Потенциал использования эмбриональных стволовых клеток человека для терапии вытекает из их способности формировать любые клетки тела. Этот потенциал используется, чтобы оправдать интенсивные исследования, несмотря на некоторые этические затруднения. Параллельно ученые ищут стволовые клетки взрослых, которые можно было бы использовать в качестве альтернативы эмбриональным клеткам и в отношении сердца это привело к многообещающим результатам. Однако, большинство кардиомиоцитов взрослых неспособно делиться и давать новые кардиомиоциты и поэтому неспособны замещать потери, возникающие при болезнях. Большинство вопросов - напр., может ли замещение кардиомиоцитов или альтернативные воздействия, такие как обеспечение поврежденного сердца новыми кровеносными сосудами или ростовыми факторами активировать резидентные стволовые клетки, остаются пока без ответов. Несмотря на это преклинические исследования на трансплантируемых кардиомиоцитах у животных и первые клинические испытания со стволовыми клетками взрослых дали
Embryonic stem (ES) клетки мышей и приматов могут дифференцироваться в любой тип клеток взрослого тела1. Потенциал для использования ES клеток взрослых людей для лечения дегенеративных болезней и повреждений давно показан. Однако, этические споры, что получаемые из ES клеток производные требуют разрушения человеческих эмбрионов вызывают антипатию во многих странах и это требует огромных усилий, чтобы найти альтернативные подходы. которые позволят использовать стволовые клетки взрослых или клетки предшественники. В терминах капиталовложений, National Institutes of Health потратил US$2.5 billion на изучение стволовых клеток в период 2004-2007, из которых только $150 million на изучение ES-клеток людей (http://
Было предположено, что если достаточно корректные клетки могут быть получены, то они д. быть способны замещать клетки. которые были потеряны или повреждены болезнью. Эта концепция особенно подходящая для сердца, где новые сердечномышечные клетки (кардиомиоциты) д.б. способны восстанавливать контрактильную функцию после сердечных атак (инфаркт миокарда). Они могут быть также пригодны для поджелудочной железы, где новые (β-cells могут секретировать инсулин в ответ на глюкозу после трансплантации людям с диабетом и для ЦНС, где трансплантации соотв. нейронов в головной мозг могут восстанавливать продукцию dopamine у пациентов с болезнью Паркинсона. Кроме того. трансплантации стволовых клеток в спинной мозг могут позволить восстановление новых нейронов, чтобы восстанавливать моторную функцию у людей с повреждениями спинного
Независимо от этических вопросов, однако, изучение человеческих ES клеток сталкивается со многими трудностями на своем пути к клинике. Сюда входит и риск образования тератом, злокачественных опухолей, содержащих дезорганизованную смесь идентифицируемых тканей, таких как хрящи и кости. Тератомы обусловливаются присутствием загрязняющих недифференцированных клеток, когда они непреднамеренно ко-трансплантируются с дифференцированными клетками. Др. фактором риска является иммунная реакция, которая может разрушать трансплантируемые клетки, несовместимые с пациентом. Др. затруднения д.быть преодолены, чтобы гарантировать клиническое соответствие культуральных реагентов, так чтобы они не содержали. напр., животных реагентов, возможно загрязненных вирусами или прионами и как стало недавно ясно с публикацией результатов преклинических трансплантационных экспериментов на животных, моделирующих болезни, это проблемы с жизнеспособностью клеток трансплантатов и с трудностями интеграции в собственно ткани хозяина. Риск возникновения тератом является специфическим для человеческих ES клеток и человеческих induced pluripotent stem (iPS) клеток, которые недавно были получены путем прямого перепрограммирования кожных фибробластов в плюрипотентное состояние (в котором они могут давать все типы клеток тела) (Box 1), в то время как постнатальные или взрослые стволовые клетки могут быть использованы непосредственно без предварительной дифференцировки или культивирования, хотя слабая интеграция и жизнеспособность их в тканях хозяина остается всё ещё проблемой. Стволовые клетки взрослых могут быть также использованы аутологически. (Такие стволовые клетки из тела пациента не д. вызывать иммунного отторжения после трансплантации.) Если они происходят из источника богатого стволовыми клетками, такого как костный мозг или пуповинная кровь, то они не нуждаются в экспансии в культуре перед использованием и тем самым устраняется воздействие происходящих из животных реагентов и предупреждается развитие хромосомных аномалий
2, которые могут возникать, если клетки были подвергнуты стрессу. Эти преимуществе привели к быстрому клиническому применению аутологичных стволовых клеток взрослых.
Stem cells in fetal and adult hearts
Сердце обладает ограниченной врожденной регенеративной способностью. Поврежденные или больные кардиомиоциты удаляются в основном макрофагами и замещаются окружающей рубцовой тканью с плохой контрактильностью. В 2006 было впервые показано Kazutoshi Takahashi и Shinya Yamanaka83, что избыточная экспрессия лишь 4-х белков - OCT4, SOX2, Myc и KLF4 - в мышиных эмбриональных или взрослых фибробластах в культуре может генерировать плюрипотентные сходные со стволовыми клетки (see figure). Годом позднее та же самая группа84 и др. группа, руководимая James Thomson85, независимо успешно генерировали человеческие induced pluripotent stem (iPS) клетки из фибробластов взрослой кожи. Группа Thomson's использовала избыточную экспрессию OCT4 и SOX2 в комбинации с двумя др. белками, NANOG и Lin28, вместо Myc и KLF4. В обоих исследованиях iPS клетки обнаруживали важные характеристики ES клеток в терминах их морфологии, маркеров клеточной поверхности, профилей генной экспрессии и активности теломеразы. Более того, iPS клеточные клоны могли поддерживаться в культуре несколько месяцев, по крайней мере, и могли быть индуцированы к дифференцировке в разные производные из всех трех эмбриональных листков как in vitro, так и in vivo в мышиных тератомах. Реактивация Myc увеличивает туморогенность у химерных мышей, происходящих из iPS клеток, разработан модифицированный протокол, который не нуждается в активации Myc ни в мышиных, ни человеческих клетках86. Т.о., стала вполне осуществимой генерация iPS клеток из культуры фибробластов от пациентов (с генетическими дефектами, скорректированными, если необходимо) и эти клетки могут затем, в принципе, быть индуцированы к дифференцировке в различные специфичные для пациента типы клеток, благодаря трансплантации без риска иммунного отторжения (see figure).
Недавно, Jacob Hanna с коллегами87 осуществили проверку принципов лечения на базе iPS-клеток в комбинации с генетической репарацией на мышах, моделирующих серповидно-клеточную анемию, генетическое нарушение крови. Фибробласты кончика хвоста таких мышей были инфицированы 0CT4-, SOX2-, KLF4- и Myc-экспрессирующими вирусами, чтобы получить iPS клетки. (Myc копии были затем делетированы с использованием recombinase Cre.) Последующая гомологичная рекомбинация в iPS клетках и коррекция генетического дефекта с помощью человеческого варианта дикого типа устраняла мутантный фенотип; гематопоэтические клетки предшественники, которые происходили из этих клеток формировали агрегаты (известные как эмбриоидные тельца) в культуре и были способны устранять анемию у мышей после трансплантации и мыши вылечивались. Этот эксперимент явился безукоризненной комбинацией клеточной и генной терапии.
Эти эксперименты открывают завораживающие перспективы для лечения различных генетических заболеваний и др. аномалий, которые могут извлекать выгоду из базирующейся на клетках терапии. Однако от существующих методов генерации iPS клеток, которые нуждаются в генетической интеграции с помощью ретровирусов или лентивирусов или даже с помощью онкогенов, таких как Myc, по-видимому, следует отказаться86. Более того, в терминах трансплантации вопрос клеточной интеграции, жизнеспособности и надежности всё ещё не решен. Более непосредственное использование человеческих iPS клеток нуждается в создании человеческих моделей человеческих болезней in vitro для изучения лежащих в основе молекулярных механизмов болезни и для скрининга кандидатов лекарств и для оценки надежности лекарств и токсичности (see figure).
Инфаркт и др. существенные или долговременные повреждения могут приводить к сердечной недостаточности, которая является фатальной в течение 5 лет для 65% пациентов. Давно уже предполагалось, что причиной плохой регенерации взрослого сердца является отсутствие эндогенных клеток предшественников. В последние несколько лет, однако, идентифицированы клеточные популяции, экспрессирующие маркерные белки стволовых клеток, такие как Kit, stem-cell antigen 1 (SCA1) и multidrug resistance protein 1 (MDR1) в сердце человека и/или мышей (Box 2), хотя и в очень небольших количествах (see ref. 3 for a review).
Хотя первоначальные доказательства для популяции стволовых клеток взрослых или клеток предшественников во взрослом сердце, которые в принципе могли бы быть использованы для репарации сердца, были восприняты с энтузиазмом, но скептицизм рос. Эти Kit-экспрессирующие клетки в тканях паренхиматозных органов, включая сердце, как полагали, происходят из костного мозга в небольших количествах, чтобы избавиться от патогенных молекул в периферических тканях, как часть механизма, способствующего локальными врожденным иммунным реакциям
4. Они не являются действительными клетками сердца, а неуместными клетками костного мозга. Кроме того, большинство клеток, экспрессирующих Kit, которые были обнаружены в биоптатах сердца взрослых людей, как было недавно сообщено, ко-экспрессируют маркеры тучных клеток (клеток иммунной системы) и лишены экспрессии кардиального транскрипционного фактора NKX2-5 и islet 1 (Isll)5, критических маркеров для состояния кардиальных клеток предшественников в сердце плода
6,7. Эти клетки, следовательно, вовсе не являются клетками кардиальных предшественников. Отслеживание клонов
In vivo у мышей оказалось важным для решения вопроса о происхождении, характеристиках и судьбе этих Kit-экспрессирующих клеток, также как и др. экспрессируемых белков маркеров стволовых клеток во взрослом сердце и их способности вносить вклад в эндогенную репарацию.
Adult stem cells and transplantation into the heart
Идея, что определенные стволовые клетки могут трансдифференцироваться в типы клеток вне их обычных клонов возникла лишь недавно. В этих сообщениях генетически маркированные постнатальные клетки, инъецированные нетрансгенным животным хозяевам, были способны приобретать экспрессию ткане-специфических маркеров8. Первая очевидная трансдифференцировка клеток костного мозга в кардиомиоциты была описана вскоре после этого. Инъекция green fluorescent protein (GFP)-маркированных клеток костного мозга от мышей доноров в сердца взрослой мыши приводили к ко-экспрессии кардиальных белков и восстановлению функции сердца у мышей, которые страдали от инфаркта миокарда9. Учитывая неудовлетворенную клиническую потребность в терапии пациентов с инфарктом миокарда и сердечной недостаточностью, эта техника быстро стала применяться к пациентам и первые рандомизированные клинические испытания были завершены в течение 5 лет.
Когда большинство сообщений об результатах испытаний с клетками костного мозга стало доступно (see ref. 10 for a review), то осталось неясным, может ли этот подход давать какую-либо достоверную пользу. Хотя некоторые ранее не-контролируемые пилотные исследования были единогласно позитивными в отношении улучшения кардиальной функции, результаты последних рандомизированных контролируемых испытаний оказались неспособными давать тот же самый результат с неконтролируемыми и не рандомизированными исследованиями пациентов, особенно спустя длительное время. Пациенты, которые получали инъекции различных количеств клеток с разными клеточными функциями из их собственного костного мозга не увеличивали ни фракции выброса (фракции крови в (левом) желудочке, выбрасываемой во время одного сокращения) или это увеличение не превышало 5% (refs 11-14), минимальные изменение. необходимое для долговременного улучшения симптомов и выживаемости15,16. Напротив, параметры, такие как инфарктное ремоделирование16 и способность к упражнениям17, которые могли бы служить более надежными показателями долговременного улучшения, были позитивными после лечения клетками костного мозга, по крайней мере, в течение первых 4-6мес. Пациенты с очень крупными инфарктами обнаруживали большую пользу14,18.
Усилия по воспроизведению результатов более ранних исследований, которые были связаны с инъекциями клеток костного мозга мышам с инфарктом миокарда оказались неспособными подтвердить трансдифференцировку в качестве механизма. лежащего в основе кажущейся экспрессии кардиальных маркеров клетками костного мозга, но они показали, что клетки костного мозга могут сливаться с низкой частотой с кардиомиоцитами хозяина и экспрессировать оба набора маркеров19-21. Имеет ли место трансдифференцировка у людей, исследовать ещё труднее и это вряд ли необходимо. На оригинальные результаты могла также повлиять аутофлюоресценция рубцовой ткани и/или погибших клеток22. На сегодня консенсусом является то, что любое улучшение кардиальной функции после трансплантаций клеток костного мозга скорее всего является результатом сохранности ишемического миокарда (миокарда, лишенного кислорода) за счет паракринного действия трансплантированных клеток в противоположность увеличению количества контрактильных клеток путем замещения тех, что потеряны после повреждения. Эта гипотеза, что трансплантированные клетки секретируют факторы, благоприятствующие выживанию миоцитов и образованию кровеносных сосудов, подтверждается доказательствами исследований на грызунах и крупных млекопитающих, показавших индукцию неоваскуляризации и восстановление ишемического миокарда23,24 и физиологические преимущества без образования стабильных трансплантатов, содержащих трансплантированные клетки25-27. Было предположено, что приживление мультипотентных клеток (которые могут формировать многие типы клеток) , такие как мезенхимные стволовые клетки, может вносить риск образования нежелательных типов клеток in vivo. В одном сообщении описывается образование кости и хряща в сердце после трансплантации28, хотя это было объяснено внесением чужеродной ткани.
Когда стало очевидным, что функциональное улучшение не обязательно коррелирует с трансплантацией клеток, внимание было обращено на использование животных моделей для изучения механизмов, связанных с улучшением (see ref. 29 for a review). Многие типы клеток, происходящие из тканей, таких разнообразных как пуповинная кровь, жировая ткань и периферическая кровь, ведут себя одинаково с клетками костного мозга после инъекции непосредственно в сердце или перемещения к ишемическому сайту после внутривенных введений, а , следовательно, все описываемые улучшения функции сердца скорее всего обусловлены преимущественно за счет паракринных эффектов30. Напр., трансплантации мультипотенных клеток предшественников взрослых, культивируемых клеток, произошедших из популяции костного мозга, как показано, дифференцируются в производные всех зародышевых слоев (три клеточных слоя, которые дают все клетки взрослого тела) улучшают кардиальную функцию посредством высвобождения воспалительных и сосудистых факторов роста, опять же в отсутствие постоянно прикрепившихся клеток31. Thymosin-β 4 (малый актин-связывающий белок, который активирует integrin-сцепленную киназу и способствует миграции и жизнеспособности кардиальных клеток), как сообщалось , затрагивает миграцию и васкуляризацию за счет популяции эндогенных эпителиальных клеток предшественников в эпикарде человека32. Эти эпителиальные клетки оказывались эффективными в течение короткого времени как и др. в восстановлении функции после инфаркта, уменьшения дилятации камер сердца и увеличению фракции выброса у иммунодефицитных мышей, получивших такие клетки33. В этом контексте интересно. что спонтанная кардиальная регенерация у рыбок данио после удаления верхушки (самой нижней части сердца) инициируется за счет репрограммирования эпикарда, изменяющего свою судьбу и замещающего всю отсутствующую верхушку34.
Принимая всё это внимание, эти данные указывают на то, сердца после трансплантаций улучшаются многочисленными типами клеток, которые не сохраняются и не формируют кардиомиоцитов. Никаких неблагоприятных явлений у пациентов не было связано с собственно трансплантацией, так что сама процедура является безопасной. Поэтому, даже если польза от них кратковременна, они тем не менее ценны для пациентов. Понимание нижестоящих механизмов может помочь в очистке факторов, таких как количество клеток и тип клеток для опитимизации этих эффектов. Напротив, трансплантации клеток, которые не дают трансплантатов, могут быть не нужны, если паракринные эффекты могут быть воспроизведены применением секретируемых активных компонентов.
Во всех исследованиях выбор контроля для сравнения является критическим. (Table 1).
Myocytes and cardiac repair
Важной задачей остается использованию кардиомиоцитов для замещения функционального миокарда после кго повреждения. Это особенно важно для долговременного восстановления функции, чтобы предупредить или устранить сердечную недостаточность, которая и является основной целью кардиальной клеточной терапии. Вновь формируемые мышцы д. обеспечивать пассивную механическую поддержку, но что более важно, они д. соединяться и сокращаться синхронно с миокардом хозяина, чтобы быть эффективными и безопасными.
Лишь миоциты или клетки предшественников миоцитов, которые были исследованы клинически, являются только что выделенными скелетными миобластами. Они и были тестированы ранее на грызунах, моделирующих инфаркт миокарда, в основном тем же самым способом, что и не-кардиомиоциты, описанные выше. Клиническое использование скелетных миобластов, однако ограничено тем, что они улучшают фракцию выброса, т.к. миоциты, которые образуются не способны соединяться функционально с миокардом хозяина и могут даже вызывать аритмии (аномалии сердечного ритма)
35. Скелетные миобласты и миогенные родоначальники/предшественники обычно обеспечивают развитие и регенерацию скелетных мышц
36. Недавнее исследование показало, однако, что скелетные миобласты могут быть преобразованы. чтобы экспрессировать белок щелевых соединений connexin 43 (ref. 37). Эта модификация улучшает электрическое купирование между областью инфаркта и окружающим миокардом. Сходные подходы были предложены для управления кардиомиоцитами в направлении электрофизиологического созревания
38, хотя это также может быть не выгодным для внутри миокардиальных трансплантаций, т.к. (незрелые) фетальные миоциты выживают лучше после инъекции, чем взрослые кардиомиоциты
39. А это, по-видимому, является важным, чтобы трансплантированные клетки были мышечными клетками, а не миофибробластами, которые могут вызывать эктопическую электрическую активность, увеличивая риск аритмии
40.
Human ES cells as a source of cardiomyocytes
Из всех источников стволовых клеток человеческие ES клетки наиболее многообещающие для обеспечения кардиальной регенерации путем замещения кардиомиоцитов благодаря своей способности эффективно подвергаться непосредственной дифференцировке в подлинные кардиомиоциты и поддерживающие кардиальные клетки41-43 in vitro. Эти получаемые in virro клетки были хорошо охарактеризованы44-49.
Первые сообщения о трансплантации производных ES клеток кардиомиоцитов у свиней и морских свинок продемонстрировали их потенциал функционировать как биологические водители ритма в электрофизиологически молчащих или AV-блокируемых сердцах, в которых проводимость между предсердиями и желудочками блокирована50,51. Эти эксперименты требуют относительно немногих кардиомиоцитов. произошедших из ES-клеток (лишь сотни) , чтобы осуществить свой эффект. Недавние успехи в генерации больших количеств (миллионы) кардиомиоцитов из ES клеток у человека указывают на то, что теперь возможно изучение их регенеративного потенциала. После трансплантации в здоровый миокард иммунодефицитных крыс или мышей человеческие производные ES кардиомиоциты выживают22,52,53 и созревают22,53 в течении 12 недель22. Во всех подобных исследованиях смеси кардиомиоцитов и др. дифференцированных производных ES клеток инъецировали в сердце. Где это были исследовано детально, то было показано, что преимущественно выживают кардиомиоциты по сравнению с не-кардиомиоцитами, последние со временем теряются и не обнаруживаются где-либо в др. органах. Хотя трансплантированные клетки формируют синцитий или соединяют сердечную ткань др. с др.. они обычно отделены от миокарда грызунов слоем фибротической ткани. Уменьшение секреции белков внеклеточного матрикса, которые формируют основу фибротической ткани , по-видимому, важно для облегчения собственно электрического купирования, т.к. присутствие фибротических участков является основным фактором риска аритмий. В этой связи необходимо отметить. что трансплантируемые клетки сами по себе вносят вклад в свою изоляцию, секретируя определенные компоненты внеклеточного матрикса (Fig. 2).
будучи трансплантированными в инфарктное сердце человеческие кардиомиоциты. производные ES клеток являются единственными клетками, которые формируют трансплантат, видимый невооруженным глазом (Fig. 2), хотя в одном из исследований это зависело от добавления способствующего выживанию коктейля54, смеси белков, которые защищали кардиомиоциты от гибели после трансплантации. Кардиальная функция улучшалась спустя 4 недели после трансплантации у мышей, получивших человеческие кардиомиоциты, производные ES клеток22,54,55. Однако грызуны, получавшие человеческие клетки, производные ES, без кардиомиоцитов, также обнаруживали некоторое улучшение по сравнению с животными. получавшими только жидкость, в которой клетки обычно находились в суспензии. Следовательно, специфичное для кардиомиоцитов улучшение обнаруживается и для клеток не-кардиомиоцитного типа, но при использовании кардимиоцитов эффект был значительно выше. в
Только в одном исследовании проведен такой расширенный анализ функции сердца после трансплантации человеческих ES клеток спустя 12 недель у мышей (Table 1). На этой временной точке польза от получения кардиомиоцитов, произошедших из ES клеток человека (в сравнении с не-кардиомиоцитами) более не обнаруживалась22, хотя она была всё ещё более высокой по сравнению с контролем. Функциональное улучшение с помощью кардиомиоцитов. полученных из ES клеток человека вместе с современными стратегиями может быть т. о., ограничено средними сроками в большинстве, эквивалентными вообще-то нескольким мес. у людей и пока нет доказательств, что лежащий в основе механизм зависит от контрактильных свойств трансплантированных клеток. Паракринный механизм, который был предположен для стволовых клеток взрослых может быть также приложим к человеческим кардиомиоцитам, происходящим из ES клеток. параметры. которые оправдывают дальнейшие исследования, включают пути для ограничения образования внеклеточного матрикса вокруг трансплантата и пути, позволяющие более поздние инъекции клеток, напр., после инициальной воспалительной фазы, когда среда может быть более пригодной для донорских клеток. Наличие расхождения между среднесрочными и долгосрочными результатами и зависимость исходов от определенного контроля говорит за тщательную переоценку описанных улучшений с любым типом клеток56.
Важной в оценке функции человеческих кардиомиоцитов у грызунов является различие в их врожденной частоте сокращений. Человеческие кардиомиоциты сокращаются 60-100 раз в мин., а трансплантируются в сердце грызунов, сокращающееся 300-600 раз в мин. Безуспешность купирования, как демонстрируется с помощью наблюдения за внутриклеточным кальцием57,58, может вносить вклад в улучшение долговременной кардиальной функции. Напротив, продолжительные периоды тахикардии (быстрые биения сердца) в результате купирования человеческих кардиомиоцитов, происходящих из ES клеток, с кардиальными клетками хозяина могут вызывать кардиальную дисфункцию. Эксперименты на крупных животных, таких как свиньи или приматы с более низкой частотой сокращений сердца необходимы для решения этого вопроса. Это д. быть преимущественно ES от того же самого вида или производные iPS клеток, которые д. быть аутологичны (Box 1). Исследования на крупных животных одновременно д. быть использованы для оценки риска образования опухолей человеческими ES клетками и iPS клетками, т.к. это может зависеть от вида59.
Хотя клинические исследования с использованием клеток из разных источников для трансплантации активно проводятся, ясно, что многие базовые вопросы остаются нерешенными. Далеки от понимания механические основы потенциальных благоприятных эффектов, наилучшие типы клеток для каждого использования (напр., при остром инфаркте миокарда в противоположность хронической сердечной недостаточности), время клеточной терапии и методы доставки в большинстве случаев всё ещё не определены. Тканевая инженерия
60-62, комбинация клеток ткани с искусственными или природными каркасами (scaffolds), или внутримиокардиальные инъекции клеточных типов (таких как кардиомиоциты и ангиогенные клетки) по-видимому, более подходящие, чем внутрикоронарные инъекции автономных (single-cell) суспензий, т.к. последние требуют высокой корректности и могут вызывать микроинфаркты
63.
Transplanting differentiated non-cardiomyocytes
Интеграция трансплантатов в ткань хозяина нуждается в формировании сосудов для снабжения кислородом и питательными веществами. Shulamit Levenberg с коллегами43 заставляли ES клетки человека дифференцироватться в эндотелиальные клетки, изолируя их с помощью антител, специфических к platelet endothelial cell-adhesion molecule 1 и продемонстрировали их способность формировать сосудо-подобные структуры после подкожных трансплантаций в подверженную разрушению scaffold у мышей. Мышиные кровяные клетки затем были установлены в некоторых человеческих кровеносных сосудах, что указывает на образование анастомозов или формирование соединений между микрососудами мышей и человека. Такая интеграция человеческих кровеносных сосудов с кровообращением хозяина наблюдалась и в др. исследованиях с использованием человеческих эндотелиальных клеток и гладкомышечных клеток, происходящих из ES клеток41,64, даже спустя 5 мес. после трансплантации64. В модели ишемии нижних конечностей у мышей, повышенное количество капилляров и улучшение перфузии (кровотока) также наблюдалось спустя 2 и 4 недели спустя после трансплантации человеческих эндотелиальных клеток, происходящих из ES клеток65,66 или эндотелиальных и гладкомышечных клеток вместе67. Трансплантация гемангиобластов, происходящих из человеческих ES клеток дает гематопоэтические клетки, а также эндотелиальные клетки и вносит вклад в репарацию поврежденных сосудов68. Человеческие ES клетки , как было показано. формируют также клетки, которые сходны с гематопоэтическими стволовыми клетками со способностью формировать клетки гематопоэтического клона69,70.
Сосудистые клетки важны для репарации миокарда по двум причинам. Во-первых, неоваскуляризация защищает кардиомиоциты, окружающие инфаркт, помогая сохранить кардиальную функцию. Мыши с мутантным transforming growth factor-β рецепторным геном, endoglin, характеризуются дефектами моноядерных клеток, страдают от нарушений васкуляризации и кардиальной функции после инфаркта миокарда. Дефекты могут быть устранены за счет внутривенных инъекций здоровых донорских моноядерных клеток от пациентов с той же самой генной мутацией
71. Эти данные указывают на то, что пациенты с сердечными заболеваниями и родственными сосудистыми нарушениями, чьи моноядерные клетки и эндотелиальные клетки предшественники часто имеют нарушенную функцию и могут получать пользу от трансплантаций здоровых эндотелиальных клеток или из подобранных гетерологичных человеческих ES клеток или из аутологичных эндотелиальных клеток предшественников. Во-вторых, трансплантированные кардиомиоциты сами по себе нуждаются в дополнительном кровоснабжении, особенно, если фиброз имеет тенденцию изолировать трансплантат от сосудистой системы хозяина. Трансплантируемые совместно сосудистые клетки, т.о., помогают соединять трансплантат с существующей сосудистой сетью. Альтернативно, bi-potent или tri-potent клетки кардиальных предшественников (Box 2) из человеческих ES клеток или сердца плода или взрослого могут быть способны формировать кардиомиоциты, гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки
in situ.
Transplanting differentiated human ES cells into other tissues
ЦНС является ещё одной тканью, которая используется для разработки клеточно-трансплантационной терапии. Одной из причин этому является то, что нейральная дифференцировка человеческих ES клеток относительно несложная. Большинство ES клеточных линий спонтанно дифференцируются в нейроны, если растут в отсутствие поддерживающих питающих фибробластов, обычно присутствующих, чтобы поддерживать рост и ингибировать дифференцировку. Более того, одинаково с кардиомиоцитами зрелые нейроны являются терминально дифференцированными клетками, которые не могут пролиферировать и замещать погибшие или нефункционирующие клетки в ЦНС. Потеря одиночного или множественных типов нервных клеток вызывает широкий круг нейрологических нарушений, таких как повреждения спинного мозга, болезнь Паркинсона (при которой происходит потеря нейронов, которые продуцируют нейротрансмиттер dopamine), боковом амиотрофическом склерозе ( болезни Lou Gehrig's, ищзветсной также как болезнь моторных нейронов), болезнь Гентингтона (генетическое нарушение, которое ведет к гибели нейрональных клеток) и связанная с возрастом макулярная дегенерация (болезнь, приводящая к слепоте). Эти болезни, как полагают, являются хорошими кандидатами для клеточной трансплантационной терапии. Как и в случае клеточной терапии сердечно-сосудистых болезней, долговременное выживание, функциональная интеграция и физиологическая совместимость трансплантируемых клеток являются важными параметрами для успешного лечения. Некоторые исследования показали долговременное (более 3-х мес.) выживание трансплантированных нейронов, происходящих из ES клеток человека. или клеток нейрональных предшественников, в особенности на моделях грызунов болезни Паркинсона, хотя количества клеток были низкими и функциональное восстановление были лишь частичным. Лечение нейрологических нарушений клетками. происходящими из ES клеток человека и из др. источников, включая нейральные стволовые клетки или клетки предшественники из мозга плода, описаны в др.месте72.
Функциональная интеграция трансплантированных клеток с тканью хозяина не обязательна для лечения некоторых болезней, таких как печеночные болезни и диабет, последний из которых характеризуется потерей инсулин-продуцирующих панкреатических β -rktnjr (type 1 diabetes) или пониженной чувствительностью к инсулину (type 2 diabetes). Эффективное кровоснабжение и в случае панкреатических клеток, высвобождение инсулина в ответ на глюкозу, может быть достаточным для лечения болезни. Трансплантации панкреатических клеток, проиходящих из ES клеток человека в субкапсулярное пространство почек у streptozotocin-обработанных диабетических мышей снижает уровень глюкозы в крови и увеличивает вес тела. При удалении трансплантата эти дефекты возвращаются
73. Это исследование подтверждает идею, что трансплантированные панкреатические клетки не нуждаются в интеграции с панкреатической тканью, чтобы быть функциональными.
Towards the future
In the years immediately after the first derivation of human ES cells, research focused on optimizing differentiation protocols for the cell type of choice, but more recently the focus has shifted towards transplantation therapies. Advances in the generation of iPS cells will probably prompt a further increase in the number of transplantation studies. However, for successful translation from experimental studies to clinical trials, many problems have to be solved. In particular, in conditions where multiple cell types have to be replaced and functional integration is necessary, we can learn valuable lessons from transplantation studies in the heart. It has become clear that restoration of heart function by replacing myocardium requires long-term integration and establishment of functional connections with the host tissue, in all cases using multiple controls that include non-functional cells, cell-free solution in which cells are normally suspended, immunosuppression alone and mock injections.
Animal experiments should include strategies to prove that transplanted cells actually cause the effect observed. These could be through inclusion of constructs that contain conditionally expressed suicide genes. These could be activated after their function has been restored with the expectation that the functional benefit would be reversed. Alternatively, in specific situations, grafted tissue could be removed after recovery, as was done in the transplantation of pancreatic cells73. Most transplantation studies have used single-cell suspensions or small groups of cells. This is generally accompanied by extensive cell death and inadequate integration. Particularly in a hostile immunoreactive, ischaemic or necrotic environment, survival of the grafted tissue is a major challenge. Instead of direct injection of cells into the site of injury or disease, an alternative delivery method could be to seed cells ex vivo on a biodegradable polymeric scaffold, followed by in vivo engraftment. Three-dimensional multicellular culture systems may also have the advantage of supporting cell proliferation, maturation and organization of cells more effectively. The disease or injury in question will probably determine whether injection of cells or grafting tissue-engineered constructs is the preferred choice67.
In addition to improving delivery methods, it will be important that, despite recent advances, further progress is made in refining effective differentiation protocols that yield highly purified cell populations for transplantation. This could best be achieved by cell sorting using cell-type-specific membrane markers, although genetic methods using cell-type-specific promoter constructs driving, for example, GFP74-76 or selected survival by antibiotic resistance could be alternatives for some purposes. As well as increasing the density of the cell type of interest at the site of transplantation, the use of highly purified populations will also minimize the chance of co-transplanting contaminating undifferentiated stem cells and hence reduce the risk of developing a teratoma. Furthermore, the optimal differentiation state of cells for successful transplantation remains to be determined. To this end, lineage-specific and cell-type-specific promoters could be used to select progenitor cells or more differentiated cells for comparison of effectiveness and safety in animal models. Approaches to identifying embryonic progenitor cells in mice6,7 may be applied to ES cells and may help to uncover new ways to isolate human ES cells and human iPS cells cleanly. Additional work in mouse ES cells will clearly be required before human ES-cell-based therapy can be launched in the clinic.
In general, mature cells have a lower proliferation rate and a lower survival rate after transplantation than progenitor cells. In addition, the microenvironment of transplanted cells often provides cues for further differentiation into mature cells. These issues need to be elaborated in future transplantation studies, which will lead to fine-tuning of transplantation therapy and eventually to repair of diseased or damaged organs.
