Неблагоприятным фактором tetracycline 'on' системы является значительная базовая активность промотора в отсутствие антибиотика. Этот эффект в основном разрешен разработкой улучшенного трансактиватора rtTA2
-M2, который обладает повышенной стабильностью и усиленными связывающими характеристиками тетрациклинового оператора (
O). Разработка химерных эукариотических репрессоров re-targeted в
O в отсутствие антибиотика также снижает базовую экспрессию.
Действенность этих улучшенных элементов продемонстрирована в новом self-contained gutless Ad, который обладает впечатляющей регуляцией после в/м введений мышам.
Сконструированы также векторы, с которых м. экспрессироваться два под независимым контролем тетрациклин и стрептограмин регуляторных систем.
Эти векторы позволяют двум генам с разными терапевтическими мишенями экспрессироваться регулируемым образом и на стадиях во время лечения, которые обеспечивают наилучший эффект, напр., экспрессия цитокинов с антивоспалительной и репарирующей ткани активностями при лечении артрита.
Альтернативой фармакологически регулируемой экспрессии генов является использование непосредственно физиологических свойств болезненного процесса для контроля экспрессии терапевтического гена disease-regulated образом. В принципе, зависимая от болезни экспрессия генов д. обеспечить профиль экспрессии, точно отражающий ход и тяжесть болезни, так что терапевтический ген будет экспрессироваться только в периоды обострения. Очевидно, успешность disease-regulated генотерапии требует эффективного введения ответственных векторов в места активной болезни. В случае RA, активная болезнь характеризуется воспалением суставов и ключевым путем транскрипции, связанным с воспалением, является путь NF-κB, который активируется при RA и в экспериментальных моделях.
170 И синтетический и нативный (напр., CMV) промоторы, содержащие NF-κB мотивы, ответственны за активацию NF-κB. Инъекции внутрь суставов AAV-кодирующего lacZ под контролем промотора CMV приводили к широко распространенной зависимой от воспаления синовиальной экспрессии β-gal. Продукция β-gal индуцируется с помощью инъекций LPS и снижается по мере уменьшения воспаления. После повторной инъекции LPS на 30 день воспаление реактивируется и не обнаруживается увеличения экспрессии β-gal до уровня. наблюдаемого после первой инъекции, это указывает на то, что экспрессия регулируется воспалением.
171 Когда AAV вектор с IL-1Ra геном вводили внутрь суставов, то терапевтический эффект наблюдался и когда воспаление реактивировалось с помощью LPS спустя 80 дней.
172 Разработана NF-κB-регулируемая экспрессия, которая характеризуется низкой базовой экспрессией и умножаемой транскрипцией в ответ на NF-κB активацию. Вектор C3-Tat
/HIV состоит из промотора complement 3 (C3), который зависит от NF-κB активации, и который управляет экспрессией укороченной HIV Tat молекулы, которая сохраняет трансактиваторную активность. Tat затем индуцирует экспрессию терапевтического гена, кодируемого с HIV LTR того же самого вектора.
173 Эта система охарактеризована
in vitro и
in vivoи используется для экспрессии терапевтических генов в двух моделях артритов. В обоих исследованиях получен одиночный аденовирусный вектор, который кодирует или hIL-1Ra
174 или hIL-10.
175 У мышей CIA Ad (10
7 PFU), содержащий конструкцию C3-Tat
/HIV-hIL-1Ra, инъецировался в суставы, что приводило к индукции болезни спустя 3 дня. В этом случае disease-regulated экспрессия IL-1Ra эффективно ингибировала опухание и деструкцию суставов. У модельных крыс с streptococcal cell wall-индуцированным артритом введение в суставы сходного Ad (10
7 PFU), кодирующего IL-10 (C3-Tat
/HIV-IL-10), существнно подавляло реактивацию воспаления суставов, когда бактериальный peptidoglycan инъецировался двумя днями позже. В обоих исследованиях экспрессия трансгена была низкой после инъекций в невоспаленные суставы и экспрессия усиливалась при возникновении воспаления. Пригодность этих и др. систем экспрессии для генотерапии аутоиммунных заболеваний зависит от продолжительноти действия систем и иммуногенности, которые предстоит еще определить.
Имеются и др. патофизиологические признаки воспаленных суставов, такие как гипоксия (oxygen deficiency), которые м.б. использованы для регуляции экспрессии генов.
176 Системы гипоксической регуляции генов базируются на том, что в normoxic условиях белок HIF-1α быстро деградирует с помощью протеосомного пути, тогда как в условиях гипоксии он димеризуется с постоянно экспрессирующимся HIF-1β, чтобы сфоримровать транскрипционный фактор HIF-1. ОН способен соединяться с ДНК мотивом (RCGTG), известным как hypoxic response element (HRE), расположенным в энхансерной области некоторых генов, включая и такие как vascular endothelial growth factor и erythropoietin. Показано, что повторы HRE, расположенные выше минимального промоторного элемента м. избирательно индуцировать экспрессию генов в ответ на гипоксическую стимуляцию.
177, 178
Болезнью регулируемая экспрессия генов разработана и в области диабета. У здоровых индивидов экспрессия инсулина с β-островковых клеток регулируется на стадии транскрипции и секреции в ответ на уровни глюкозы и инсулина в крови. Синтетические системы, в которых экспрессия инсулина транскрипционно регулируется с помощью ткане-специфической и глюкоза/инсулин-чувствительных последовательностей или с промоторов, только разрабатываются. Печень-специфическая экспрессиия инсулина достигается интронными энхансерами гена aldolase B в комбинации с glucose 6-phosphatase промотором, который стимулируется глюкозой и супрессируется инсулином.
179 Сходным образом, целенаправленная и регулируемая экспрессия инсулина облегчается включением чувствительных к глюкозе элементов выше базовоаго промотора insulin-like growth factor binding protein-1, который содержит ингибирующие элементы, чувствительные к инсулину.
180 Др.
in vivo исследование показало действие проверяемой системы в мышцах.
10,22
Транскрипционно регулируемые системы характеризуются значительным lag периодом (~ 6 ч) между индукцией экспрессии гена и синтезом белка. По сравнению с секрецией эндогенного инсулина с β-островковых клеток, которая осуществляется ~ спустя 20 мин после приема глюкозы. Это расхождение в кинетике реакции рассматривается в обзоре Halban
et al.181 Обновлена система, с помощью которой секреция белка м. быстро регулироваться фармакологическим способом.
182 Система базируется на том факте, что одиночные мутации (Phe
36-Met) превращают мономерный белок FKBP12 человека в кондиционный агрегационный домен, названный F
M, который образует димеры с микромолярным сродством, в результате чего он полностью диссоциируется малыми синтетическими лигандами. Слитые белки, содержащие 4 повтора F
M мотива образуют агрегаты в эндоплазматическом ретикулеме, которые быстро диспергируют при добавлении лиганда. Проинсулин человека экспрессируется, т.к. слитый белок освобождается от F
M повторов по furin cleavage сайту. Если этот белок экспрессируется в HT 1080 клетках, но начинается дощзово-зависимое высвобождение инсулина после 30 мин экспозиции лигандом (AP21998). Применительно к мышиной STZ-индуцированной модели диабета, iв/в введение лиганда индуцирует быструю секрецию инсулина с имплантированных клеток с соотв. снижением глюкозы в крови. As anticipated with this system, when all the accumulated protein is secreted the ligand must be removed for stores to be replenished.
Vectors in the clinic
The experience in the application of routine protein therapies such as anti-TNF
in RA and insulin injections in diabetes brings with it the realization that gene therapy has the potential to deliver the same molecules by a vastly superior clinical approach. Gene therapy can harness the patients' own cells to produce these agents directly within disease sites at low yet active levels and in a regulated manner. The challenge is to ensure that gene therapy also has all the benefits of protein therapy, such as simple administration, precise adjustment of the dose, and easy termination of treatment upon reversal of disease or in the event of adverse effects. Engineering of vectors and their components is central to achieving these requirements.
Параллельно с разработкой векторов охарактеризован ряд терапевтических генов применительно к острым экспериментальным аутоиммунным моделям. Табл. 3 суммирует те терапевтические стратегии вместе с необходимыми векторами и показывает типы векторов, которые потенциально подходят для каждой из ст ратегий.
Безопасность является ключевым фактором, который предопределяет разработку генотерапии для несмертельных случаев, таких как аутоиммунные заболевания.
Ex vivo стратегии наиболее безопасны и уже проходят проверку в клинических испытаниях. Вирусные векторы способны к интеграции в геном и м.б. использованы эффективно в
ex vivo протоколах для достижения продолжительной экспрессии и избегания влияния на хозяина вирусных белков. Наиболее безопасной
ex vivo стратегией является повторное введение клеток в энкапсулированной форме, которая делает возможной секрецию терапевтического белка, но нуждается в способе удаления всех трансдуцированных клеток после окончания лечения.
183 Альтернативно, клетки, трансдуцированные
ex vivo, м.б. непосредственно вводиться повторно в места болезни. Такой подход использован в фазе I клинических испытаний при RA , когда ретровирусом трансдуцированные synoviocytes инъецуировали в metacarpophalangeal суставы.
184
Использование
In vivo векторов является более сложным сценарием, но и в этом случае безопасность высока. Плазмиды являющиеся одними из предпочтительных векторов, т.к. они не содержат акцессорных или структурных белков и , следовательно, менее иммуногенны, чем вирусы и м. использоваться повторно. Способы введения плазмид, к сожалению, ограничены эффективной трансфекцией мышечных клеток, но даже в этом случае они м. б. использованы для вакцинации и в протоколах системной экспрессии генов. Плазмидные векторы уже предложены для ранних стадий клинических испытаний при chronic myocardial ischaemia,
185 Buerger's disease
186 и critical limb ischaemia,
187, от успеха этих испытаний будет зависеть их использование при др. болезнях.
Вирусные векторы имеют определенные привлекательные свойства для применения in vivo, включая потенциал длительной экспрессии (lentivirus и AAV) и эффективную трансдукцию в неделеящиеся клетки (lentivirus и Ad). Однако, клиничпеское использование вирусных векторов in vivo нуждается в тщательной проверке безопасности относительно: вирусной иммуногенности, приобретенного иммунитета пациента, инсерционного мутагенеза (для интегрируемых вирусов), рекомбинации с вирусами дикого типа и невозможности повторного применения. Прогресс в использовании вирусных векторов намечается при фатальных заболеваниях, это позволит накопить информацию о безопасности вирусных векторов и для аутоиммунных витальных заболеваний.