации нервной системы благодаря их способности поддерживать нейрогенез и глиогенез во время роста организма (14). Тем не менее, самовосстановление, пролиферация, дифференцировка и миграция этих клеток варьирует в зависимости от локального микроокружения, которое характеризует разные типы нарушений целостности ЦНС (например, острые, хронические, фокальные и мультифокальные) (15-18). Было показано присутствие nestin-реактивных пролиферирующих клеток-предшественников в области между поврежденной тканью и окружающей интактной мозговой паренхимой через неделю после патогенного события у экспериментальных моделей острых фокальных воспалительных расстройств – таких как SCI и инсульт (18-22). У экспериментальных моделей хронических мультитфокальных демиелинизирующих болезней – таких как экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (experimental autoimmune encephalomyelitis - EAE) и моделей рассеянного склероза, митотически активные клетки-предшественники, локализующиеся в SVZ мозга или в субэпендимальном слое (subependymal layer) центрального канала спинного мозга, нарушают их физиологическую судьбу. Они либо мигрируют вдоль рострального миграционного потока (rostral migratory stream - RMS) к обонятельным луковицам, либо радиально к латеральным колонкам (lateral columns) спинного мозга, и мигрируют в области демиелинизации, где они дифференцируются в глиальные клетки (16, 17).

Однако, несмотря на доказательства того, что эндогенный нейрогенез и глиогенез являются частью «внутреннего» (intrinsic) само-репарационного процесса во время воспаления при болезнях мозга, нет никаких убедительных объяснений о неспособности компартмента стволовых клеток поддерживать длительную репарацию ЦНС. Последние данные в этой области дали возможность предположить, что воспалительные компоненты, такие как CNS-infiltrating blood-borne воспалительные мононуклеарные клетки, реактивные ЦНС-резидентные клетки (например, астроциты, эндотелиальные клетки мозга и микроглия) и гуморальные медиаторы (цитокины и хемокины) могут отвечать за такую «неспособность» стволовых клеток. Это может происходить вследствие того, что эти компоненты могут нарушать пролиферацию и дифференцировку aNPCs (Табл.1, РИС.1b) прямо или косвенно через аберрантную (некоординированную) ре-экспрессию генетических программ развития, которые регулируют поведение стволовых клеток.

Эта гипотеза подтверждается исследованиями, проведенными на экспериментальных моделях хронического (EAE) и подострого (индуцированного липополисахаридом, LPS) воспаления ЦНС. Активированные энцефалитогенные лимфоциты и реактивные ЦНС-резидентные клетки от EAE мышей, которые вызывают неоднородную демиелинизацию и косуществуют в одной и той же воспаленной периваскулярной области мозга, секретируют bone morphogenetic protein 4 (BMP4 и его антагонист noggin - два основных регулятора судьбы стволовых клеток (stem cell fate regulators) ниши в SVZ (23-27). Sonic hedgehog (SHH), который генерируется в вентральной нервной трубке во время эмбрионального развития мозга, способствуя формированию и идентичности предшественников вентральных интернейронов (28), реэкспрессируется в воспаленной демиелинизированной области у крыс с EAE (29). Notch и jagged), которые играют ключевую роль в аксональном паттернировании и миелинизации во время эмбриогенеза (30), экспрессируются на границе повреждения воспалительных демиелинизированных поражений у больных с рассеянным склерозом (31). Однако их экспрессия при болезнях связанных с демиелинизацией может быть ограниченной функционально, что и было недавно продемонстрированро при использовании индуцибельных Cre-Lox технологий для удаления Notch из клеток-предшественников (32). Во время подострого LPS-индуцированного воспаления мозга interleukin-6 (IL-6), высвобождаемый микроглией, в значительной степени нарушает нейрогенез в гиппокампе in vivo. Однако такое нарушение полностью восстанавливается, когда используются нестероидные противовоспалительные препараты (например, индометацин) (25). In vitro генерирование новых нейронов и олигодендроцитов из aNPCs индуцируется и поддерживается мышиной микроглией, которая имеет encountered T-cell-associated цитокины, такие к примеру, как interferon-γ (IFNγ и IL-4), но блокируется микроглией, которая имеет encountered endotoxins, такие как LPS (24). У мышиных моделей острого ишемического инсульта имеется временное увеличение пропорции SVZ клеток, которые подвергаются симметричному клеточному делению (оппозитные к ассиметричному клеточному делению), и увеличение случаев нейрональной дифференцировки (20). У иммунно-дефицитных мышей гиппокампальный нейроногенез заметно нарушен и может быть восстановлен Т клетками реактивными против мозговых аутоантигенов (таких как myelin basic protein - MBP (33).

Эти результаты заставляют предполагать, что при определенных хронических воспалительных расстройствах мозга (таких как рассеянный склероз), региональный тропизм для niche-like областей blood-borne inflammatory cells может встречаться (РИС.1b) в результате способности клеточных компонентов ниши секретировать молекулы, привлекающие воспалительные клетки. Это, в свою очередь, поддерживает гипотезу о том, что эти заболевания могут рассматриваться как заболевания, связанные с дисфункциями стволовых клеток, а не как вызванные неконтролируемыми и еще не обнаруженными патогенетическими чужеродными факторами (alien(s)). Предшественники нейронов, не относящиеся к канонической герминальной нише, могут также препятствовать репарации мозга при хронических воспалительных процессах (обзор 34).

aNPC transplantation for CNS repair

Острое и хроническое воспаление ЦНС может нарушать анатомические и функциональные связи между клеточными компонентами герминальной ниши (ниш), нарушая таким образом репаративные способности эндогенных компонентов стволовых клеток. Как следствие, протоколы, направленные на мобилизацию эндогенных предшественников из герминальной ниши in vivo, могут быть терапевтически неэффективными при воспалительных заболеваниях мозга (35, 36). Поэтому трансплантация aNPCs может представлять альтернативный и, возможно, более эффективный терапевтический подход. В ТАБЛ.2 авторы суммировали клеточные источники, пути трансплантации и терапевтические эффекты aNPCs при острых (например, при SCI, инсульте и травме) и хронических (при рассеянном склерозе) воспалительных заболеваниях, а также при расстройствах, характеризующихся хронической воспалительной реактивностью к нейродегенерации (например, при болезни Гентингтона, эпилепсии и болезни Паркинсона).

Cell sources for aNPC transplantation. В сущности, «золотым стандартом» клеточного источника для трансплантации должна быть пластичность. Как эмбриональные стволовые клетки (ES), так и aNPCs удовлетворяют этому критерию, поскольку они способны адаптировать свою спецификацию к разным потребностям среды (37). Если исключить этические проблемы, то терапевтическое использование ES клеток сдерживается по следующим причинам – из-за feeder-independent growth (expansion) и из-за образования тератокарцином (38), что должно быть устранено (39, 40) еще до того как ES терапия может быть применена у человека (BOX 2). Однако aNPCs могут представлять собой готовый к использованию источник для терапии, поскольку они могут быть получены из разных тканей (эмбриональной, плодной и тканей взрослого организма) и могут быть широко использованы in vivo без вероятности появления опухолей, без токсического и других побочных эффектов (41).

Route of aNPC transplantation. Пути введения клеток во многом зависят от локализации и типа повреждения мозга (фокальное или мультифокальное). С одной стороны анатомо-патологические признаки фокальных расстройств ЦНС, таких как болезнь Паркинсона или SCI, болезнь Гентингтона, инсульт и травма мозга, подтверждают, что прямая локальная клеточная трансплантация может способствовать регенерации ткани. С другой стороны, мультифокальность определенных расстройств ЦНС, таких как рассеянный склероз и эпилепсия, является главным ограничением такого подхода при клеточной трансплантации (т.е. введение клеток в место повреждения). Было показано (42, 43), что при мультифокальных расстройствах системная (к примеру, внутривенная или интратекальная (подоболочечная)) трансплантация aNPCs может быть терапевтически эффективной (27,44-49) благодаря способности трансплантированных клеток следовать (через кровяное русло или спинномозговую жидкость) в соответствии с градиентом хемоаттрактантов (таких как pro-inflammatory цитокины и хемокины), которые имеются в области воспаления (27, 44, 50, 51). Во время взаимодействия между трансплантированными aNPCs и активированными эндотелиальными/эпендимальными клетками вблизи воспаленной ткани мозга, такой хемоаттрактивный градиент ведет к селективному и специфическому «хомингу» трансплантированных клеток в мультифокальные области воспаления ЦНС (РИС.2). Особый хоминг трансплантированных aNPCs был продемонстрирован при SCI, эпилепсии и инсульте (ТАБЛ.2). Однако точный молекулярный механизм, лежащий в основе этого явления, был детализирован только при EAE (experimental autoimmune encephalomyelitis). Tethering, rolling и firm adhesion с воспаленными эндотелиальными клетками и экстравазация в воспаленные области мозга (РИС.2) последовательно опосредуются постоянной экспрессией функциональных молекул клеточной адгезии (таких как CD44 (27, 44), интегринами (такими как α4β1) (27, 44, 52-54) и хемокиновыми рецепторами (CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 и CXCR4 ) (27, 55, 56) на поверхности aNPCs (ТАБЛ.3).

Bystander effects of transplanted aNPCs. На экспериментальных моделях воспаления мозга показано, что при трансплантации aNPCs мигрируют в пределах поврежденной ткани и сохраняют свою мультипотентность. Однако данных, которые бы поддерживали концепцию о том, что эти клетки дают начало окончательно дифференцированным нервным клеткам, способным поддерживать программу репарации мозга путем замещения, пока недостаточно (57). Независимо от характеристик экспериментальных заболеваний, т.е. от течения заболевания (острое или хроническое), нейропатологических признаков (фокальное или мультифокальное) и типа воспаления (первичное или реактивное) функциональное восстановление с помощью aNPC трансплантации почти не коррелирует с абсолютным числом трансплантированных, вновь генерированных окончательно дифференцированных нейронов (ТАБЛ.2). Трансплантация C17.2-CD v-myc-иммортализованных, полученных из SVZ взрослых животных или из плодных (человеческих) тканей NPCs грызунам с экспериментально индуцированной болезнью Паркинсона (58-60) или болезнью Гентингтона (61, 62) редко дает начало нейронам, которые экспрессируют tyrosine hydroxylase (фермент, участвующий в синтезе дофамина), несмотря на значительные улучшения поведения. Около 13-16% syngenic эмбриональных NPCs, инъецированных крысам с 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-индуцированной нигростриальной дегенерацией (модель болезни Паркинсона) являются иммуннореактивными по doublecortin - маркеру ранней дифференцировки стволовых клеток (63). У экспериментальных моделей болезни Гентингтона только около 1% трансплантированных плодных (человеческих) NPCs дифференцируются в neuronal nuclear (NeuN)-позитивные нейроны (62), хотя большинство из этих NPCs демонстрируют маркер стволовых клеток nestin (61). Точно также у мышей с SCI (48, 64), острым инсультом (65) или внутримозговым кровоизлиянием показано некоторое функциональное восстановление. У мышей с экспериментальным (bacterial collagenase-induced) мозговым кровоизлиянием (46) или с острым (transient middle cerebral artery occlusion-induced) инсультом (65) большинство трансплантированных C17.2-CD v-myc-иммортализованных NPCs, окружающих поврежденную область мозга, экспрессируют маркеры (нестин) недифференцированных клеток. Эмбриональные, плодные и неонатальные мозжечковые NPCs, инъецированные моделям SCI, не дифференцируются в окончательно дифференцированные нейроны (48, 66-68). У EAE очень низкий уровень дифференцировки NPCs (полученных из SVZ), в миелин-формирующие олигодендроциты сопровождается нейрофизиологическими признаками аксональной защиты и ремиелинизации (44). Более 20% трансплантированных клеток, достигших воспаленной демиелинизированной области, не экспрессируют маркеры дифференцировки (44).

Недостаточная и несоответствующая окончательная дифференцировка так же как и предрасположенность к сохранению недифференцированного фенотипа в ткани хозяина, предполагает, что трансплантированные aNPCs могут быть терапевтически эффективными при использовании bystander механизмов альтрнативных клеточному замещению. Бимодальный механизм действия означает, что aNPCs могут оказывать эффекты двумя путями, которые «оркестрируются» ЦНС-резидентными клетками реактивными к патологическому повреждению (в основном астроциты и микроглия) и воспалительными blood-borne клетками.

Во-первых, трансплантированные клетки могут существенно снижать формирование рубца и/или увеличивать выживаемость и функции эндогенных глиальных и нейрональных предшественников переживших патологический инсульт. Такой нейрозащитный эффект обычно сопровождается увеличением in vivo биодоступности основных нейротрофинов - nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), cilliary neurotrophic factor (CNTF) и glial-derived neurotrophic factor (GDNF. Это было продемонстрировано у грызунов с первичным воспалением мозга (EAE (44), SCI (67,68) и инсультом (65)) и с нейродегенеративными расстройствами, сопровождающимися реактивным воспалением (болезнь Паркинсона, болезнт Гентингтона и эпилепсия) (Табл.2). Клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе этого явления, могут быть связаны с внутренними свойствами нейросфер. Неросферы генерируются in vitro через неделю в среде не содержащей сыворотки и в присутствии высокого уровня epidermal growth factor (EGF) и fibroblast growth factor 2 (FGF2). Такой протокол культивирования избирается только для growth factor-responsive клеток. При трансплантации выжившие трансплантированные aNPCs могут быть гораздо более реактивными на специфические (growth factor-driven) сигналы среды в тканях-мишенях, которые инициируют высвобождение таких ростовых факторов как GDNF, BDNF, CNTF and NGF (61, 64, 67, 69).

Во-вторых, недифференцированные трансплантированные aNPCs могут способствовать bystander иммунномодулированию, т.к. они могут высвобождать растворимые молекулы (цитокины и хемокины) и экспрессировать иммунно-релевантные рецепторы (хемокиновые рецепторы и CAMs), которые способны в значительной мере изменять воспалительное окружение (ТАБЛ. 1,3). Трансплантированные aNPCs могут индуцировать апоптоз воспалительных Т лимфоцитов, апрегулируя мембранную экспрессию определенных death receptor ligands (FALS, TRAIL, и APO3L), как это недавно было показано in vitro и у мышей с EAE (27). Такой aNPC-опосредованный механизм запускается pro-inflammatory (T helper 1-like, IFNγ, IL-1β и tumour necrosis factor-α, TNFα), но не anti-inflammatory (T helper 2-like, IL-4, IL-5 and IL-13) цитокинами. Трансплантированные aNPCs могут также даунрегулировать эффекторные функции воспалительных T клеток и макрофагов в ткнях-мишенях. При EAE было показано, что антген-специфическая скорость пролиферации энцефалитогенных MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein)-реактивных Т лимфоцитов снижается в присутствии aNPCs (45). У животных моделей инсульта сниженную инфильтрацию мононуклеарных клеток наблюдали на границах поврежденной ишемической области ЦНС, т.е. там, где накапливались aNPCs (70, 71).

The atypical ectopic niche

Окончательный вопрос связан со способностью трансплантированных недифференцированных aNPCs оказывать bystander эффект в течение длительного времени. При определенных неврологических расстройствах, характеризующихся рекуррентным и/или хроническим воспалением, ведущим к деструкции ЦНС-резидентных и трансплантированных клеток, склонность трансплантированных aNPCs к модулированному клеточному замещению в отличие от bystander иммуномодулирующих и/или нейротрофических свойств, может приобретать важное терапевтическое значение.

Недавние исследования у EAE показали, что долгосрочное функционирование недифференцированных aNPCs, способных содействовать бимодальной bystander нейрозащите, может быть достигнуто при внутривенной трансплантации (27, 44). При таком способе введения обеспечивается формирование новых анатомических и функциональных атипичных эктопических (периваскулярных) ниш, которые функционально сходны с прототипичными герминальными нишами, но отличаются по клеточным компонентам и региональному тропизму (РИС.3). Такие атипичные эктопические ниши формируются около периваскулярных областей воспаленного мозга (головного и спинного) и содержат трансплантированные aNPCs (РИС.2), blood-borne (encephalitogenic) воспалительные клетки, а также резидентные клетки ЦНС – такие как реактивные астроциты и микроглия. В ответ на стимулы окружающей среды, динамичная секреция растворимых воспалительных медиаторов, ростовых факторов и регуляторов стволовых клеток разными типами клеток в атипичной эктопической нише (ТАБЛ.1) вносит значительный вклад в сохранение и продолжительность терапевтического эффекта трансплантированных aNPCs. Когда преобладает нейровоспаление, трансплантированные клетки сохраняют недифференцированный фенотип в результате высвобождения BMP4 и noggin blood-borne inflammatory клетками, активированными эндотелиальными клетками и астроцитами, и предотвращают повреждение ткани посредством индукции in situ запрограммированной клеточной гибели blood-borne encephalitogenic лимфоцитов (27). Когда сигналы воспаления ослабевают и исчезают, и преобладает нейродегенерация, трансплантированные клетки действуют как bystander регуляторы астроглиоза через высвобождение нейротрофических ростовых факторов, сохраняя т.о. способность эндогенных ремиелинизированных OPCs (44) к пролиферации и дифференцировке. В этом случае даунрегуляция средовых (воспалительных) сигналов, которые «оркестрируют» и вносят вклад в высвобождение регуляторов стволовых клеток в эктопической нише может индуцировать выход трансплантированных клеток из ниши, которые приобретают зрелый функциональный фенотип и замещают некоторые поврежденные эндогенные нервные клетки (27, 44). Клеточная и молекулярная динамика атипичной эктопической ниши может также объяснить корреляцию между присутствием недифференцированных трансплантированных aNPCs в поврежденной ткани и клиническим восстановлением, наблюдаемым у животных, являющихся моделями хронического воспаления мозга (Табл.2).

Conclusions and future perspectives

Полученные к настоящему времени данные опровергают мнение о том, что стволовые клетки могут быть эффективным терапевтическим средством исключительно при заместительной клеточной терапии. Фактически же стволовые нервные клетки могут способствовать восстановлению мозга через свои внутренние нейрозащитные свойства, которые в основном связаны с высвобождением недифферинцированными стволовыми клетками нейропротекторных молекул в области поврежденной ткани. Такая среда содержит молекулы (иммуномодуляторы, нейротрофические факторы роста, и регуляторы стволовых клеток), которые постоянно экспрессируются нервными стволовыми клетками для поддержания тканевого гомеостаза во время развития и у взрослого организма (75). Природа этих молекул и их конститутивная экспрессия разными типами стволовых клеток (мезенхимальными, нервными, гематопоетическими) пока неясны.

Способность трансплантированных aNPCs защищать мозг от разных типов повреждений используя разные и/или multifaceted bystander стратегии (атипичные эктопические ниши являются одним из интригующих примеров), является важным свойством для разработки будущих терапевтических подходов, основанных на замещении клеток. Мы сможем регулировать разные терапевтические эффекты в соответствии с этой стратегией для лечения неврологических расстройств человека более эффективно и без побочных токсических эффектов.