Анализ пропорции описанных мутаций показал, что точковые мутации объясняют 91% , а крупные перестройки 9% от всех мутаций в гене
. Первые сообщения давали более высокие пропорции крупных перестроек в гене
gene: 1/3(30) и 25% (26). Такое расхождение является результатом эволюции со временем методов скрининга. Сначала использовали в основном Southern blotting и поэтому пропорция обнаруживаемых крупных перестроек была преувеличена (26, 30). Затем стали наиболее распространенными техники, такие как single strand conformation polymorphism (SSCP), denaturating gradient gel electrophoresis (DGGE), denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) и двунаправленное секвенирование, улучшающие эффективность и скорость. Соответственно пропорция крупных перестроек оказалась заниженной (10%) (28). Оценка точного вклада крупных перестроек станет возможной с расширением использования multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). Недавние исследования, которые комбинировали SSCP, или секвенирование с MLPA, чтобы скринировать мутации в гене
, обнаружили пропорцию крупных перестроек равной в 21% (31), 13% (32), 11% (33), 8% (34) или 0% (35). Наконец. недавнее секвенирование ещё и интронных последовательностей позволило идентифицировать большую пропорцию сплайс-мутаций (36).
Взаимодействие между LDLs и LDL рецепторами является фундаментальным для регуляции холестерола в плазме у людей (19). Единственным белковым компонентом LDL является apo B-100, который является основным лигандом для LDL рецептора (37). Следовательно, apo B-100 обеспечивает связывание LDL с LDL рецептором. Домен в apo B-100, который взаимодействует с LDL рецептором, был идентифицирован с помощью нескольких подходов. Согласно предложенной модели эта область связывания представлена двумя кластерами [A (3147-3157) и B (3359-3367)] базовых аминокислот, которые сцеплены посредством дисульфидного мостика между остатками 3167 и 3297 (38, 39), затем она была расширена благодаря открытию FDB как результата мутации в остатке 3500 (4, 5). Это привело к общему мнению. что остатки 3130-3630 являются важными для связывания apo B-100 с LDL рецептором (40). Более сложная модель была предложена после иммуно-ЭМ исследований, которые показали, что первые 89% apo B-100 покрывают LDL частицу подобно языку и что COOH-концевые 11% составляют изгиб. который пересекает язык, сводя вместе остатки 4154-4189 и 4507-4513 вблизи аминокислоты 3500 (41). Точнее, было показано, что обычное связывание рецептора использует взаимодействие между аргинином 3500 и триптофаном 4369 на С-конце apo B-100 (42). Было также показано, что COOH-терминальный изгиб функционирует как негативный модулятор связывания рецептора и ингибирует связывание липопротеина очень низкой плотности с LDL рецептором посредством apo
На сегодня 10 настоящих мутаций было идентифицировано, которые изменяют свойства связывания в локусе
APOB с apo B-100 (Fig. 2). Наиболее частой мутацией является p.R3500Q, оторая ведет к аутосомно доминантно наследуемому клиническому нарушению FDB (OMIM #144010). В 1995, Pullinger et al. (44), Nissen et al. (45) and Gaffney et al. (46) показали, что FDB является более гетерогенной, чем это представлялось при описании субъектов с FDB, несущими p.R3531C, p.R3480P и p.R3500W варианты гена
APOB, соотв. Сродство связывания у p.R3500Q и p.R3531C мутантов LDL рецептора снижено на 30% и 70%, соотв. (44-48). Несмотря на это повреждающий эффект варианта p.R3531C был пересмотрен нашей группой благодаря идентификации тотального отсутствия ко-сегрегации с hypercholesterolemia в французской семье (49). Анализ гена
LDLR в этой семье, наконец-то, выявил, что мутация, ассоциирует с болезнью и даёт доказательства, что p.R3531C замена в гене
APOB не является аллельным вариантом, приводящим к FDB. Мы также установили, что мутация APOB-p.R3531C усиливает hypercholesterolemic эффект дефекта в гене
LDLR, указывая тем самым, что она вызывает большую изменчивость чувствительности, чем причинная мутация (49). Значительный уровень аллельной гетерогенности FDB был установлен с помощью идентификации др. мутаций в гене
APOB. Мутация p.E3405Q ассоциирует с LDL, который соединяется с LDL рецепторами с той же самой скоростью, что и нормальный LDL, но размещается и деградирует с достоверно более низкой скоростью, указывая тем самым, что домены apo B-100, участвующие в связывании и усвоении, не полностью перекрываются (50). Мутация p.R3480W также ассоциирует с FDB, т.е. её позиция находится вблизи триптофана 4369, который, как показано, взаимодействует с аргинином 3500 и облегчает конфронтацию apo B-100, необходимую для нормального связывания рецептора LDL (42). Мутация p.N3516K вносит позитивно заряженную аминокислоту (лизин), тогда как др. FDB мутации удаляют позитивно заряженный остаток (аргинин) и как было установлено. влияют на конформацию LDL apo B и на его взаимодействие с LDL рецептором (51). В 2004, Soufi et al. скринировали германскую популяцию на присутствие каких-либо новых мутаций apo B-100 внутри области кодонов 3448-3561 и обнаружили новый аллель с заменой одного аснования, вызывающей мутацию p.His3543Tyr (p.H3543Y) (52). Fouchier et al. скринировали экзон 26 (codons 3458-3608) в датской популяции и впервые также скринировали экзон 29 (codons 4336-4433). Они выявили три новые мутации: p.R3500L, p.R4358H и p.V4367L (33). Однако, причинная связь этих 4-х последних мутаций с боезнью не была продемонстрирована.
In the PCSK9 gene
PCSK9 локализован в 1p32.3 и представлен 12 экзонами, транскрибируемыми в комплементарную ДНК, которая занимает 3617 bp. Он кодирует PCSK9, гликопротеин, относящийся у млекопитающих к семейству subtilisin- и kexin-подобных сериновых протеаз. известных также как PCs. PCs участвуют в ограниченном протеолизе предшественников белков, следующих секреторному пути, такому как про-гормоны или предшественники нейропептидов (53). Субстраты и точная роль PCSK9 неизвестны. но подозревается его участие в регенерации печени, нейрональной дифференцировке и клеточной гибели (9, 54). PCSK9 синтезируется в виде растворимого зимогена в 692 аминокислот, приблизительно в 72 kDa (proPCSK9), который быстро подвергается превращению в ER (Fig. 3). Как наблюдается для большинства PCs, процессинг зимогена является аутокаталитическим внутримолекулярным событием. Согласно Seidah et al. (9), приблизительно в 14 kDa отщепившийся просегмент остается ассоциированным с PCSK9 до тех пор. пока он секретируется (8). Как и в случае LDL рецептора, apo B-100 и LDLRAP1 (белок, измененный в чрезвычайно редкую аутосомно рецессивную форму FH), PCSK9, по-видимому, принимает участие в гомеостазе LDL рецепторов. Лимфобластоидные клетки от пациентов, несущих p.S127R hypercholesterolemic мутацию, обнаруживают пониженные количества на клеточной поверхности LDL рецепторов приблизительно на 35% по сравнению с нормальными субъектами(55). Это наблюдение трудно объяснить, т.к. было установлено, что PCSK9 экспрессируется на очень низком уровне в лимфоцитах (56). Несмотря на это некоторое снижение количества LDL рецепторов на клеточной поверхности обнаруживается в клетках с избыточной экспрессией тикого типа или мутантных PCSK9 (55, 56). Сходным образом, избыточная экспрессия дикого типа PCSK9 снижает потребление (57) и деградацию LDL (55). Напротив, эксперименты по РНК интерференции PCSK9 показали повышение связывания и интернализации LDL (55, 57). Более того, те же самые результаты наблюдались при избыточной экспрессии мутантных форм PSCK9, указывая, что hypercholesterolemic мутации обеспечивают повышение активности энзима (55-58). Все эти результаты указывают на то, что PCSK9 каким-то образом контролирует количество LDL рецепторов в клетках на посттранскрипционном уровне. Однако, существование прямых эффектов PCSK9 на деградацию LDL рецепторов описаны
Кстати, hgbcfys 5 hypercholesterolemic миссенс мутаций и 8 hypocholesterolemic вариантов PCSK9 (8, 10, 59-62) (Fig. 3). Две первые миссенс мутации PCSK9 были обнаружены в трех non-LDLR/non-APOB французских ADH семьях (8). Мутация p.S127R , идентифицирована в двух неродственных семьях, затрагивает остатки, локализованные в просегменте, который известен как оказывающий ингибирующее действие на активность протеазы. Такая замена может приводить к устранению этого эффекта, приводя к ранней продукции зрелой протеазы. Затронутые члены третьей семьи являются гетерозиготами по мутации p.F216L. Эта вторая мутация локализована в каталитическом домене, близкому к остатку p.His-226 из канонической каталитической триады. Затем первая повторная мутация, p.D374Y, была обнаружена в крупной родословной шт. Utah США (60), в двух норвежских семьях (62) и трех английских семьях (59). Вариант p.D374Y локализован также в каталитическом домене вблизи p.Ser-386 остатка триады. Наконец, описали две мутации у французов p.R218S и
Напротив, две широко распространенные нонсенс мутации гена PCSK9 (p.Y142X and p.C679X) были описаны среди американцев африканского происхождения, характеризующиеся низким
Итак, идентификация третьего гена, ответственного за ADH открывает путь к новым открытиям по регуляции метаболизма холестерола. Как это ужек случилось с геном
APOB мутации в гене
PCSK9 также ведут к противоположным hyper- и hypocholesterolemia фенотипам. Помимо увеличения фундаментальных знаний о метаболизме холестерола эти последние результаты д.побудить к развитию новых терапевтических воздействий при hypercholesterolemia.
Differences in the clinical phenotype
Известна фенотипическая изменчивость у пациентов, гетерозиготных по FH (мутациям в гене LDLR)(63-65). Фенотипическая изменчивость между индивидами при FDB (мутации в гене APOB) также описана: пациенты, гетерозиготные по мутации APOB-3500 обычно четко hypercholesterolemic, но концентрации холестерола в плазме могут варьировать от тех, что обнаруживаются при гетерозиготных FH до лишь легкой hypercholesterolemia. Некоторые исследования показали, что пациенты с FDB и FH имеют сходные концентрации холестерола в плазме (66, 67), тогда как др. (17, 68-72) показали. что пациенты с FDB в целом обладают менее тяжелой гиперхолестеролемией с достоверно более низкими концентрациями TC и LDL-C, чем пациенты с FH. Частота сухожильных ксантом и arcus cornea увеличивается с возрастом у пациентов с FDB (69). Во всех возрастных группах частота CVD была ниже у пациентов с FDB, чем у пациентов с FH (69, 72). TC, LDL-C и TG увеличиваются с возрастом у пациентов с FDB (69), это согласуется с находками в normolipidemic популяциях (1). Напротив, LDL-C не меняется с возрастом ни у мужчин, ни у женщин с FH. Это подтверждает идею, что на повышение LDL-C у пациентов с FDB сильно влияет образ жизни (напр., потребление жиров и сидячий образ жизни), чем у пациентов с FH. Все эти наблюдения подтвердают концепцию, что фенотип FDB в отношении как повышения LDL-C, так и CHD несколько легче, чем проявление FH. Однако, пациенты с FDB всё равно подвергаются существенно более высокому риску CHD по сравнению с незатронутыми родственниками (71, 72).
Фенотипическая изменчивость у пациентов, гетерозиготных по мутации в гене PCSK9 пока не оценена. Клиническое сравнение носителей мутации PCSK9 с субъектами с FH или FDB затруднено, т.к. большая часть носителей мутации PCSK9 идентифицирована в выборках. отобранных по клиническому диагнозу FH (8, 60-62). Только одно сообщение описывает три семьи, представленные 12 индивидами, в которых косегрегирует вариант p.D374Y гена PCSK9 с необычно тяжелой формой hypercholesterolemia, которая трудно поддается лечению и ассоциирует с очень ранним началом преждевременной
Наконец, не обнаружено различий в ответе на статины между субъектами с мутациями в любом из трех известных генов.
Respective contribution of each gene
Некоторые исследования, использующие молекулярный и генетический подходы попытались оценить вклад LDLR, APOB или PCSK9 дефектов генов в ADH (Table 1). Вклад мутаций в этих трех генах варьирует в пределах 37% - 82.1%, 0% - 7.1% и 0% to 3%, соотв. Такие различия могут быть результатом различий в размерах выборок, гетерогенности клинических определений и, скорее всего, в протоколах
К сожалению, большинство исследований неполны и не могут быть сравнены. Наиболее часто используется клиническое определение ADH, согласно US MEDPED Program (13). Прежде всего исследуются биохимические показатели; субъекты рассматриваются как затронутые и включаются в исследование в соотв. с их возрастной группой и уровнем холестерола в плазме выше критических точек (see Biological and clinical definitions). Критические точки были установлены по уровням холестерола в плазме сопоставимого контингента США, чтобы определить значения выше 95th percentile каждой возрастной группы. Но это правило может быть не совсем точным для всех популяций мира. Напр., MEDPED критическими точками являются уровне холестерола в плазме выше 90th percentile в сопоставимой Мексиканской популяции (74). Это наблюдение иллюстрирует тот факт, что уровни холестерола в плазме варьируют не только с возрастом у мужчин и женщин, но и также специфичны для популяции. Критические точки для диагностики hypercholesterolemia д. быть таким образом в идеале пол-, возраст. и популяция-специфическими. Это влияет на величины значений липидов в плазме для сопоставимых выборок в каждой популяции. Более того, даже если наследственные характеристики болезни оцениваются у пробандов, по присутствию hypercholesterolemia у, по крайней мере, одного родственника первой степени родства, то показатели случаев, которые являются фенокопиями, могут быть включены в эти исследования. Это обычно склонные оценивать как результат отсутствия данных семейной истории и/или как частоту hypercholesterolemia в общей популяции. Напротив, гетерозиготные носители могут быть исключены из этого анализа, т.к. неполная пенетранстность ADH, возникает в результате влияния генетического фона и средовых факторов. влияющих на уровень TC. Во всем остальном различия между исследованиями по оценке вклада мутаций в генах LDLR, APOB или PCSK9 осуществляются в основном по протоколу гетерогенного
Исследования с использованием подходов по исчерпывающему и систематическому секвинирования могут дать более реальные результаты. Относительные вклады известных генов в ADH не могут быть собственно оценены до тех пор. пока не будет использоваться повсеместно протокол стандартизированной скрининга мутаций. В идеале мутации в гене LDLR следует искать с помощью двух комплементарных протоколов: анализа последовательностей exon-by-exon, включая сплайс-соединения и MLPA. Идеально мутации в гене APOB следует искать не только в кодоне 3500, но и также в целых экзонах 26 и 29, которые кодируют домен связывания рецептора. Сходным образом мутации в гене PCSK9 д. искать путем секвенирования всего гена. Более того, систематический скрининг мутаций в трех генах у всех субъектов д. быть освоен всеми диагностическими лабораториями, чтобы определять пропорцию носителей множественных
Несмотря на эти недостатки все исследования обнаруживают, что дефекты LDL рецепторов наиболее распространены, чем др.
APOB, PCSK9 или др. генов, ассоциированный с небольшой частью случаев ADH. Лучше всего подсчитанные частоты разных нарушений даны в наиболее полном исследовании (second row of the table) и соответствуют 79.1% LDLR, 5.5% APOB and 1.5% PCSK9 (32).
A greater level of genetic heterogeneity
Существование высокого уровня генетической гетерогенности описывается в литературе (Table 1). Пропорция субъектов без идентифицированных мутаций варьирует между 12% и 72% в зависимости от исследования. Как обсуждалось выше, такие различия могут быть результатом различных размеров выборок, гетерогенности клинического определения и протокола
Концентрируясь на исследованиях с использованием мощного протокола, пропорция индивидов без мутаций в генах LDLR, APOB или PCSK9 находится в пределах от 12% до 47.9% ADH-затронутых субъектов (31-34, 36, 77, 79). Наилучшим образом подсчитанная пропорция индивидов без мутаций в каком-либо из 3-х идентифицированных генов представлена в табл. и соответствует 15.25% (32). Новые гены скорее всего будут находить в выборках 'возможных
Итак, все эти результаты лежат в основе генетической гетерогенности для ADH в разных популяциях и показывают, что помимо мутаций в генах LDL рецептора, apo B и PCSK9, участвуют и дефекты др. белков метаболизма LDL, которые могут вызывать ADH. Было также предположено, что изменчивость в
PCSK9 является редкой причиной non-LDLR/non-APOB ADH (from 0% to 3%). Исследование 85 взрослых и 45 детей из французской популяции, ранее оцененных как носители non-LDLR/non-APOB мутаций, показало, что только 2.3% пациентов имеют мутации в
PCSK9 (61). Сходные наблюдения были сделаны в исследовании 20 non-LDLR/non-APOB пациентов из датской популяции, у которых мутация
PCSK9 не была обнаружена (79). Т.о., даже если несколько полиморфизмов
PCSK9 ассоциируют с изменчивостью уровней TC (80-83), мутации в
PCSK9, по-видимому, редки как причина ADH, и поэтому ожидается открытие дополнительных генов.
Suggestions for future studies
From all these observations and comments, it seems clear that the new genes involved in ADH would not be identified unless the use of an uniformly applied clinical definition and a standardized mutation screening protocol in the three known genes. Then, from identified non-LDLR/non-APOB/non-PCSK9 subjects, new genes may be searched by linkage analysis (genome scan) of a sample of large well-characterized families. And, as such a sample would probably be genetically heterogeneous, the greater the number of families used, the more significant results will be obtained and new loci precisely localized. Because of the few number of non-LDLR/non-APOB/non-PCSK9 subjects identified in each study, the identification of new ADH gene warrants an international collaboration and a focus on families presenting possible FH (36).
Conclusions
The likely consequences of the identification of new genes involved in ADH affect fundamental research as well as medical research. First, the identification of new genes could reveal a new metabolic pathway or regulatory mechanism, as it was the case for PCSK9. Furthermore, hypercholesterolemia is a major risk factor for atherosclerosis and coronary artery disease. Although it is highly prevalent in the general population, the predisposing genetic factors of complex hypercholesterolemia are still largely unknown. The identification of new genes may reveal new predisposing genetic factors with a greater
Finally, as was the case for the discovery of the LDL receptor pathway, results of new genes discovery may open a new field of research to identify targets for cholesterol-lowering drugs. The major results of Brown and Goldstein have led to the development of highly efficient hypocholestrolemic molecules: inhibitors of HMGCoA reductase (hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase) or statins. This therapeutic class is the widely preferred class by practitioners for treatment of almost all hypercholesterolemias. The identification of new genes involved in ADH, in unraveling new mechanisms implicated in cholesterol homeostasis, could lead to the development of new potent drugs. Promising results already arise with the observation that statin administration to PCSK9-KO mice produced an exaggerated enhanced LDL clearance from plasma (11), thus suggesting that inhibitors of PCSK9 may act synergistically with statins and open the way to the development of new hypocholesterolemic therapeutics tools.
Сайт создан в системе
uCoz
M Abifadel, J-P Rabe`s, C Boileau