В 14-килобаз кодирующая последовательность - мРНК человеческого гена дистрофина (DMD) состоит из 79 экзонов, простирающихся на 2,4 мегабазы (2,4 миллиона оснований - 2,4 centimorgan) Х-хромосомы человека, что составляет около 0,1% генома человека [Koenig et al. 1987; Gherardi et al. 2017]. Соответствующий белок, дистрофин, состоит из 3685 аминокислот (аа) с относительной молекулярной массой 427 кДа и содержит четыре домена: N-концевой домен (экзоны 2-8 - аа 14-240), стержневой домен (экзоны 8-61 - аа 253-3040), богатый цистеином домен (экзоны 63-69 - aa 3080-3360) и С-концевой домен (экзоны 70-79 - aa 3361-3685). Дистрофин - мембран-связанный белок, необходимый для поддержания структуры и функций мышц и функции. Функции дистрофина включают сбор и стабилизацию дистрофинового гликопротеинового комплекса (DGC) для соединения актинового цитоскелета с внеклеточным матриксом сарколеммы мышечного волокна [Young et al. 2017]. Отсутствие функционального дистрофина приводит к нарушению гомеостаза кальция, хроническому воспалению, прогрессирующему фиброзу, истощению мышечных стволовых клеток³, дегенерации мышц и накоплению жировой ткани в мышцах. И наоборот, отсутствие миостатина или его рецептора активина IIB увеличивает мышечную и костную массу [Saad 2020], это указывает на его потенциал для генотерапии DMD Аналогично, избыточная экспрессия антагониста миостатина (фоллистатина) может увеличить мышечную массу и силу [Rodino-Klapac et al. 2009]. Мышечная дистрофия Дюшенна Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD и мышечная дистрофия Беккера ((BMD) - это аллельные Х-сцепленные рецессивные нервно-мышечные заболевания, поражающие как скелетные, так и сердечные мышцы. Таким образом, благодаря единственной Х-хромосоме, больные мальчики получают патогенные генные мутации от своих не знающих об этом матерей-носителей. В то время как DMD является неизлечимым смертельным заболеванием, его аллельный вариант (BMD) представляет собой относительно более легкую форму заболевания. Внутри-генные изменения в гене дистрофина вызывают как мышечную дистрофию Дюшенна, так и мышечную дистрофию Беккера. На сегодняшний день известно более 7000 внутри-генных изменений в гене дистрофина [Bladen et al. 2015]. Эти внутри-генные изменения включают экзонные делеции, экзонные дупликации и точечные мутации. Точечные мутации представляют собой внутри-экзонные вставки или делеции (Indels) из нескольких нуклеотидов, нуклеотидные замены, и изменения последовательности сайтов сплайсинга, которые упраздняют реальные сайты сплайсинга или создают эктопические сайты сплайсинга.

Экзонные делеции составляют около 65% [Koenig et al. 1989; Love et al. 1991; Tuffery-Giraud et al. 2009; Bladen et al. 2015], экзонные дупликации составляют около 10 % [Love et al. 1991; Mostacciuolo et al. 1993; Galvani et al. 1994], а остальные 25 % представляют собой точечные мутации гена дистрофина. Несмотря на трудности, связанные с огромным размером гена дистрофина, выявление точечных мутаций привлекло большое внимание - поиск единственного изменения основания в 2,4 миллионах оснований. Поэтому несколько групп по всему миру решили исследовать ДНК больных DMD у которых в гене дистрофина не обнаружено ни экзонных делеций, ни дупликаций [Roberts et al. 1992; Kilimann et al. 1992; Saad et al. 1992, Link et al. 1993; Prior et al. 1993; Saad et al. 1993; Wilton et al. 1993; Saad et al. 1994; Tuffery et al. 1996; Lasa et al. 1997; Saad et al. 1997; Sitnik et al. 1997; Cau et al. 1998; Saad et al. 1998; Ikezawa et al. 1999; Ginjaar et al. 2000; Percesepe et al. 2005; Baskin et al. 2009; Zhu et al. 2013; Todeschini et al. 2016; Jiang et al. 2018; Wang et al. 2020; Zimowski et al. 2021]. Большинство пациентов с DMD и BMD имеют либо сдвиг рамки считывания, либо делецию внутри рамки одного или нескольких экзонов, соответственно [Monaco et al. 1988; Koenig et al. 1989; Aartsma-Rus et al. 2006]. Мутации со сдвигом рамки создают преждевременные стоп-кодоны и усеченные не функциональные фрагменты дистрофина. Существует два мутационных очага в гене дистрофина - проксимальный расположен между экзонами 3 и 9, и дистальная - между экзонами 45 и 55 [Echigoya et al. 2018]. ⁴

Кластеризованные, регулярно чередующиеся, короткие палиндромные повторы (CRISPR) вместе с CRISPR-ассоциированным белком - CRISPR/Cas [Cencic et al. 2014] - это новая методика редактирования генов. Технология редактирования генов включает в себя CRISPR/Cas [Gilbert et al. 2013], редакторы оснований [Eid et al. 2018; Gapinske et al. 2018], и прайм-редакторы [Anzalone et al. 2019; Chen et al. 2021]. Технология редактирования генов произвела революцию в области терапевтического редактирования генов. Малая направляющая РНК (sgRNA) направляет нуклеазу Cas в точное место последовательности ДНК, где Cas9 никаза перерезает противоположную нить ДНК рядом с protospacer adjacent motif (PAM - NGG). Вырезка (nick) открывает 3' праймер ДНК и гибридизуется с праймер-связывающим сайтом в pegRNA, что позволяет транскрибировать шаблон RT и записать генетическое сообщение в геном. Hotta и его коллеги продемонстрировали способность CRISPR/Cas9 исправлять делеции со сдвигом рамки и нонсенс-мутации гена дистрофина в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках пациентов (iPSC) [Li et al, 2015; Ousterout et al. 2015]. В этом обзоре мы освещаем современные возможности генотерапии мышечной дистрофии Дюшенна.

Стандартным лечением мышечной дистрофии Дюшенна является терапия кортикостероидами, направленная на купирование симптомов и замедление прогрессирования заболевания, что обусловлено их мощным противовоспалительным действием [Kourakis et al. 2021]. Кортикостероиды (prednisone/prednisolone и deflazacort) на некоторое время стабилизируют мышечную силу [Angelini 2007]. Большинство нерандомизированных клинических исследований доказывает положительное влияние кортикостероидов на мышечную силу и продолжительность ходьбы у пациентов с DMD [Shah 2008].

Рандомизированные контролируемые исследования показывают, что лечение пациентов с DMD кортикостероидами обеспечивает краткосрочное улучшение мышечной силы и функций [Manzur et al. 2008; Matthews et al. 2016]. Schreiber и коллеги сообщили, что кортикостероиды оказывают длительное, адекватное и достоверное влияние на силу мышц в течение периода от 6 месяцев до 2 лет после начала терапии [Schreiber et al.2018]. Однако, Buckon и коллеги сообщили, что терапия кортикостероидами молодых мальчиков с DMD не уменьшила мышечную слабость. Хотя терапия кортикостероидами мальчиков старшего возраста улучшает мышечную силу и подвижность [Buckon et al. 2016]. Недавно Merlini и коллеги сообщили, что кортикостероидная терапия увеличивает подвижность мальчиков с DMD [Merlini et al. 2020].

Хотя глюкокортикоиды вызывают остеопороз, они широко используются для лечения различных заболеваний, включая DMD [Saad 2020]. Например, такие глюкокортикоиды, как преднизолон негативно влияют на клетки костной ткани, подавляя дифференцировку остеобластов [Pereira et al. 2002], увеличивая апоптоз остеобластов и остеоцитов [Weinstein et al. 1998; Dallas et al. 2013; Mirza & Canalis 2015], а также вызывают резорбцию костной ткани [Hofbauer et al. 1999], это может привести к потере костной ткани и повышению риска переломов костей [Van Staa et al. 2000]. Кроме того, глюкокортикоиды направляют мезенхимные стволовые клетки на адипогенез, а не на путь остеогенеза [Pereira et al.2002].

Как и при любом другом моногенном мышечном заболевании, существующая фармакологическая терапия DMD носит паллиативный характер, которая направлена на устранение симптомов, а не генетической причины заболевания. Несмотря на обширные до-клинические исследования, до сих пор не удалось разработать преобразующую фармакологическую терапию, способную компенсировать потерю дистрофина в мышцах, оказалась трудно достижимой, в результате чего пациенты с DMD остаются без эффективной терапии [Guiraud & Davies 2017].

Вирусные системы доставки являются распространенными средствами доставки наборов CRISPR/Cas в генотерапии DMD. Формами доставки Cas9/sgRNA являются ДНК/ДНК, мРНК/sgRNA или белок/sgRNA. Для постнатального редактирования генов необходима эффективная система доставки груза отредактированных генов (Cas9 и sgRNA). Адено-ассоциированные вирусные (AAV) векторы имеют преимущество перед лентивирусными и аденовирусными векторами для доставки терапевтических грузов, что обусловлено их эписомальной природой, минимальным риском интеграции, длительной экспрессией трансгенов, низкой иммуногенностью и незначительной генотоксичностью. Поэтому AAV-векторы являются предпочтительным инструментом для доставки CRISPR/Cas9-грузов у пациентов с DMD [Zhang et al. 2020]. Однако небольшая грузовая емкость AAV-векторов (4,7 кб) является недостатком. Тем не менее, они по-прежнему подходят для доставки Cas9 (4,2 кб) [Yang et al. 2016]. Двойная система AAV является полезным средством для доставки более крупных грузов [Yang et al. 2016; Chemello et al. 2021] в конкретные органы. Некоторые AAV обладают тропизмом к мышцам, например серотипы 1, 6, 7, 8, 9, rh10 и rh74, которые представляют собой эффективные средства доставки CRISPR для постнатального редактирования генов при мышечных заболеваниях [Lau & Suh 2017; Wang et al. 2017]. В мае 2019 года Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) одобрило Zolgensma в качестве терапии с помощью AAV имплантации генов для лечения детей в возрасте до двух лет со спинальной мышечной атрофией [Mendell et al. 2017].

Липидные и золотые наночастицы - это не вирусные системы доставки, которые используют различные формы, такие как ДНК, мРНК или рибонуклеопротеин для доставки Cas9 и sgRNAs in vivo. Не вирусная система переноса генов обладает такими преимуществами, как гибкость и безопасность [Cotten &Wagner 1993]. С тех пор как тридцать лет назад впервые были описаны не вирусные векторы доставки, было предпринято несколько попыток создать не вирусные векторы для DMD генотерапии [Yang et al. 2009, Schatzlein 2001; Kim et al. 2014; Zuris et al. 2015; Xu et al. 2016; Lee et al. 2017]. Безусловно, благодаря своей безопасности не вирусная система доставки имеет большие перспективы для генотерапии DMD

Пропуск экзонов приводит к образованию короткого, но полуфункционального белкового фрагмента путем целенаправленного воздействия на предшественника мРНК (пре-мРНК) для ремонта, позволяя пропустить один или несколько экзонов, чтобы восстановить трансляционную открытую рамку считывания (ORF) мРНК дистрофина, это опирается на маскирование, изменение специфических сайтов сплайсинга олигонуклеотидов, переключающих сплайсинг, или удаления определенных экзонов с помощью технология редактирования генов CRISPR/Cas. Теоретически, пропуск экзонов может быть связан с 81% всех мутаций DMD с 91% точечных мутаций, 73% дупликаций экзонов и 79% делеций экзонов [Aartsma-Rus et al. 2009]. В то время как пропуск нескольких экзонов может восстановить ORF примерно у 90% пациентов с DMD [Yokota et al. 2007], пропуск одного экзона может восстановить ORF примерно у 70% пациентов с DMD особенно у пациентов с DMD с делециями в стержневом домене [Aartsma-Rus et al. 2009]. Метод пропуска одного экзона является чрезвычайно мутационно-специфической терапией и, следовательно, является персонализированным генетическим лекарством.

Single exon skipping: Универсальная последовательность сайта акцептора сплайсинга NAG, являющаяся PAM-последовательностью SpCas9, облегчает доставку Cas9 к акцепторному сайту сплайсинга любого экзона. Восстановление Cas-генерированных двунитевых разрывов ДНК (DSBs) посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) создает indels, которые выгрызают/удаляют сайт акцептора сплайсинга, что приводит к эксцизии этого экзона [Min et al. 2019]. На рисунке 1 показаны домены дистрофина человека, сплайсинг экзонов и трансляционная совместимость ORF. Компания Astellas Gene Therapies разрабатывает препараты AT702, AT751 и AT753 антисмысловые олигонуклеотиды (ASOs), направленные на эксцизию экзонов 2, 51 и 53 соответственно (AT702, AT751 и AT753 - - Duchenne Muscular Dystrophy - Astellas Gene Therapies), что должно помочь пациентам с DMD имеющим эти экзонные дупликации/делеции со сдвигом рамки считывания. Aartsma-Rus с коллегами нацелились на вырезание экзонов 47 и 57 по отдельности [AartsmaRus et al. 2006].

Пропуск экзонов с помощью CRISPR/Cas9 с использованием одной sgRNA для уничтожения либо акцепторного сайта сплайсинга, либо донорного сайта сплайсинга экзона со сдвигом рамки считывания более эффективен. sgRNA должна направлять Cas9, чтобы разжевать сайт акцептора сплайсинга или сайт донора сплайсинга, что приведет к сплайсингу следующего доступного экзона и к вырезанию экзона со сдвигом рамки. Например, делеция экзона 50 со сдвигом рамки приводит к сплайсингу экзона 49 - 51. Одна sgRNA, нацеленная на сайт акцептора сплайсинга экзона 51, приведет к пропуску экзона 51, восстановлению экспрессии дистрофина и функций мышц [Amoasii et al. 2017; Amoasii et al. 2018]. На данный момент существует 31 клиническое исследование, посвященное пропуску одного экзона гена дистрофина (ClinicalTrials.gov).

Пропуск экзона 51 восстанавливает ORF в миобластах, полученных от человека с DMD и несущих делецию экзонов 48-50 или 45-50 [Incitti et al. 2010, Cirak et al. 2012]. Пропуск экзона 23 с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на границу экзона и интрона, недавно описан Novak et al.[2021]. Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США ускорило одобрение четырех morpholino-based oligonucleotides (MOs), пропускающих экзоны для генотерапии DMD [Novak et al. 2021]. Эти МОs являются Casimersen для экзона 45, Eteplirsen для экзона 51, Golodirsen для экзона 53 (Sarepta Therapeutics) и Viltolarsen для экзона 53 (NS Pharma). FDA (fda.gov) одобрило антисмысловые олигонуклеотиды для пропуска экзонов 45, 51 и 53, включая Amondys 45 (casimersen), Exondys 51 (eteplirsen) и Vyondys 53 (golodirsen) компании Sarepta Therapeutics. Пропуск одного экзона дистрофина должен принести пользу 60 % пациентов с DMD [Flanigan et al. 2009]. Одновременный двойной пропуск экзонов генов дистрофина и миостатина был зарегистрирован десять лет назад [Kemaladewi et al. 2011; Malerba et al. 2012].

Multiexons skipping: В то время как пропуск одного экзона является простым, пропуск двух или нескольких экзонов является технически сложной задачей, и современные правила одобрения лекарств FDA и EMA (Европейское агентство по лекарственным средствам) ставят этот подход под сомнение [Aoki et al. 2013]. Компания MyoGen Bio разрабатывает препарат Myo45-55 для удаления экзонов с 45 по 55 путем редактирования генов (MyoGene Bio LLC Our Products), которые кодируют центральный стержневой домен белка дистрофина [Flanigan et al. 2009]. Компания Saad Pharmaceuticals разрабатывает новые фармакофоры (SRx-0309 и SRx-4555) для мостиков между экзонами 2 и 10 и экзонами 44 и 56 соответственно. Эти фармакофоры должны восстановить ORF дистрофина примерно у 7% и 63% пациентов с DMD соответственно [Beroud et al. 2007; Flanigan et al. 2009; Echigoya et al. 2018]. Помимо высокой концентрации креатинкиназы (КК) в сыворотке крови у пациентов с (BMD с делецией экзонов 45-55 помимо высокой концентрации креатинкиназы (КК) в сыворотке крови наблюдается поражение сердца, но нет очевидной слабости скелетных мышц после более чем десятилетнего наблюдения [Yazaki et al. 1999; Nakamura et al. 2008; Nakamura et al. 2017]; однако кардиологические проблемы поддавались лечению с помощью фармакологическими препаратами. Пациенты с делециями экзонов 45-55 или 3-9 сохраняли подвижность до 60-70 лет [Heald et al. 1994; Beroud et al. 2007; Ferreiro et al. 2009; Anthony et al. 2011; van den Bergen et al. 2014; Taglia et al. 2015; Nakamura et al. 2016; Nakamura et al. 2017; Mori-Yoshimura et al. 2018]. Кроме того, как и у пациентов с BMD, имеющих экзоны 45-55, исследования на мышиных моделях показали, что функция мышиного дистрофина, лишенного экзонов 45-55 практически не отличается от функции полноразмерного дистрофина [Tanihata et al. 2018].

Gersbach и его коллеги использовали генное редактирование CRISPR/Cas9 для вставки/удаления нуклеотидов (indels) внутри экзонов (рефрейминг экзонов) или вырезания одного или нескольких экзонов в дистальной мутационной части (экзоны 45-55) гена дистрофина. Пропуск нескольких экзонов для обхода этой широкой делеция соединяет экзоны с 44 по 56 и восстанавливает ORF у 62 % пациентов с DMD [Flanigan et al. 2009; Ousterout et al. 2015]. Стратегии пропуска экзонов также являются жизнеспособным вариантом исправления экзонных дупликаций, которые встречаются примерно у 10 % пациентов с DMD. Исключение одного или нескольких дублированных экзонов может восстановить открытую рамку считывания мРНК дистрофина и привести к образованию полноразмерного белка дистрофина [Long et al. 2018].

Пропуск экзонов с помощью комбинации антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на один или несколько экзонов, является обнадеживающим. Aartsma-Rus и коллеги нацелились на экзоны 45 - 51, экзоны 17 - 51, экзоны 42 - 55 и экзоны 45 - 59 для пропуска нескольких экзонов [Aartsma-Rus et al. 2006]. CRISPR/Cas9 редактирование генов эффективно для пропуска области экзонов 45-55 дистрофина из генома гуманизированной мыши для DMD [Young et al. 2017], а также для восстановления ORF в iPSCs DMD [Ousterout et al. 2015]. Пропуск нескольких экзонов может восстановить ORF транскрипта дистрофина у пациентов, несущих экзонные делеции в пределах мутационных очагов (рис. 2 и 3). Однако, пропуск экзонов с помощью ASO изменяет мРНК дистрофина, а не ДНК, в которой находится основная мутацию гена. Таким образом, требуется длительное применение терапии.

CRISPR/Cas9: эндонуклеаза SpCas9 гибридизуется с sgRNA в геномной последовательности целевой ДНК и разрезает последовательности ДНК и разрезает ДНК, прилегающую к мотиву примыкания протоспейсера (PAM) - NGG [Jinek et al. 2012; Cong et al. 2013; Mali et al. 2013]. Редактирование с помощью CRISPR/Cas9 открывает большие перспективы для исправления мутаций, вызывающих генетические заболевания, в том числе DMD [Mendell & Rodino-Klapac 2016]. Первое использование редактирования генов CRISPR/Cas9 для исправления гена дистрофина в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (IPSCs) пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна было достигнуто в 2015 году Hotta и коллеги [Li et al. 2015]. В том же году Gersbach и коллеги использовали мультиплексный CRISPR/Cas9 для восстановления ORF дистрофина после экзонных делеций в экзонах 45 и 55 путем введения indels внутрь экзонов (рефрейминг экзонов) или исключения одного или нескольких экзонов [Ousterout et al. 2015]. Три доклада в журнале Science свидетельствуют о больших перспективах редактирования генов дистрофина в клинической практике [Long et al. 2016; Nelson et al. 2016; Tabebordbar et al. 2016]. Кроме того, в этих исследованиях представлены доказательства отсутствия вне-целевого редактирования генов или генотоксичности в клинической практике. Эти исследования также демонстрируют возможности редактирования генов CRISPR/Cas9 для обхода точечной мутации в экзоне 23 мышей mdx, которая в противном случае создает преждевременный стоп-кодон и усеченный не функциональный дистрофин. Хотя доказательство концепции уже получено, путь к клиническому применению проходит медленно. Существует 330 клинических испытаний терапии мышечной дистрофии Дюшенна (ClinicalTrials.gov); тем не менее, нет ни одного клинического исследования по коррекции мутаций DMD с помощью редактирования генов CRISPR.

Base Editors: Редакторы оснований состоят из трех компонентов: каталитически ослабленной нуклеазы Cas (мертвая Cas - dCas), слитая с белком деаминазы, и sgRNA, позволяющая осуществлять точные преобразования одной пары оснований в пределах пятинуклеотидного окна редактирования, локализованного между 12 и 16 участками вверх по течению (от - 12 до -16) PAM [Rees & Liu 2018]. В то время как редакторы адениновых оснований (ABE) опосредуют изменения оснований с A на G, редакторы оснований цитозина (CBEs) опосредуют преобразования C в T [Sakata et al. 2020]. Редакторы оснований способны нарушать акцепторные или донорские сайты сплайсинга [Gapinske et al. 2018, Chemello et al. 2021] и устранять преждевременные стоп-кодоны, индуцируя пропуск экзонов, что, безусловно, открывает новые пути для генотерапии DMD. Редакторы адениновых оснований CRISPR/dCas9 восстановили нонсенс-мутацию в мышиной модели DMD путем однонуклеотидной замены, аденина на гуанин (A - G) в экзоне 20 [Ryu et al. 2018].

Prime Editing: Прайм-редактирование включает в себя nikase Cas9 (nCas9), соединенную со сконструированной обратной транскриптазой (RT) и направляющей РНК прайм-редактирования [Anzalone et al. 2019]. Направляющая РНК для прайм-редактирования (pegRNA) включает sgRNA, которая отжигается на целевом сайте, каркас для никазы nCas9, prime-binding site (PBS), который связывается с не-целевой последовательностью ДНК, и шаблон обратной транскриптазы (RT), кодирующий нужную редакторскую правку (рис. 4). RT генерирует комплементарную ДНК (cDNA) нить из РНК матрицы. Таким образом, обратная транскриптаза копирует генетическое сообщение, закодированное в матрице RT, в целевой участок. Шаблон RT может быть зашифрован так, чтобы осуществлять введение любых типов правок, включая всевозможные точечные мутации, в том числе перестановки оснований (переходы и трансверсии), а также indels различной длины без необходимости двунитевых разрывов ДНК (DSBs) или донорских шаблонов. Одно только прайм-редактирование может исправить около 89 % генетических изменений, вызывающих заболевания человека [Anzalone et al. 2019; Hampton 2020; Li et al. 2021]. Преобразование рамки считывания ORF транскрипта дистрофина в кардиомиоцитах, полученных из iPSC человека и мышей с делецией экзона 51 с помощью прайм-редактирования была впервые достигнута [Chemello et al. 2021], что гипотетически может восстановить ORF транскрипта дистрофина у 13 % пациентов с DMD [Aartsma-Rus et al. 2009]. Подобно редакторам оснований, прайм-редактирование предлагает исправление точечных мутаций DMD с незначительной модификацией генома.

Стержневой домен дистрофина (экзоны 8-61 - аа 253-3040) составляет около 68 % гена дистрофина человека. История двух пациентов с BMD с inframe экзонными делециями 44 и 46 % стержневого домена дистрофина привела к мысли о том, что делеция большой части стержневого домена может не оказывать негативного влияния на функции мышц [England et al. 1990; Love et al. 1991]. Однако этот укороченный белок дистрофина частично функционален, пока в нем сохраняются важнейшие актин-связывающий, богатый цистеином и карбокситерминальный домены [Monaco et al. 1988]. На этом этапе родилась идея создания полу-функциональных мини- и микроверсий гена дистрофина. Соответственно, на горизонте забрезжила надежда на генотерапию DMD. Однако большой размер мРНК дистрофина (14 кб) превышает возможности упаковки вирусных векторов для генотерапии. Поэтому Dickson и его коллеги разработали мини (6,3 кб) и микро (3,8 кб) версии гена дистрофина человека [Wells et al. 1995; Scott et al. 2002; Fabb 2002].Вскоре Chamberlain и его коллеги успешно доставили человеческий ген микродистрофина человека мышам mdx [Yue et al. 2003]. На рисунке 5 представлены диаграммы для человеческого полноразмерного дистрофина, минидистрофина и кодирующих последовательностей микродистрофина. Пока DMD пациенты все еще ждут генотерапии, доставка генов минидистрофина и микродистрофина с помощью AAV являются перспективными стратегиями генотерапии DMD Клинические испытания минидистрофин и микродистрофин генотерапии от Pfizer Pharmaceuticals, Sarepta Therapeutics, и Solid Biosciences являются многообещающими (http://clinicalTrials.gov).

С момента первого описания мышечной дистрофии Дюшена прошло сто пятьдесят пять лет [Duchenne 1867], до сих пор не существует лекарства от этого заболевания. Интенсивные клинические исследования, направленные на разработку фармакологических препаратов для лечения DMD тем не менее, не существует, которые могли бы компенсировать отсутствие белка дистрофина в мышцах [Guiraud & Davies 2017]. Поэтому, несмотря на значительный прогресс в лечении пациентов с DMD терапия, направленная на течение болезни вспять до сих пор не удается. Существующие фармакологические препараты носят паллиативный характер, а не на его генетическую причину заложенную в гене дистрофина. Поэтому альтернативные методы лечения, такие как генные препараты, которые могут устранить генетическую причину заболевания в корне, которые включают гена имплантацию, пропуск экзонов и редактирование генов CRISPR. В то время как имплантация генов, таких как микродистрофин является универсальной терапией для всех пациентов с DMD, пропуск нескольких экзонов может исправить около 70% делеций/дупликаций со сдвигом рамки считывания дистрофина. Пропуск экзонов с помощью антисмысловых олигонуклеотидов является преходящим и требует пожизненной терапии. Редактирование генов CRISPR является постоянным, но его трудно прервать в случае возникновения проблем с безопасностью [Olson 2021].

Коррекция мутаций гена дистрофина с помощью редактирования генов позволяет обеспечить нормальную регуляцию белка дистрофина с тканеспецифичного эндогенного промотора; с другой стороны, экспрессия гена микродистрофина зависит от регуляторных элементов в средстве доставки [Olson 2021]. Поскольку редактирование генов и пропуск одного экзона в высокой степени специфичны для мутаций, они являются персонализированным генетическим лекарством. Пропуск нескольких экзонов с помощью антисмысловых олигонуклеотидов (ASOs), коктейля совершенно не похож на фармацевтические препараты; тем не менее FDA не желает рассматривать этот новый подход. До тех пор перед мультиэкзонным пропуском стоят большие препятствия в качестве генотерапии на долгие годы. Система доставки AAV-векторов является перспективным инструментом для генотерапии, однако развитие нейтрализующего антитела после первого раунда доставки капсидов ограничивает использование этой технологии для повторного введения [Ilyinskii и др. 2021]. Кроме того, примерно у шестидесяти процентов населения уже выработались нейтрализующие AAV антитела [Boutin et al. 2010]. Поэтому очищение от AAV антител с помощью плазмафереза необходимо для первой или последующих инъекций [Chicoine et al. 2014]. В противном случае, использование различных серотипов AAV для последующих инъекций должно облегчить эти проблемы [Min et al. 2019]. Однако специфическая доставка в мышцы с помощью существующих средств доставки пока не достигнута [Echigoya et al. 2018]. В настоящее время существует возможность с помощью генетического генетического перепрограммирования сконструировать AAV-векторы для доставки определенных терапевтических грузов именно в мышцы или другие органы независимо от серотипа AAV. Аналогичным образом можно направлять биогенез экзосом для доставки компонентов CRISPR для редактирования генов или определенных терапевтических грузов в конкретные ткани, включая мышцы и мозг. Хотя аутологичные экзосомы иммунологически инертны, можно закамуфлировать капсиды AAV, липидные наночастицы и наночастицы золота, чтобы избежать распознавания иммунной системой [Liu et al. 20021].

Прайм-редактирование генов открывает большие перспективы для исправления большинства, если не всех, базовых изменений вызывающих мышечную дистрофию Дюшенна и другие генетические заболевания. Хотя редактирование генов показывает перспективность генотерапии DMD вне-целевое редактирование генов представляет собой большую проблему для терапевтического использования этой технологии. Теперь появилась возможность определять эти вне-целевые участки до начала генотерапии. Существует несколько подходов для достижения этой цели, которые включают DISCOVER-Seq, GUIDE-seq, ONE-seq, CIRCLE-seq и SITE-seq. Однако благодаря прорыву в разработке Cas-Clover, вне-целевое редактирование генов останется на не-обнаруживаемом уровне, поскольку в нем используется дуплекс gRNA вместо одной gRNA . Фактически, CRISPR/dCas-Clover представляет собой чистую альтернативу CRISPR/Cas9.