В последние десятилетия генотерапия продемонстрировала свой огромный потенциал, привлекая постоянно растущий интерес со стороны биомедицинского научного сообщества. С момента открытия ДНК в 1950-х годах до недавней разработки инструментов редактирования генов, таких как кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR), ассоциированные с Cas9, идея исправления дисфункционального генома перешла от обнадеживающих футуристических концепций к осязаемым рыночным методам лечения. В настоящее время генотерапия успешно применяется для лечения рака, иммунодефицитов, наследственных заболеваний, неврологических заболеваний и заболеваний крови (Steffin et al., 2019, Mendell, 2021). Эти продукты генотерапии основаны на восстановлении измененных функций клеток путем knocking out или knocking определенных генов, тем самым подавляя или усиливая производство белка. Генетическая модуляция достигается либо с помощью прямой инъекции in vivo, либо с помощью подхода ex-vivo – терапии CAR-T-клетками, при котором клетки-мишени извлекаются, генетически модифицируются и повторно вводятся обратно пациенту. Теоретически любое заболевание, связанное с идентифицированным дисфункциональным геном, может быть вылечено; Таким образом, генотерапия дает надежду на улучшение жизни миллионов людей, в том числе пациентов с редкими заболеваниями, лечение которых в настоящее время ограничивается простым облегчением симптомов. Генотерапия заключается в лечении заболеваний путем трансфекции и изменения генетического материала в клетках-мишенях. Регуляция экспрессии генов происходит в цитозоле или в ядре и подчиняется различным механизмам в зависимости от природы генетического инструмента.

Ранние стадии генотерапии начались в середине 1960-х годов, когда были впервые исследованы системы вирусной ДНК. Затем были изучены репликация и транскрипция ДНК, и последовательности ДНК были клонированы в кольцевые двухцепочечные плазмиды в 1980-х годах, что позволило упростить и удешевить производство с более длительным сроком хранения (Hardee et al., 2017, Hauswirth and Berns, 1977, Carter et al., 1972, Marcus et al., 1981, Laughlin et al., 1983). Два десятилетия спустя РНК и другие системы редактирования генов приняли участие в буме генотерапии (Whitehead et al., 2009, Uddin et al., 2020). Общие схемы генотерапии заключаются в модуляции транскрипции – производства РНК из последовательностей ДНК полимеразами в ядре – или трансляции – производства белка из последовательностей РНК рибосомами в цитоплазме. По сути, доставка сконструированных последовательностей нуклеиновых кислот может либо способствовать экспрессии определенного гена путем транскрипции введенной ДНК, либо ингибировать его, блокируя его трансляцию через различные механизмы РНК. Другая схема заключается в редактировании последовательностей ДНК с помощью устройств «вырезания и ремонта».

Плазмидная (pDNA) и мини-кольцевые ДНК (mcDNA) были сконструированы из вирусной ДНК для достижения умножения генов (Ain et al., 2021, Mayrhofer et al., 2009). pDNA и mcDNA представляют собой продуцируемые бактериями кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, которые действуют в ядре клетки посредством регуляции транскрипции (Kay et al., 2010). Поэтому после доставки в клетки они должны переместиться в ядро и пересечь ядерную оболочку через ядерные комплексы пор (NPC) или путем дестабилизации оболочки (Bai et al., 2017). В конце концов, в ядре они запускают синтез одноцепочечных нитей РНК под действием РНК-полимераз в процессе транскрипции. mcDNA — это упрощенная pDNA, лишенная бактериальных основных последовательностей. Было показано, что такая минимизация последовательности до чисто терапевтических сегментов увеличивает экспрессию трансгена и уменьшает иммунные проблемы (Kobelt, 2013).

Терапия на основе РНК направлена на модуляцию биологических путей посредством регуляции матричной РНК (мРНК) путем экспрессии белков, подавления экспрессии генов и процессов расщепления РНК (Kim, 2022). Прямая доставка мРНК была использована для восстановления здоровой выработки белка. В качестве недавнего примера можно привести вакцины против COVID-19, в которых мРНК используется для трансляции в антиген и запуска выработки антител (Bettini and Locci, 2021). В отличие от увеличения экспрессии генов мРНК, другие стратегии регуляции, основанные на одноцепочечных и двухцепочечных РНК меньшего размера, такие как короткая интерферирующая РНК (siRNA), микро-РНК (miRNA) и антисмысловой олигонуклеотид (AON), могут вызывать ингибирование генов. siRNA и miRNA вызывают деградацию мРНК, связываясь с белками Argonaute, образуя РНК-индуцированные комплексы сайленсинга (RISC) и нацеливаясь на комплементарные сайты расщепления, где белок Argonaute может расщеплять определенные последовательности мРНК, тем самым предотвращая трансляцию белка (Hu, 2020, Treiber et al., 2019, Valencia-Sanchez et al., 2006). AON — это синтетические олигонуклеотиды (ON), которые могут как понижать, так и повышать экспрессию генов. Помимо нокдауна генов процессами расщепления ферментов, AON также может повышать экспрессию генов, модулируя сплайсинг пре-мРНК. Чтобы восстановить выработку белка, AON может связываться со специфическими экзонами или интронами, тем самым блокируя некоторые последовательности замалчивания (сайленсинга) экзонов (Kuijper et al., 2021). В конечном счете, было сообщено, что олигонуклеотиды против микроРНК нацелены на аберрантные микроРНК и регулируют их, косвенно модулируя выработку белка (Lennox and Behlke, 2011, Lima et al., 2018).

Наконец, в качестве последней платформы в генотерапии, редактирование генов в последнее время привлекло огромное внимание. Например, инструмент CRISPR-Cas9 быстро вызвал интерес после первых плодотворных исследований, опубликованных в начале 1990-х годов (Mojica et al., 1993, Mojica et al., 2000), а недавно был представлен в 2020 году с Нобелевской премией (Bharathkumar, 2022). Механизм действия CRISPR-Cas9 основан на целенаправленных двухцепочечных разрывах ДНК и последующей репарации путем нокдауна, делеции, коррекции или вставки гена. Разрез ДНК достигается за счет нуклеаз – ферментов, расщепляющих фосфодиэфирные связи, – перегруппированных в четыре основные платформы: нуклеазу с цинковыми пальчиками (ZFN), эффекторную нуклеазу активатора транскрипции (TALEN), мегануклеазы и недавно систему CRISPR/Cas9 (Zheng et al., 2020, Wang et al., 2017). После целенаправленных разрывов ДНК репарация может быть достигнута различными путями. Репарация, направленная на гомологию, является шаблон-зависимым методом, в котором задействована вставка цепи. В этом случае для коррекции и введения гена необходим донорский шаблон. В противоположность этому, в процессах негомоталогичного соединения расщепленных концов пряди соединяются непосредственно без использования шаблона. В результате нокдаун и делеции генов (Maeder and Gersbach, 2016).

В настоящее время на рынке появилось более 50 одобренных методов лечения, в том числе недавние вакцины против COVID для экстренной помощи, в то время как все еще продолжаются сотни клинических испытаний (Wang and Sun, 2020, Mullard, 2021, Mullard, 2022, Mullard, 2023, Wang et al., 2020, Shahryari, 2019, Sheridan, 2021, Nakagami, 2021, Arabi et al., 2022). Продукты на основе вирусной ДНК, плазмидной ДНК, миРНК, мРНК и AON были одобрены во всем мире (Shahryari, 2019, Ma et al., 2020). Первый коммерческий продукт генотерапии, основанный на технологии AON, был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в 1998 году. Позже, в 2003 году, Государственное управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (SFDA) Китая одобрило первый продукт на основе вирусной ДНК. Продукты миРНК появились на рынке в конце 2018 года. Совсем недавно, во время пандемии COVID-19, вакцины на основе мРНК были быстро разработаны и одобрены в этом чрезвычайном контексте. На сегодняшний день одобренные методы лечения на основе РНК составляют 45 % против 55 % систем, ориентированных на ДНК (рис. 1, А). Треть всех процедур – это экстренные вакцины против COVID-19. Такая высокая доля свидетельствует о выдающейся универсальности генотерапии: в условиях внезапной пандемии вакцины на основе нуклеиновых кислот были быстро разработаны и успешно применены для замедления распространения вируса (Coccia, 2022). Помимо этих прорывных технологий ДНК и РНК, инструменты редактирования генов остаются в области клинических испытаний из-за значительных не-целевых эффектов, неблагоприятного мутагенного потенциала и этических проблем (Naeem et al., 2020, Teboul et al., 2020, Ledford, 2019). Тем не менее, потенциал CRISPR-Cas9 больше не ставится под сомнение, и интенсивные исследования в этой области продолжаются для устранения этих узких мест. Недавно была глубоко изучена эволюция Cas9 и получена важная информация о структуре и активности, что открыло возможность получения искусственных эквивалентов Cas9 с превосходными характеристиками (Alonso-Lerma, 2023).



Рис 1. Fig. 1. A) Genetic materials used in approved gene therapy products. B) Challenging steps in gene delivery: 1: complexation/loading; 2: binding with cell membrane; 3: internalization; 4: endosome escape; 5: genetic material release and vectorization to acting site. C) Vectors in approved gene products. D) Vectors in pre-clinical and clinical trials.

Несмотря на то, что голые генетические материалы могут быть использованы для трансфекции путем простой инъекции, таким способом была получена низкая экспрессия по сравнению с другими методами трансфекции (Giacca and Zacchigna, 2012). Физические методы, такие как электропорация, сонопорация или генная пушка, были разработаны для усиления трансфекции путем дестабилизации клеточной мембраны или форсирования интернализации внешним давлением (Sharma et al., 2021, Wells, 2004). Несмотря на более высокую эффективность трансфекции, эти стратегии могут привести к постоянной проницаемости клеток, что вызывает опасения по поводу безопасности (Hui, 2008). Для защиты генетических материалов от физиологических условий и векторизации их в клетках разработаны наноразмерные аппараты (Bulcha et al., 2021, Kanvinde et al., 2022). Для этого было определено несколько сложных шагов, как показано на рисунке 1, Б. Во-первых, нуклеиновые кислоты должны быть загружены в транспортер и образовать устойчивые комплексы. Затем они должны быть интернализованы и высвобождены в цитозоле. Наконец, нуклеиновые кислоты должны быть освобождены от носителя, чтобы действовать в цитоплазме или в ядре, в зависимости от механизма их действия. Для успешной трансфекции все эти этапы должны быть выполнены, не вызывая гибели клеток. За последние десятилетия было разработано множество вирусных и не вирусных, органических и не органических переносчиков (Zu and Gao, 2021, Jiao, 2020, Loh et al., 2016). В то время как вирусные векторы и липидные наночастицы были одобрены в качестве продуктов генотерапии, другие носители, такие как полимеры, пептиды, дендримеры, экзосомы, наночастицы железа и золота и квантовые точки, используются в доклинических и клинических испытаниях (рис. 1, C, D) (Piotrowski-Daspit et al., 2020).

Аденоассоциированные вирусы, аденовирусы, лентивирусы, вирус простого герпеса и ретровирус являются вирусами носителями, которые быстро показали отличную эффективность трансфекции и свойства скрытности (Bulcha et al., 2021, Zhao et al., 2022, Wang et al., 2019). Вирусные носители извлекают выгоду из естественной способности вируса проникать в клетки; белковые капсиды в вирусе носителе индуцируют эндоцитарную или не-эндоцитарную интернализацию посредством взаимодействия с клеточными рецепторами. Вирусы носители высвобождают свой груз в нуклеоплазме при взаимодействии с комплексом ядерных пор ((Dimitrov, 2004). Используя преимущества этих оптимизированных природных объектов, генотерапия добилась значительных успехов в первые годы генотерапии благодаря превосходной эффективности трансфекции. Однако ограничения по размеру груза, производственному процессу и опасения по поводу безопасности, связанные с их потенциальной иммуногенной токсичностью, создают препятствия для их применения (Srivastava, 2020, Seow and Wood, 2009).

Альтернативные носители – не вирусные носители – оказались способными преодолеть эти проблемы. Среди множества различных типов носителей, от органических до неорганических, липидные и полимерные наночастицы выделялись эффективностью инкапсуляции, трансфекционной способностью и безопасным производством (Zu and Gao, 2021, Guo et al., 2019, Buck et al., 2019). Наночастицы на основе липидов появились на рынке в качестве первого генного продукта для доставки siRNA в 2018 году и привлекли значительное внимание позже, во время пандемии COVID-19 (Akinc, 2019, Zhao and Huang, 2014, Hou et al., 2021). Они строятся путем самосборки катионных амфифилов в липосомы, в которых аминные группы могут комплексироваться с отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновых кислот для загрузки (Guevara et al., 2020). Структура носителя и механические свойства могут варьироваться в зависимости от липосомной формулы и техники приготовления. Например, было использовано несколько подходов для придания липидам поверхностных функций, например, путем украшения их поверхности дендритными молекулами (Tschiche, 2014, Barnard, 2014, Bromfield, 2014). Кроме того, ветви полиэтиленгликоля (PEG) часто включаются в векторы для улучшения коллоидной стабильности за счет уменьшения адсорбции белка на поверхности наночастиц. Помимо липидов, полимеры также конденсируют и трансфицируют генетический материал с более высокой стабильностью (Madkhali et al., 2019, Cordeiro et al., 2019, Xu et al., 2017, Zou et al., 2019). Среди них интенсивно исследовались поликатионный поли(L-лизин) (PLL), поли(амидоамин), хитозан и полиэтиленнеймид (PEI) (Bielke and Erbacher, 2010, Sun and Zhang, 2010, Rai et al., 2019). Синтетические виниловые мономеры, такие как амино-содержащие метакрилаты, также привлекли значительное внимание (Van De Wetering et al., 1999). Разветвленный PEI с молекулярной массой 25 кДа был назван золотым стандартом среди полимеров для трансфекции и показал самый быстрый перевод в клинические испытания (Piotrowski-Daspit et al., 2020, Bono et al., 2020). Этот коммерчески доступный продукт демонстрирует высокую поливалентность благодаря своей разветвленной архитектуре, обеспечивающей высокую плотность положительных зарядов для комплексообразования и взаимодействия с клетками. Довольно часто, в качестве альтернативы Lipofectamine 2000, разветвленный PEI с молекулярной массой 25 кДа служит эталоном для оценки эффективности трансфекции полимерных векторов. Тем не менее, сравнение эффективности векторов в разных исследованиях ограничено различными методологиями трансфекции, основанными на различных концентрациях, количествах, клетках разной природы и т.д. По этой причине в данном обзоре не проводится общее сравнение эффективности трансфекции.

Что касается липидных наночастиц, то положительно заряженные аминные полимеры соединяются с нуклеиновыми кислотами посредством электростатических связей, образуя наночастицы – полиплексы – обычно в нанометрическом диапазоне. Несмотря на то, что эти положительные заряды необходимы для векторизации, известно, что они взаимодействуют с фосфолипидной клеточной мембраной, что приводит к токсикологическим конечным точкам для клеток (Parhamifar et al., 2010). Таким образом, терапевтическое окно, описывающее диапазон доз, в котором достигаются безопасность и эффективность, по-прежнему ограничивает применение не-вирусных векторов.

Для разблокировки и открытия этого окна можно рассмотреть два подхода: повышение эффективности трансфекции и снижение цитотоксичности. Учитывая исходную токсичность и трансфективный потенциал переносчиков, некоторые работы должны проводиться в одном подходе, в другом или в обоих вместе. James Wilson, профессор медицины и пионер в области генотерапии, задается вопросом: «Должны ли мы попытаться сделать наиболее эффективные векторы более безопасными, или мы должны сделать более безопасные векторы более эффективными?» (Wilson, 2018, Marshall, 1999). В прошлом веке быстрое развитие вирусов в качестве генных векторов продемонстрировало большую эффективность при сомнительной безопасности (Srivastava, 2020). В настоящее время тенденция перевернулась. Несмотря на более низкую эффективность трансфекции, чем у вирусов, эти носители могут быть настроены и оптимизированы для достижения удовлетворительных внутриклеточных уровней высвобождения без риска активации иммунной системы. Контроль при подготовке носителя связан с его безопасностью с точки зрения масштабирования и производственных процессов; Именно здесь полимеры показали большие перспективы. Еще одним важным преимуществом невирусных векторов является настраиваемая грузоподъемность. В отличие от вирусов, трехмерную структуру полностью синтетических векторов относительно легко адаптировать.

Благодаря достижениям в области науки о полимерах, макромолекулы могут быть точно настроены для адаптации их свойств. Методы контролируемой полимеризации позволяют получать точно определенные макромолекулярные архитектуры (Hadjichristidis et al., 2006, Yagci and Tasdelen, 2006, Parkatzidis et al., 2020). Для конструирования генов-носителей были описаны методы свободно-радикальной полимеризации (FRP), радикальной полимеризации с переносом атомов (ATRP), обратимого переноса цепи присоединения-фрагментации (RAFT) и анионной полимеризации (de Goncalves and Vieira, 2020, Xu and Yang, 2011, Ahmed and Narain, 2013, Yang et al., 2006). Каждый метод полимеризации, основанный на различных механизмах распространения электронов и выращивания цепей, обеспечивает устойчивость к различным растворителям, условиям реакции и различным типам мономеров. Помимо синтетических полимеров, поликатионы на биологической основе, такие как хитозан, могут быть извлечены из натуральных продуктов, очищены и функционализированы для доставки генов (Chuan et al., 2019).

FRP является одним из самых простых методов полимеризации, как с практической, так и с теоретической точки зрения. Эта форма полимеризации очень универсальна из-за относительно не специфической природы (Colombani, 1997). ATRP и RAFT представляют собой контролируемые процессы полимеризации, в которых агенты для переноса цепи используются для регулирования роста цепи с помощью механизмов радикального переноса, что приводит к лучшему контролю за введением единиц. В ATRP роль этого медиатора играет галогенид металла, в то время как в RAFT используется тиокарбонильное соединение (Lorandi et al., 2022, Nothling, 2020). Оба метода широко используются при построении полимерных носителей от линейной и до наращиваемой (grafted), звездообразной или дендритной архитектурой (Chen, 2020, Cook and Perrier, 2020, Bravo-Anaya, 2021, Van Bruggen et al., 2019, Gibson, 2020). Анионная полимеризация - это метод, позволяющий значительно контролировать размер и архитектуру полимеров, при котором активная полимеризующая группа имеет отрицательный заряд и останавливает полимеризацию только при добавлении терминирующего агента. Несмотря на высокий контроль, этот метод не был наиболее известным для синтеза векторов для генотерапии. Требование к условиям, свободным от кислорода и воды, делает его сложным с практической точки зрения (Rai et al., 2019). Более того, этот уровень контроля может превышать потребности в переносчиках генов. С помощью этих инструментов полимерные генные носители могут быть легко адаптированы с целью расширения терапевтического окна генотерапии. Например, валентность поликатиона, тип амина, длина цепи, архитектура, наличие отзывчивых связей могут быть настроены непосредственно в процессе синтеза транспортных средств или позже, на втором этапе функционализации (Rai et al., 2019, Sanson and Rieger, 2010).

Наногели, наноразмерные сшитые полимеры, образуют особую группу в составе полимерных носителей. Наногели уникальны своей трехмерной ковалентной структурой, мягкостью, стабильностью и способностью к набуханию (Yin, 2020). Свойства наногелей могут быть настроены с помощью выбора мономеров или полимеров, пути полимеризации и функционализации, а также условий синтеза (Sanson and Rieger, 2010, Molina et al., 2014). Эмульсия, осаждение и матричная полимеризация используются для создания наногелей для доставки лекарств и генов (Li et al., 2021). В каждом из них фазовое разделение с контролем по размеру позволяет создавать нано-ограниченные полимерные карманы. Для поддержания структуры наногелей во время очистки ключевым этапом является сшивание. Это может быть достигнуто во время полимеризации в 1-ступенчатой реакции или в качестве второй стадии, после полного образования полимерных цепей. Сшивание может быть достигнуто с помощью ковалентных или физических связей, таких как водородная связь, силы Ван-дер-Ваальса, электростатические и гидрофобные взаимодействия (Mauri et al., 2021). В большинстве примеров, приведенных в этом обзоре, наногели, используемые для доставки генов, ковалентно сшиты. Как правило, более высокая стабильность достигается с ковалентными, чем с физическими структурами в биологических средах, где конкурирующие соли, белки, внеклеточные матриксы могут ослаблять физические связи (Hennink and van Nostrum, 2012). При доставке генов носители должны преодолеть несколько биологических барьеров, и поэтому их надежность является преимуществом для эффективной трансфекции. Помимо химической природы, плотность точек сшивания играет важную роль в механических свойствах наногелей (Soleimani, 2013, Theune, 2019). Эту плотность можно регулировать, контролируя коэффициент подачи сшивающего агента при синтезе.

Чтобы повысить эффективность наногелей в расширенных приложениях, в синтез были введены чувствительные сегменты в виде мономеров или сшивающих агентов. В наногели включены химические фрагменты, реагирующие на температуру, рН, ферменты, свет и магнитное поле (Zha et al., 2011). Эти химические группы избирательно реагируют на определенные условия и позволяют контролировать набухание, коллапс или деградацию наногелей. Такой контроль в этих специализированных материалах привлек значительное внимание в наномедицине для доставки лекарств и диагностических приложений (Ekkelenkamp et al., 2018, Cuggino et al., 2019). Чтобы активировать ответное поведение в физиологических условиях, триггеры могут быть обнаружены внутри организма – в некоторых патологических тканях температура, рН и содержание ферментов отличаются от здоровых участков (Liu et al., 2017) – или применены снаружи с помощью лазеров, нагревательных ламп или магнитов (Wang and Kohane, 2017). Одним из наиболее часто упоминаемых триггеров для чувствительных наногелей является температура. Термочувствительные наногели показали отличные результаты в доставке лекарств и белков (Zha and Alexis, 2011). Эти наногели обычно получают из термочувствительных полимеров, которые претерпевают переходы от растворимых к нерастворимым при критической температуре раствора. В результате сшивания этих полимеров получаются наногели с температурой объемного фазового перехода (VPTT). VPTT является полезным триггером для высвобождения терапевтических средств, поскольку наногели могут выделять большую часть своего содержимого путем повышения или понижения температуры. Оказание медицинской помощи может быть локализовано в патологических участках, где установлена температура по всему VPTT.

Несмотря на то, что клинические анализы с использованием чувствительных наногелей для доставки генов не проводились, были предприняты большие усилия для повышения эффективности их трансфекции при одновременном ограничении их токсичности. Действительно, они показали многообещающие результаты, исходя из своего потенциала для открытия терапевтического окна и раскрытия огромного потенциала генотерапии.

Данная работа направлена на изучение последних работ, достигнутых в области генотерапии с использованием наногелей в качестве не-вирусных транспортеров, и анализ различных подходов к раскрытию терапевтического окна. Большинство статей были найдены в период с 2000 по 2023 год, с особым акцентом на последние 5 лет. Этот обзор отличается от других по наногелям для доставки генов и лекарств (Ekkelenkamp et al., 2018, Neamtu et al., 2017, Huang, 2018, Mauri et al., 2018, Anooj, 2021, Kandil and Merkel, 2019, Smith and Lyon, 2012) своим основным фокусом на химических аспектах. Здесь выбор мономеров, сшивающих агентов, декорирующих химических групп, а также внутренняя организация и методы прикрепления нуклеиновых кислот перегруппированы в соответствии с их биологической значимостью в генотерапии. Для этого два вопроса: «Как наногели могут быть сконструированы для оптимизации процесса трансфекции?» и «Как их структура может быть оптимизирована для снижения цитотоксичности?» поставлены в двух отдельных главах.

Complexation with nucleic acids: binding strategies. В качестве первого шага и перед трансфекцией генетические инструменты должны быть загружены в транспортеры. Для этого решающую роль играют размер, внутренняя структура и валентность заряда наногелей. Нуклеиновые кислоты могут связываться с полимерами посредством физических взаимодействий – электростатических, водородных связей, гидрофобных и координационных взаимодействий – и химического присоединения (Nie, 2018). В литературе электростатические взаимодействия между аминосодержащими наногелями и богатыми фосфатами нуклеиновыми кислотами представляют собой наиболее распространенную стратегию. Незаряженные наногели также были исследованы, но они остаются ограниченными в клеточном поглощении во время эндосомного этапа использования (Blackburn et al., 2009, Ding, 2019). В литературе было просеяно несколько полимеров с аминами различной природы, от первичных до четвертичных аминов в линейных, разветвленных или циклических структурах (Lin, 2007). В то время как заряд четвертичных аминов постоянен, pH, степень протонирования первичных и третичных аминов варьирует в зависимости от pH и их pKa, это указывает на pH, соответствующий 50 % протонации. Таким образом, четвертичные амины или амины с высоким pKa приветствуются в полимерных структурах для эффективного связывания.

Архитектура аминированного сегмента оказывает влияние на энтальпию и энтропию связи с нуклеиновыми кислотами: структурная перестройка катионной группы будет наделять большей или меньшей энергией в зависимости от ее гибкости и окружающей химической среды (Jones et al., 2010). Помимо типа и архитектуры аминов, валентность аминосодержащих фрагментов также влияет на комплексообразование (Jones et al., 2010, Azzam et al., 2003, Lu, 2009). Плотность заряда и стереохимия влияют на электростатические взаимодействия через конденсацию нуклеиновых кислот. Например, спермин и спермидин использовались при построении полимерных векторов (Azzam et al., 2003, Du et al., 2012). Эти аминные поливалентные сегменты находятся в сперматозоидах, где они действуют как конденсаторы ДНК. Сама их структура – первичные и вторичные амины, расположенные внутри углеродных цепей [3:4:3] и [3:4] соответственно для спермина и спермидина – делает осаждение ДНК селективным во внутри- и межмолекулярных реакциях (Hoopes and McClure, 1981, Porschke, 1984). Для количественной оценки количества нуклеиновых кислот, которые могут быть загружены в наногели, получены комплексы нуклеиновых кислот и наногелей с различными соотношениями N/P, связанные с эффективностью инкапсуляции. Значения N/P описывают соотношение атомов аминного азота, присутствующих в носителе и заряженных при комплексообразовании, на отрицательно заряженных атомах фосфора, содержащихся в нуклеиновых кислотах. Эволюция эффективности инкапсуляции с соотношением N/P изменяется в зависимости от pKa амина и его доступности в наногеле.

Для введения аминов в наногели обычно используют три различных метода: 1) через прямую полимеризацию аминированных мономеров, таких как аминометакрилаты, 2) через сшивание аминизированных биополимеров, 3) через пост-синтетическую функционализацию реакционноспособных полимеров/наногелей с аминосодержащими молекулами, как показано на рис. 2, А (Li, 2016, Guo, 2015, Agarwal et al., 2012). В то время как первые два метода являются самыми простыми, поскольку они требуют только одностадийного синтеза, третий соответствует системе «подключи и работай», которая позволяет настроить носитель путем широкого скрининга аминосодержащих молекул. Для этого было исследовано использование мономеров, обладающих реакционноспособными группами, такими как активированный эфир, эпоксидное кольцо или фрагменты клик-химии (Li, 2016, Zhuang et al., 2012, Darcos et al., 2012).



Fig. 2. A) Amine introduction pathways in nanogels: direct polymerization of amine-bearing monomers, crosslinking of amine-containing polymers such as chitosan and amine-functionalization of reactive nanogels such as glycidyl methacrylate and pentafluorophenyl methacrylate. B) Amine type and functions in gene delivery.

Несмотря на то, что введение положительных зарядов в наногели необходимо для комплексообразования генов, чрезмерное электростатическое взаимодействие может препятствовать внутриклеточному высвобождению. Таким образом, инкорпорация аминов должна учитывать другие этапы доставки генетического груза, такие как клеточный захват, где амина pKa и его буферная способность играют важную роль (рис. 2, Б).

Помимо электростатического связывания, было показано, что гидрофобные взаимодействия эффективны для прикрепления нуклеиновых кислот к векторам (Xiao et al., 2020). В отличие от гидрофильного фосфатного каркаса, нуклеиновые основания – аденин (А), цитозин (С), гуанин (G), тимин (Т) и урацил (U) – являются гидрофобными единицами, что делает нуклеиновые кислоты амфифилами. Таким образом, они могут самособираться и конденсироваться с помощью внешних гидрофобных фрагментов. Сочетание гидрофобных и электростатических сил улучшает сродство с нуклеиновыми кислотами (Zheng, 2019). Недавно Matyjaszewki et al. сконструированы наногели с помощью ядро-оболочка полимеризации АТР в обратных условиях микроэмульсии с использованием кватернизованных мономеров на основе 2-(диметиламино)этилметакрилата (qDMAEMA) и олиго(окиси этилена) для доставки плазмид (Simakova et al., 2023). Гидрофобные поверхностно-активные вещества на основе додецилового эфира полиэтиленгликоля (Brij L4) вводили в различных концентрациях при реакции FRP для установления различной плотности гидрофобной точки внутри внутренней оболочки. Исследования электрофореза в агарозном геле показывают, что наличие цепей додецильалканов индуцирует снижение весового отношения наногеля к pDNA для полного комплексообразования с 3 до 0,1. Интеркаляция небольших планарных ароматических молекул в пару оснований, обычно используемая для окрашивания нуклеиновых кислот, частично обусловлена гидрофобной связью, но также π - π укладкой и силами Ван-дер-Ваальса (Sapia et al., 2021). В одной работе интеркаляция использовалась для построения наногелей миРНК (Huang, 2021). В этом примере молекулы бис-интеркалятора GelRed и GelGreen используются в качестве сшивающего агента для построения флуоресцентных наногелей нуклеиновых кислот с длиной волны излучения около 250 нм. Эти наногели были стабильны в 10 % сывороточном состоянии в течение 1 суток.

Водородные связи между основаниями нуклеиновых кислот и полимерами, содержащими комплементарные фрагменты, могут способствовать конденсации генов. Например, было показано, что поли(N-винилпирролидон) или поли(винилдиаминотриазин) образуют сложные наночастицы с ДНК в водном растворе (Cao et al., 2007, Mumper, 1996). Cообщалось, что наногели на основе PEG взаимодействуют посредством водородных связей с плазмидами (Mok and Park, 2006). Была выдвинута гипотеза о том, что атомы кислорода PEG взаимодействуют с основаниями ДНК в апротонных растворителях. В другом примере миРНК сшивали с дубильной кислотой (ТА) с получением сфероподобных наногелей размером 50–100 нм (Lei and Fan, 2022). В этих структурах силы сшивания возникают из-за водородной связи между фенольными группами ТА и основой фосфата siRNA Подтверждено, что динамические связи зависят от температуры; они стабильны при комнатной температуре и обратимо диссоциируют при 50 °C.

В качестве последнего физического взаимодействия координационная конденсация между металлами и нуклеотидными основаниями (называемая металлизацией) вызывает меж- и внутрицепочечное сшивание и конформационные искажения во время конденсации (Leczkowska and Vilar, 2012, Jena, 2022). Однако металл-содержащие полимеры могут взаимодействовать с ДНК только посредством электростатических взаимодействий (Qiu et al., 2013).

В физиологических условиях физические взаимодействия между транспортировщиками и грузами могут быть изменены в результате просеивания шихты или конкуренции водородных связей, что приводит к утечкам груза. Чтобы преодолеть эту проблему прочности связи, генетический материал может быть химически прикреплен к наногелям (Dispenza, 2017). Например, DeSimone и его коллеги загружали миРНК как через физическую, так и через химическую связь (Dunn, 2012). В этом исследовании миРНК присоединяется к полимеризуемой акрилатной группе, включающей разлагаемый дисульфидный спейсер, затем этот чувствительный к восстановлению мономер полимеризуется с помощью процесса формования наногеля. В отличие от физических комплексов, в этих ковалентных полиплексах не наблюдается утечки при воздействии на буфер с 10-кратной концентрацией соли PBS при 37 °C в течение 4 ч, что доказывает их более высокую стабильность. Опять же, химические связи обеспечивают более сильную нагрузку, вызывая последующие проблемы в высвобождении.

Для успешного поглощения клеток носители должны соответствовать типичным оптимальным размерам между 50 и 500 нм (Rejman et al., 2004). Для достижения этого разрыва в размерах наиболее распространенной стратегией является эмульсионная полимеризация, которая предшествует осадительной полимеризации и другим подходам, таким как микрофлюидическое или шаблонное нанопроизводство (Ekkelenkamp et al., 2018). Преимуществом по сравнению с несшитыми полимерными комплексами является то, что наногели обеспечивают высокий контроль над конечным размером и морфологией комплекса (Lee, 2009). Эти два параметра очень важны в процессе интернализации, поскольку они влияют на прочность взаимодействия с клеточными мембранами. Загрузка груза обычно описывается двумя методами: 1) его инкубация с ранее синтезированными векторами; 2) его инкапсуляция in-situ, когда груз включается во время приготовления носителя (рис. 3). Для предотвращения деградации генетического материала в жестких условиях полимеризации чаще всего используется первый способ загрузки нуклеиновых кислот.



Fig. 3. A) Genetic material post-loading and location in function of genetic material sizes. B) In-situ encapsulation.

Конденсация генов приводит к уплотнению структур (Kaul and Amiji, 2003, Kim et al., 2021). В зависимости от количества нуклеотидов и размера и геометрии пор наногеля они могут проникать в полимерную структуру или оставаться на поверхности, как показано на рис. 3, А (Evers et al., 2015, Schroeder et al., 2010, Xu, 2021, Pausch, 2020, Arkhangelsky et al., 2011). Как правило, небольшие молекулы, такие как AON, miRNA и siRNA, с молекулярной массой обычно от 6 до 15 кДа, могут проникать в поры наногеля при инкапсуляции (Blackburn et al., 2009, Vinogradov et al., 2004, Vinogradov et al., 1999, Raemdonck, 2009, Naeye, 2010, Hoshiko, 2020, O'Brien et al., 2018, Shatsberg, 2016). Комплексообразование нуклеиновых кислот внутри предварительно сформированных наногелей приводит к коллапсу структуры, поскольку внутримолекулярное электростатическое отталкивание переходит в межмолекулярное взаимодействие. Затем конденсация изменяет гидратацию и наногели набухают. В одном из примеров наногели, содержащие разветвленный PEI плотностью 25 кДа, были приготовлены с использованием PEG-сшивателя и комплексированы с AON. Инкапсуляция AONs в поликатионные наногели привела к уменьшению размера носителя в 3 раза (Vinogradov et al., 2004). О расположении нуклеиновых соединений в наногеле можно судить по измерению дзета-потенциала комплексов. Действительно, изменение поверхностного заряда в зависимости от эффективности инкапсуляции будет зависеть от того, где происходит комплексообразование. В одном из примеров siRNA загружается в наногели поликатионного декстрана, и изучается влияние N/P на эффективность инкапсуляции и дзета-потенциал (Raemdonck, 2009). Замечено, что с увеличением количества siRNA нейтрализация заряда происходит сначала при 25 пмоль/мкг наногеля, а затем достигает максимума при более 50 пмоль/мкг. Это указывает на то, что загрузка siRNA не ограничивается поверхностным комплексообразованием, а может проникать внутрь наногелей.

Напротив, более крупные грузы, такие как мРНК и плазмиды - до более чем 1000 кДа - скорее всего, останутся в основном на поверхности наногеля (Maldonado-Valderrama, 2022, Huang, 2020, McAllister, 2002). При этом с насыщением ДНК при максимальной эффективности комплексообразования свойства поверхности претерпевают резкие изменения, такие как уменьшение заряда и уплотнение (Song, 2017). Агрегация наногеля также может происходить из-за нейтрализации заряда в результате комплексообразования на поверхности ДНК (Zhu, 2005, Sunasee et al., 2012). Одна из стратегий, позволяющих избежать агрегации, заключается в том, чтобы не превышать 100 % инкапсуляции и регулировать соотношение N/P для поддержания электростатического отталкивания между наночастицами.

Помимо размера и морфологии носителя, разница в расположении груза также влияет на профиль высвобождения. При нарушении электростатического притяжения внешние молекулы могут напрямую покинуть носитель, в то время как внутреннему грузу необходимо диффундировать через полимерную матрицу. Поэтому, помимо функциональных мономеров, используемых при создании наногелей, важную роль играет выбор сшивающего агента и его концентрация, определяющая внутреннюю структуру и размер пор.

Альтернативой постполимеризационному комплексообразованию может быть загрузка генетических инструментов in-situ для решения таких проблем, как большие размеры груза или неоднородная поверхность заряда (рис. 3, B). Полимеризация и сшивание могут осуществляться вокруг груза, таким образом адаптируя внутреннюю структуру наногеля с момента его создания. Для этого необходимо адаптировать условия реакции, чтобы обеспечить сохранность груза в процессе изготовления наногеля.

Для создания наногелей вокруг нуклеиновых кислот использовались мягкие методы полимеризации (Liu, 2015). В одном из примеров Haag и др. инкапсулировали siRNA, используя метод нанопреципитации thiol-Michael (Dimde, 2017). К тиол-функционализированному дендритному полиглицерину в присутствии siRNA в воде добавляли 600 Da разветвленного PEI-акриламида и осаждали в ацетоне при 4 °C. В данном примере инкапсуляция siRNA in-situ стала возможной благодаря ортогональной реакции щелчка (orthogonal click reaction) в биосовместимых условиях - методу, который недавно был удостоен Нобелевской премии по химии (Zaia, 2023).

Помимо больших размеров конструкций из нуклеиновых кислот, одновременное присутствие положительных и отрицательных зарядов может вызвать проблемы с инкапсуляцией. Например, рибонуклеопротеины, такие как комплексы CRISPR/Cas9-sgRNA, представляют собой относительно крупные системы, в которых присутствуют как положительно, так и отрицательно заряженные аминокислоты, что затрудняет их загрузку посредством простого аминного комплексообразования. Опять же, полимеризация in-situ может решить эту проблему. Shaoquin и соавторы сообщили о in-situ инкапсуляции комплексов нуклеазы Cas9 и одноцепочечной РНК анионными и катионными полимерами (Chen, 2019). После электростатического связывания мономеров на комплексах, сшитые полимерные нанокапсулы получаются путем низкотемпературной FRP.

Наногели также могут быть сформированы in-situ путем сшивания полимеров. Реакционные связи могут способствовать этому пути через водородные, ионные или host–guest взаимодействия. Так, ДНК была привита к цепям поли(капролактона) (DNA-g-PCL) и гибридизована с внешним хвостом sgRNA в комплексах Cas9/sgRNA путем инженерного сопряжения оснований (Ding, 2019). Добавление ДНК-линкера приводит к сшиванию структуры и формированию наногеля за счет сильной комплементарной водородной связи, как показано на рис. 4.



Fig. 4. In-situ encapsulation of Cas9/sgRNA in nucleic acid nanogels. Reprinted with permission from F. Ding et al. (2019) (Ding, 2019).

В другом примере супрамолекулярные наногели на основе PLL были построены с помощью ассоциации хозяин-гость адамантана и циклодекстрина (Pottanam Chali et al., 2021). Поливалентные звездообразные и линейные полимеры PLL, привитые адамантаном и циклодекстрином, были впервые синтезированы методом полимеризации с раскрытием колец. На втором этапе ДНК инкапсулируется в структуру во время пост-кросс-сшивки через ассоциацию хозяин-гость. Опять же, преимущества физических и химических взаимодействий подчеркиваются условиями сборки: реакция протекает в воде при низкой температуре (Lee, 2016).

Среди всех не-вирусных носителей наногели выделяются своей прочной трехмерной ковалентной структурой. Ковалентные связи обеспечивают высокую стабильность транспортеров даже в суровых физиологических условиях, что делает их привлекательными для определенных биомедицинских применений. Эта прочность является преимуществом для защиты груза и срока хранения (Zhang et al., 2016). В приложениях по доставке генов наногели обеспечивают хорошую защиту функциональности нуклеиновых кислот (Mauri et al., 2018, Li et al., 2015).

Иммобилизация и конденсация нуклеиновых кислот в ковалентную структуру помогают им избежать деградации, физически отделяя их от химических и биохимических веществ, присутствующих во внешней и внутренней клеточной среде. Zhu, Zhang и др. разработаны сшитые наногели нуклеиновых кислот, изготовленные из сшитых с функциональными siRNA кистями DNA-g-PCL (Ding, 2018). В этой архитектуре цепи DNA-g-PCL обладают высокой степенью связи (27 точек сшивания в каждой цепи DNA-g-PCL). Такая высокая степень иммобилизации приводит к высокой термостабильности siRNA и физиологической стабильности; нуклеиновые кислоты лишь частично деградируют в питательной среде с 0,05 U mL^-1 РНКазы А при 37 °С, тогда как для голой siRNA наблюдается быстрая деградация в тех же условиях.

Использование малых олигонуклеотидов ограничено из-за низкой стабильности при 37 °С в присутствии сыворотки; внеклеточная активность РНКазы вызывает их быструю деградацию (Mitchell, 2008, Tsui et al., 2002). Например, период полураспада микроРНК колеблется от 1,5 до 13 ч при 37 °C, в зависимости от природы микроРНК (Coenen-Stass, 2019). Инкапсуляция в наногелях увеличила время жизни (Yang et al., 2022). В одном исследовании регулятор микроРНК (анти-miR-21) был инкапсулирован в PEG, а разветвленные наногели полученные на основе PEI 10 кДа для повышения их стабильности (Javanmardi et al., 2020). Анализы разложения ДНКазы показали повышенную защиту от ферментативной деградации в наногелях при концентрации 2 U при 37 °C. Стабильность несшитых полимеров PEG-PEI и комплексов анти-miR-21 предотвращает его деградацию только в течение 6 ч, в то время как комплексы с сшитым наногелем обеспечивают более длительную защиту до 24 ч, что свидетельствует о важности трехмерной ковалентной структуры наногеля в защите его груза. В другом примере для визуализации микроРНК используются поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAM) и ДНК-сшитые наногели (Yang et al., 2022). Загрузка ДНК-шпильчатых зондов (используемых для распознавания РНК) в ДНК-сшитые полимерные светящиеся наногели (DPLN) приводит к значительному повышению их стабильности. На рисунке 5 интенсивность полосы гель-электрофореза зондов-шпильки значительно снижается после 4-часовой инкубации с 10 % FBS, 2-часовой инкубации с клеточным лизатом и 1-часовой обработки ДНКазой I. Напротив, DPLN остаются стабильными в течение 8 ч во всей среде, что указывает на повышенную стабильность. Цитосовместимость DPLN еще больше подчеркивает их потенциал в биологическом применении.



Fig. 5. Biological stability of the DPLNs and hairpin probes (H1/H2) characterized by gel electrophoresis in A) 10% FBS, B) MCF7 cell lysate, and C) 0.5 U mL-1 DNase I. D) Cytocompatibility evaluated by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Reprinted with permission from F. Yang et al. (2022) (Yang et al., 2022).

В стратегиях репарации и редактирования генов мегануклеазы, ZFN, белки TALEN или Cas9 используются для разрезания определенных последовательностей ДНК. Хотя эти белки показали более высокую стабильность, чем нуклеиновые кислоты, их инкапсуляция в наногель дает им убежище для расширения их потенциала применения. Zhu, Zhang и др. использовали свои наногели нуклеиновых кислот для защиты и доставки CRISPR/Cas9 (Ding, 2019). Показано, что внутри наногелей на основе ДНК-g-PCL как single guide РНК, так и белок Cas9 демонстрируют высокую стабильность в физиологических условиях и в 0,8 U мл^-1 раствора РНКазы А через 1 ч при 37 °С.

Наногели, стабилизированные легочным сурфактантом, были использованы для стабилизации и защиты целостности белка путем лиофилизации и небулайзера для доставки siRNA в легкие. Лиофилизация является распространенным процессом для хранения или в некоторых приложениях доставки. Однако присутствие криочувствительных молекул, таких как белки, может ограничить его использование. В своей работе De Smedt, Raemdonck и др. разработали наногели декстрана с покрытием Curosurf® — клинически используемым белоксодержащим легочным сурфактантом — и загрузили его siRNA (Merckx, 2020). Интернализация наногелем и потенциал подавления экспрессии генов регулируются сурфактантным белком B (Merckx, 2018). Сравнение свойств и характеристик транспортера до и после лиофилизации показывает, что биологическая активность белка не изменяется. Это исследование подчеркивает надежность наногеля в защите белковой чувствительной структуры в жестком процессе без криопротектора; это может быть полезно для приложений редактирования генов, в которых используются белки.

Для дополнительной защиты и стабилизации всей системы наногели могут быть включены в более крупные гидрогелевые матрицы. Таким образом, большие полимерные микро- и макрокапсулы были разработаны для защиты и векторизации наногелей в клетках-мишенях. Эти усовершенствованные гидрогелевые структуры «нано-в-микро» и «нано-в-макро» обеспечивают локальную доставку лекарств через сайт-специфическую инъекцию и локальную деградацию инкапсулирующей матрицы. Действительно, макроматериалы легче фиксируются в некоторых тканях-мишенях, и поэтому используются в качестве резервуаров для пролонгированного высвобождения наногелей. В этих сложных материалах микрометрическая окружающая фаза обеспечивает дополнительную защиту наногеля и векторизацию в труднодоступных или суровых условиях, таких как легкие, желудок или позвоночник (Du et al., 2014, Wanakule et al., 2012, Knipe et al., 2016, Wang, 2023). В одной работе, посвященной воспалительным заболеваниям кишечника, siRNA была инкапсулирована в поли(2-диэтиламиноэтилметакрилат-ко-трет-бутилметакрилат) (PDEAEMA-co-TBMA) наногели, которые сами дополнительно покрыты микрогелями из полиметакриловой кислоты-co-N-винил-2-пирролидона, содержащими трипсин-реактивные пептидные сшивающие агенты (Knipe et al., 2016). Полимерное покрытие защищает наногели от низкого рН желудка и высвобождает их в кишечнике в присутствии ферментов трипсина. В этом примере наногели демонстрируют большие преимущества для доставки генов в специфических и суровых местах, благодаря простоте их инкапсуляции в более крупные и сложные структуры. Действительно, настраиваемая стабильность полимерных покрытий является преимуществом для целенаправленного высвобождения груза.

После загрузки груза следующим этапом трансфекции является поглощение его клетками. Транспортеры должны взаимодействовать с фосфолипидной мембраной клетки, напрямую пересекать ее или образовывать эндосомы. В то время как вирусные векторы могут проникать в клетку не эндоцитарным путем и через слияние с клеточной поверхностью, большинство невирусных переносчиков проходит через клатрин- или кавеола-опосредованные эндоцитарные пути, включающие образование эндосом, как показано на рис. 6 (Dimitrov, 2004, Augustine, 2020). Клатрин - это белок, присутствующий в цитоплазме и позволяющий создавать округлые везикулы для внутриклеточной транспортировки. Активация рецепторных белков, участвующих в формировании везикул, - адапторных белков - приводит к набору и полимеризации клатрина в мембране, способствуя ее деформации (Kaksonen and Roux, 2018). Кавеолярный эндоцитоз - это клатрин-независимый процесс входа, при котором наночастицы инвагинируются в небольшие пещеристые структуры плазматической мембраны (Pelkmans and Helenius, 2002). Помимо этих путей, одновременно могут происходить и другие эндоцитарные механизмы внедрения, такие как фагоцитоз или макропиноцитоз (Liechty et al., 2019). После эндоцитарного поглощения векторы должны выйти из эндосом до созревания их в эндолизосомы, где подкисление до pH ~ 4 может привести к деградации груза.



Fig. 6. Cellular uptake pathways. Reprinted with permission from R. Augustine et al. (2020) (Augustine, 2020).

Поликатионные не вирусные носители могут проникать одновременно как через клатрин-опосредованные, так и через кавеоло-опосредованные эндоцитарные процессы с разной эффективностью трансфекции (Diaz-Moscoso, 2010, Monnery, 2021). Наличие положительных зарядов на поверхности наногеля способствует взаимодействию с отрицательно заряженными фосфолипидными клеточными мембранами, способствуя интернализации в эндосомах. В присутствии сыворотки заряды поликатионов экранируются путем образования белковой короны. Известно, что этот эффект влияет на связывающие свойства векторов, а также влияет на скорость и путь эндоцитаров (Zhu, 2018, Capriotti, 2011). Несмотря на то, что было показано, что эти поликатионные наногели способны проникать в клетки по эндоцитарным путям через комплексообразование заряда, даже после образования белковой короны, поверхностные модификации наногелей были исследованы для усиления их интернализации.

Введение лигандов на поверхность наногеля является широко известной стратегией для увеличения взаимодействия с клеточной мембраной и помощи в образовании эндосом. Преимущество воздействия на биомолекулы, такие как пептиды или белки, было использовано для создания материалов, вдохновленных биологией. Например, включение пептидов, проникающих в клетку, помогло наночастицам активировать клеточные рецепторы, способствующие инкапсуляции (Koren and Torchilin, 2012, Zilkowski, 2019). Один из первых примеров cбыл описан Lyon et al. более десяти лет назад (Blackburn et al., 2009). В данной работе поверхность наногелей на основе PNIPAM была украшена пептидом из 12 аминокислот с последовательностью YSAYPDSVPMMS. Известно, что этот пептид активирует гепатоцеллюлярный рецептор А2 (EphA2), продуцирующий эритропоэтин, избыточно экспрессируемый в опухолевых клетках. Трансфекцию этих наногелей в клетках HEY карциномы яичников человека сравнивают с безпептидными контрольными наногелями, и пептиды указывают на значительное усиление клеточного поглощения. Как и ожидалось, пептид способствовал эндоцитозу через активацию рецептора EphA2. Совсем недавно Gong et al. сообщили об усиленном клеточном поглощении наногелей на основе гепарина путем пересадки проникающего в клетки пептида RRRRRRRR (R8) на их поверхность (Song, 2017). Трансфекционная эффективность наногелей достигает 65 % против 37 %, полученных при разветвленном PEI 25 кДа. В другом исследовании анионные фузогенные пептиды, полученные из виркса гриппа (dilNF-7), присоединяются к наногелям декстрана гидроксиэтилметакрилата посредством электростатического взаимодействия (Raemdonck, 2009). Опять же, наблюдается значительное увеличение до 20 % подавления экспрессии генов из-за присутствия пептида.

Помимо пептидов, было также показано, что белки усиливают интернализацию наногелей клетками. В области применения ингаляционной терапии De Smedt, Raemdonck et al. исследовали клеточное поглощение наногелей поверхностно-активных белков, покрытых поверхностно-активными веществами (Merckx, 2018). Описанный механизм отличается от механизма пептидов; Считается, что поверхностно-активное вещество, белок B (SP-B) обладает фузогенными свойствами, т.е. способствует тесному контакту и слиянию с клеточной мембраной и/или эндолизосомальной мембраной. Таким образом, присутствие этих белков может способствовать поглощению эндосом на кавеолярном пути.

Известно, что форма и мягкость наногеля влияют на интернализацию клеток. Во время действия эндоцитарных интернализационных путей наночастицы инвагинируются внутри мембраны; Таким образом, размер, геометрия и деформируемость наночастиц влияют на площадь контакта с фосфолипидными мембранами, механизм поглощения и скорость поглощения (Donahue et al., 2019, Lorenz, 2010). В то время как более мягкие наногели преимущественно интернализуются посредством макропиноцитоза, жесткие наногели скорее вводятся в эндосомы с помощью клатрин-зависимого механизма (Banquy, 2009). Наногели, как правило, имеют сферическую морфологию. Таким образом, для такого рода полимерных транспортеров деформируемость является основным параметром, на который следует опираться. Для этого плотность точки сшивания может быть легко настроена во время синтеза наногеля.

Поглощение наногеля подразумевает его адгезию к клеточной мембране и деформацию мембраны. Таким образом, прочность связи между наночастицами и мембраной конкурирует с модулем изгиба и поверхностным натяжением мембраны (Contini et al., 2018). В то время как мягкость наночастиц влияет на прочность их связывания, их адгезия c мембраной может привести к увеличению модуля мембраны за счет активации внутренних белков. В недавней работе Singh и др. исследовали влияние жесткости наногеля на клеточное поглощение (Desai, 2022). Они синтезировали наногели на основе PEG с помощью обратной миниэмульсии с различным дисульфидным сшиванием и получили модуль накопления 37 и 93 kPa. Были охарактеризованы свойства наногелей, такие как способность к сплющиванию и деформации, когда наногели вводили в клетки. Более высокие поглощения были получены для более твердых наночастиц. Разница объясняется полимеризацией актина – белка цитоскелета – в клеточной мембране, спровоцированной деформацией наногеля. При более жесткой мембране затраты на инвагинацию увеличиваются. В их работе были проведены компьютерные симуляции, которые подтвердили эти результаты, как показано на рис. В то время как твердые наногели полностью интернализируются посредством эндоцитоза через 340 мкс, для мягких наногелей получается только 70 % оборота за то же время.



Fig. 7. Membrane interaction and internalization simulations of A) hard and B) soft nanogels at different times. C) Contact point number between nanogels and membrane lipids. D) Wrapping ratio of hard and soft nanogels calculated by simulation as function of time. Reprinted with permission from P. Desai et al. (2022) (Desai, 2022).

Жесткость наногеля может быть изменена путем модуляции плотности сшивания и выбора мономеров. Гидрофильность полимеров напрямую влияет на набухание наногеля и, следовательно, на его жесткость. В одной исследовательской работе Kleuser и его коллеги создали термочувствительные наногели и заметили, что механизм клеточного поглощения зависит от состояния набухания наногеля (Edlich, 2017). Дендритные полиглицериновые (dPG) и поли(глицидилметиловые эфир-коэтилглицидиловый эфир) (pGME-co-EGE) наногели показали температуру перехода около 30 °C. Выше этого перехода наногели набухают и проникают в клетки в основном по механизму поглощения, опосредованного кавеолами, тогда как при 29 °C интернализация также одновременно опосредована макропиноцитозом. Чтобы доказать, что на механизм интернализации влияет гидрофильное состояние наногеля, а не температура, были синтезированы аналогичные наногели с температурой перехода 48 °C. Как при 29, так и при 37 °C основным путем поглощения является макропиноцитоз. Таким образом, помимо плотности сшивания, гидрофильность полимера и гидратация наногеля являются важными параметрами, которые следует учитывать при модуляции жесткости.

Эндосомный выход является очень сложным этапом во время клеточного поглощения. Чтобы избежать деградации и переваривания нуклеотидов после слияния с лизосомами, носители должны дестабилизировать эндосомную мембрану, чтобы выйти в цитоплазму. Для этого наиболее предлагаемым механизмом является так называемый «эффект протонной губки» (Vermeulen et al., 2018). Эта гипотеза постулирует изменение мембраны эндосомы, вызванное абсорбцией протонов на носитель во время эндосомного закисления. Эта буферная способность (наделяемая присутствием протонных аминных групп) создает дисбаланс осмотического давления и хрупкость эндосомной мембраны. Сообщается, что наногели с настроенными значениями pKa в диапазоне рН эндосом, т.е. 6,5–7, являются оптимальными для эффективного выхода из эндосом (Spencer, 2021).

В одной из работ Nagasaka и его коллеги построили PEGилированные наногели DEAEMA для доставки siRNA и кватернизировали (quaternized) аминную группу в различных степенях (Tamura et al., 2010). Несмотря на то, что стабильность комплексообразования siRNA и клеточное поглощение увеличиваются со степенью кватернизации, эндосомный выход уменьшается из-за снижения буферной емкости носителя. На рисунке 8, А выход из эндосом визуализирован с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в клеточной линии HuH-7 с разделением желтых участков на красные и зеленые точки (соответствующие лизосомам и siRNA) через 24 ч инкубации. 100 % кватернизация (Q100) аминных групп препятствует выходу по сравнению с 10 и 28 % (Q10 и Q28). Таким образом, в данном исследовании показано, что в наногеле необходимы как четвертичные, так и третичные амины для оптимизации комплексообразования, клеточного поглощения и эндосомального ускользания. Частично кватернизированные наногели с 10 % четвертичных аминов показали более высокую способность к подавлению экспрессии генов в клетках HuH-7 по сравнению с 0 и 100 % кватернизированными носителями (рис. 8, Б). Эти наногели Q10 также превосходят разветвленные 25 кДа PEI с эффективностью 63 против 55 % при N/P = 20.



Fig. 8. A) Confocal laser scanning microscopy of HuH-7 cells after 3 h (a, c, e, g) and 24 h (b, d, f, h) of siRNA incubation using nanogels of various quaternization degree: Q10 (a, b), Q28 (c, d), Q100 (e, f), and branched 25 kDa PEI (B-PEI) (g, h). The nucleus, siRNA and lysosomes are stained respectively blue, green and red. B) Gene knockdown from siRNA loaded nanogels at various quaternarization degree (Q0 to Q100) in HuH-7 cells. Figure adapted with permission from A. Tamura et al. (2010) (Tamura et al., 2010). (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

Было доказано, что присутствие гидрофобных мономерных единиц в полимерных транспортных средствах полезно для эффективности трансфекции генов, помогая векторам пересекать мембраны, особенно во время эндосомного выхода. В самом начале этого столетия Okano et al. сообщили о важности гидрофобности полимеров во внутриклеточном высвобождении комплексов pDNA-полимеров (Kurisawa et al., 2000). С тех пор гидрофобные фрагменты были введены в конструкцию наногелей, и влияние этих групп на взаимодействие наногеля с клеточной мембраной было изучено более глубоко.

Peppas et al. исследовали, как гидрофобные фрагменты могут помочь наногелям улучшить трансфекцию генов (Liechty et al., 2019). Они модулировали гидрофобное содержание в наногелях метилового эфира DMAEMA и PEG, включив TBMA или 2-(тербутиламино) этилметакрилат (TBAEMA) в различных концентрациях, и наблюдали за механизмами захвата наногелей с помощью визуализации проточной цитометрии. Показано, что, регулируя и расширяя гидрофобно-гидрофильный фазовый переход, TBMA оптимизирует разрушение мембраны после интернализации с помощью клатрин-опосредованных механизмов эндоцитоза и макропиноцитоза. Совсем недавно van Rijn, Zuhorn и их коллеги разработали наногели на основе NIPAM, включающие алифатические фрагменты 1-бромододекана (BDD), для улучшения взаимодействия с клеточными мембранами и облегчения интернализации внутриклеточного носителя (Zhang, 2021). Дисморфофобия проявляет липидоподобное поведение, которое помогает дестабилизировать эндосомные мембраны.

Сообщается, что тиол-дисульфидный обмен является еще одним инструментом для улучшения пересечения мембран (Torres and Gait, 2012). Дисульфидные связи представляют собой динамические связи, которые могут распадаться на тиолы в присутствии восстановителей. Эти связи присутствуют в трансмембранных белках – экзофациальных тиолах – и могут быть использованы для усиления клеточной интернализации за счет их динамического взаимодействия с тиолсодержащими наночастицами. Помимо интернализации клеток, Thayumanavan et al. (Kanjilal et al., 2022) недавно опубликовали эндосомальное усиление выхода наночастиц с поверхностными тиоловыми группами (Kanjilal et al., 2022). В их работе дисульфидсодержащие наногели были синтезированы методом RAFT-полимеризации боковых цепей на основе пиридилдисульфида в качестве мономера и самосшивающего агента. Показано, что преобладающим способом интернализации является клатрин-опосредованный путь. Дисульфидсодержащие наногели могут ускользать из эндосом, в то время как не дисульфидные наногели, как было замечено, остаются в ловушке. Кроме того, были синтезированы наногели, содержащие высокую концентрацию дисульфидных групп на поверхности, и проведено сравнение с другими наногелями; Это увеличение доступности дисульфидов на поверхности приводит к клеточному поглощению и усилению эндосомного ускользания.

Помимо физико-химической оптимизации носителя для клеточного поглощения, к клеткам можно применять внешние усилители трансфекции для усиления клеточного поглощения (Heath, 2019). Молекулы, такие как хлорохин, метиламин и хлорид аммония, используются для увеличения клеточной интернализации. Эти небольшие молекулы относительно липофильны и содержат амины, которые могут быть протонированы, способствуя эндосомальному ускользанию за счет эффекта протонной губки (Hajimolaali, 2021, Varkouhi et al., 2011). Физические процессы, основанные на ультразвуке, напряжении или электрическом токе – сонопорация, электропорация или ионофорез – были применены к клеткам для повышения их проницаемости и усиления клеточного поглощения генов (Delalande et al., 2013, Dujardin and Preat, 2004, Hao et al., 2010).

Фотохимическая интернализация (PCI) – это еще один метод внешнего усилителя трансфекции, основанный как на физических, так и на химических процессах. PCI включает в себя световую активацию фотосенсибилизатора, вызывающую накопление активных форм кислорода (ROS) в мембранах эндосом (Hogset, 2004). Местное производство ROS изменяет мембрану, способствуя освобождению груза. De Smedt et al. воспользовались этим инструментом для повышения эффективности подавления давления наногелей, загруженных siRNA (Raemdonck, 2009). Здесь переносящий сульфонат мезотетрафенилпорфин используется в качестве фотосенсибилизатора, способствуя эндосомному выходу. Значительное увеличение эффективности нокдауна с 10 и 40 % до 60 и 78 % наблюдалось при применении PCI при двух концентрациях наногелей: 10 и 25 µг/мл. Таким образом, использование PCI позволяет эффективности нокдауна достигать сопоставимых значений с Lipofectamine 2000 в районе 70–80 %. Тем не менее, это значительное улучшение ограничено результирующей цитотоксичностью; Концентрация PCI ограничена 0,4 µг/мл для снижения его токсичности.

Хотя точные механизмы пересечения мембранных путей наночастицами все еще изучаются, ясно, что увеличение взаимодействия между векторами и клеточной мембраной через присоединение пептидов, белков или химических групп помогает улучшить клеточное поглощение. Использование внешних усилителей трансфекции может помочь в разработке оптимизированных носителей; Однако их применение ограничено из-за возникающей цитотоксичности механизмов проникновения мембраны.

После подключения сотовой связи транспортные средства должны, наконец, доставить свою посылку в пункт назначения. В то время как мРНК и siRNA действуют в цитоплазме, AON, ДНК и инструменты редактирования генов должны быть направлены в ядро. Для этого в клетке должна снижаться устойчивость комплексов носитель-груз для высвобождения груза перед его переносом с помощью цитоплазматического транспорта. Первый подход заключается в разработке биоразлагаемых наногелей, нацеленных на пассивное и длительное высвобождение.

Биодеградация - широко известный путь высвобождения и доставки терапевтических препаратов (Chen, 2020). При этом способе высвобождения физически и химически связанные грузы высвобождаются в результате нарушения структуры транспортного средства, что обусловлено низкой стабильностью химических связей в физиологических условиях. Расщепление полиионной цепи способствует ослаблению комплексов, так как валентность заряда уменьшается, снижая энергию связывания. Сообщалось о биоразлагаемых наногелях, созданных на основе биоразлагаемых полимеров, таких как желатин (Mimi et al., 2012), PCL (Zhang, 2015) и гепарин (Gou, 2010). Биодеградация происходит путем гидролиза амидных или сложноэфирных связей и энзимолиза. Кроме того, соединение полимеров при получении наногеля может быть достигнуто с помощью биоразлагаемых соединений. В одном из примеров гидроксиэтилметакрилатные (HEMA) группы присоединяются к цепям декстрана с помощью карбонового эфира в процессе приготовления наногеля (Raemdonck, 2009). Эта связь расщепляется путем гидролиза в физиологических условиях, обеспечивая устойчивое высвобождение груза в течение 10 ч при 37 °C. Инкапсулируемость siRNA, и эффективность нокдауна сравнивается с аналогичными наногелями без деградирующих связей. Наблюдается значительная разница: в то время как не разлагаемые наногели могут вызвать 20 % нокдауна, вероятно, за счет диффузионного высвобождения, нокдаун деградирующих наногелей достигает 70 % эффективности при концентрации наногелей 40 µг/мл.

Несмотря на то, что устойчивое высвобождение может быть достаточным для некоторых применений, отсутствие контроля над местом высвобождения создает недостатки для специфического высвобождения в генотерапии.

Для контролируемой доставки в создании "умных" наногелей используются чувствительные полимеры (Zha et al., 2011). В этом случае высвобождение генов из наногеля происходит под влиянием изменений состояния тканей-мишеней, вызывающих набухание, разрушение или деградацию наногеля. Таким изменением может быть снижение pH, увеличение концентрации ферментов или повышение температуры, как, например, в опухолевой среде (Mura et al., 2013). В табл. 1 приведена краткая информация о недавно созданных наногелях с чувствительными свойствами.

Таблица 1. Резюме недавно разработанных наногелей для доставки генов, TMAEMA ...

Присутствие первичных и третичных аминов в наногелях наделяет их pH-чувствительными свойствами. Известно, что внеклеточный рН составляет около 7,4, в то время как эндосомный и внутриклеточный рН ниже, варьируя от 5 до 6 и даже до 4,5 в лизосомах (Wang, 2017). Переход рН наногелей сопровождается большей степенью набухания с понижением рН, что обусловлено более высокими внутренними электростатическими отталкиваниями и гидратацией.

В то время как степень протонации носителя увеличивается со снижением рН, протонация груза может дестабилизировать комплексы. Forcada et al. добились усиленного высвобождения siRNA при pH 6 с помощью наногелей PDEAEMA-PVCL ядро-оболочка (Aguirre et al., 2016). 100 % высвобождения наблюдалось при рН 6 через 1 сутки при 25 °С против 70 % при рН 7,4 в тех же условиях. Разница в высвобождении объясняется более слабыми электростатическими взаимодействиями при рН 6 по сравнению с рН 7,4 из-за протонирования siRNA. В этом примере измерение pKa наногелей составляет около 7,4, что может объяснить эти результаты. Действительно, в типичных системах с более низким pKa около 6–7 (оптимальный pKa для эндосомного ускользания) наблюдается более сильное связывание за счет протонирования наногеля (Moraes, 2021, Liechty et al., 2019). Кроме того, глядя на 70% высвобождение при рН 7,4, можно подумать, что сила комплексообразования относительно низкая, что облегчает высвобождение. Как следует из этого примера, контролируемое рН высвобождение нуклеиновых кислот не представляется наиболее привлекательной стратегией, поскольку для внутриклеточного высвобождения, вероятно, потребуется слабое электростатическое связывание, поэтому и наблюдается низкая эффективность и низкая буферная емкость при обычном эндосомном рН.

Температура является еще одним хорошо изученным триггером в области доставки лекарств (Le, 2022, Abouelmagd et al., 2018). Термочувствительные наногели строятся с использованием полимеров с температурным переходом между растворимым и нерастворимым состояниями; Затем, в зависимости от температуры, наногели могут набухать или схлопываться. Этот переход, называемый нижней или верхней критической температурой раствора (LCST или UCST), в зависимости от того, растворимы ли полимеры при этом переходе или над ним, может быть легко настроен путем сополимеризации с гидрофобными/гидрофильными ко-мономерами. PNIPAM, наиболее изученный термочувствительный полимер с резким переходом при температуре около 32 °C, широко применяется для термоконтролируемого высвобождения лекарств (Subhash et al., 2011). Singh et al. использовал поли (N-изопропилметакриламид) (PNIPMAM), мономер, отличающийся от NIPAM своей дополнительной метильной группой, обеспечивающей более высокую LCST при 45 °C, в конструкции термочувствительных наногелей (Deshpande et al., 2018). Наногели на основе NIPAM и NIPMAM были физически загружены с помощью PLL для введения положительных зарядов и дальнейшей инкапсуляции siRNA при 25 °C. При температуре 37 °C наногели NIPAM пересекли свой LCST и, следовательно, находятся в схлопнувшемся состоянии, в то время как наногели NIPMAM все еще набухали. Высвобождение siRNA наблюдается для наногелей NIPAM с помощью электрофорезного анализа, в то время как для наногелей NIPMAM высвобождение не отмечается. Сделан вывод о том, что при пересечении температуры перехода происходит изгнание комплексов pLL/siRNA что приводит к 4-кратному снижению экспрессии siRNA-таргетных генов. Несмотря на то, что потенциал температуры в качестве триггера высвобождения очевиден, о дальнейших исследованиях высвобождения siRNA из PLL не сообщается.

Хотя термочувствительные ковалентные наногели использовались во многих приложениях для доставки генов, в большинстве из них температура не использовалась в качестве триггера для прямого контроля высвобождения нуклеиновой кислоты (Sunasee et al., 2012, Zhang, 2021, Ahmed et al., 2013). Например, в одном из исследований термочувствительные свойства использовались для повышения гидрофобности наногеля и его поглощения клетками, однако это свойство не способствовало внутриклеточному высвобождению (Cao, 2015). Отсутствие систем с термоконтролируемым высвобождением может быть связано с требуемой развитой структурой. Действительно, набухание и сворачивание наногеля косвенно влияет на электростатическое взаимодействие между транспортным средством и грузом, поскольку в ковалентных системах оно не влияет на величину заряда. Для небольших нуклеиновых кислот, которые могут проникнуть в полимерную структуру, увеличение плотности заряда, вызванное коллапсом структуры, препятствует их выведению за счет простого ограничения пространства. Аналогично, уменьшение площади поверхности конкурирует с увеличением плотности заряда для более крупных грузов. Усовершенствованные структуры, демонстрирующие ограничение заряда в недоступных местах нуклеиновых кислот при изменении температуры, еще предстоит исследовать, чтобы максимально использовать термочувствительные векторы. Например, полу-проникающие системы могут быть привлекательными в этой области (Miceli, 2018, Molina, 2015, Molina et al., 2016, Molina et al., 2017, De Leon, 2016).

Дисульфидная связь - одна из наиболее изученных реактивных связей для контролируемого высвобождения терапевтических препаратов. Они образуются в результате объединения двух тиоловых групп в окислительных условиях. Образование связи обратимо и может быть расщеплено в присутствии восстановителей. Во внутриклеточных условиях реакционный обмен смещается в сторону восстановленного состояния благодаря присутствию высококонцентрированного - от 1 до 10 мМ - восстановителя глутатиона (GSH), что делает эту связь очень привлекательной для контролируемой доставки в клетки. В наногелевые носители их обычно вводят в качестве сшивателей. Наногели с дисульфид-метакрилатной и цистаминовой сшивкой изучались для контролируемого высвобождения (Liechty et al., 2019, Averick, 2012, Lee et al., 2007). В них изменение всей структуры происходит быстро после введения в 10 мМ раствор GSH. В одном из примеров наногели DMAEMA, сшитые дисульфидметакрилатом, подвергаются воздействию 1 и 10 мМ GSH и инкубируются при 37 °C (Liechty et al., 2019). Деградация наногеля отслеживается с помощью DLS, и расщепление структуры достигает максимума через 1 ч. siRNA загружается с помощью электростатических взаимодействий и доставляется в клетки Caco-2. Линейное увеличение внутриклеточной доставки siRNA с 5 до 60 мин наблюдается с помощью проточной цитометрии.

Дисульфидные связи также могут быть введены в качестве линкеров для химического присоединения груза к наногелям (Dunn, 2012, Hong, 2013). В одной из работ siRNA была связана с наногелем PEG-аминоэтилметакрилата посредством функционализации акриламида siRNA-NH2 (Dunn, 2012). Здесь высвобождение нуклеиновых кислот происходит непосредственно из-за разрыва связи. Показано, что высвобождение происходит только тогда, когда наногель попадает в восстановительную среду цитоплазмы. Максимальное высвобождение достигается через несколько часов при 37 °C.

В другом исследовании линейные цепи PEI с массой 2,5 кДа были сшиты дисульфидными мостиками с тиол-концевой siRNA (Hong, 2013). В отличие от несшитых комплексов siRNA/PEI и сшитых структур PEI с siRNA без тиола, наногели демонстрируют способность проникать в клетки и в значительной степени доставлять siRNA, заглушающую гены. Высвобождение зависит от концентрации GSH, как показано на рис. 9. Высвобождение siRNA происходит только в присутствии GSH, достигая полного высвобождения при 10 мМ.



Fig. 9. A) Schematic representation of disulfide crosslinked nanogel cellular uptake. On top of the scheme, mutually crosslinked siRNA/PEI nanogels are shown to enter the cells via endosomal escape. Below, PEI crosslinked siRNA and uncrosslinked nanogels cannot be internalized. B) siRNA release from mutually crosslinked siRNA/PEI nanogels at increasing GSH concentration as measured by electrophoresis assay. Figure adapted with permission from C. A. Hong et al. (2013) (Hong, 2013).

Важно отметить, что для электростатических систем высвобождение груза не связано напрямую с деградацией структуры. Действительно, расщепление поликатионной цепи приводит к изменению размера пор и плотности заряда, но не к увеличению количества положительных зарядов. Более короткие поликатионные молекулы могут по-прежнему связываться с нуклеиновой кислотой, образуя агрегаты. В одном из примеров синтеза наногелей, чувствительных к восстановлению, методом FRP были использованы N,N-диметилакриламид (DMAM), [2-(акрилоилокси)этил]триметиламмоний хлорид в качестве катионных мономеров и N,N' -бис(акрилоил)цистамин в качестве GSH-чувствительного сшивателя (Maruf et al., 2023). miRNA инкапсулировали и исследовали высвобождение при 5 мМ GSH. По сравнению с обычными физиологическими условиями без GSH, присутствие восстановителя оказывает незначительное влияние на высвобождение миРНК. В лучшем случае, при наибольшем N/P = 10, через 24 ч происходит лишь дополнительное высвобождение на 15 %. После расщепления дисульфидных связей в наногелях размером 100 нм методом cryo-TEM наблюдаются крупные агрегаты. Высвобождение нуклеиновых кислот из GSH-чувствительных систем может зависеть от их размера. Крупные нуклеиновые кислоты, такие как плазмиды, создают больше точек связывания с поликатионами, чем мелкие. Поэтому расщепление наногеля на мелкие сегменты может оказывать большее влияние на стабильность комплекса с крупными генами, чем с мелкими нуклеиновыми кислотами.

Наконец, в качестве альтернативы дисульфидным связям для контролируемой деградации наногеля можно использовать и другие чувствительные химические группы. Haag и др. сообщили о контролируемой доставке siRNA путем встраивания benzacetal связей в наногели (Dimde, 2017, Dimde, 2017). Высвобождение контролируется рН за счет расщепления acetal путем гидролиза в кислых условиях: в то время как связи стабильны при физиологическом рН 7,4, 50 % расщепляются при рН 5, что соответствует рН поздних эндосом. Расщепление наногеля должно быть тщательно связано с высвобождением груза.

Хотя не вирусные трансфектанты могут доставлять груз во внутриклеточную цитоплазму, они также ассоциируются с нежелательной цитотоксичностью. Механизмы токсичности полимерных комплексов были изучены и показали, что они включают некротический, апоптотический и аутофагический пути (Parhamifar et al., 2010, Parhamifar, et al., 2014). В отличие от запрограммированной гибели клеток через апоптоз, некроз описывает гибель клеток через патологические механизмы вследствие необратимого повреждения клеток, когда воспалительные реакции провоцируются митохондриальной, лизосомной или ферментативной дисрегуляцией. Напротив, апоптоз - это процесс, при котором поврежденные клетки уничтожаются в проуессе гомеостаза обновляющихся тканей. Он характеризуется разрушением и фрагментацией клеток на более мелкие единицы, которые могут быть фагоцитированы. Поликатион также связан с аутофагией, третьим путем клеточной гибели (Gao, 2011). Аутофагия - еще один механизм запрограммированной клеточной гибели, подразумевающий образование вакуолей - аутофагосом, в которых происходит поглощение и деградация части компонентов цитоплазмы. Эти процессы могут активироваться как на ранних этапах поглощения клеток при взаимодействии носителя с мембраной, так и на более поздних - при выходе из эндосом и внутриклеточном высвобождении. В каждом случае основная цитотоксическая причина трансфекция поликатиона, связанная с ферментативной дисрегуляцией.

До интернализации клетки структурные нарушения могут возникать в результате взаимодействия транспортера с фосфолипидами и белками мембраны, вызывая истончение, искривление и образование пор (Zhang and Smith, 2000, Yaroslavov et al., 2006). Поликатионы могут изменять проницаемость мембраны, смещая внутренние молекулы фосфолипидов к внешней поверхности клетки, дестабилизируя ее структуру. Хотя обратимая дестабилизация необходима для формирования эндосом при поглощении, избыточные заряды могут вызвать необратимые структурные сдвиги.

После поглощения в эндосомах поликатионы должны выйти из них, чтобы разрушиться в лизосомах. Лизосомы - многофункциональные клеточные компартменты, играющие важную роль в регуляции гомеостаза. Эти везикулы содержат ферменты, способные вызывать гибель клеток через апоптоз и некротические механизмы. Полимеры с буферной способностью, такие как PEI, могут покидать эндосомы благодаря эффекту протонной губки, снижая соотношение массы/рН лизосом и тем самым нарушая ферментативную активность (Gao, 2011, Lin et al., 2012).

После интернализации поликатионы могут влиять на стабильность жизненно важных органелл. Например, разветвленный 25 кДа PEI, как сообщается, провоцирует дисфункцию митохондрий и снижение уровня аденозинтрифосфата (АТФ) (Hall, 2015). Этот биоэнергетический стресс возникает из-за снижения производства АТФ, вызванного нарушением плазматической мембраны, снижением мембранного потенциала митохондрий и утечкой метаболитов. Затем чрезмерные колебания в производстве АТФ могут привести к гибели клетки. Помимо энергетического кризиса, разрушение мембраны митохондрий может привести к нарушению окислительно-восстановительного гомеостаза, провоцируя окислительный стресс.

Все эти механизмы могут происходить одновременно во время интернализации носителя. В одном из исследований цитотоксичности, опосредованной PEI, были выделены две фазы как для разветвленного 25 кДа, так и для линейного 750 кДа PEI (Moghimi, 2005). В первой фазе в течение первых 30 минут на клеточной мембране появляются некротические изменения. Вторая фаза, согласно описанию, наступает через 24 ч в результате опосредованной митохондриями апоптотической программы, при которой проапоптотические белки высвобождаются из-за изменения мембраны митохондрий, как показано на рис. 10.



Fig. 10. Polyplex-mediated membrane perturbation events (phase I) and initiation of programmed cell-death (phase II). Reprinted with permission from L. Parhamifar et al. (2010) (Parhamifar et al., 2010).

Наконец, важно отметить, что генетические инструменты не вызывают прямой токсичности при контакте с клетками. Безопасность груза стимулирует развитие генотерапии по сравнению с химиотерапией. Генетические материалы повышают скрытность носителя после комплексообразования за счет нейтрализации положительного заряда. Учитывая преимущества поликатионных систем для трансфекции, наногели все же должны быть разработаны таким образом, чтобы минимизировать их токсичность. Для этого необходимо оптимизировать природу аминов, архитектуру поликатиона и структуру наногеля, чтобы ограничить их воздействие на обратимые клеточные изменения.

Биораспределение и фармакокинетику наногелей можно регулировать, изменяя свойства их поверхности. Например, их мягкость, введение стелс-молекул и таргетных лигандов может увеличить время циркуляции в крови и сделать их накопление специфичным при внутривенных инъекциях (Desai, 2022, Eslami et al., 2019). Эти свойства - в зависимости от целевых заболеваний - важны для ограничения количества необходимого транспортера и, следовательно, косвенного снижения цитотоксичности препарата.

Во время трансфекции, если только часть наногеля интернализуется, остальная часть наногеля может оставаться во внеклеточной среде и накапливаться в почках, селезенке, печени или сердце, в зависимости от размера частиц (Alexis et al., 2008). При этом деградация наногеля на мелкие фрагменты имеет ключевое значение для долгосрочной цитотоксичности, поскольку, в отличие от носителей размером 20-500 нм, низкомолекулярные полимерные отходы могут выводиться из организма (Kunzmann, 2011). В настоящее время долгосрочная цитотоксичность малых полимерных фрагментов все еще не очень ясна; имеется ограниченная информация на клиническом уровне (Li et al., 2015).

Чтобы ограничить их накопление в нежелательных органах, наногели должны быть способны нацеливаться на конкретные клетки, в которые должно быть доставлено лечение, ограничивая тем самым концентрацию наногеля в определенных органах. Таким образом, инкапсуляция наногелей в более крупные гидрогелевые структуры (nano-in-micro) была исследована в качестве платформы для контролируемой доставки генов в конкретные места (Knipe et al., 2016, Wang, 2023). Используя преимущества стабильности и совместимости полимеров, более крупные полимерные структуры привели к созданию более совершенных систем высвобождения. Совсем недавно Wang и др. разработали инъекционный наногель, содержащий гидрогель для доставки анти-миРНК в качестве лечения дегенерации межпозвоночного диска (IDD) (Wang, 2023). Механические свойства, а также ROS-, pH- и ферментная чувствительность пептидсодержащих гидрогелей на основе декстрана и хитозана гарантируют устойчивую доставку в пульпозное ядро позвоночника в течение 14 дней. Таким образом, терапевтические олигонуклеотиды доставляются по трехступенчатому механизму, который ограничивает утечку груза и ограничивает высвобождение только в очаге воспаления IDD.

Помимо накопления в органах, длительное накопление в клетках после доставки генов может привести к токсичности через взаимодействие с органеллами и изменение их функций. Опять же, биоразлагаемые полимеры обычно менее токсичны, чем соответствующие не разлагаемые (Luten et al., 2008).

Наногели были разработаны для ограничения их цитотоксичности путем настройки механических свойств и декорирования поверхности. В данном обзоре долгосрочная цитотоксичность не рассматривается.

Плотность заряда была первым идентифицированным параметром, вызывающим цитотоксичность. Сравнивая различные поликатионы, было замечено, что наиболее токсичными являются поликатионы с более высокой плотностью аминов (Fischer et al., 2003). Более высокая валентность аминов вызывает более высокую устойчивость к электростатическим конкурентам и усиливает перенос отрицательно заряженных липидов из внутреннего бислоя во внешний (Yaroslavov et al., 1999, Yaroslavov et al., 1994). В зависимости от электростатической силы это изменение структуры мембраны может быть обратимым или необратимым. Помимо плотности заряда, большую роль в цитотоксичности полиаминов играет тип амина (первичный, вторичный, третичный или четвертичный). Например, было замечено, что четвертичные аммониевые группы более токсичны, чем третичные (Tamura et al., 2010). Поскольку мембран-разрушающая активность зависит от плотности заряда, степень протонирования каждой аминной группы также имеет большое значение. Эта степень зависит от химического окружения и раскрывается как pKa амина. Настройка pKa аминогрупп на значения около 6-7 - это способ уменьшить плотность положительных зарядов при физиологическом pH. Действительно, наногели с pKa ниже 7 будут лишь частично протонированы во внеклеточной среде, что приведет к меньшему повреждению клеточной мембраны, чем соответствующие наногели с более высоким pKa и степенью протонирования. Связывание поверхности поликатиона с липидной мембраной может сдвинуть значение pKa. В одном из исследований, основанном на моделировании упаковки поли(аллиламиногидрохлорида) (PAH) на модели поверхности фосфолипидной мембраны, значительный сдвиг в сторону более низких значений pKa происходит за счет высокого покрытия (Troiano, 2017). Наконец, трехмерная структура и гибкость поликатиона имеют большое значение, поскольку влияют на воздействие заряда и связывание с клеточной мембраной. Например, жесткие дендритные поли(амидоамины) (PAMAM) демонстрируют более высокую биосовместимость, чем гибкие линейные или разветвленные структуры, благодаря ограничению взаимодействия с клеточной мембраной (Fischer et al., 2003).

Наиболее простой стратегией снижения цитотоксичности поликатионных наногелей является добавление биосовместимого ко-мономера ( co-monomer). Во многих исследованиях сообщалось о снижении токсичности при ко-полимеризации синтетических полимеров или биополимеров; ко-полимеризация вызывает разбавление положительных зарядов на поверхности и, следовательно, более слабое взаимодействие с клеточными мембранами (Kandil and Merkel, 2019). Наночастицы, конъюгированные с PEG, были глубоко изучены в качестве систем доставки лекарств (Sanchez Armengol et al., 2022). Этот полиэфир повышает растворимость в воде, скрытость и биосовместимость многих лекарств (Abbina and Parambath, 2018). Nagasaki и др. разработали наногели на основе DEAEMA, функционализированные цепочками PEG на поверхности, и отметили низкую цитотоксичность (Tamura et al., 2010, Oishi et al., 2007, Tamura et al., 2009). Интересно, что большинство наногелей с PEG-цепями, о которых сообщалось, используемых для доставки генов, нагружены siRNA для нокдауна генов (Dunn, 2012, Tamura et al., 2010, Oishi et al., 2007, Tamura et al., 2009). Если цепи PEG привиты и остаются на поверхности, можно предположить, что поверхностное комплексообразование больших нуклеиновых кислот, таких как плазмида, будет затруднено. Напротив, небольшие нуклеиновые кислоты, способные проникать в структуру наногеля, не будут ощущать такой разницы во время загрузки.

Аналогичным образом, биополимеры и полисахариды также исследовались в качестве ко-мономеров при создании наногелей PEI, чтобы снизить их цитотоксичность. Поскольку PEI известен как золотой стандарт трансфекции, его ко-полимеризация с биосовместимыми ко-полимерами представляется перспективной стратегией для достижения высокой эффективности трансфекции при улучшенной цитосовместимости. Сообщалось о наногелях на основе PEI с желатином, гепарином и гиалуроновой кислотой (Song, 2017, Mimi et al., 2012, Gou, 2010, Park et al., 2015). Все эти наногели обладают более низким дзета-потенциалом и значительно меньшей цитотоксичностью по сравнению с чистыми разветвленными полимерами PEI плотностью 25 кДа.

Нуклеиновые кислоты также могут быть использованы в качестве биополимеров для создания носителей. Наноструктуры на основе генов включают ДНК-оригами и ДНК-каркасы (Dey, 2021, Yin, 2020). Полимеры также могут быть смешаны с такими структурами. Zhang и др. разработали наногели на основе нуклеиновых кислот и сообщили об отсутствии цитотоксичности (Ding, 2019, Huang, 2020, Xue, 2019). В их работах ДНК-привитый поликапролактон используется в качестве биосовместимого материала для безопасной доставки генов. Сначала поли(T20) прививается к поликапролактону с помощью ДНК-линкеров, содержащих два одноцепочечных навеса поли(A20). Комплементарные одноцепочечные цепи Т20 и А20 соединяются, образуя ДНК-сшитый наногель. Несмотря на привлекательную биосовместимость, получение этих наногелей достаточно сложно из-за конъюгации нуклеиновых кислот по сравнению с другими поликатионными системами на основе полностью синтетических полимеров.

Сообщалось, что гидрофобность также влияет на жизнеспособность наногелей. В одной из работ Peppas и др. исследовали механизм цитотоксичности наногелей PEG-co-DEAEMA, приготовленных с использованием дисульфидных метакрилатных сшивателей и различных концентраций гидрофобных мономеров (Spencer, 2021). 2-(ди-изопропиламино) этилметакрилат (DPAEMA) и трет-бутилметакрилат (tBMA) используются в качестве гидрофобного катионного мономера и гидрофобных ко-мономеров для модуляции pKa наногеля. Как видно на рис. 11, резкий всплеск цитотоксичности в 4 различных клеточных линиях (мышиный фибробласт (NIH 3 T3), рак печени человека (HEPG2), рак молочной железы человека (MDA-MB-231-eGFP) и устойчивый к доксорубицину рак молочной железы (MCF-7/ADR)) наблюдается при наименьшем содержании DPAEMA/DEAEMA (DP0: 0 % DPAEMA) с наибольшей pKa при 7,1. Помимо физических взаимодействий с клеточными мембранами, в качестве источника цитотоксичности определены эффекты объемного набухания за счет "эффекта протонной губки". Увеличение содержания гидрофобных веществ в наногеле приводит к сочетанию снижения pKa и степени объемного набухания, а значит, к повышению цитосовместимости.



Fig. 11. Cytocompatibility of nanogels with 5 different DEAEMA/DPAEMA ratio: DP0 = DEAEMA, DP25 = DPAEMA:DEAEMA (1:3), DP50 = DPAEMA:DEAEMA (1:1), DP75 = DPAEMA:DEAEMA (3:1), DP100 = DPAEMA in four cell lines (NIH 3 T3, HEPG2, MDA-MB-231-eGFP, MCF-7/ADR) after 48 h, measured using [3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)–2H-tetrazolium] (MTS) cytotoxicity assay. Reprinted with permission from D. S. Spencer et al. (2021) (Spencer, 2021).

Гидрофобные и поликатионные свойства синергически сочетаются и способствуют переходу внутренних липидов во внешний слой в пределах фосфолипидного двойного слоя (Yaroslavov et al., 1999, Yaroslavov et al., 1994). Этот эффект "flip-flop" зависит от размера гидрофобных молекул, а также от заряда и размера полярной головной группы (Yaroslavov et al., 2006). Таким образом, присутствие как гидрофобных групп, так и поликатионов способствует цитотоксичности для мембраны. Динамическая дестабилизация поликатионных молекул способствует переносу из внутренней мембраны во внешнюю, в то время как гидрофобные группы усиливают взаимодействие носителя с мембраной.

Из примеров, рассмотренных в предыдущем разделе, следует, что введение биосовместимых сегментов является общей стратегией повышения цитосовместимости. Там включение нейтральных и гидрофильных полимеров на поверхность векторов приводит к ослаблению взаимодействия с клетками за счет эффекта разбавления. В данном разделе показано, что гидрофобность поверхности также повышает цитосовместимость за счет изменения pKa и степени объемного набухания. При этом концентрация амина не изменяется, но изменяется способность к протонированию. Несмотря на тесную взаимосвязь, плотность заряда и гидрофильность наногелей - это два разных параметра, которые должны рассматриваться отдельно при оптимизации транспортного средства. Для обоих параметров необходимо найти компромисс, чтобы достичь тонкого терапевтического окна между эффективностью и токсичностью.

Помимо химического состава поверхности, трехмерная структура наногелей влияет на их способность взаимодействовать с клетками. С учетом этого были разработаны сложные полимерные структуры. Одной из наиболее часто встречающихся структур наногелей является структура "ядро-оболочка", в которой две или более полимерных фаз разделены между внутренней и внешней областями. Такая морфология привлекает большое внимание, поскольку комбинация материалов обладает более высокими свойствами, чем просто сумма компонентов (Ramli et al., 2013). Микро- и наноразмерные гидрогели ядро-оболочка нашли применение во многих биомедицинских областях (Kaewruethai et al., 2021). Такие наногели были получены путем осаждения, эмульсионной и дисперсионной полимеризации с использованием, как правило, FRP, а также с помощью более современных методов, таких как RAFT и ATRP (Shen, 2011, Ghorbani et al., 2016, Blackburn and Lyon, 2008, Li and Stover, 2000). Особое поведение чувствительных наногелей с ядрами-оболочками было отмечено в статье Richtering и Pich (Richtering and Pich, 2012). В наногелях этого типа динамические переходы набухания и коллапса одной фазы сдерживаются другой. Рассмотрено поведение наногеля с заряженным ядром-оболочкой. Хотя информация о поведении голых наногелей необходима, прежде чем использовать их в качестве носителя для доставки генов, важно отметить, что комплексирование с полианионными нуклеиновыми кислотами приводит к серьезным изменениям чувствительных свойств. Организации типа "ядро-оболочка" демонстрируют улучшенную биосовместимость благодаря пространственному ограничению поликатиона в ядре или иммобилизации поликатиона на поверхности. В первом случае оболочка может служить препятствием для положительно заряженного ядра. В отличие от ко-полимеризации и разбавления заряда биосовместимыми полимерами, рассмотренными ранее, здесь плотно заряженное ядро все еще может прочно связываться с небольшими нуклеиновыми кислотами благодаря разделению фаз заряда.

Как уже упоминалось ранее, следуя этой стратегии, Nagasaki и др. разработали наногели на основе DEAEMA с ядром-оболочкой, используя группы PEG в качестве оболочки (Tamura et al., 2010, Oishi et al., 2007, Tamura et al., 2009). Наногели с короткими цепями PEG массой 1 800 г/моль показали жизнеспособность 50 % клеток при концентрации 10 µг/мл, в то время как прививка более длинных цепей массой 8 000 г/моль привела к жизнеспособности более 70 % клеток при концентрации 100 µг/мл. Значения дзета-потенциала положительно заряженных наногелей ограничены низкими положительными значениями из-за препятствующей поверхности цепи PEG. Дзета-потенциал около + 20 мВ получен для полностью кватернизованных наногелей, содержащих около 66 % (масс./масс.) положительно заряженного мономера (Tamura et al., 2010). Для сравнения с другими наногелями, не содержащими PEG и не имеющими ядра- оболочки, дзета-потенциал + 30 мВ был получен для NIPAM-кватернизованного диметиламинопропилметакрилата (DMAPMA) при четырехкратном снижении концентрации амина в наногелях (Zhang, 2021). Этот результат подчеркивает концентрацию зарядов в ядре. Помимо экранирования положительного заряда, цепи PEG не препятствуют взаимодействию с клеточной мембраной, поскольку при доставке siRNA достигается более 50 % эффективности нокдауна генов. Цепи PEG мягкие, поэтому они могут реорганизовываться, чтобы обеспечить электростатическое взаимодействие между носителем и клеточной мембраной.

В рамках второго подхода в оболочку могут быть введены положительные заряды. Ограничение поликатиона на поверхности может повысить цитосовместимость за счет снижения общего количества аминов по сравнению с чистыми поликатионными наногелями. Такое снижение общей концентрации аминов может ограничить дестабилизацию лизосом и органелл. Кроме того, иммобилизация и ригидизация структуры дендритоподобных поликатионов, таких как разветвленный PEI, может ограничить токсичность мембраны. Li и др. работали над системами ядро-оболочка из разветвленного PEI плотностью 25 кДа, располагая PEI на поверхности. В одной из работ включение поли(метилметакрилата) (PMMA) в ядро наногелей PMMA-PEI привело к 3-кратному увеличению цитосовместимости по сравнению с нативным PEI (рис. 12, A и B) (Zhu, 2005). Несколько лет спустя были получены наногели с оболочкой из желатина и PEI, цитосовместимость которых была улучшена в 4 раза по сравнению с разветвленным 25 кДа PEI (рис. 12, C и D) (Mimi et al., 2012). В своей работе авторы предположили, что иммобилизация молекул PEI препятствует их многоцелевому связыванию с мембранами. В дополнение к цитотоксичности, опосредованной мембранами, может быть снижена и лизосомная токсичность; уменьшение общего количества аминов приводит к снижению буферной способности наногелей, тем самым ограничивая дестабилизацию лизосомных мембран. Действительно, в их работе относительная жизнеспособность клеток сравнивается в зависимости от массовой концентрации носителя, и поэтому при одинаковых массовых концентрациях наногелей наногель желатин-PEI обладает меньшим количеством PEI и меньшей буферной емкостью, чем PEI. Однако из-за относительно низкого массового соотношения желатина и PEI, использованного в данном примере (около 6 %), этот эффект может быть сдержанным.



Fig. 12. A) TEM of a PMMA-PEI core–shell nanogel. B) Cytotoxicity profiles of PMMA-PEI NP and PEI at various concentrations measured by MTT assay. C) SEM and TEM (top right corner) of gelatin-PEI core–shell nanogel. D) Cytotoxicity profiles of gelatin-PEI nanogels and PEI at various concentrations measured by MTT assay. Figure adapted with permissions from J. Zhu et al. (2005) and H. Mimi et al. (2012) (Zhu, 2005, Mimi et al., 2012).

Как упоминалось ранее, скорость поглощения наногелей связана с их механическими свойствами и, следовательно, с их цитосовместимостью. Поэтому важно оптимизировать их мягкость и способность к набуханию за счет настройки степени сшивания наногелей (рис. 13). Чрезмерно мягкие наногели деформируются и сплющиваются на клеточной мембране, провоцируя ригидность мембраны и препятствуя ее инвагинации (Desai, 2022). Это изменение мембраны сильнее для мягких, чем для жестких наногелей, и может вызвать клеточную дисфункцию при высоких концентрациях наногелей. Таким образом, увеличение степени сшивки является способом иммобилизации структуры и увеличения скорости ее поглощения.



Fig. 13. Strategies to reduce nanogel cytotoxicity.

В одной работе Peppas et al. варьировали молярное отношение дисульфида диметакрилата к сшивающему агенту от 0,3 до 5 в наногелях на основе DEAEMA и PEG и наблюдали повышение жизнеспособности клеток в клеточных линиях NIH 3T3, HEPG2 MDA-MB-231-eGFP и MCF-7/ADR (Spencer, 2021). Плотность сшивания влияет на способность к набуханию: при самом низком коэффициенте сшивания, равном 0,3, наногели имеют в 3 раза меньший коэффициент набухания по сравнению с самым высоким коэффициентом сшивания 5. Однако из-за коррелированных изменений в химическом составе поверхности из-за сшивания вывод о влиянии на токсичность не столь очевиден. Действительно, сшивание может индуцировать увеличение содержания PEG на поверхности, тем самым повышая биосовместимость.

Тем не менее, в другом примере те же эффекты наблюдаются на наногелях на основе PEGилированных PLL (Oishi et al., 2007). Здесь диметакрилат этиленгликоля (EGDMA) используется в качестве сшивающего агента и вводится в синтез наногеля в дозе 0,1 и 1 мол. Существенная разница в жизнеспособности клеток наблюдается уже при 1 мкг/мл. При 10-кратно более высоких концентрациях 0,1 % сшитых наногелей вызывают гибель всех клеток, тогда как жизнеспособность выше 80 % получается у 1 % сшитых наногелей. Таким образом, выделено влияние ригидности наногеля на биосовместимость.

В предыдущей главе II было показано, что контроль внутренней структуры наногелей имеет важное значение для загрузки и доставки генов. И в этом случае трехмерная структура является ключом к достижению низкого профиля токсичности. Даже если взаимодействие между клетками и наногелями происходит через их поверхности, клеточная интернализация представляет собой сложный трехмерный процесс, на который влияет внутренняя природа векторов. С одной стороны, внутренняя химия может диктовать подвижность поверхности. Токсичность мембраны может быть снижена за счет увеличения жесткости наногеля за счет плотности сшивания. С другой стороны, внутренняя структура в основном управляет набуханием и буферной способностью наногелей и, таким образом, также влияет на лизосомную цитотоксичность.

После смерти нескольких пациентов в клинических исследованиях из-за неожиданного иммунного ответа, вызванного введением генных продуктов на основе вирусных векторов, в настоящее время более жизнеспособным подходом становятся не-вирусные носители (Srivastava, 2020). Несмотря на то, что вирусные векторы быстро открыли некоторые двери, необходимо приложить больше усилий, чтобы понять альтернативные механизмы клеточного поглощения для безопасной трансфекции материалов, не вызывающих иммунного ответа, или, другими словами, сделать наиболее безопасные переносчики более эффективными. Действительно, безопасность должна быть в приоритете, а не потенциальное проведение лечения. Эти ошибки преподали нам уроки и наставили на будущее. В некотором смысле генотерапия все еще находится на ранних стадиях; До сих пор мало что до конца известно о механизмах трансфекции и цитотоксичности, индуцированной наночастицами.

В соответствии с этим подходом были разработаны наногели. Для этого были созданы аминосодержащие и положительно заряженные транспортеры, которые комплексуются с нуклеиновыми кислотами и взаимодействуют с клеточными мембранами для интернализации посредством электростатических взаимодействий. Эти иммунонеактивные материалы были успешны в трансфекции малых и больших нуклеиновых кислот. Тем не менее, проблемы токсичности остаются из-за наличия положительных зарядов. Было обнаружено, что электростатические взаимодействия с использованием аминов очень эффективны для конденсации нуклеиновых кислот, взаимодействия с клеточными мембранами и эндосомами для внутриклеточного поглощения, это объясняет подавляющее большинство систем поликатионных наногелей. Цитотоксичность, вызванная наногелями, вызванная структурными изменениями в клеточной мембране, лизосомах или органеллах, должна точно контролироваться, чтобы обеспечить обратимую дестабилизацию и эффективность трансфекции, но должна быть ограничена, чтобы избежать необратимых модификаций.

В качестве альтернативы заряженным наногелям разработаны лигандные подходы к построению лишенных заряда наногелей. Несмотря на то, что эффективность трансфекции, до сих пор неясно, как они могут быть интернализированы в клетках (Blackburn et al., 2009, Lee et al., 2007, Dickerson, 2010). Для продвижения этого подхода необходимо провести дополнительные исследования биохимических процессов на молекулярном уровне. Кроме того, процесс масштабирования и производства будет более сложным и дорогим, чем для простых заряженных наногелей. Тем не менее, другие нагружающие взаимодействия, отличные от электростатических, такие как водородные связи, гидрофобные взаимодействия или химические присоединения, все еще нуждаются в изучении. Комбинаторные методы также могут быть использованы для оптимизации трансфекции.

Необходимо также проектировать более совершенные конструкции. Одним из примеров является разработка наногелей «ядро-оболочка». Разработка трехмерной структуры может улучшить использование свойств чувствительности. Температура, по-видимому, является многообещающим триггером для индуцирования объемного фазового перехода и доставки генов. В одном из примеров коллапс используется для высвобождения не-ковалентных комплексов полимеров-нуклеиновых кислот (Deshpande et al., 2018). Исключение голых малых нуклеиновых кислот из-за сужения пор наногеля еще необходимо исследовать в дальнейшем.

Еще одной разработкой в наногелях может стать введение фрагментов, преобразующих заряд. Транспортеры, изменяющие заряд, были разработаны для доставки лекарств, белков и генов (Yoon, et al., 2012, Zhang et al., 2015, McKinlay, 2017). Например, Haag et al. использовали внеклеточные и внутриклеточные условия опухоли для модификации плотности заряда цвиттерионного наногеля и внутриклеточной доставки цитохрома С (Zhang et al., 2015). Цитаконамид (СА)-функционализированные карбоксильные группы расщепляются при рН 5 с помощью реакции элиминации, катализируемой кислотой, превращая отрицательный поверхностный заряд в положительный для клеточного поглощения в течение нескольких часов, как показано на рис. Наногели, изменяющие заряд, по-видимому, обладают большим потенциалом для доставки генов. Переход от положительных значений к нейтральным может быть эффективной стратегией высвобождения нуклеиновых кислот из наногелей во внутриклеточных условиях.



Fig. 14. A) Zeta potential evolution of nanogels with various CA content as a function of pH. B) Zeta potential change over time at pH 5 and 7.4. C) Two-stage charge conversion of the CA nanogels. Reprinted with permission from X. Zhang et al. (2015) (Zhang et al., 2015).

Наконец, помимо оставшейся технической оптимизации и взгляда на светлое будущее генотерапии, необходимо установить этику. Действительно, когда безопасные и эффективные векторы будут готовы к коммерциализации, некоторые социальные и этические вопросы должны быть решены уже сейчас. Помимо лечения генетических заболеваний, модификации генома эмбрионов могут позволить нам контролировать их будущие эстетические аспекты тела или другие основные человеческие черты, такие как спортивные способности. Границу между болезнью и оптимизацией организма придется провести. В этом случае использование генотерапии может нуждаться в обосновании; «Надлежащее использование» и «неправильное использование», «ненормальное» и «нормальное» должны быть определены. Этот процесс может повлиять на общественную ценность толерантности. Очевидно, что скандал с «CRISPR-младенцами» не должен повториться, и что такого рода исследования должны быть тщательно оценены перед проведением. Кроме того, цена и доступность такого лечения могут усугубить неравенство. Несмотря на то, что мы еще не достигли этой точки, важно внимательно отнестись к потенциалу генотерапии. Помимо огромного научного и медицинского воздействия, это также повлияет на все общество.

Глядя на фантастический потенциал генотерапии, мы видим, что разработка безопасных и эффективных носителей для лечения генетических заболеваний, которые до сих пор не поддавались лечению. Действительно, несмотря на то, что терапевтические генетические материалы уже доступны в настоящее время, их векторизация в целевых областях по-прежнему считается узким местом генотерапии. Для этого полимеры показали себя очень универсальными инженерными инструментами. Сшитые наногели могут быть разработаны для решения всех проблем доставки генов, от загрузки генов до внутриклеточного высвобождения и экспрессии генов.

В течение последних двух десятилетий многие исследовательские группы разрабатывали наногели на основе синтетических и биополимеров с целью оптимизации эффективности трансфекции. Чувствительные свойства носителям придавали с помощью термо-, рН-, окислительно-восстановительных и фермент-чувствительных полимеров и сшивающих агентов. Также были исследованы различные методы полимеризации для получения более совершенных структур. Наконец, было изучено прикрепление нуклеиновых кислот к носителю посредством ковалентных связей и физических электростатических взаимодействий. Затем внутренняя и поверхностная химия была оптимизирована для ограничения токсичности, опосредованной мембранами, лизосомами и органеллами.

Из всей этой экспериментальной информации важно сделать один шаг назад и взглянуть на биологические клеточные процессы, чтобы понять механизмы доставки генов. На самом деле, несмотря на то, что оптимизация свойств наногелей дала отличные результаты в лаборатории, терапевтическое окно, находящееся между высокой эффективностью трансфекции и низкой цитотоксичностью, остается ограниченным, что ограничивает его применение в клинике и на рынке. Это ограничение остается в силе, поскольку трансфекция и цитотоксичность являются двумя взаимосвязанными параметрами. Наногели, нацеленные на трансфекцию, должны взаимодействовать с клеточными мембранами и модифицировать их структуру, провоцируя ее хрупкость. Таким образом, важно понимать биохимические механизмы, такие как взаимодействие рецепторов, процессы эндосомной интернализации или внутриклеточный цитоплазматический транспорт. Для этого химики и биологи должны работать вместе, чтобы раскрыть потенциал доставки генов и оказать большое положительное влияние на медицинские приложения. С помощью этого обзора мы намерены способствовать развитию такого рода междисциплинарного сотрудничества.