Целенаправленная Терапия

Melanoma biology and new targeted therapy Vanessa Gray-Schopfer, Claudia Wellbrock and Richard Marais Nature 445,n7130, 851-857 (22 February 2007) \| doi:10.1038/nature05661
Melanoma is a cancer that arises from melanocytes, specialized pigmented cells that are found predominantly in the skin. The incidence of melanoma is rising steadily in western populations — the number of cases worldwide has doubled in the past 20 years. In its early stages malignant melanoma can be cured by surgical resection, but once it has progressed to the metastatic stage it is extremely difficult to treat and does not respond to current therapies. Recent discoveries in cell signalling have provided greater understanding of the biology that underlies melanoma, and these advances are being exploited to provide targeted drugs and new therapeutic approaches. Рис.1. \| Progression of melanocyte transformation Рис.2. \| Melanoma drugs and their target pathways. Рис.3. \| Model of MITF regulation in melanoma. Табл. 1 \| Selected genetic alterations in malignant melanomas Табл. 2 \| Selected drugs for targeted melanoma therapy	Меланоциты являются специализированными пигментными клетками, которые обнаруживаются преимущественно в коже и глазах, где они продуцируют меланины, пигменты, отвечающие за окраску кожи и волос. Кожные меланоциты происходят из высоко подвижных предшественников нервного гребня, которые мигрируют в кожу во время эмбрионального развития. В коже меланоциты располагаются в базальном слое эпидермиса (Fig. 1) и в волосяных фолликулах и их гомеостаз регулируется с помощью эпидермальных кератиноцитов¹. В ответ на облучение УФЛ кератиноциты секретируют факторы, которые регулируют жизнеспособность, дифференцировку, пролиферацию и подвижность меланоцитов, стимулируют меланоциты к продукции меланина и вызывают реакцию загара. Т.о., меланоциты играют ключевую роль в защите кожи от повреждающих эффектов УФЛ и предупреждают появление рака кожи (see page 843). Следовательно, люди, лишенные функциональных меланоцитов, т.е. пигментных нарушениях, таких как vitiligo и альбинизм гиперчувствительнык облучению УФЛ2. Они могут оказаться порочными, т.к. меланоциты являются предшественниками меланомы, наиболее гибельной формы рака кожи. Рак кожи является третьим из наиболее распространенных злокачественных новообразований и его глобальный показатель растет с устрашающей скоростью вместе с базальноклеточной карциномой, а меланома является наиболее распространенной из форм. Определяется 2-3 миллиона случаев рака кожи по всему свету за год и хотя меланома из них составляет только около 132,000 случав (World Health Organization), она является наиболее ужасной формой, наиболее частая причина гибели от рака кожи. Если меланома диагностируется рано, то она может быть излечена хирургической резекцией и примерно 80% случаев излечивается подобным образом. Однако, метастатическая злокачественная меланома довольно устойчива к существующей терапии и имеет очень плохой прогноз со средней продолжительностью жизни в 6 мес. и 5-летним периодом жизни у менее 5%3, так что необходимы новые стратегии для её лечения. Недавние исследования улучшили наше понимание биологии меланомы и предложены новые терапевтические подходы к этой болезни. Types and progression of cutaneous melanoma Мутации в критических генах, регулирующих рост, продукция аутокринных факторов роста и потеря адгезивных рецепторов, все они в нарушениях передачи внутриклеточных сигналов в меланоцитах, т.к. это позволяет им избегать аккуратной регуляции кератиноцитами⁴. Следовательно, меланоциты могут пролиферировать и распространяться, приводя к образованию naevus или широко распространенных родимых пятен (Fig. 1). Пролиферация меланоцитов может быть ограничена эпидермисом (junctional naevus), дермой (dermal naevus) или перекрывающимися компонентами обоих (compound naevus). Невусы обычно доброкачественны, но могут прогрессировать до radial-growth-phase (RGP) меланомы (Fig. 1), внутриэпидермальных повреждений, которые могут использовать некоторые локальные микроинвазии в дерму. Клетки RGP могут прогрессировать до vertical-growth phase (VGP), более опасной стадии, при которой клетки становятся потенциально метастазными с узелками или гнездами клеток, инвазирующими дерму (Fig. 1). Не все меланомы проходят через каждую из этих индивидуальных фаз - RGP или VGP и могут развиваться непосредственно из изолированных меланоцитов или невусов, и могут прогрессировать непосредственно в метастазирющую злокачественную меланому⁵. Существует 4 клинических субтипа меланом6. Nodular melanoma состоит из увеличивающихся узелков без значительной плоской части. Acral lentiginous melanoma (ALM) имеет тенденцию обнаруживаться на ладонях рук и подошвах ног и в ногтевом ложе и не ассоциирует с воздействиями УФЛ. ALM составляет почти 50% меланом non-Caucasian популяциях⁷. Lentigo maligna имеет обычно плоскостное проявление и возникает на подверженных воздействию солнца местах у пожилых. Она, следовательно, ассоциирует с хроническим воздействием солнца в течение всей жизни. Наконец, плоская по проявлению superficial spreading melanoma (SSM), наиболее сильно распространенная форма меланомы. Она обычно плоская с внутри-эпидермальным компонентом, особенно на краях и связана с эпизодами тяжелых солнечных ожогов, особенно в раннем возрасте. SSM является третьим из наиболее распространенных раков у молодых людей в Великобритании и США и объясняет оставшиеся 50% случаев меланом у non-Caucasians^8,9. До сих пор диагноз меланомы базировался на патологии, но Bastian с коллегами недавно продемонстрировали, что изменения по всему геному количества копий ДНК вместе с анализом индивидуальных соматических мутаций могут использоваться для дифференциальной диагностики разных подтипов меланом с 70% точностью¹⁰. Следовательно, разные меланомы развиваются согласно самостоятельным генетическим путям. Insight into melanoma biology from cell signalling pathways Меланома является сложным генетическим заболеванием, лечение которого требует глубокого понимании биологии, лежащей в основе инициации и прогрессирования. Это позволяет улучшить классификацию стадий и подтипов и ведет к разработке лучших терапевтических агентов и подходов. Всесторонние стратегии, такие как сравнительная геномная гибридизация и анализ мутаций с помощью генного ресеквенирования идентифицированы некоторые критические клеточные сигнальные пути этой болезни. Ras/Raf/MEK/ERK signalling Путь Ras/Raf/MEK/ERK регулирует решения клеточных судеб ниже рецепторной тирозин киназы, цитокинов и гетеротримерных G-protein-coupled рецепторов¹¹. Малый G протеин Ras привлекается во внутренний листок плазматической мембраны , в то время как Raf, MEK и ERK являются цитозольными протеин киназами (Fig. 2). В меланоцитах этот путь активируется посредством ростовых факторов, таких как stem-cell factor (SCF), fibroblast growth factor (FGF) и hepatocyte growth factor (HGF)12, но в отдельности эти факторы индуцируют лишь слабую или временную активацию ERK activation, ведущую к легкому митогенному эффекту. Т.о., для пролиферации комбинированное действие нескольких ростовых факторов необходимо, чтобы стимулировать строго и устойчиво активность ERK в меланоцитах^12,13. Этот путь также является ключевым регулятором пролиферации клеток меланомы с гиперактивированным ERK в более чем 90% меланом у человека¹⁴. В меланоме, ERK может быть активирован путем продукции автокринных факторов роста¹⁵ или в редких случаях мутантной активацией рецепторов ростовых факторов, таких как c-Kit¹⁶. Наиболее распространенным механизмом является, как полагают, мутации NRAS с избыточной функцией, одного из трех генов Ras у людей (др. являются HRAS и KRAS). NRAS мутантен от 15% до 30% меланом, наиболее распространенной заменой является лейцин вместо глютамина в положении 61 (Q61L)17 (Table 1). Важно, что онкогенный Ras может индуцировать меланомы у p16INK4a-дефицитных мышей и также играет роль в поддержании опухолей^18,19. Наиболее распространенным мутантным компонентом этого пути является BRAF, один из трех Raf генов у человека (вместе с ARAF и CRAF). BRAF мутантен от 50% до 70% меланом¹⁷ (Table 1), а наиболее распространенной мутацией является замена glutamic acid на valine в положении 600 (V600E)¹⁷. V600EBRAF конституитивная передача сигналов ERK стимулирует пролиферацию и выживаемость, а также обеспечивает занчительный опухолевый рост и сохранение функций²⁰. V600EBRAF вносит также вклад в нео-ангиогенез путем стимуляции секреции аутокринного vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion²¹ а недавние исследования идентифицировали несколько генов в меланоме, которые функционируют иерархически ниже V600EBRAF. Сюда входят те, что кодируют транскрипционные факторы MITF (microphthalmia-associated transcription factor)²² и BRN-2 (POU domain class 3 транскрипционный фактор)²³, регуляторы клеточного цикла cyclin D1 (ref. 24) и p16INK4a (refs 25, 26), и энзимы поддержания опухолей matrix metalloproteinase-1 (ref. 27) и индуцибельная nitric oxide synthase²⁸. Т.о., BRAF участвует в нескольких аспектах индукции и прогрессирования меланом. Ras-ERK and phosphoinositide-3-OH kinase signalling Др. путь передачи сигналов, который оказывается важным в меланомах, это путь phosphoinositide-3-OH kinase (PI(3)K) (Fig. 2). Phosphoinositides являются мембранными липидами, которые превращаются во вторичные мессенджеры посредством гиперфосфорилирования с помощью семейства PI(3)Ks²⁹. Липидные вторичные мессенджеры активируют многочисленные пути нижестоящих эффекторов, а передача сигналов завершается с помощью липид фосфатазы PTEN (phosphate and tensin homologue). Передача сигналов PI(3)K регулирует клеточную жизнеспособность, рост (увеличение клеточной массы) и подвижность и она гиперактивирована в большой пропорции меланом (Table 1). Это объясняется частично находками, что мутации PI(3)K встречаются в 3% метастатических меланом³⁰, функция PTEN теряется отn 5% до 20% меланом поздней стадии³¹, a PI(3)K effector protein kinase B (PKB, известная также как Akt) избыточно экспрессируется в 60% меланом³². В трехмерных культурах меланом передача сигналов ERK и PI(3)K д.быть ингибирована, чтобы супрессировать клеточный рост, следовательно, оба пути важны³³. В меланомах мутации NRAS и BRAF взаимоисключающие, также как NRAS и PTEN в то время как BRAF и PTEN мутации встречаются одновременно примерно в 20% случаев³⁴. Эпистатические взаимоотношения этих генов не только продемонстрированы генетически, но и паттерны этих мутаций подтверждают наше сегодняшнее понимание пути Fig. 2). BRAF и PI(3)K активируют нижестоящий Ras, так что в присутствии онкогенного NRAS дополнительные мутации в BRAF и PTEN излишни, т.к. эти компоненты уже активированы. В самом деле, их мутации в этом контексте могут даже противодействовать прогрессированию опухолей, т.к. они могут стимулировать путь суперактивации. Напротив, т.к. PTEN и BRAF взаимно не активируются, то эти пути кооперируются, чтобы стимулировать пролиферацию, отдельные мутации необходимы для активации обоих путей. Подтверждение этой модели получено в наблюдениях, что онкогенный Ras трансформирует меланоциты более эффективно, чем онкогенный BRAF³⁵, по-видимому, из-за PI(3)K компонента. Курьезно поэтому, что мутации BRAF более часты, чем мутации Ras в меланомах, это, по-видимому, отражает др. генетические и биологические воздействия, способствующие прогрессированию меланом с мутациями BRAF по сравнению с теми, что с мутациями NRAS. Microphthalmia-associated transcription factor MITF является basic helix-loop-helix leucine zipper транскрипционным фактором, который , как полагают, является ведущим регулятором биологии меланоцитов, частично изза того. что регулирует экспрессию меланогенных белков, таких как tyrosinase, silver homologue (GP100) и melanoma-associated antigen recognized by T cells-1 (MART-1, известен также как melan-A)³⁶ (see also page 843). Однако, MITF регулирует также жизнеспособность меланобластов и детерминацию клона меланоцитов и является ключевым игроком в меланомах³⁶. MITF экспрессируется в большинстве меланом человека, а их гены мишени являются диагностическими маркерами этой болезни³⁶. Более того, продолжающаяся экспрессия MITF важна для пролиферации и жизнеспособности меланомных клеток³⁶. Однако, мы полагаем, что уровни белков д.быть тщательно контролируемы. MITF экспрессируется на существенно более низких уровнях в клетках меланом, а увеличение уровней MITF редуцирует пролиферацию клеток меланом даже в присутствии онкогенного BRAF²². Высокие уровни MITF также снижают онкогенный потенциал меланомных клеток³⁷. Мы полагаем, что MITF регулирует самостоятельные функции в меланоцитных клетках при разных уровнях экспрессии. Высокие уровни предрасполагают к аресту клеточного цикла и к дифференцировке, преимущественно за счет контроля регуляторов клеточного цикла (таких как p16INK4a, cyclin-dependent kinase 2 (Cdk2) and p21Cip)³⁶, в то время как критически низкие уровни ведут к аресту клеточного цикла и апоптозу. только при промежуточных уровнях обеспечивается пролиферация (Fig. 3). Важно, что недавние исследования показали, что MITF может кооперировать с V600EBRAF, чтобы трансформировать меланоциты, иммортализованные с помощью экспрессии каталитической субъединицы теломеразы (TERT), доминантно-негативной p53 и активированной Cdk4 (ref. 38). Эти данные показывают, что хотя MITF сам по себе не может трансформировать нормальные или иммортализованные меланоциты человека, он может кооперироваться с V600EBRAFчтобы вносить вклад в процесс трансформации, действуя как клон-специфичный дополнительный 'онкоген'³⁸, возможно из-за того, что он обеспечивает важную функцию выживания и вносит вклад в пролиферацию. В этом контексте и учитывая, что ERK гиперактивировна в меланоме и необходима для пролиферации и жизнеспособности, поразительно, что MITF направляется на деградацию после его фосфорилирования с помощью ERK³⁹. В самом деле, конституитивная активация ERKс помощью V600EBRAFв меланоцитах вызывает постоянное подавление MITF^22,38,39 (Fig. 3). Следовательно, чтобы противодействовать ситуации, при которой уровни MITF могут становиться критически низкими, клетки меланомы, по-видимому, развивают стратегии по восстановлению белка MITF до уровней, соответствующих прогрессированию опухоли. Как недавно было показано, MITF амплифицируется в небольшом проценте (10-16%) метастатических меланом, в которых BRAF мутантен38 (Table 1). Неожиданно, несмотря на тот факт, что ген может быть амплифицирован в 10-100-раз,уровни MITF увеличиваются только в 1.5-раза по сравнению с клетками без амплификации³⁸, это снова подтверждает, что уровни MITF могут поддерживаться внутри узких границ. Однако, т.к только 10-16% BRAF-мутантных меланом обнаруживают амплификацию MITF, то возникает важный вопрос, как остальные 84-90% противостоят деградации MITF, обусловленной гиперактивированной ERK. Один из механизмов может использовать β-catenin, который может индуцировать экспрессию MITF посредством LEF-1/TCF связывающего сайта MITF промотора⁴⁰ и хотя стабилизирующие мутации в β-catenin редки в меланомах⁴¹, ядерная и/или цитоплазматическая локализация β-catenin обнаружена в 28% метастатических меланом⁴². Other signalling pathways Наконец, заслуживает внимания то, что некоторые генетические альтерации, распространенные в меланомах, по-видимому, редуцируют апоптоз, включая мутации в NRAS и BRAF, избыточную экспрессию гена B-клеточной leukaemia/lymphoma 2 (Bcl-2), nuclear factor-κB (NF-κB) и Akt3 и потерю PTEN (Fig. 2). Не является неожиданностью, что некоторые из этих путей также способствуют росту, т.к. пути пролиферации и жизнеспособности перекрываются. Др. сигналы выживаемости могут исходить от позитивной регуляции путиβ-catenin посредством потери или молчания adenomatous polyposis coli (APC)⁴³, или от редких активирующих мутаций в β-catenin (CTNNB1)⁴¹. Избыточная экспрессия транскрипционного фактора SKI может также играть роль⁴⁴, т.к. возможны альтерации, которые затрагивают p14ARF. Наконец, часто молчание apoptotic peptidase activating factor-1 (APAF-1) в продвинутых меланомах⁴⁵ также могут вносить вклад в жизнеспособность. Очевидно, что эти пути нуждаются в дальнейшем исследовани, чтобы определить их роль в меланомах людей и обладаемый ими потенциал для терапевтического вмешательства. Overriding senescence mechanisms Обычные соматические клетки обладают ограниченным пролиферативным потениалом и после определенного количества делений они выходят из клеточного цикла и вступают в состояние, известное как старение⁴⁶. Старение является ключевым механизмом клеточной защиты против рака, т.к. оно удерживает от аберрантной клеточной пролиферации и процесс этот физиологически важен, т.к. он индуцируется активированными онкогенами в нормальных соматических клетках. Раковые клетки преодолевают старение путем инактивации ключевых путей, таких как те, что регулируют p16INK4a/Rb (retinoblastoma protein) и p53 (ref. 47). Белок супрессор опухолей p16INK4a действует путем соединения с cyclin-D-зависимой протеин киназой Cdk4 и 6, блокируя их активность и предупреждая фосфорилирование Rb48 (Fig. 2). Гены, кодирующие p16INK4a и Cdk4 являются высоко пенетрантными локусами для чувствительности к меланомам. p16INK4a кодируется с помощью CdkN2A, локуса, который также кодирует опухолевый супрессор p14ARF (p19ARF у мышей) при помощи разных промоторов и благодаря использованию альтернативной рамки считывания⁴⁹. При семейной меланоме мутации CdkN2A обычно затрагивают только p16INK4a или p16INK4a вместе с p14ARF; очень редко затрагивается только p14ARF. Мутации в Cdk4 нарушают связывание p16INK4a⁴⁹. Соматические мутации в этих генах обнаружены также в большинстве спорадических меланом. p16INK4a инактивированный мутациями. делециями, метилированием промотора⁵⁰ (Table 1) или посредством транскрипционного молчания за счет избыточной экспрессии транскрипционного супрессора, inhibitor of differentiation 1 (ID1)⁵¹. Альтернативно, могут возникнуть мутации Cdk4, которые блокируют связывание p16INK4a или может избыточно экспрессироваться cyclin D1 (Table 1), частично как результат генной амплификации⁵². Более того, большинство линий клеток культивируемых меланом, по-видимому, обладает дефектом в p16INK4a или Rb, или избыточной экспрессией Cdk4 или cyclin D1. Очевидно, передача сигналов p16INK4a/Rb является ключевым регулятором старения меланоцитов и, следовательно, чтобы отказаться от старение клеток меланом этот путь д. быть инактивирован⁴⁶. Интригующим наблюдением является то, что BRAF мутантен у более 80% злокачественных невусов⁵³, всё же большинство невусов остается вялотекущими в течении десятков лет и очень редко прогрессируют в меланому. Т.о., только онкогенного BRAF недостаточно для инициации меланомы и что поразительно, V600EBRAF, как недавно было обнаружено, индуцирует экспрессию p16INK4a и старение в первичных меланоцитах человека in vitro^25,26 (Fig. 2). Важно, что V600EBRAF не может трансформировать меланоциты человека даже когда они иммортализованы с помощью экспрессии TERT expression38, но может трансформировать меланоциты p16INK4a-дефицитных мышей³⁵, a p16INK4a дефицит необходим для Ras-индуцированных меланом у мышей¹⁹. Более того, позитивная регуляция p16INK4a, по-видимому, вносит вклад в индукцию старения в невусах^25,26, a p16INK4a дефекты обнаруживаются в диспластических, но доброкачественных невусах⁵⁴. Итак, эти исследования подтверждают интригующую модель, согласно которой p16INK4a служит в качестве тормоза для V600EBRAF-запускаемой трансформации меланоцитов. В этой модели, приобретение мутаций в BRAF или NRAS д.приводить к гиперпролиферации и последующему p16INK4a-обусловленному старению, генерации невусов, которые содержат клоны стареющих меланоцитов. Эти исследования подтвердили, что прогрессирование меланом нуждается в инактивации p16INK4a/Rb пути. Удивительно, однако, что p16INK4a экспрессируется в виде мозаичного паттерна в невусах, в то время как экспрессия β-galactosidase, др. маркера старения, униформна25, 26. Возможно, что p16INK4a арестовывает пролиферацию в некоторых клетках на уровнях, которые ниже чувствительности подходов иммуноокрашивания, это объясняет, почему экспрессия неуниформна. Др. возможность заключается в том, что стареющие клетки секретируют старением-индуцированные агенты, которые влияют на соседние клетки, которые не экспрессируют p16INK4a. Наконец, вполне осуществимо, что распространенное ремоделирование хроматина и генное молчание, обусловленное гиперактивацией белка Rb семейства⁵⁵ заставляет клетки становиться транскрипционно неактивными, так что p16INK4a становится молчащим в некоторых клетках, но остановка роста поддерживается молчащими генами, которые необходимы для пролиферации. Кроме того, старение может быть индуцировано др. факторами. В согласии с этой идеей находится тот факт, что пациенты с гомозиготными делециями p16INK4a всё ещё формируют доброкачественные невусы. В самом деле, люди, несущие мутации p16INK4a не только обладают повышенной чувствительностью к меланомам, но и обычно имеют множество родинок, которые часто крупны46, указывая тем самым, что p16INK4a является не только индуктором старения невусов. Др. механизмы могут использовать p53, как это наблюдается в культивируемых меланоцитах от p16INK4a-дефицитных пациентов46. Заметим, что melanophages (макрофаги, которые заглатывают меланин) и лимфоциты часто обнаруживаются вблизи дермальных p53-позитивных клеток, которые указывают на гибель меланоцита. Это указывает на то, что p53-зависимый 'back-up' (известный также как 'crisis') КПП (checkpoint) старения, который может быть активирован в меланоцитах после p16INK4a-зависимого старения (принципиальный механизм защиты меланоцитов от NRAS- или BRAF-обусловленной трансформации) transformation) , может быть обойден²⁵. Конечно, возможно, что др. пути, которые не используют p16INK4a/Rb- oили p53-зависимые механизмы также играют роль. Treating melanoma Меланома чрезвычайно агрессивное заболевание с высоким потенциалом метастазирования и печально известной высокой устойчивостью к цитотоксическим агентам. Это, как полагают, из-за того, что меланоциты происходят от высоко подвижных клеток, которые обладают усиленными свойствами выживания. Меланомные клетки обладают низкими уровнями спонтанного апоптоза in vivo по сравнению с др опухолевыми типами клеток и относительно резистентны к апоптозу. вызываемому лекарствами in vitro⁵⁶. Большинство химиотерапевтических лекарств функционирует путем индукции апоптоза в злокачественных клетках, так что резистентность к апоптозу скорее всего лежит в основе лекарственной устойчивости меланом⁵⁶, и эта чрезвычайная устойчивость к химиотерапии, радиотерапии и иммунотерапии является основным препятствием для успешного лечения меланом. Имеется несколько апробированных подходов к постоперативной вспомогательной терапии злокачественых меланом⁵⁷. Interferon-α (IFN-α ) наиболее широко используемый для вспомогательной иммунотерапии продвинутых меланом, хотя его эффективность всё ещё предмет споров. Высокие дозы interleukin-2 (IL-2) также одобрены, но показатели ответной реакции низки, а токсичность составляет проблему. Dacarbazine (DTIC) является ориентированным одобренным химиотерапевтическим агентом для лечения далеко зашедших меланом и лекарства, такие как carmustine (BiCNU), paclitaxel (Taxol), temozolomide и cisplatin , как было продемонстрирован по активности одиночных агентов при метастатических болезнях⁵⁷. Кроме того, были тестированы многие др. иммунтерапевтические подходы, но пока ни один из этих подходов не получил всеобщего одобрения58. Однако, недавние испытания переноса генетически измененных лимфоцитов оказались обнадеживающими, 2 (из 17) пациентов достигли полной ремиссии в течение18 мес.59. К сожалению, все эти терапевтические подходы очень мало вносят в общую выживаемость пациентов, так что идентификация сигнальных путей, которые являются центральными в инициации и прогрессировании меланом, это начало новой области для лечения меланом. Это создает благоприятные возможности зля разработки целенаправленной терапии и применения этого лечения к пациентам в соответ. с генетическими повреждениями, которые лежат в основе индивидуального заболевания. На базе этих принципов несколько новых целенаправленных агентов сегодня разработаны и тестированы по отдельности и в комбинации с обычной химиотерапией. Targeted therapies Наиболее привлекательными раковыми мишенями являются те, в которых раковые клетки приобретают способность к прогрессии. Концепция 'oncogene addiction' аргументирует, что раковые клетки полагаются скорее на пути гиперактивации, по сравнению с нормальными клетками и следовательно, полагаются на активированные онкогены, которые управляют этими путями. Это предоставляет терапевтическую возможность, т.к. раковые клетки д. быть более чувствительны к ингибированию этих путей и онкогенов, чем нормальные клетки. Не все онкогены являются послушными мишенями, но энзимы такие как киназы, протеазы и фосфатазы оцениваются высоко благодаря своим каталитическим сайтам, включая глубокие карманы, в которых тщательно разработанные лекарства могут соединяться с разумной пограничной избирательностью. Т.к. NRAS и BRAF являются важными терапевтическими мишенями при меланоме, то не удивительно, что лекарства, которые нацелены на этот путь вызывают значительный интерес. Первые лекарства, нацеленные на этот путь, поступившими в клинику, были Ras farnesyl transferase ингибиторы (Table 2), которые были предназначены блокировать важные пост-трансляционные модификации Ras. Хотя эти лекарства не были специфичными, они могут иметь некоторое значение в комбинации с cisplatin⁶⁰, хотя реакции вряд ли нацелены на механизм. Мульти-киназный ингибитор sorafenib (BAY 43-9006) нацелен на BRAF, CRAF и VEGF, также platelet-derived growth factor (PDGF) receptor tyrosine kinases⁶¹ (Table 2). В качестве монотерапии sorafenib обнаруживает лишь слабую активность против меланом, но если он комбинируется с carboplatin и paclitaxel , то результаты более обнадеживающие⁶². Неясно, почему монотерапия sorafenib является столь неэффективной при меланомах. Это может быть связано с тем, что он недостаточно мощный или возможно, что пролиферация клеток меланомы управляется альтернативными путями, когда передача сигналов Raf/MEK/ERK блокирована⁶³. Возможно также, что др. механизмы выживаемости, обеспечивающиеся с помощью tumour-necrosis factor-α (TNF-α ), предоставляют survival 'escape' путь, позволяя клеткам меланомы выживать, когда передача сигналов BRAF ингибирована64 или механизмы петли обратной связи могут устранять эффект sorafenib65. Очевидно, более мощные BRAF лекарства необходимы для тестирования, является ли BRAF подходящей мишенью при меланоме. С этой целью BRAF ингибитор CHIR-265 недавно поступил на клинические испытания для меланомы (Table 2). Хотя BRAF сегодня в фокусе разработки Raf лекарства, др. изоформы Raf не следует упускать из виду не в последнюю очереь из-за того, что BRAF активирует CRAF в клетках млекопитающих⁶⁶ и хотя CRAF не нужен для активации MEK в присутствии V600EBRAF, но он необходим для пролиферации20. Более того, мы недавно открыли, что когда Ras мутантен в меланоме, то CRAF, а не BRAF активирует MEK⁶⁷. Итак, CRAF участвует в пролиферации клеток меланомы и хотя пока неясно, нуждаются ли эти функции в активности CRAF kinase, данные указывают на то, что панспецифические Raf лекарства д.быть более лучшими противо-меланомными агентами, чем BRAF-специфические лекарства. В качестве альтернативы, были разработаны лекарства, такие как PD0325901 и AZD6244, которые нацелены на MEK (Table 2). Они ингибируют in vitro пролиферацию, формирование колоний на жидком агаре и инвазию в matrigel V600EBRAF мутантных меланомных клеток человека, а также эффективны против V600EBRAF меланомных xenografts⁶⁸. Отметим, что меланомные клетки, в которых BRAF мутантен, наиболее чувствительны к MEK ингибиторам, чем клетки, в которых мутирован Ras⁶⁹. Это неожиданно, т.к. Ras и BRAF оба пердают сигнал через MEK. Это позволят предположить, что или активируются дополнительные пути с помощью Ras, которые делают клетки меланомы менее зависимыми от MEK или напротив, что BRAF-мутантные клетки являются 'more addicted' к передаче сигналов MEK, указывая тем самым, что BRAF-мутантные опухоли д. отвечать с большой готовностью на ингибирование MEK, чем Ras-мутантные опухоли. AZD6244 и PD0325901 сегодня протестированы в клинических испытаниях у пациентов с далеко зашедшими меланомами (Table 2). Наконец, летальный anthrax токсин, который избирательно деградирует и инактивирует MEK1 и MEK2 (ref. 70),также был протестирован относительно меланомы в клинических испытаниях. Однако, следует отметить, что одной из потенциальных проблем ингибирования MEK является то, что MEK активируется также с помощью tumour progression locus 2 (TPL2), протеин киназы, которая регулирует врожденный иммунитет⁷¹, так что хроническое подавление MEK может иметь негативные эффекты на врожденный иммунитет. Не должно быть проблем с ингибированием Raf , это фактор, который следует учитывать при подготовке клинических испытаний. Передача сигналов PI(3)K скорее всего также является прекрасной мишенью для лечения меланом, и разработаны агенты для мишени PI(3)K, PKB и др. нижестоящие компоненты этого пути, такие как mammalian target of rapamycin (mTOR). Среди них, mTOR ингибиторы, такие как CCI-779 или RAD001 являются наиболее продвинуты⁷² (Table 2). Важность этого пути для меланомы подтверждает, что лекарства, нацеленные на этот путь д. быть благотворны у правильно отобранных пациентов, в частности, если используется в комбинации с др. агентами. В особенности, т.к. перадача сигналов Ras-ERK и PI(3)K/PKB вносят вклад в выживаемость меланомных клеток и могут частично объяснить печально известную резистентность меланомных клеток к цитотоксическим лекарствам, было бы особенно интересным протестировать anti-Raf-MEK лекарства совместно с anti-PI(3)K/PKB лекарствами, с или без агентов, индуцирующих апоптоз. Др. лекарства, которые следует учитывать, являются те, что нацелены на сигналы выживаемости, предоставляемые передачей сигналов NF-κB (чувствительной к velcade и aspirin) или на факторы жизнеспособности, такие как Bcl-2. Bcl-2 в частности является важным фактором клеточной выживаемости меланоцитов и меланом (Fig. 2), это может защитить клетки от токсических промежуточных образовании меланина или реактивных видов кислорода во время меланогенеза и/или УФЛ. Нормальные меланоциты и меланобласты экспрессируют высокие уровни Bcl-2 (ref. 73) а количества меланоцитов снижаются преждевременно у Bcl2-нулевых мышей благодаря потере популяции стволовых клеток⁷⁴. В преклинических исследованиях антисмысловых олигонуклеотидов против Bcl-2 (таких как oblimersen) можно сенсибилизировать меланомные клетки к химиотерапии⁷⁵ (Table 2) , а испытания Phase III показали некоторый успех в progression-free выживаемости при использовании в комбинации в dacarbazine^57,76. Биспецифические олигонуклеотиды кBcl-2 и Bcl-XL также были протестированы⁷⁷. Тот факт, что функция p16INK4a теряется в большинстве меланом, идентифицирует Cdk4 и 6 в качестве др. потенциальных терапевтических мишеней. Pan CDK ингибиторы, такие как flavopiridol в основном неактивны и нет доказательств клинической активности в злокачественных меланомах, но эти агенты могут быть эффективны у некоторых пациентов, т.к. ингибирование CDK преимущественно супрессирует экспрессию мРНК с коротким периодом полу-жизни, включая те, что кодируют антиапоптические белки, такие как X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP). Более избирательные лекарства Cdk4/6, такие как PD0332991 (Table 2), которые активны в xenograft моделях colon carcinoma78, могут быть более эффективными. Наследственное перекрывание в этом пути, по-видимому, не является вопросом, т.к. ингибирование Cdk4/6 индуцирует арест G1 клеточного цикла и регрессию опухолей in vivo, в то время как ингибирование Cdk1/2 индуцирует E2F-зависимую клеточную гибель, демонстрируя, что активности этих двух родственных кинах могут быть разделены. И снова эти лекарства могут быть скомбинированы с др. агентами, чтобы предоставить возможность для лечения меланом и особенно интересно комбинировать их с лекарствами, нацеленными на Ras-ERK путь. Targeting multiple pathways Др. подходом является использование агентов, которые нацелены на несколько путей одновременно. Молекулярный хаперон хитшоковый белок 90 (Hsp90) регулирует укладку и функцию вновь синтезированных белков, среди которых много протеин киназ, включая CRAF, BRAF, Cdk4 и Cdk6 (ref. 78). Ингибирование Hsp90 с помощью benzoquinone anisomycin 17AAG (Table 2) вызывает деградацию их белков клиентов посредством ubiquitin-зависимого протеосомного пути. Т.о., ингибирование Hsp90 может затрагивать несколько путей одновременно и удивительно, что это не ведет к значительным уровням токсичности, как этого можно было ожидать⁷⁹. Важно, что V600EBRAF более чувствителен к 17AAG , чем к дикого типа BRAF, но17AAG также затрагивает дикого типа BRAF и CRAF, стоящих ниже онкогенного Ras^80,81. Затем, однако, он активируется, 17AAG затрагивает этот путь и, более того, т.к. 17AAG затрагивает многие пути, присутствие мутантного BRAF не повышает чувствительность клеток меланом к 17AAG80,⁸¹. Вместо этого, 17AAG ,по-видимому, осуществляет свой терапевтический эффект путем таргетинга нескольких путей, которые гиперактивированы в раковых, но не в нормальных клетках. Безусловно, реакции на 17AAG видны на пациентах с меланомой⁷⁹ и дальнейшие испытания уже идут (http://www.nature.com/nature/journal/v445/n7130/full/www.clinicaltrials.gov). Сходным образом протеосомный ингибитор PS-341 (bortezomib, velcade; Table 2) , как было установлено, усиливает активность лекарства temozolomide против меланомы in vitro и in vivo⁸², что привело к клиническим испытаниям. Противо-опухолевая активность PS-341 может быть обусловлена ингибированием NF-κB, but NF-κB еще не оценена полностью в качестве мишени в меланоме. Однако, пригодность лекарств, таких как BMS-345541, который является избирательным IκB kinase ингибитором⁸³, сегодня делают это возможным, чтобы протестировать важность NF-κB в качестве мишени в меланоме. Дополнительной потенциальной мишенью является ангиогенез, который выполняет критическую роль в меланоме. Ангиогенные факторы, такие как VEGF, IL-8, basic FGF и PDGF высвобождаются меланомой и хозяйскими клетками в опухолевую микросреду⁸⁴ , а ингибиторы VEGF рецептора SU5416 и AG013736 (Table 2) обладают противо-опухолевой активностью у мышей, несущих xenografts человеческой меланомы. Однако, нет обнадеживающих данных Phase II испытаний, и из-за sorafenib, который, как полагают действует посредством анти-ангиогенного механизма, возникает лишь маргинальная реакция в меланомах, возможно, что влияние только на ангиогенез является неэффективным лечением меланом. В согласии с этим наблюдение, что ингибитор VEGF рецептора EMD 121974 (Table 2) обнаруживает себя многообещающим в преклинических исследованиях, но неутешительные результаты на пациентах85. Важно определить, может ли вносимый sorafenib вклад в проводимые комбинационные исследования⁶², быть обусловлен его анти-ангиогенной активностью, как это было показано, или анти-ангиогенные лекарства играют достойную роль только в комбинационных терапевтических подходах. Наконец, несколько потенциальных антимеланомных лекарств являются источником информации, или уже доступны, но некоторые из этих мишеней пока полностью не оценены. Белки, такие как integrin αvβ3, который играет важную роль в адгезии меланомных клеток, может испытывать влияние со стороны Vitaxin (Table 2), humanized моноклональными антителами⁸⁶. Рецепторная тирозин киназа c-Kit, которая активируется мутациями примерно у 2% метастатических меланом, ингибируется с помощью imatinib¹⁶. Рецепторы c-Met и FGF также не следует упускать из виду и следовательно, важные факторы, такие как MITF могут быть сами по себе не подходящими мишенями для лекарств, процессы, которые они контролируют, д. использовать нижестоящие компоненты, которые могут быть великолепными мишенями. Наше понимание метастазирования 87, раковых стволовых клеток и наша способность использовать сложные аналитические подходы для идентификации новых мишеней, таких как NEDD9 (neural-precursor-cell-expressed downregulated 9)⁸⁸ также предоставляют ряд новых мишеней. Когда мы узнаем больше о биологии меланом и наша способность просеивать и отобрать пациентов увеличится, условия прицельного клинического вмешательства станут более обширными. В самом деле, наше понимание биологии меланом уже предопределяет новые и захватывающие терапевтические подходы.

Меланоциты являются специализированными пигментными клетками, которые обнаруживаются преимущественно в коже и глазах, где они продуцируют меланины, пигменты, отвечающие за окраску кожи и волос. Кожные меланоциты происходят из высоко подвижных предшественников нервного гребня, которые мигрируют в кожу во время эмбрионального развития. В коже меланоциты располагаются в базальном слое эпидермиса (Fig. 1) и в волосяных фолликулах и их гомеостаз регулируется с помощью эпидермальных кератиноцитов¹. В ответ на облучение УФЛ кератиноциты секретируют факторы, которые регулируют жизнеспособность, дифференцировку, пролиферацию и подвижность меланоцитов, стимулируют меланоциты к продукции меланина и вызывают реакцию загара. Т.о., меланоциты играют ключевую роль в защите кожи от повреждающих эффектов УФЛ и предупреждают появление рака кожи (see page 843). Следовательно, люди, лишенные функциональных меланоцитов, т.е. пигментных нарушениях, таких как vitiligo и альбинизм гиперчувствительнык облучению УФЛ2. Они могут оказаться порочными, т.к. меланоциты являются предшественниками меланомы, наиболее гибельной формы рака кожи.

Рак кожи является третьим из наиболее распространенных злокачественных новообразований и его глобальный показатель растет с устрашающей скоростью вместе с базальноклеточной карциномой, а меланома является наиболее распространенной из форм. Определяется 2-3 миллиона случаев рака кожи по всему свету за год и хотя меланома из них составляет только около 132,000 случав (World Health Organization), она является наиболее ужасной формой, наиболее частая причина гибели от рака кожи. Если меланома диагностируется рано, то она может быть излечена хирургической резекцией и примерно 80% случаев излечивается подобным образом. Однако, метастатическая злокачественная меланома довольно устойчива к существующей терапии и имеет очень плохой прогноз со средней продолжительностью жизни в 6 мес. и 5-летним периодом жизни у менее 5%3, так что необходимы новые стратегии для её лечения. Недавние исследования улучшили наше понимание биологии меланомы и предложены новые терапевтические подходы к этой болезни.

Types and progression of cutaneous melanoma

Мутации в критических генах, регулирующих рост, продукция аутокринных факторов роста и потеря адгезивных рецепторов, все они в нарушениях передачи внутриклеточных сигналов в меланоцитах, т.к. это позволяет им избегать аккуратной регуляции кератиноцитами⁴. Следовательно, меланоциты могут пролиферировать и распространяться, приводя к образованию naevus или широко распространенных родимых пятен (Fig. 1). Пролиферация меланоцитов может быть ограничена эпидермисом (junctional naevus), дермой (dermal naevus) или перекрывающимися компонентами обоих (compound naevus). Невусы обычно доброкачественны, но могут прогрессировать до radial-growth-phase (RGP) меланомы (Fig. 1), внутриэпидермальных повреждений, которые могут использовать некоторые локальные микроинвазии в дерму. Клетки RGP могут прогрессировать до vertical-growth phase (VGP), более опасной стадии, при которой клетки становятся потенциально метастазными с узелками или гнездами клеток, инвазирующими дерму (Fig. 1). Не все меланомы проходят через каждую из этих индивидуальных фаз - RGP или VGP и могут развиваться непосредственно из изолированных меланоцитов или невусов, и могут прогрессировать непосредственно в метастазирющую злокачественную меланому⁵.

Существует 4 клинических субтипа меланом6. Nodular melanoma состоит из увеличивающихся узелков без значительной плоской части. Acral lentiginous melanoma (ALM) имеет тенденцию обнаруживаться на ладонях рук и подошвах ног и в ногтевом ложе и не ассоциирует с воздействиями УФЛ. ALM составляет почти 50% меланом non-Caucasian популяциях⁷. Lentigo maligna имеет обычно плоскостное проявление и возникает на подверженных воздействию солнца местах у пожилых. Она, следовательно, ассоциирует с хроническим воздействием солнца в течение всей жизни. Наконец, плоская по проявлению superficial spreading melanoma (SSM), наиболее сильно распространенная форма меланомы. Она обычно плоская с внутри-эпидермальным компонентом, особенно на краях и связана с эпизодами тяжелых солнечных ожогов, особенно в раннем возрасте. SSM является третьим из наиболее распространенных раков у молодых людей в Великобритании и США и объясняет оставшиеся 50% случаев меланом у non-Caucasians^8,9. До сих пор диагноз меланомы базировался на патологии, но Bastian с коллегами недавно продемонстрировали, что изменения по всему геному количества копий ДНК вместе с анализом индивидуальных соматических мутаций могут использоваться для дифференциальной диагностики разных подтипов меланом с 70% точностью¹⁰. Следовательно, разные меланомы развиваются согласно самостоятельным генетическим путям.

Insight into melanoma biology from cell signalling pathways

Меланома является сложным генетическим заболеванием, лечение которого требует глубокого понимании биологии, лежащей в основе инициации и прогрессирования. Это позволяет улучшить классификацию стадий и подтипов и ведет к разработке лучших терапевтических агентов и подходов. Всесторонние стратегии, такие как сравнительная геномная гибридизация и анализ мутаций с помощью генного ресеквенирования идентифицированы некоторые критические клеточные сигнальные пути этой болезни.

Ras/Raf/MEK/ERK signalling

Путь Ras/Raf/MEK/ERK регулирует решения клеточных судеб ниже рецепторной тирозин киназы, цитокинов и гетеротримерных G-protein-coupled рецепторов¹¹. Малый G протеин Ras привлекается во внутренний листок плазматической мембраны , в то время как Raf, MEK и ERK являются цитозольными протеин киназами (Fig. 2). В меланоцитах этот путь активируется посредством ростовых факторов, таких как stem-cell factor (SCF), fibroblast growth factor (FGF) и hepatocyte growth factor (HGF)12, но в отдельности эти факторы индуцируют лишь слабую или временную активацию ERK activation, ведущую к легкому митогенному эффекту. Т.о., для пролиферации комбинированное действие нескольких ростовых факторов необходимо, чтобы стимулировать строго и устойчиво активность ERK в меланоцитах^12,13.

Этот путь также является ключевым регулятором пролиферации клеток меланомы с гиперактивированным ERK в более чем 90% меланом у человека¹⁴. В меланоме, ERK может быть активирован путем продукции автокринных факторов роста¹⁵ или в редких случаях мутантной активацией рецепторов ростовых факторов, таких как c-Kit¹⁶. Наиболее распространенным механизмом является, как полагают, мутации NRAS с избыточной функцией, одного из трех генов Ras у людей (др. являются HRAS и KRAS). NRAS мутантен от 15% до 30% меланом, наиболее распространенной заменой является лейцин вместо глютамина в положении 61 (Q61L)17 (Table 1). Важно, что онкогенный Ras может индуцировать меланомы у p16INK4a-дефицитных мышей и также играет роль в поддержании опухолей^18,19.

Наиболее распространенным мутантным компонентом этого пути является BRAF, один из трех Raf генов у человека (вместе с ARAF и CRAF). BRAF мутантен от 50% до 70% меланом¹⁷ (Table 1), а наиболее распространенной мутацией является замена glutamic acid на valine в положении 600 (V600E)¹⁷. V600EBRAF конституитивная передача сигналов ERK стимулирует пролиферацию и выживаемость, а также обеспечивает занчительный опухолевый рост и сохранение функций²⁰. V600EBRAF вносит также вклад в нео-ангиогенез путем стимуляции секреции аутокринного vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion²¹ а недавние исследования идентифицировали несколько генов в меланоме, которые функционируют иерархически ниже V600EBRAF. Сюда входят те, что кодируют транскрипционные факторы MITF (microphthalmia-associated transcription factor)²² и BRN-2 (POU domain class 3 транскрипционный фактор)²³, регуляторы клеточного цикла cyclin D1 (ref. 24) и p16INK4a (refs 25, 26), и энзимы поддержания опухолей matrix metalloproteinase-1 (ref. 27) и индуцибельная nitric oxide synthase²⁸. Т.о., BRAF участвует в нескольких аспектах индукции и прогрессирования меланом.

Ras-ERK and phosphoinositide-3-OH kinase signalling

Др. путь передачи сигналов, который оказывается важным в меланомах, это путь phosphoinositide-3-OH kinase (PI(3)K) (Fig. 2). Phosphoinositides являются мембранными липидами, которые превращаются во вторичные мессенджеры посредством гиперфосфорилирования с помощью семейства PI(3)Ks²⁹. Липидные вторичные мессенджеры активируют многочисленные пути нижестоящих эффекторов, а передача сигналов завершается с помощью липид фосфатазы PTEN (phosphate and tensin homologue). Передача сигналов PI(3)K регулирует клеточную жизнеспособность, рост (увеличение клеточной массы) и подвижность и она гиперактивирована в большой пропорции меланом (Table 1). Это объясняется частично находками, что мутации PI(3)K встречаются в 3% метастатических меланом³⁰, функция PTEN теряется отn 5% до 20% меланом поздней стадии³¹, a PI(3)K effector protein kinase B (PKB, известная также как Akt) избыточно экспрессируется в 60% меланом³².

В трехмерных культурах меланом передача сигналов ERK и PI(3)K д.быть ингибирована, чтобы супрессировать клеточный рост, следовательно, оба пути важны³³. В меланомах мутации NRAS и BRAF взаимоисключающие, также как NRAS и PTEN в то время как BRAF и PTEN мутации встречаются одновременно примерно в 20% случаев³⁴. Эпистатические взаимоотношения этих генов не только продемонстрированы генетически, но и паттерны этих мутаций подтверждают наше сегодняшнее понимание пути Fig. 2). BRAF и PI(3)K активируют нижестоящий Ras, так что в присутствии онкогенного NRAS дополнительные мутации в BRAF и PTEN излишни, т.к. эти компоненты уже активированы. В самом деле, их мутации в этом контексте могут даже противодействовать прогрессированию опухолей, т.к. они могут стимулировать путь суперактивации. Напротив, т.к. PTEN и BRAF взаимно не активируются, то эти пути кооперируются, чтобы стимулировать пролиферацию, отдельные мутации необходимы для активации обоих путей. Подтверждение этой модели получено в наблюдениях, что онкогенный Ras трансформирует меланоциты более эффективно, чем онкогенный BRAF³⁵, по-видимому, из-за PI(3)K компонента. Курьезно поэтому, что мутации BRAF более часты, чем мутации Ras в меланомах, это, по-видимому, отражает др. генетические и биологические воздействия, способствующие прогрессированию меланом с мутациями BRAF по сравнению с теми, что с мутациями NRAS.

Microphthalmia-associated transcription factor

MITF является basic helix-loop-helix leucine zipper транскрипционным фактором, который , как полагают, является ведущим регулятором биологии меланоцитов, частично изза того. что регулирует экспрессию меланогенных белков, таких как tyrosinase, silver homologue (GP100) и melanoma-associated antigen recognized by T cells-1 (MART-1, известен также как melan-A)³⁶ (see also page 843). Однако, MITF регулирует также жизнеспособность меланобластов и детерминацию клона меланоцитов и является ключевым игроком в меланомах³⁶. MITF экспрессируется в большинстве меланом человека, а их гены мишени являются диагностическими маркерами этой болезни³⁶. Более того, продолжающаяся экспрессия MITF важна для пролиферации и жизнеспособности меланомных клеток³⁶. Однако, мы полагаем, что уровни белков д.быть тщательно контролируемы. MITF экспрессируется на существенно более низких уровнях в клетках меланом, а увеличение уровней MITF редуцирует пролиферацию клеток меланом даже в присутствии онкогенного BRAF²². Высокие уровни MITF также снижают онкогенный потенциал меланомных клеток³⁷. Мы полагаем, что MITF регулирует самостоятельные функции в меланоцитных клетках при разных уровнях экспрессии. Высокие уровни предрасполагают к аресту клеточного цикла и к дифференцировке, преимущественно за счет контроля регуляторов клеточного цикла (таких как p16INK4a, cyclin-dependent kinase 2 (Cdk2) and p21Cip)³⁶, в то время как критически низкие уровни ведут к аресту клеточного цикла и апоптозу. только при промежуточных уровнях обеспечивается пролиферация (Fig. 3).

Важно, что недавние исследования показали, что MITF может кооперировать с V600EBRAF, чтобы трансформировать меланоциты, иммортализованные с помощью экспрессии каталитической субъединицы теломеразы (TERT), доминантно-негативной p53 и активированной Cdk4 (ref. 38). Эти данные показывают, что хотя MITF сам по себе не может трансформировать нормальные или иммортализованные меланоциты человека, он может кооперироваться с V600EBRAFчтобы вносить вклад в процесс трансформации, действуя как клон-специфичный дополнительный 'онкоген'³⁸, возможно из-за того, что он обеспечивает важную функцию выживания и вносит вклад в пролиферацию. В этом контексте и учитывая, что ERK гиперактивировна в меланоме и необходима для пролиферации и жизнеспособности, поразительно, что MITF направляется на деградацию после его фосфорилирования с помощью ERK³⁹. В самом деле, конституитивная активация ERKс помощью V600EBRAFв меланоцитах вызывает постоянное подавление MITF^22,38,39 (Fig. 3). Следовательно, чтобы противодействовать ситуации, при которой уровни MITF могут становиться критически низкими, клетки меланомы, по-видимому, развивают стратегии по восстановлению белка MITF до уровней, соответствующих прогрессированию опухоли.

Как недавно было показано, MITF амплифицируется в небольшом проценте (10-16%) метастатических меланом, в которых BRAF мутантен38 (Table 1). Неожиданно, несмотря на тот факт, что ген может быть амплифицирован в 10-100-раз,уровни MITF увеличиваются только в 1.5-раза по сравнению с клетками без амплификации³⁸, это снова подтверждает, что уровни MITF могут поддерживаться внутри узких границ. Однако, т.к только 10-16% BRAF-мутантных меланом обнаруживают амплификацию MITF, то возникает важный вопрос, как остальные 84-90% противостоят деградации MITF, обусловленной гиперактивированной ERK. Один из механизмов может использовать β-catenin, который может индуцировать экспрессию MITF посредством LEF-1/TCF связывающего сайта MITF промотора⁴⁰ и хотя стабилизирующие мутации в β-catenin редки в меланомах⁴¹, ядерная и/или цитоплазматическая локализация β-catenin обнаружена в 28% метастатических меланом⁴².

Other signalling pathways

Наконец, заслуживает внимания то, что некоторые генетические альтерации, распространенные в меланомах, по-видимому, редуцируют апоптоз, включая мутации в NRAS и BRAF, избыточную экспрессию гена B-клеточной leukaemia/lymphoma 2 (Bcl-2), nuclear factor-κB (NF-κB) и Akt3 и потерю PTEN (Fig. 2). Не является неожиданностью, что некоторые из этих путей также способствуют росту, т.к. пути пролиферации и жизнеспособности перекрываются. Др. сигналы выживаемости могут исходить от позитивной регуляции путиβ-catenin посредством потери или молчания adenomatous polyposis coli (APC)⁴³, или от редких активирующих мутаций в β-catenin (CTNNB1)⁴¹. Избыточная экспрессия транскрипционного фактора SKI может также играть роль⁴⁴, т.к. возможны альтерации, которые затрагивают p14ARF. Наконец, часто молчание apoptotic peptidase activating factor-1 (APAF-1) в продвинутых меланомах⁴⁵ также могут вносить вклад в жизнеспособность. Очевидно, что эти пути нуждаются в дальнейшем исследовани, чтобы определить их роль в меланомах людей и обладаемый ими потенциал для терапевтического вмешательства.

Overriding senescence mechanisms

Обычные соматические клетки обладают ограниченным пролиферативным потениалом и после определенного количества делений они выходят из клеточного цикла и вступают в состояние, известное как старение⁴⁶. Старение является ключевым механизмом клеточной защиты против рака, т.к. оно удерживает от аберрантной клеточной пролиферации и процесс этот физиологически важен, т.к. он индуцируется активированными онкогенами в нормальных соматических клетках. Раковые клетки преодолевают старение путем инактивации ключевых путей, таких как те, что регулируют p16INK4a/Rb (retinoblastoma protein) и p53 (ref. 47).

Белок супрессор опухолей p16INK4a действует путем соединения с cyclin-D-зависимой протеин киназой Cdk4 и 6, блокируя их активность и предупреждая фосфорилирование Rb48 (Fig. 2). Гены, кодирующие p16INK4a и Cdk4 являются высоко пенетрантными локусами для чувствительности к меланомам. p16INK4a кодируется с помощью CdkN2A, локуса, который также кодирует опухолевый супрессор p14ARF (p19ARF у мышей) при помощи разных промоторов и благодаря использованию альтернативной рамки считывания⁴⁹. При семейной меланоме мутации CdkN2A обычно затрагивают только p16INK4a или p16INK4a вместе с p14ARF; очень редко затрагивается только p14ARF. Мутации в Cdk4 нарушают связывание p16INK4a⁴⁹. Соматические мутации в этих генах обнаружены также в большинстве спорадических меланом. p16INK4a инактивированный мутациями. делециями, метилированием промотора⁵⁰ (Table 1) или посредством транскрипционного молчания за счет избыточной экспрессии транскрипционного супрессора, inhibitor of differentiation 1 (ID1)⁵¹. Альтернативно, могут возникнуть мутации Cdk4, которые блокируют связывание p16INK4a или может избыточно экспрессироваться cyclin D1 (Table 1), частично как результат генной амплификации⁵². Более того, большинство линий клеток культивируемых меланом, по-видимому, обладает дефектом в p16INK4a или Rb, или избыточной экспрессией Cdk4 или cyclin D1. Очевидно, передача сигналов p16INK4a/Rb является ключевым регулятором старения меланоцитов и, следовательно, чтобы отказаться от старение клеток меланом этот путь д. быть инактивирован⁴⁶.

Интригующим наблюдением является то, что BRAF мутантен у более 80% злокачественных невусов⁵³, всё же большинство невусов остается вялотекущими в течении десятков лет и очень редко прогрессируют в меланому. Т.о., только онкогенного BRAF недостаточно для инициации меланомы и что поразительно, V600EBRAF, как недавно было обнаружено, индуцирует экспрессию p16INK4a и старение в первичных меланоцитах человека in vitro^25,26 (Fig. 2). Важно, что V600EBRAF не может трансформировать меланоциты человека даже когда они иммортализованы с помощью экспрессии TERT expression38, но может трансформировать меланоциты p16INK4a-дефицитных мышей³⁵, a p16INK4a дефицит необходим для Ras-индуцированных меланом у мышей¹⁹. Более того, позитивная регуляция p16INK4a, по-видимому, вносит вклад в индукцию старения в невусах^25,26, a p16INK4a дефекты обнаруживаются в диспластических, но доброкачественных невусах⁵⁴.

Итак, эти исследования подтверждают интригующую модель, согласно которой p16INK4a служит в качестве тормоза для V600EBRAF-запускаемой трансформации меланоцитов. В этой модели, приобретение мутаций в BRAF или NRAS д.приводить к гиперпролиферации и последующему p16INK4a-обусловленному старению, генерации невусов, которые содержат клоны стареющих меланоцитов. Эти исследования подтвердили, что прогрессирование меланом нуждается в инактивации p16INK4a/Rb пути. Удивительно, однако, что p16INK4a экспрессируется в виде мозаичного паттерна в невусах, в то время как экспрессия β-galactosidase, др. маркера старения, униформна25, 26. Возможно, что p16INK4a арестовывает пролиферацию в некоторых клетках на уровнях, которые ниже чувствительности подходов иммуноокрашивания, это объясняет, почему экспрессия неуниформна. Др. возможность заключается в том, что стареющие клетки секретируют старением-индуцированные агенты, которые влияют на соседние клетки, которые не экспрессируют p16INK4a. Наконец, вполне осуществимо, что распространенное ремоделирование хроматина и генное молчание, обусловленное гиперактивацией белка Rb семейства⁵⁵ заставляет клетки становиться транскрипционно неактивными, так что p16INK4a становится молчащим в некоторых клетках, но остановка роста поддерживается молчащими генами, которые необходимы для пролиферации.

Кроме того, старение может быть индуцировано др. факторами. В согласии с этой идеей находится тот факт, что пациенты с гомозиготными делециями p16INK4a всё ещё формируют доброкачественные невусы. В самом деле, люди, несущие мутации p16INK4a не только обладают повышенной чувствительностью к меланомам, но и обычно имеют множество родинок, которые часто крупны46, указывая тем самым, что p16INK4a является не только индуктором старения невусов. Др. механизмы могут использовать p53, как это наблюдается в культивируемых меланоцитах от p16INK4a-дефицитных пациентов46. Заметим, что melanophages (макрофаги, которые заглатывают меланин) и лимфоциты часто обнаруживаются вблизи дермальных p53-позитивных клеток, которые указывают на гибель меланоцита. Это указывает на то, что p53-зависимый 'back-up' (известный также как 'crisis') КПП (checkpoint) старения, который может быть активирован в меланоцитах после p16INK4a-зависимого старения (принципиальный механизм защиты меланоцитов от NRAS- или BRAF-обусловленной трансформации) transformation) , может быть обойден²⁵. Конечно, возможно, что др. пути, которые не используют p16INK4a/Rb- oили p53-зависимые механизмы также играют роль.

Treating melanoma

Меланома чрезвычайно агрессивное заболевание с высоким потенциалом метастазирования и печально известной высокой устойчивостью к цитотоксическим агентам. Это, как полагают, из-за того, что меланоциты происходят от высоко подвижных клеток, которые обладают усиленными свойствами выживания. Меланомные клетки обладают низкими уровнями спонтанного апоптоза in vivo по сравнению с др опухолевыми типами клеток и относительно резистентны к апоптозу. вызываемому лекарствами in vitro⁵⁶. Большинство химиотерапевтических лекарств функционирует путем индукции апоптоза в злокачественных клетках, так что резистентность к апоптозу скорее всего лежит в основе лекарственной устойчивости меланом⁵⁶, и эта чрезвычайная устойчивость к химиотерапии, радиотерапии и иммунотерапии является основным препятствием для успешного лечения меланом.

Имеется несколько апробированных подходов к постоперативной вспомогательной терапии злокачественых меланом⁵⁷. Interferon-α (IFN-α ) наиболее широко используемый для вспомогательной иммунотерапии продвинутых меланом, хотя его эффективность всё ещё предмет споров. Высокие дозы interleukin-2 (IL-2) также одобрены, но показатели ответной реакции низки, а токсичность составляет проблему. Dacarbazine (DTIC) является ориентированным одобренным химиотерапевтическим агентом для лечения далеко зашедших меланом и лекарства, такие как carmustine (BiCNU), paclitaxel (Taxol), temozolomide и cisplatin , как было продемонстрирован по активности одиночных агентов при метастатических болезнях⁵⁷. Кроме того, были тестированы многие др. иммунтерапевтические подходы, но пока ни один из этих подходов не получил всеобщего одобрения58. Однако, недавние испытания переноса генетически измененных лимфоцитов оказались обнадеживающими, 2 (из 17) пациентов достигли полной ремиссии в течение18 мес.59. К сожалению, все эти терапевтические подходы очень мало вносят в общую выживаемость пациентов, так что идентификация сигнальных путей, которые являются центральными в инициации и прогрессировании меланом, это начало новой области для лечения меланом. Это создает благоприятные возможности зля разработки целенаправленной терапии и применения этого лечения к пациентам в соответ. с генетическими повреждениями, которые лежат в основе индивидуального заболевания. На базе этих принципов несколько новых целенаправленных агентов сегодня разработаны и тестированы по отдельности и в комбинации с обычной химиотерапией.

Targeted therapies

Наиболее привлекательными раковыми мишенями являются те, в которых раковые клетки приобретают способность к прогрессии. Концепция 'oncogene addiction' аргументирует, что раковые клетки полагаются скорее на пути гиперактивации, по сравнению с нормальными клетками и следовательно, полагаются на активированные онкогены, которые управляют этими путями. Это предоставляет терапевтическую возможность, т.к. раковые клетки д. быть более чувствительны к ингибированию этих путей и онкогенов, чем нормальные клетки. Не все онкогены являются послушными мишенями, но энзимы такие как киназы, протеазы и фосфатазы оцениваются высоко благодаря своим каталитическим сайтам, включая глубокие карманы, в которых тщательно разработанные лекарства могут соединяться с разумной пограничной избирательностью. Т.к. NRAS и BRAF являются важными терапевтическими мишенями при меланоме, то не удивительно, что лекарства, которые нацелены на этот путь вызывают значительный интерес. Первые лекарства, нацеленные на этот путь, поступившими в клинику, были Ras farnesyl transferase ингибиторы (Table 2), которые были предназначены блокировать важные пост-трансляционные модификации Ras. Хотя эти лекарства не были специфичными, они могут иметь некоторое значение в комбинации с cisplatin⁶⁰, хотя реакции вряд ли нацелены на механизм.

Мульти-киназный ингибитор sorafenib (BAY 43-9006) нацелен на BRAF, CRAF и VEGF, также platelet-derived growth factor (PDGF) receptor tyrosine kinases⁶¹ (Table 2). В качестве монотерапии sorafenib обнаруживает лишь слабую активность против меланом, но если он комбинируется с carboplatin и paclitaxel , то результаты более обнадеживающие⁶². Неясно, почему монотерапия sorafenib является столь неэффективной при меланомах. Это может быть связано с тем, что он недостаточно мощный или возможно, что пролиферация клеток меланомы управляется альтернативными путями, когда передача сигналов Raf/MEK/ERK блокирована⁶³. Возможно также, что др. механизмы выживаемости, обеспечивающиеся с помощью tumour-necrosis factor-α (TNF-α ), предоставляют survival 'escape' путь, позволяя клеткам меланомы выживать, когда передача сигналов BRAF ингибирована64 или механизмы петли обратной связи могут устранять эффект sorafenib65. Очевидно, более мощные BRAF лекарства необходимы для тестирования, является ли BRAF подходящей мишенью при меланоме. С этой целью BRAF ингибитор CHIR-265 недавно поступил на клинические испытания для меланомы (Table 2).

Хотя BRAF сегодня в фокусе разработки Raf лекарства, др. изоформы Raf не следует упускать из виду не в последнюю очереь из-за того, что BRAF активирует CRAF в клетках млекопитающих⁶⁶ и хотя CRAF не нужен для активации MEK в присутствии V600EBRAF, но он необходим для пролиферации20. Более того, мы недавно открыли, что когда Ras мутантен в меланоме, то CRAF, а не BRAF активирует MEK⁶⁷. Итак, CRAF участвует в пролиферации клеток меланомы и хотя пока неясно, нуждаются ли эти функции в активности CRAF kinase, данные указывают на то, что панспецифические Raf лекарства д.быть более лучшими противо-меланомными агентами, чем BRAF-специфические лекарства.

В качестве альтернативы, были разработаны лекарства, такие как PD0325901 и AZD6244, которые нацелены на MEK (Table 2). Они ингибируют in vitro пролиферацию, формирование колоний на жидком агаре и инвазию в matrigel V600EBRAF мутантных меланомных клеток человека, а также эффективны против V600EBRAF меланомных xenografts⁶⁸. Отметим, что меланомные клетки, в которых BRAF мутантен, наиболее чувствительны к MEK ингибиторам, чем клетки, в которых мутирован Ras⁶⁹. Это неожиданно, т.к. Ras и BRAF оба пердают сигнал через MEK. Это позволят предположить, что или активируются дополнительные пути с помощью Ras, которые делают клетки меланомы менее зависимыми от MEK или напротив, что BRAF-мутантные клетки являются 'more addicted' к передаче сигналов MEK, указывая тем самым, что BRAF-мутантные опухоли д. отвечать с большой готовностью на ингибирование MEK, чем Ras-мутантные опухоли. AZD6244 и PD0325901 сегодня протестированы в клинических испытаниях у пациентов с далеко зашедшими меланомами (Table 2). Наконец, летальный anthrax токсин, который избирательно деградирует и инактивирует MEK1 и MEK2 (ref. 70),также был протестирован относительно меланомы в клинических испытаниях. Однако, следует отметить, что одной из потенциальных проблем ингибирования MEK является то, что MEK активируется также с помощью tumour progression locus 2 (TPL2), протеин киназы, которая регулирует врожденный иммунитет⁷¹, так что хроническое подавление MEK может иметь негативные эффекты на врожденный иммунитет. Не должно быть проблем с ингибированием Raf , это фактор, который следует учитывать при подготовке клинических испытаний.

Передача сигналов PI(3)K скорее всего также является прекрасной мишенью для лечения меланом, и разработаны агенты для мишени PI(3)K, PKB и др. нижестоящие компоненты этого пути, такие как mammalian target of rapamycin (mTOR). Среди них, mTOR ингибиторы, такие как CCI-779 или RAD001 являются наиболее продвинуты⁷² (Table 2). Важность этого пути для меланомы подтверждает, что лекарства, нацеленные на этот путь д. быть благотворны у правильно отобранных пациентов, в частности, если используется в комбинации с др. агентами. В особенности, т.к. перадача сигналов Ras-ERK и PI(3)K/PKB вносят вклад в выживаемость меланомных клеток и могут частично объяснить печально известную резистентность меланомных клеток к цитотоксическим лекарствам, было бы особенно интересным протестировать anti-Raf-MEK лекарства совместно с anti-PI(3)K/PKB лекарствами, с или без агентов, индуцирующих апоптоз. Др. лекарства, которые следует учитывать, являются те, что нацелены на сигналы выживаемости, предоставляемые передачей сигналов NF-κB (чувствительной к velcade и aspirin) или на факторы жизнеспособности, такие как Bcl-2. Bcl-2 в частности является важным фактором клеточной выживаемости меланоцитов и меланом (Fig. 2), это может защитить клетки от токсических промежуточных образовании меланина или реактивных видов кислорода во время меланогенеза и/или УФЛ. Нормальные меланоциты и меланобласты экспрессируют высокие уровни Bcl-2 (ref. 73) а количества меланоцитов снижаются преждевременно у Bcl2-нулевых мышей благодаря потере популяции стволовых клеток⁷⁴. В преклинических исследованиях антисмысловых олигонуклеотидов против Bcl-2 (таких как oblimersen) можно сенсибилизировать меланомные клетки к химиотерапии⁷⁵ (Table 2) , а испытания Phase III показали некоторый успех в progression-free выживаемости при использовании в комбинации в dacarbazine^57,76. Биспецифические олигонуклеотиды кBcl-2 и Bcl-XL также были протестированы⁷⁷.

Тот факт, что функция p16INK4a теряется в большинстве меланом, идентифицирует Cdk4 и 6 в качестве др. потенциальных терапевтических мишеней. Pan CDK ингибиторы, такие как flavopiridol в основном неактивны и нет доказательств клинической активности в злокачественных меланомах, но эти агенты могут быть эффективны у некоторых пациентов, т.к. ингибирование CDK преимущественно супрессирует экспрессию мРНК с коротким периодом полу-жизни, включая те, что кодируют антиапоптические белки, такие как X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP). Более избирательные лекарства Cdk4/6, такие как PD0332991 (Table 2), которые активны в xenograft моделях colon carcinoma78, могут быть более эффективными. Наследственное перекрывание в этом пути, по-видимому, не является вопросом, т.к. ингибирование Cdk4/6 индуцирует арест G1 клеточного цикла и регрессию опухолей in vivo, в то время как ингибирование Cdk1/2 индуцирует E2F-зависимую клеточную гибель, демонстрируя, что активности этих двух родственных кинах могут быть разделены. И снова эти лекарства могут быть скомбинированы с др. агентами, чтобы предоставить возможность для лечения меланом и особенно интересно комбинировать их с лекарствами, нацеленными на Ras-ERK путь.

Targeting multiple pathways

Др. подходом является использование агентов, которые нацелены на несколько путей одновременно. Молекулярный хаперон хитшоковый белок 90 (Hsp90) регулирует укладку и функцию вновь синтезированных белков, среди которых много протеин киназ, включая CRAF, BRAF, Cdk4 и Cdk6 (ref. 78). Ингибирование Hsp90 с помощью benzoquinone anisomycin 17AAG (Table 2) вызывает деградацию их белков клиентов посредством ubiquitin-зависимого протеосомного пути. Т.о., ингибирование Hsp90 может затрагивать несколько путей одновременно и удивительно, что это не ведет к значительным уровням токсичности, как этого можно было ожидать⁷⁹. Важно, что V600EBRAF более чувствителен к 17AAG , чем к дикого типа BRAF, но17AAG также затрагивает дикого типа BRAF и CRAF, стоящих ниже онкогенного Ras^80,81. Затем, однако, он активируется, 17AAG затрагивает этот путь и, более того, т.к. 17AAG затрагивает многие пути, присутствие мутантного BRAF не повышает чувствительность клеток меланом к 17AAG80,⁸¹. Вместо этого, 17AAG ,по-видимому, осуществляет свой терапевтический эффект путем таргетинга нескольких путей, которые гиперактивированы в раковых, но не в нормальных клетках. Безусловно, реакции на 17AAG видны на пациентах с меланомой⁷⁹ и дальнейшие испытания уже идут (http://www.nature.com/nature/journal/v445/n7130/full/www.clinicaltrials.gov).

Сходным образом протеосомный ингибитор PS-341 (bortezomib, velcade; Table 2) , как было установлено, усиливает активность лекарства temozolomide против меланомы in vitro и in vivo⁸², что привело к клиническим испытаниям. Противо-опухолевая активность PS-341 может быть обусловлена ингибированием NF-κB, but NF-κB еще не оценена полностью в качестве мишени в меланоме. Однако, пригодность лекарств, таких как BMS-345541, который является избирательным IκB kinase ингибитором⁸³, сегодня делают это возможным, чтобы протестировать важность NF-κB в качестве мишени в меланоме.

Дополнительной потенциальной мишенью является ангиогенез, который выполняет критическую роль в меланоме. Ангиогенные факторы, такие как VEGF, IL-8, basic FGF и PDGF высвобождаются меланомой и хозяйскими клетками в опухолевую микросреду⁸⁴ , а ингибиторы VEGF рецептора SU5416 и AG013736 (Table 2) обладают противо-опухолевой активностью у мышей, несущих xenografts человеческой меланомы. Однако, нет обнадеживающих данных Phase II испытаний, и из-за sorafenib, который, как полагают действует посредством анти-ангиогенного механизма, возникает лишь маргинальная реакция в меланомах, возможно, что влияние только на ангиогенез является неэффективным лечением меланом. В согласии с этим наблюдение, что ингибитор VEGF рецептора EMD 121974 (Table 2) обнаруживает себя многообещающим в преклинических исследованиях, но неутешительные результаты на пациентах85. Важно определить, может ли вносимый sorafenib вклад в проводимые комбинационные исследования⁶², быть обусловлен его анти-ангиогенной активностью, как это было показано, или анти-ангиогенные лекарства играют достойную роль только в комбинационных терапевтических подходах.

Наконец, несколько потенциальных антимеланомных лекарств являются источником информации, или уже доступны, но некоторые из этих мишеней пока полностью не оценены. Белки, такие как integrin αvβ3, который играет важную роль в адгезии меланомных клеток, может испытывать влияние со стороны Vitaxin (Table 2), humanized моноклональными антителами⁸⁶. Рецепторная тирозин киназа c-Kit, которая активируется мутациями примерно у 2% метастатических меланом, ингибируется с помощью imatinib¹⁶. Рецепторы c-Met и FGF также не следует упускать из виду и следовательно, важные факторы, такие как MITF могут быть сами по себе не подходящими мишенями для лекарств, процессы, которые они контролируют, д. использовать нижестоящие компоненты, которые могут быть великолепными мишенями. Наше понимание метастазирования 87, раковых стволовых клеток и наша способность использовать сложные аналитические подходы для идентификации новых мишеней, таких как NEDD9 (neural-precursor-cell-expressed downregulated 9)⁸⁸ также предоставляют ряд новых мишеней. Когда мы узнаем больше о биологии меланом и наша способность просеивать и отобрать пациентов увеличится, условия прицельного клинического вмешательства станут более обширными. В самом деле, наше понимание биологии меланом уже предопределяет новые и захватывающие терапевтические подходы.

Melanoma biology and new targeted therapyVanessa Gray-Schopfer, Claudia Wellbrock and Richard Marais Nature 445,n7130, 851-857 (22 February 2007) | doi:10.1038/nature05661

Melanoma biology and new targeted therapy
Vanessa Gray-Schopfer, Claudia Wellbrock and Richard Marais
Nature 445,n7130, 851-857 (22 February 2007) | doi:10.1038/nature05661