Посещений:
RNAi ТЕРАПИЯ

Первые Успехи

The promises and pitfalls of RNA-interference-based therapeutics
Daniela Castanotto & John J. Rossi
Nature 457, 426-433 (22 January 2009) | doi:10.1038/nature07758; Published online 21 January 2009

The discovery that gene expression can be controlled by the Watson–Crick base-pairing of small RNAs with messenger RNAs containing complementary sequence — a process known as RNA interference — has markedly advanced our understanding of eukaryotic gene regulation and function. The ability of short RNA sequences to modulate gene expression has provided a powerful tool with which to study gene function and is set to revolutionize the treatment of disease. Remarkably, despite being just one decade from its discovery, the phenomenon is already being used therapeutically in human clinical trials, and biotechnology companies that focus on RNA-interference-based therapeutics are already publicly traded.


Рис.1.  | Mechanisms of cellular gene silencing.


Рис.2.  |  In vivo delivery strategies for therapeutic siRNAs.

Табл.1 Cellular small RNAs involved in gene silencing

Табл.2 Current clinical trials of RNAi-based therapeutics

До 1980, РНК в основном рассматривалась не более как пассивный промежуточный переносчик информации между ДНК и синтезом белка. Открытие каталитических РНК в начале 1980s заслуженно получили Нобелевскую премию Tom Cech и Sidney Altman, и в 1986 была предложена концепция 'the RNA world', идиом созданный Walter Gilbert. Сегодня это является обычным выражением и РНК заслужила центральное место в клеточной биологии.
Ещё 10 лет назад функциональный репертуар РНК расширился с открытием у нематод Caenorhabditis elegans1, что double-stranded RNAs (dsRNAs) могут вызывать молчание комплементраных последовательностей мРНК и родился термин 'RNA interference' (RNAi). Вскоре после этого которкие dsRNAs - или short interfering RNAs (siRNAs) (reviewed in ref. 1) - были получены искусственно и были использованы для демонстрации, что этот процесс происходит также в клетках млекопитающих, обычно, но не всегда, без запуска системы врожденного иммунитета, которая обычно распознает РНК как часть антивирусного механизма защиты (see page 421). Знание, что малые РНК могут влиять на экспрессию генов, оказало огромное влияние на базовые и прикладные исследования и RNAi сегодня одни из наиболее обещающих новых подходов для лечения болезней.
RNAi может быть запущена in vivo у млекопитающих, это было продемонстрировано на животных, зараженных hepatitis B virus2. После этого было предложено первое терапевтическое использование siRNAs: siRNAs переносились на Fas мРНК у мышей, моделирующих аутоиммунный гепатит, и вызывали защиту обработанных животных от фиброза печени3. В 2004, спустя лишь 6 лет после открытия RNAi, предложена первая, базирующаяся на siRNA человека терапия - разработка для лечения wet age-related макулярной дегенерации - вступила в фазу I клинических испытаний. RNAi одна из самых быстро прогрессирующих областей биологии.
Хотя много уже известно о механизмах RNAi, имеется ряд затруднений в отношении применения этой технологии генного молчания. Так, RNAi является чрезвычайно важным регуляторным механизмом в клетке и поэтому использование её в интересах терапии может давать побочные эффекты. Экзогенно вносимые dsRNA последовательности могут секвестрировать компоненты, которые создают клеточный аппарат, участвующий в молчании генов (see page 396), снижая тем самым доступность аппарата для класса малых РНК, известных как microRNAs (miRNAs), которые используются естественными клеточными путями4, 5. Кроме того, некоторые синтетические siRNAs содержат мотивы последовательностей, которые могут индуцировать реакции type I interferon и стимулировать продукцию про-воспалительных цитокинов6-8.
В последние годы многие ученые искали решения для преодоления этих ограничений и увеличения надежности потенциальной базирующейся на RNAi терапии.

Endogenous gene silencing


Эффекторные РНК молекулы из RNAi состоят ~20-30 нуклеотидов9. Они комплексуются с белковыми компонентами из RNA-induced silencing complex (RISC). Его каталитическая основа у растений и животных (за исключением одноклеточных организмов) представлена AGO2, членом высоко консервативного семейства белков Argonaute10. Эти малые РНК могут замалчивать генную экспрессию с помощью двух механизмов: post-transcriptional gene silencing (PTGS)11 и transcriptional gene silencing (TGS)12, 13 (Fig. 1). PTGS может, в свою очередь, подразделен на два основных механизма: прямое сиквенс-специфическое разрезание и репрессия трансляции и деградация РНК. Прямое сиквенс-специфическое разрезание происходит, когда мРНК мишень в точности комплементарная siRNA и деградирует после сайт-специфического разрезания с помощью RISC. Репрессия трансляции и деградация РНК происходят, когда ведущая последовательность малых молекул РНК имеет ограниченную комплементарность с мишенью в 'seed' регионе (нуклеотиды 2-8 с 5' конца ведущей нити), со спариванием оснований обычно происходящим в 3' untranslated region (UTR). Последний механизм используется miRNAs.

Figure 1 : Mechanisms of cellular gene silencing. Unfortunately we are unable to provide accessible alternative text for this. If you require assistance to access this image, or to obtain a text description, please contact npg@nature.com a, Primary microRNAs (pri-miRNAs) are, in plants and animals, processed by Drosha and its partner DGCR8 into precursor miRNAs (pre-miRNAs) and then transported to the cytoplasm by exportin 5 (XPO5). In the cytoplasm, they are bound by a Dicer-containing pre-RISC and processed to yield the guide sequence that is loaded into the holo-RISC, which contains all the components required for gene silencing. AGO2 is the catalytic core of the RISC (present but not shown in the schematically drawn holo-RISC). The guide sequence binds to the corresponding target sequences in the 3' UTRs of cellular mRNAs. If the miRNA guide sequence is fully complementary to its target site (left pathway), it triggers site-specific cleavage and degradation of the mRNA through the catalytic domain of AGO2. If the base-pairing is incomplete (right pathway) but includes pairing of the seed region (nucleotides 2-8 of the miRNA) with the target, translational inhibition occurs, and this can be accompanied by non-sequence-specific degradation of the mRNA in P bodies. b, Similarly to miRNAs, artificially transcribed shRNAs (in this case from a plasmid) are transported to the cytoplasm by XPO5. The dsRNA in the cytoplasm is recognized and processed by Dicer into approx21-25-nucleotide siRNA fragments that are loaded into the RISC. The siRNAs can target complementary sequences of cellular mRNAs and trigger their degradation through AGO2-mediated cleavage. c, When siRNAs are present in the nucleus and are complementary to promoter regions, they can trigger chromatin remodelling and histone modifications that result in transcriptional gene silencing. In mammalian cells, the details of this mechanism are still under investigation but are known to include Argonaute-family proteins. Accessory proteins indicated in the figure are TRBP (HIV tar-RNA-binding protein; also known as TRBP2P) and PACT (activator of protein kinase PKR; also known as PRKRA). m7G, 7-methylguanosine.

TGS был продемонстрирован у Schizosaccharomyces pombe (делящиеся дрожжи), растений и совсем недавно в клетках млекопитающих14-17. У S. pombe процесс обеспечивается с помощью RNA-induced transcriptional silencing complex (RITS), который содержит Ago1, chromodomain белок Chp1 и glycine и tryptophan (GW)-повторы-содержащий белок Tas3 (ref. 18) (see page 413). Хотя в клетках млекопитающих механизм, с помощью которого малые РНК, управляющие молчанием появлются, всё ещё дискуссионен, но и AGO1 и AGO2, как было установлено, являются интегральными для процесса в целом19, 20. Недавно miRNA (miR-320) , как было установлено, регулирует транскрипцию POLR3D субъединицу RNA polymerase III (Pol III)21 в культуре клеток человека.
Эндогенные малые РНК были найдены у разных организмов, включая людей, мышей, Drosophila melanogaster и C. elegans. Большинство их происходят из транспозонов, вирусов и повторяющихся последовательностей и характерны своими взаимодействиями с PIWI подсемейством (или PIWI clade) белков Argonaute22-25 - поэтому они были названы PIWI-interacting RNAs (piRNAs). Идентификация piRNAs была ограничена клетками зародышевой линии. Недавно идентифицирован новый класс эндогенных siRNAs (endo-siRNAs или esiRNAs) в гонадах и соматических тканях D. melanogaster26-29 и ооцитах мышей30, 31. У мышей, endo-siRNAs, как было предположено, регулируют перемещения ретротранспозонов30, 31. Некоторые семейства малых РНК, включая repeat-associated siRNAs (ra-siRNAs), tiny non-coding RNAs (tncRNAs), trans-acting siRNAs (ta-siRNAs) и scan RNAs (scnRNAs) (Table 1) были найдены у грибов, растений и животных, но ни одно из них не наблюдается у млекопитающих. Доказательства подтверждают, что piRNAs действуют посредством др. клеточных путей, отличающихся от таковых для siRNAs и miRNAs и поэтому д. быть предложены альтернативные targeting стратегии для терапевтических мишеней.

Table 1 - Cellular small RNAs involved in gene silencing Full table

Superior designs for small molecules


Клеточные гены могут быть затронуты с помощью экзогенного введения siRNAs, которые затем используют преимущества эндогенного PTGS механизма. siRNAs могут быть или трансфицированы в клетки, где они непосредственно вступают в RISC, или генерированы внутри клеток посредством генной экспрессии с использованием векторов, содержащих Pol II или Pol III промоторы. Эти триггеры RNAi могут экспрессироваться у животных и растений, но не у S. pombe, в форме miRNAs или short hairpin RNAs (shRNAs), которые разрезаются на малые (~21-25-нуклеотид) РНК с помощью энзимов Drosha и/или Dicer. В обоих случаях, если две нити РНК триггера полностью комплементарны, то пассажирская нить отрезается с помощью AGO2 (refs 32, 33), приводя к образованию однонитчатой ведущей последовательности, которая действует как матрица для распознавания последовательности гена мишени с помощью RISC (Fig. 1).
Большинство предстоящих терапевтических вмешательств, базирующихся на RNAi предполагает исползование прямого введения синтетических siRNAs. Преимущества от использования химически синтезированных молекул заключается в том, что химические модификации могут быть внесены, чтобы повысить стабильность, способствовать эффективности, блокировать соединение с нежелательными мишенями, которые содержат несовпадающие последовательности (специфические off-target эффекты) и снижать или устранять потенциальные иммуностимулирующие эффекты). Однако эффекты этих молекул временные, тогда как промотор экспрессирующие shRNAs или miRNAs могут потенциально обеспечивать долговременное молчание в результате единичного применения.
Обычные siRNAs ~22 нуклеотида и имеют 3' динуклеотидный довесок, который воспроизводит продукт разрезания Dicer. Т.к. не все siRNAs достигают эквивалентных уровней нокдауна мишеней, то широко-масштабный скрининг siRNA часто осуществляют для какой-либо данной мишени, чтобы найти наиболее мощные ингибиторы. Выработаны определенные правила для получения siRNA. Напр., чтобы облегчить инкорпорацию в RISC, 5' конец антисмысловой (ведущей) нити д. быть задуман так, чтобы он имел более низкую термодинамическую стабильность, чем 5' конец смысловой нити. Пропорция нуклеотидов guanosine и cytidine д. быть около 50% или ниже, и нахождение известных белок-связывающих сайтов в регуляторных регионах мРНК д. быть устранено, т.к. связывание регуляторных белков может блокировать спаривание siRNA-мишень. По той же причине внутримолекулярные структуры в мишени д. быть устранены. Статистический анализ также установил предпочтение определенных нуклеотидов в специфических позициях в siRNA34. Множество компьютерных программ доступно для идентификации оптимальных последовательностей мишени для данного гена34, 35. Одна из них, искусственная нервная сеть, была использована для разработки библиотеки siRNA для всего генома человека и для идентификации эффективных siRNAs для 34 мишеней36.
Химические модификации часто включаются в дизайн синтетических siRNAs. Избирательное добавление phosphorothioate сцеплений или замены 2' fluoropyrimidines или 2'-O-methyl для 2' ribose в определенные позиции не нарушают активности siRNA и одновременно увеличивают резистентность к ribonucleases37, это важно для применения in vivo. Одиночная 2'-O-methyl группа на пассажирской нити siRNA дуплекса может устранять активацию Toll-like рецептров38 и предупреждать токсичность, обусловленную активацией пути генной экспрессии type I interferon. Недавно было показано, что fluoro-beta-d-arabinonucleic acid (FANA39 или 4'-S-FANA40) или arabinonucleic acid (ANA41) модификации могут увеличивать как стабильность сыворотки, так и потенциал siRNAs. Некоторые химические модификации также имеют важные преимущества, снижая или блокируя активность siRNA's смысловой (пассажирской) нити, редуцируя тем самым специфические off-target эффекты. Др. модификации, такие как добавление lauric кислоты, lithocholic кислот и производных cholesterol, могут вызывать увеличение клеточного потребления42, которое на сегодня остается главным препятствием для RNAi терапии.

Breaking and entering


Терапевтическое использование siRNAs нуждается в эффективной доставке в клетки и ткани мишени. Двумя основными стратегиями явлюятся доставка химически синтезированных siRNAs (не вирусная доставка) или доставка shRNA-кодирующих генов за счет искусственного видоизменения вирусов, которые д. в конечном итоге генерировать siRNAs с помощью транскрипции в клетках мишенях.

Non-viral delivery


Из-за своего размера и негативного заряда siRNAs нелегко пересекать клеточную мембрану. поэтому их доставка одна из основных задач RNAi технологии. Были разработаны различные способы доставки и протестированы на мышах и на не человекообразных обезьянах, от инъекций голых РНК в орган мишень, такой как легкие или глаза или до системной доставки РНК с наночастицами, скомплексованными с поликатионами, прикрепленными к cholesterol группам или конъюгированными с рецепторами клеточной поверхности. Некоторые подходы к доставке приведены на Fig. 2.

Figure 2 : In vivo delivery strategies for therapeutic siRNAs. Unfortunately we are unable to provide accessible alternative text for this. If you require assistance to access this image, or to obtain a text description, please contact npg@nature.com a, Cholesterol groups can be linked to modified siRNAs to enhance their stability before systemic delivery. The most common siRNA modifications are 2'-O-methyluridine or 2'-fluorouridine substitutions (blue circles) combined with phosphorothioate linkages. b, Polycation nanoparticles can direct delivery of the siRNAs to specific cells through the use of surface ligands (such as transferrin) that bind to receptors on target cells. c, SNALPs encapsulate modified siRNAs into cationic or neutral lipid bilayers coated with diffusible PEG-lipid conjugates. SNALPs allow siRNAs to be taken up by cells and released by endosomes. d, Masked endosomolytic agent (MEA)-Dynamic PolyConjugates (DPCs) are similar to SNALPS but smaller, and contain a ligand that allows targeted cell delivery. The release of the siRNA from the endosome is also improved by the inclusion of a pH-labile bond in the MEA-DPC particles. e, Tagging specific antibodies with protamine or other positive charges allows the delivery of siRNAs to specific cell types via receptor-mediated uptake. f, Chemically linking or co-transcribing siRNAs with RNA aptamers allows the targeted delivery of the siRNAs to cells expressing the appropriate receptor.

Два полимера, которые были исследованы в отношении их свойств доставки, это были atelocollagen и chitosan. Chitosans обладают mucoadhesive свойствами и были использованы для интраназального введения в bronchiolar эпителиальные клетки43. Интраназальное введение оказалось эффективным способом доставки siRNA у мышей44 и у не человекообразных приматов45, чтобы блокировать респираторную инфекцию syncytial вирусом верхнего дыхательного тракта. Фактически доставка siRNAs в слизистые мембраны, по-видимому, в целом эффективный подход. Напр., внутривагинальное введение энкапсулированных в липиды siRNAs, нацеленных на herpes simplex virus 2 (HSV-2) , обеспечивали защиту от летальной вирусной инфекции у более чем 2/3 обработанных siRNA мышей46.
Целенаправленная доставка anti-apolipoprotein B (APOB) и peroxisome proliferator-activated receptor-alpha (PPAR-alpha) siRNAs в печень достигалась посредством 'membrane-active' полимера, который может маскировать свою активность до тех пор, пока не достигнет эндосом, в результате происходит доставка siRNAs в гепатоциты после простых внутривенных вливаний47. Разные подходы доставки siRNA используют transferrin, конъюгированный с cyclodextrin-polycation полимером, чтобы доставлять siRNAs мишеням, Ewing's sarcoma Ews-Fli1 слитую мРНК посредством трансферриновых рецепторов у мышей48, приводя к ингибированию прогрессирования опухоли. И конъюгация siRNA с cholesterol группой делает возможной её доставку в печень и тощую кишку, гда она подавляет свою мишень, APOB, приводя к последующему снижению уроней холестерола в крови в модельной мышиной системе49.
Важным успехом в деле доставки siRNA стало успешное применение стабильных нуклеиново-кислотных липидных частиц, декорированных polyethylene glycol (PEG) полимерными цепочками (наз. SNALPs) для доставки siRNAs, направленных против APOB мРНК (APOB-нацеленные siRNAs) в печени не человекообразных приматов50. В этом случае эффект siRNA effect от одиночной внутривенной инъекции длился более 11 дней и приводил к более чем 90% нокдауну мишеней и не обнаруживал токсичности50. Эти удивительные результаты увеличили доверие к потенциалу терапевтических siRNAs для лечения болезней печени.
Вплоть до недавнего времени большинство подходов к in vivo доставке было нацелено на определенный орган, в первую очередь глаза, легкие или печень. Существенный прогресс в доставке siRNAs к специфическому классу лейкоцитов был разработан для воспаления кишечника51. В этом исследовании на cyclin D1 (Cyd1)-нацеленные siRNA загружались на стабилизированные наночастицы, поверхность которых инкорпорировала антитела, специфические к рецепторам, экспрессируемым лейкоцитами. Нацеленные siRNA-содержащие наночастицы подавляли cyclin D1 мишень, супрессировали пролиферацию лейкоцитов и устраняли экспериментально индуцированный колит у мышей51.
Доставка siRNAs в нервную систему была особенно трудной. Головной мозг общеизвестно устойчив к targeting из-за трудностей пересечения гематоэнцефалического барьера. Однако доставка siRNAs в периферическую нервную систему с помощью прямых инфузий в головной мозг для смягчения хронических болей52-54 или стахов55 была продемонстрирована на крысах. Конъюгаты липосом и антител или нейропептидов были использованы для доставки siRNAs в головной мозг мышей56. Несмотря на это эти методы не затрагивали нейроны, и менее инвазивная и более приемлемая альтернатива прямых краниальных инъекций д. быть создана для такой терапии.
Недавнее исследование открыло возможность селективной доставки siRNAs в ЦНС с помощью systemic внутривенных инъекций57. siRNA, предназначенная для воздействия на Japanese encephalitis virus, былп конъюгирована с коротким пептидом, происходящим от гликопротеина вируса бешенства, который был соединен с ацетилхолиновым рецептором нервных клеток. После доставки посредством сосудов, 80% мышей, обработанных терапевтическими siRNA, переживали инфекцию вируса Японского энцефалита, в то время как, 100% не леченных животных погибали от осложнений инфекции57.
Др. интересный подход, который делает возможным системную и целенаправленную доставку siRNA, использует protamine-antibody слитый белок58. Половинка protamine сцеплена с тяжелой цепью антиген-связывающей области (Fab) антитела к белку оболочки human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) gp160. Позитивно заряженный протамин связывает негативно заряженные siRNAs - которые нацелены против HIV гена gag - делает возможным избирательную доставку клетками экспрессирующегося gp160 белка оболочки на её поверхность58. Это ведет к интернализации комплекса антитела-siRNA, высвобождению siRNAs и подавлению HIV Gag-кодируемых транскриптов у мышей in vivo. В том же исследовании слияние протамина антител, специфичных к рецептору гормонов ERBB2, делало возможным поставку siRNA в раковые клетки, экспрессирующие этот рецептор58.
Сходная технология специфически направляемого высвобождения базируется на aptamer-RNAi химерах59. Аптамерами являются in vitro-сформированными, синтетически подготовленными нуклеиновыми кислотами, которые селективно связывают специфические лиганды. РНК аптамер, предназначенный соединяться с со специфичными (prostate-specific membrane antigen (PSMA; известным также как FOLH1)), оказывается сцепленным с PLK1-нацеленной siRNA, а соединение аптамера с PSMA рецептором ведет к избирательной доставке в клетки рака простаты siRNAs, которые нарушают pro-survival гены59, 60. Внутриопухолевые инъекции конъюгатов PSMA-Plk1-targeted siRNA или PSMA-Bcl2-targeted siRNA в мышиную ксенотранспланта приводит к запуску апоптоза, ингибированию роста и репрессии опухоли59.
Др. конъюгаты siRNA с vitamin-A-coupled липосомами ведут к доставке антифибротических siRNAs в печеночные звездчатые клетки, которые продуцируются в ответ на повреждения печени61. В этом исследовании обработки множественными siRNA, нацеленными на collagen chaperone-кодирующие гены обращает фиброз печени за счет предупреждения отложения коллагена и повышения жизнеспособности у крыс, это открывает потенциальный терапевтический подход к лечению цирроза печени.
Примечательны также липид-подобные молекулы (lipidoids), которые могут быть отобраны для доставки siRNA в различные ткани62.

Viral delivery


Альтернативным способом запуска RNAi является промотором экспрессируемые последовательности siRNA, видоизмененные из shRNAs или miRNA mimics. Гены, кодирующие эти шпилечные структуры, обычно вставляются в остов вирусных векторов под контроль промоторов Pol II или Pol III. Потенциальные преимущества доставки вектора заключаются в том, что одиночное применение запускает долговременную экспрессию терапевтических RNAi. Это особенно пригодно для хронических вирусных болезней, таких как HIV и вирусный гепатит.
Lentiviral вектора были успешно использованы для доставки конструкций shRNA в различных системах млекопитающих. Напр., было показано, что подавление активированного Ras онкогена с помощью lentiviral-доставки shRNA, ведет к супрессии опухолевого роста у мышей63. Подавление экспрессии мутантной формы superoxide dismutase 1 (SOD1) у мышиных моделей amyotrophic lateral sclerosis задерживает начало болезни64, 65. Недавно lentiviral вектор был использован для доставки Smad3-нацеленной shRNA для регенерации сателлитных клеток и репарации старой ткани в старых и поврежденных мышцах66. Экспрессия вирусного вектора shRNAs было также использовано у мышей, моделирующих нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Гентингтона и Алцгеймера67.
Чтобы доставлять гены в ЦНС обычно используются аденовирусные вектора. Напр., непосредственные введения в головной мозг аденовирусного вектора, экспрессирующего shRNA, направленную против мРНК, кодирующей polyQ-harbouring SCA1-encoding транскрипт spinocerebellar ataxia type 1, оказалось эффективным воздействием на мышей, моделирующих эту болезнь68.
Несмотря на успехи вирусной доставки, важно помнить, что хотя некоторые вирусы не являются патогенными, они всё ещё потенциально иммуногенны. Др. крупным беспокойством является то, что эта техника обладает риском навлечь на себя мутации в вирусных последовательностях, вызывая инсерционный мутагенез или запуская аберрантную экспрессию генов. Однако вирусные вектора могут трансдуцировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, вызывая продолжительную экспрессию терапевтического гена, когда экспрессируются в больших количествах и не нуждаются в доставке крупных доз. В конечном итоге любой терапевтический ген, если экспрессируется в больших количествах обладает потенциалом вызывать токсичность и иммуногенность. Критические параметры, такие как сопротивляемость, долговременная экспрессия, эффективность и способность регулировать экспрессию и доставку д. учитываться при выборе метода доставки. Нет идеального способа доставки для каждого применения, скорее способ доставки д. быть подобран под способ применения.

Clinical trials using RNAi to treat human diseases


Для новых технологий siRNAs открывают для клиники беспрецендентное пространство. Первым siRNA протоколом, разрешенным investigational new drug (IND) и тестированным в клинических испытаниях на людях явилась vascular endothelial growth factor (VEGF)-нацеленная siRNA Bevasiranib (Acuity Pharmaceuticals, Philadelphia, Pennsylvania) для лечения влажной. связанной с возрастом макулярной дегенерации (see Table 2 for a summary of ongoing siRNA clinical trials). Здесь задействован избыточный рост кровеносных сосудов под сетчаткой и он вызывает тяжелую необратимую потерю зрения; ею стадают 1.6 миллионов населения только United States и предположительно 11 миллионов индивидов во всем мире будут иметь это заболевание к 2013. Преклинические исследования Bevasiranib на мышах показали, снижение неоваскуляризации в результате подавления экспрессии Vegf после прямых инъекций в глаз siRNA69. Эта siRNA, которая теперь находится в фазе III испытаний, а также в фазе II клинических испытаний для лечения диабетического макулярного отека. По заключению в испытаниях несколько сотен пациентов будут получать лечение siRNA.

Table 2 - Current clinical trials of RNAi-based therapeutics
Две др. компании также сфокусировались на siRNA-базирующейся терапии против макулярной дегенерации: Merck's Sirna Therapeutics (San Francisco, California) с siRNA (Sirna-027), которая нацелена на VEGF рецептор VEGFR1, и Quark Pharmaceuticals (Fremont, California) в сотрудничестве с Silence Therapeutics (London and Berlin; previously SR Pharma), с siRNA, против гипоксией индуцируемого гена, RTP801 (также известного как DDIT4), который, как известно, участвует в прогрессировании болезни. Эта siRNA, RTP801i-14, лицензирована Pfizer, UK, она находится теперь в фазе I/IIA клинических испытаний. Quark Pharmaceuticals также получила IND статус для др. преклинических испытаний, в которых сегодня составляется список пациентов. Это испытание для siRNA, нацеленной на TP53 мРНК (которая кодирует белок p53), ингибирование которой задерживает индукцию путей клеточной гибели и тем самым уменьшает острые повреждения почек после хирургии.
Calando Pharmaceuticals (Pasadena, California), между тем инициировала фазу I клинических испытаний для солидных опухолей, используя siRNA, которая нацелена на субъединицу ribonucleotide reductase (RRM2), энзима, необходимого для синтеза ДНК строительных блоков. Важно, что это испытание впервые использует рецепторами обусловленную доставку siRNAs, которые инкапсулируются в cyclodextrin частициы, декорированные transferrin. Это ведет к потреблению клетками экспрессирующегося рецептора transferrin, который экспрессируется на высоком уровне на поверхности раковых клеток.
Клинические испытания, осуществленные Acuity Pharmaceuticals и Merck's Sirna Therapeutics, успешно стабилизировали у пациентов условия, направленные против дальнейшей дегенерации и на улучшение их зрения без побочных эффектов. Эти результаты породили большой оптимизм относительно внутриглазных инъекций siRNAs, но оглушительный поворот событий, описанный Kleinman et al. продемонстрировал, что наблюдаемое снижение васкуляризации может быть следствием не специфичных для siRNA эффектов на ангиогенез, а скорее неспецифической активации Toll-like receptor 3 (TLR3) и последующей активации interferon-gamma и interleukin 12, которые, в свою очередь, подавляют VEGF70. Др. словами, как целенаправленные, так и контрольные siRNAs обеспечивали неспецифическое подавление ангиогенеза путем прямого взаимодействия siRNAs с TLR3. Клеточное поглощение необязательно для этого эффекта и т.к. TLR3 участвует и в некоторых др. клеточных путях, эта находка проливает свет на др. уровень, связанный с безопасностью клинического использования siRNAs.
Alnylam Pharmaceuticals (Cambridge, Massachusetts) является хорошо известной siRNA-терапевтической компанией, чей ведущий кандидат siRNA, ALN-RSV01, находится в фазе II клинического испытания. Эта siRNA нацелена на респираторный синцитиальный вирус - который затрагивает почти 300,000 людей каждый год только в США - с помощью замалчивания вирусного nucleocapsid 'N' гена, гена, существенного для репликации вируса. ALN-RSV01 оказалась первой антивирусной siRNA , поступившей на клинические испытания и испытания вскоре будут расширены на детей. Было показано, что она эффективна и легко переносима. Недавно Alnylam Pharmaceuticals сформировала эксклюзивный альянс с Kyowa Hakko Kogyo по разработке коммерческого использования ALN-RSV01 в Японии и др. странах Азии.
Также в разработке Alnylam Pharmaceuticals находятся siRNAs, направленные против генов, участвующих в гиперхолестеролемии, болезни Гентингтона (в кратковременном объединении с Medtronic of Minneapolis, Minnesota), гепатите C (в кратковременном объединении с Isis Pharmaceuticals in Carlsbad, California), progressive multifocal leukoencephalopathy (при временном содружестве с Biogen Idec of Cambridge, Massachusetts) и pandemic flu (при временном объединении с Swiss company Novartis).
International Pachyonychia Congenita Consortium (IPCC), в содружестве с TransDerm (Santa Cruz, California), разработал siRNA, которые позволяют корректировать продукцию keratin для лечения редкого кожного заболевания pachyonychia congenita.
City of Hope National Medical Center in Duarte, California, в сотрудничестве Benitec (Melbourne, Australia), начала фазу I испытаний для лечения AIDS лимфомы. Это испытание использует на Pol III промоторе-экспрессируемую shRNA, нацеленную на HIV tat и rev совместно используемые экзоны. shRNA была инкорпорирована в базирующийся на HIV lentiviral вектор, который в свою очередь был использован для инсерции гена shRNA (вместе с двумя др. базирующимися на РНК анти-HIV генами) в клетки кровотока71. Ген-модифицированные стволовые клетки были введены HIV-позитивным пациентам при испытании, которые использовали аутологические трансплантации костного мозга для лечения связанных с AIDS лимфом. 4 пациента на сегодня излечены в этом испытании.
Как показано выше партнерство широко использется в этой области siRNA биотехнологии. Консорциумы существенно увеличили капиталы, необходимые для этих попыток и для укорочения времени, необходимого для коммерциализации базирующихся на siRNA лекарств.
Некоторые компании, такие как Regulus Therapeutics (Carlsbad, California), сконцентрировались на miRNAs в качестве терапевтических мишеней. Santaris Pharma in Hirsholm, Denmark, недавно начала первую фазу испытаний, чтобы нацелить miRNA (miR-122) человека. В этом испытании, miR-122 была нацелена на подавление locked nucleic acid (LNA) anti-miRNA (SPC3649). LNA является модификацией остова, которая усиливает гибридизацию олигонукелеотида со своей мишенью и защищает её от нуклеазной деградации. Этот подход нацелен на лечение инфекции вирусм гепатита С, поскольку miR-122 облегчает репликацию этого вируса в печени72, 73. Подавление miR-122 также возможно использовать для лечения гиперхолестеролемии. Запрограммированные miRNAs, экспрессируемые в сердце, такие как miR-208, которые регулируют кардиальную гипертрофию и фиброз74, могут обладать преимуществами, поскольку в области медицины имеется значительный опыт по доставке лекарств непосредственно в этот орган.
Избыточность или потеря функции miRNA связана с началом и прогрессированием различных болезней75-77. Функция белка может регулироваться или непосредственно или косвенно с помощью с помощью miRNAs, а альтерации в экспрессии miRNA могут оказывать выраженное влияние на регуляцию генов. Среди примеров, при которых болезнь возникает в результате измененной экспрессии miRNA, вполне допустимо, что нормальные уровни будут достигнуты или путем таргетинга специфических miRNA, если экспрессия слишком высока, или путем доставки miRNA mimic, ели экспрессия слишком низка. Однако специфичность и эффективность систем доставки д. быть улучшены для этой цели. Более того, корректная модуляция экспрессии нацеленных miRNA's нелегкая задача и не совсем ясно, может ли одна miRNA быть специфически нацеленной без затрагивания др. miRNAs того же самого семейства.
Регуляторные сложности miRNAs также д. учитываться при устранении или восстановлении функции miRNA при создании терапевтических наборов. Одиночная miRNA может регулировать уровни сотен белков78, 79, это ставит предупреждающие знаки относительно последствий подавления или эктопической экспрессии даже одиночного вида miRNA.

The safety issue


Использование siRNAs для терапии наталкивается на ряд проблем, связанных с их безопасностью. После инициального воодушевления ряд сообщений подчеркнул потенциальные недостатки этой обещающей технологии. Первое предупреждение поступило от исследования, описавшего смерть мышей после Pol III промотором управляемой экспрессии shRNAs в печени4. Точные механизмы, ведущие к смертности всё ещё изучаются, но, по-видимому, они обусловлены, по крайней мере, частично насыщением транскрипционного фактора, exportin 5, который доставляет miRNAs из ядра в цитоплазму. Имеются указания, что др. факторы, участвующие в процессе RNAi, могут также быть насыщенными за счет высокого уровня экспрессии экзогенных siRNAs, которые могут секвестрировать их от соотв. им клеточных miRNAs. Поскольку каждая клеточная miRNA может потенциально модулировать экспрессию нескольких сотен генов78, 79, то минорные альтерации в пути miRNA могут приводить к значительным последствиям.
Одной из стратегий уменьшения этой проблемы является использование наинизшей из возможных концентраций siRNAs, которые обеспечивают терапевтическую эффективность с помощью создания экзогенных siRNAs в качестве субстратов для Dicer (путем увеличения их длины). Эти РНК вступают на путь RNAi выше RISC на ступени разрезания с помощью Dicer, это облегчает прохождение siRNA на AGO2 для выбора ведущей нити, часто приводя к усилению RNAi при более низких концентрациях, чем те, которые достигаются при доставке экзогенных соотв. 21-base siRNAs80-83. Хотя небольшие количества siRNAs не смогут насыщать аппарат RNAi, они могут конкурировать с miRNAs за избирательное включение в RISC5. Долговременные последствия такой конкуренции изучены плохо.
С использованием микромассивов, стало очевидным, что введение чужеродных siRNAs в клетку изменяет экспрессию генов, не являющихся мишенями, также как и генов-мишеней84, 85; самое малое комплементарность 6 или 7 нуклеотидов в seed регионе может приводить к специфическому off-target эффекту86 посредством miRNA-подобного механизма. Поскольку микромассивы отражают только уровни мРНК, они не учитывают какие-либо гены, затрагиваемые на трансляционном уровне и поэтому в нестоящее время нет четкости, насколько обширна проблема эффектов off-target в реальности. Учитывая, что применение синтетических siRNAs приводит к временному ингибированию экспрессии генов, специфический off-targeting может не быть основным препятствием для большинства клинических использований. Тем не менее соотв. тесты на токсичность д. проводиться для оценки потенциала определенной siRNA находить 3' UTRs в генах, не являющихся мишенями. в
Некоторые стратегии могут быть использованы для создания siRNA, чтобы минимизировать проблему попаданий мимо цели. Напр., было показано, что 2'-O-Me модификации87 или ДНК замены88 в дуплексах siRNA могут существенно снижать нецелевые эффекты. Хорошо бы также улучшить избирательность антисмысловой нити путем вмешательства в термодинамическую стабильность (see 'Superior designs for small molecules') или путем блокирования 5' фосфорилирования смысловой нити89.
RNAi является широко законсервированным механизмом, который мог первоначально участвовать в защите от вирусных инфекций. Поэтому неудивительно, что в некоторых случаях siRNAs могут действовать как агонисты Toll-like рецепторов90 и что специфические мотивы последовательностей, такие как богатые uridine регионы и guanosine- и uridine-богатые регионы могут индуцировать клеточные иммунные реакции6, 7. Способность siRNA стимулировать клеточные иммунные реакции базируется не только на специфических последовательностях, но и также на структуре, типе системы доставки и типе клеток7, 91. Хотя иммуностимулирующий потенциал siRNAs может быть благоприятным в определенных условиях92, обычно же он является нежелательным. Упомянутая выше находка TLR3 реакции на модуляцию неспецифических последовательностей VEGF или VEGF рецептора70, также как и отдельное сообщение, показавшее, что на macrophage migration inhibitory factor (Mif)-нацеленная siRNA (у модельных мышей) и неспецифическая контрольная siRNA увеличивают пролиферацию раковых клеток груди посредством активации dsRNA-activated protein kinase (PKR)93, создают серьезные проблемы в интерпретации результатов применения in vivo siRNA.
Хотя мы ещё не достигли универсального решения для избегания всех off-target эффектов, предсказуемо, что эти проблемы будут преодолены путем использования соотв. модификаций основы, а также систем доставки, которые смогут маскировать РНК от рецепторов врожденной иммунной системы 94.

Gazing ahead


Despite the technique's youth, the list of diseases for which RNAi is being tested as a therapeutic agent is extensive, and includes Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, HIV infection, wet age-related macular degeneration, type 2 diabetes, obesity, hypercholesterolaemia, rheumatoid arthritis, respiratory diseases and cancers. It is already a multimillion dollar business, projected to reach US$1 billion by 2010, and intellectual property rights will become an increasingly important concern in the coming years.
However, although much has been accomplished, obstacles remain that will hamper the race to the clinic. The ultimate goal of achieving RNAi-based therapies for life-threatening or debilitating diseases cannot be attained without improving the safety, effectiveness and reliability of RNAi-trigger delivery systems. The use of targeted delivery strategies that permit systemic delivery will be a big step towards fulfilling this difficult task. The development of new, noninvasive imaging methods to monitor the in vivo delivery of siRNAs, such as labelling with near-infrared dyes95, will aid studies of tissue uptake and biodistribution.
Although RNAi is not yet an accepted therapeutic modality, the enormous interest in this phenomenon ensures that we will soon witness fast advances and new applications for RNAi-based therapies. Given the way that RNAi has transformed basic research and the unprecedented speed with which it has reached the clinic, the coming years promise to be exciting.