Только ли гены определяют онтогенез млекопитающих? Казалось бы, ответ на этот вопрос очевиден. Только гены являются основным фактором, определяющим выражение генотипических и фенотипических признаков в онтогенезе млекопитающих. Тем не менее, вне-генные (эпигенетические) факторы также играют ключевую роль в регуляции экспрессии генов в онтогенезе млекопитающих, начиная с оплодотворения яйцеклетки и формирования зиготы, через пре- и пост-имплантационное развитие зародыша, внутриутробное развитие, пред- и постнатальное развитие, последующие стадии онтогенеза и вплоть до смерти. Поэтому ооциты и эмбрионы млекопитающих являются очень хорошим объектом для анализа факторов, определяющих эпигенетические процессы регуляции экспрессии генов [1-4]. Анализ этих факторов может способствовать более глубокому пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе транскрипционного перепрограммирования (т.е. эпигенетических перестроек) ядерного генома в процессе развития эмбрионов, полученных в результате как оплодотворения in vivo, так и современных вспомогательных репродуктивных технологий (ARTs), включая экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) путем совместного культивирования гамет или интрацитооплазматической инъекции сперматозоидов (ICSI), а также клонирование путем переноса ядер соматических клеток (SCNT). Современные знания о факторах, определяющих эпигенетическое перепрограммирование генома на ранних стадиях эмбрионального развития, все еще противоречивы и фрагментарны [5-8].

Молекулярные сценарии эпигенетической регуляции экспрессии индивидуальных генотипических и фенотипических характеристик определяются процессами, дифференцирующими степень полезности информации, хранящейся в одинаковых нуклеотидных последовательностях ДНК, и процессами, определяющими варьирующий профиль будущей транскрипционной активности генов в клетках организма [9-12]. Эпигенетическая информация, в отличие от генетической, которая хранится в нуклеотидных последовательностях ДНК (т.е. в первичной структуре ДНК), закодирована в структуре и функциях ковалентных модификаций ДНК и связанных с ДНК гистоновых белков ядерного хроматина. Качественным и количественным анализом этих модификаций занимается крупная область молекулярной генетики, называемая эпигенетикой или эпигеномикой. Эпигенетика имеет дело с наследственными функциональными изменениями, как в клеточных паттернах, так и в количественном профиле экспрессии генов. Эти изменения возникают не в результате наследственных изменений нуклеотидных последовательностей ДНК (генных мутаций), а в результате стабильных, но обратимых биохимических модификаций ДНК и гистоновых белков ядерного хроматина, которые передаются следующим поколениям дочерних клеток. На практике эпигеномика описывает механизмы внегенетической биохимической регуляции структурных и функциональных свойств ДНК и белков хроматина, в результате которой генетически идентичные клетки данного индивидуума, а также генетически идентичные особи данного вида (монозиготные близнецы) демонстрируют различную (тканеспецифическую) экспрессию генов, что лежит в основе межклеточной или межвидовой фенотипической вариации [13-15]. Межвидовые различия в эпигенетических паттернах геномных модификаций выявляют генотипическую и фенотипическую вариабельность не только между генетически близкородственными особями (дизиготные близнецы, полусибсы, особи инбредных линий), но и между генетически идентичными особями данного вида (рис. 1) [16-19]. У человека последствия диверсификации эпигенетического контроля геномной активности у близкородственных или моногенетических особей проявляются в различиях восприимчивости (чувствительности или устойчивости) к нейродегенеративным заболеваниям, психическим болезням [20-27] и онкологическим заболеваниям [28-31]. Была предпринята попытка связать эпигенетические различия между генетически идентичными индивидами (монозиготными близнецами) и их различной сексуальной ориентацией [32-33]. У людей зафиксированы случаи пар женских и мужских монозиготных близнецов, когда одна сестра-близнец была гомосексуальной, а другая - гетеросексуальной, или один брат-близнец был гетеросексуальным, а другой - гомосексуальным; при этом необходимо учитывать, что каждый из близнецов воспитывался в одной и той же семейной среде и подвергался одним и тем же социокультурным влияниям [34, 35]. Различия в эпигенетических модификациях ядерной ДНК также отражаются в генотипических и фенотипических различиях между клонированными особями (донорами соматических клеток для клонирования) и их клонами (репликами близнецов), а также между самими клонированными особями (соматическими клонами) [36,37]. Эти различия отражаются в разном эпигенетическом возрасте, что связано не только с разной скоростью укорочения теломер в постнатальный период (детство и взрослость), но и в период эмбрионального и фетального развития с разной биокаталитической активностью теломеразы - фермента, восстанавливающего исходную длину теломер в каждом цикле деления клетки и в каждом раунде репликации ДНК. Поскольку в период постнатального развития активность внутриклеточной теломеразы подавляется (за редким исключением, включая зародышевые клетки, лейкоциты периферической крови и раковые клетки), способность к обновлению теломер также полностью утрачивается. Это, в свою очередь, отражается в различиях внутригрупповой восприимчивости к репликативному и физиологическому клеточному старению у разных клонированных особей, входящих в моногенетическую популяцию соматического клона, каждый представитель которой является точной копией клонированной особи [38-41].



Fig. 1. Epigenetically conditioned intra- and inter-population diversification as a major cause of genotypic and phenotypic variability not only between specimens characterized by a very high degree of consanguinity (i.e., additive genetic relationship and coefficient of inbreeding), but also between genetically identical individuals of the same mammalian species.

Полный паттерн и уровень стабильности эпигенетических модификаций ядерного генома и гистоновых белков ядерного хроматина (эпигенома) лежат в основе эпигенетической памяти клетки со строго определенным (тканеспецифическим) паттерном экспрессии генов, который, в свою очередь, определяет степень клеточной дифференцировки. Профиль эпигенетической памяти клетки - это информация, хранящаяся в виде эпигенетического кода, последовательности которого сгруппированы, запрограммированы и считываются сложным образом, то есть на уровне двух основных структурно-функциональных систем: 1) эпигеномного кода метилирования ДНК (метилома) и 2) гистонового эпигеномного кода хроматина (гистонового эпигенома). Поэтому профиль эпигенетической памяти зависит, с одной стороны, от частоты метилирования ДНК и гистонов и степени ацетилирования гистоновых белков, с другой - от положительных или отрицательных корреляций между этими двумя типами ковалентных модификаций, а также от соотношения сайтов метилирования ДНК к сайтам метилирования и деацетилирования гистонов или соотношения сайтов деметилирования ДНК к сайтам деметилирования и ацетилирования гистонов [2], [42-44].

Эпигеномные модификации приводят к изменениям в степени экспрессии генов. Изменения транскрипционной активности генов происходят в результате нуклеосомной репрессии/супрессии (т. е. замалчивания генов), которая вызывается: 1) гиперметилированием лизиновых остатков ДНК и гистонов; 2) деметилированием аргининовых остатков гистонов и 3) гипоацетилированием лизиновых остатков гистонов ядерного хроматина. Они также могут происходить через стимуляцию транскрипционной активности генов (т.е. усиление экспрессии генов), что сопровождается: 1) деметилированием остатков цитозина ДНК и остатков лизина гистонов; 2) гиперметилированием остатков аргинина гистонов и 3) гиперацетилированием остатков лизина гистонов H3 и H4 [5], [11], [45, 46].

Информация, запрограммированная в эпигенетическом коде, который определяется последовательностью ковалентных модификаций ДНК и белков ядерного хроматина, наследуется, но иначе, чем информация, содержащаяся в генетическом коде, который определяется последовательностью нуклеотидов ДНК. Высокая наследуемость фиксированного профиля эпигенетической памяти клеток с их паттерном экспрессии генов подтверждает высокую трансгенерационную стабильность эпигенетического кода в родительских клеточных линиях и в их потомках (дочерних клеточных линиях). В свою очередь, аномальное наследование эпигенетической памяти часто приводит к неправильным перестройкам (эпимутациям) в паттернах ковалентных модификаций ДНК и ядерного хроматина в последующих поколениях клеток. Аномальное наследование эпигенетического кода происходит в результате неправильного или неполного перепрограммирования транскрипционной активности ядерного генома в клетках развивающихся эмбрионов. Эти аномалии также обусловлены молекулярными ошибками, сопровождающими эпигенетические перестройки ДНК и ядерного хроматина в клетках, подвергающихся дифференцировке, пролиферативной активности, старению, некротической, апоптотической или аутофагической гибели, неопластической трансформации в различных тканях, отдельных органах и системах органов у образцов на разных стадиях фетального, пре- и постнатального развития, а также на последующих этапах онтогенеза. Отмеченные выше аномалии также являются непосредственной причиной эпимутаций, накапливающихся в последовательных наборах ковалентных модификаций ДНК и ядерного хроматина в линиях дочерних эмбриональных клеток, а также стволовых, соматических и раковых клеток, которые дифференцируются и размножаются в различных тканях и органах плода, новорожденного, юноши, взрослого и стареющего человека [7], [47-50].

Предварительный этап перепрограммирования транскрипционной активности родительских геномов в ооцитах стадии метафазы II (MII) и в одноклеточных бластомерных эмбрионах млекопитающих (зиготах) происходит путем структурного (архитектурного) и эпигенетического ремоделирования ядерного хроматина (рис. 2, рис. 3). Оно включает все конформационные и биохимические изменения, затрагивающие женский (материнский) и мужской (отцовский) ядерный хроматин в результате оплодотворения мейотически созревшей (MII-стадия) яйцеклетки одним сперматозоидом [5,10]. После активации оплодотворенных ооцитов (зиготы) эти структурные и функциональные изменения приводят к появлению интерфазных клеточных ядер (пронуклеусов). Механизм эпигенетического ремоделирования ядерного хроматина материнской яйцеклетки и ядерного хроматина отцовской (яйцеклетки/сперматозоида) связан с интенсивными ковалентными модификациями лизиновых и аргининовых остатков гистоновых белков ядра нуклеосом (в основном гистонов H3 и H4) [2], [51].



Fig. 2 . Preliminary phase of reprogramming the transcriptional activity of nuclear genome in the cytoplasm of mammalian oocyte – structural and epigenetic remodeling of maternal and paternal chromatin before activation of embryonic developmental program.



Fig. 3. Preliminary phase of reprogramming the transcriptional activity of nuclear genome in the cytoplasm of mammalian oocyte and zygote – structural and epigenetic remodeling of maternal and paternal chromatin after activation of embryonic developmental program.

До активации программы развития ооцита на стадии MII в результате оплодотворения на хроматин женского и мужского геномов воздействуют присутствующие в ооплазме белковые факторы, которые эпигенетически регулируют уровень транскрипционной активности материнского и отцовского генома (рис. 2) [1], [11], [52]. К этим факторам относятся: 1) ДНК-метилтрансферазы (метилазы) - DNMTs (включая изофермент DNMT1o, специфичный для ооцитов); 2) белки с метил-CpG-связывающим доменом/5-метилцитозин-связывающие белки; 3) ингибиторы H3 и H4 гистоновых ацетилтрансфераз (ацетилаз) - iHATs; 4) гистоновые деацетилазы - HDACs; 5) метилтрансферазы (метилазы) лизина гистонов - HMTs; 6) ингибиторы деметилазы (дейминазы) лизина гистонов - iHDMs; 7) деметилазы (дейминазы) аргинина гистонов - HDMs; и 8) ингибиторы метилтрансферазы (метилазы) аргинина гистонов - iHMTs.

Воздействие этих факторов приводит к прогрессированию процессов метилирования/деацетилирования лизиновых остатков гистонов H3 и H4 и процессов деметилирования аргининовых остатков этих гистонов [53-55]. Следует подчеркнуть, что деацетилирование гистонов положительно коррелирует с метилированием ДНК и метилированием лизиновых остатков гистонов [56,57]. Эти процессы приводят как к конденсации женского и мужского хроматина (т. е. гетерохроматинизации материнского и отцовского генома), так и к транскрипционной репрессии родительских геномов (рис. 2).

В свою очередь, после активации программы развития моноспермического оплодотворенного ооцита MII стадии на женский и мужской хроматин воздействуют ооплазматические и нуклеоплазматические факторы (антагонистичные вышеописанным), которые регулируют транскрипционную активность родительских геномов (рис. 3) [15], [58,59]. Среди этих факторов жизненно важную роль играют: 1) ингибиторы ДНК-метилтрансфераз (метилаз) - iDNMTs; 2) ингибиторы метил-CpG-нуклеотид-связывающих белков - iMeCPs/iMBPs; 3) ферментные белки TET (ten-eleven translocation proteins/ten-eleven translocation 5-methylcytosine (5-mC) dioxygenases) - активаторы транскрипции, катализирующие активное деметилирование цитозиновых остатков ДНК; 4) ацетилтрансферазы (ацетилазы) гистонов H3 и H4 - HATs; 5) ингибиторы деацетилаз гистонов - iHDACs; 6) ингибиторы гистон-лизин метилтрансфераз (метилаз) - iHMTs; 7) гистон-лизин деметилазы (дейминазы) - HDMs; 8) гистон-аргинин метилтрансферазы (метилазы) - HMTs; 9) ингибиторы гистон-аргинин деметилазы (дейминазы) - iHDMs; а также 10) белковые комплексы с АТФазной активностью, отвечающие за архитектурное ремоделирование хроматина - ChRs (chromatin remodelers).

Воздействие этих факторов приводит к таким процессам, как: деметилирование/ацетилирование остатков лизина и метилирование аргининовых молекул гистоновых белков [60,61]. Здесь необходимо подчеркнуть, что ацетилирование гистонов положительно коррелирует с деметилированием ДНК и деметилированием лизиновых остатков гистонов [44], [62,63]. Эти процессы сопровождаются: 1) деконденсацией материнского и сперматозоидного хроматина, то есть эухроматинизацией женского и мужского ядерного генома, а впоследствии - после восстановления ядерной оболочки - 2) формированием интерфазных ядер зиготы (меньшего женского пронуклеуса и большего мужского пронуклеуса) и 3) транскрипционной активацией родительских геномов (рис. 3).

Репрограммирование транскрипционной активности геномных ДНК ооцит-специфического/материнского и спермато-специфического/отцовского происхождения (рис. 4) включает в себя биохимические изменения (которые происходят в два этапа не только в цитоплазме оплодотворенных ооцитов, но и в пре- и постимплантационной фазе развития эмбриона) в рамках информации, заложенной в виде эпигенетического кода на уровне метилирования ДНК (метилома) и на уровне эпигенома гистонов ядерного хроматина [5,6], [45,48].



Fig. 4 . Schema of epigenetic remodeling and reprogramming of nuclear genome during preimplantation development of murine embryos. Explanation of abbreviations: 0–10hpf – 0–10 h post fertilization; E2.5 – embryo at Day 2.5 of development (embryo at the morula stage); E3.5 – embryo at Day 3.5 of development (embryo at the blastocyst stage); ICM – inner cell mass; PE – primitive endoderm; TE – trophectoderm.

На первом этапе эпигенетическое перепрограммирование родительских ядерных геномов включает двухцикловую волну интенсивного активного (независимого от репликации) деметилирования остатков цитозина отцовской ДНК и волну пассивного (зависимого от репликации) деметилирования остатков цитозина материнской ДНК, которые сопровождаются гиперацетилированием и деметилированием лизина гистонов (в основном H3 и H4) и метилированием остатков аргинина гистонов H3 и H4. Начальная фаза (цикл I) этих ковалентных модификаций ДНК и гистоновых белков мужского и женского ядерного хроматина происходит между стадией зиготы и стадией развития эмбриона, что предполагает инициацию транскрипционной активности эмбрионального генома, т.е. переход от материнского к эмбриональному контролю экспрессии генов, необходимых для дальнейшего развития [55,57,60,64,65]. Транскрипционная активация эмбрионального генома начинается в разные периоды предимплантационной фазы эмбриогенеза у разных видов млекопитающих, например, на ранней 2-клеточной стадии у мышей, на поздней 4-бластомерной стадии у свиней, крыс и приматов (включая человека), на 8-16-бластомерной стадии у кроликов и жвачных животных (крупный рогатый скот, овцы, козы). Заключительная фаза (цикл II) деметилирования остатков цитозина ДНК, а также ацетилирования и деметилирования остатков лизина и метилирования остатков аргинина гистоновых белков происходит между стадией развития, наступающей после транскрипционной активации эмбрионального генома, и стадиями морулы и бластоцисты [37,66,67].

Второй этап эпигенетически обусловленного перепрограммирования транскрипционной активности геномной ДНК начинается, когда развивающийся эмбрион достигает стадии продвинутой постимплантационной бластоцисты, проходящей гаструляцию. Этот этап эпигеномной перестройки ядерного генома характеризуется быстрой волной de novo метилирования цитозиновых остатков ДНК в эмбриобласте/внутриклеточной массе (ICM), которые впоследствии дифференцируются в клетки эпибласта (первичной эктодермы) и гипобласта (первичной эндодермы). Кроме того, необходимо упомянуть о механизме положительной обратной связи между процессами переметилирования ДНК и процессами de novo деацетилирования и метилирования остатков лизина и de novo деметилирования остатков аргинина гистонов ядра нуклеосомы. В соматических (соматогенных) клеточных линиях, происходящих из специализированных ICM-клеток, которые постепенно становятся детерминированными для формирования эпибласта и гипобласта, глобальные эпигенетические модификации количественно восстанавливаются в виде переметилирования остатков цитозина в составе CpG-динуклеотидов. Тем не менее, в этом последнем случае в результате тканеспецифической дифференцировки клеток устанавливается совершенно новый эпигенетический код. В вне-эмбриональных клетках, полученных из клеточной линии трофэктодермы, поддерживается гипометилирование ядерного генома [45,68-70].

В данном подразделе статьи представлен сравнительный аналитический обзор и глубокая интерпретация межвидовых эпигенетических сближений и расхождений в транскрипционном перепрограммировании генома с особым акцентом на их зависимость от современных ARTs (клонирование на основе SCNT, ЭКО, ICSI) и методов эмбриональной геномной/эпигеномной инженерии.

Независимо от вида млекопитающих, одну из важнейших ролей в эпигенетическом перепрограммировании посттрансляционно играет ковалентная модификация на основе триметилирования (me3) лизина 9 молекул нуклеосомного ядра гистона H3 (H3K9), которая приводит к гетерохроматинизации и глушению транскрипционной активности генов в различных типах клеток и преимплантационных эмбрионах. Подобное состояние было подтверждено в эмбрионах макак, полученных методом SCNT [71], их аналогах - человеческих [72], мышиных [73], бычьих [74], [75], козлиных [37], свиных [76], [77] и буйволиных [78], а также во множестве соматических клеток и эмбрионов млекопитающих [72,75,79,80], включая их аналоги, полученные методом ЭКО [37]. В то время как обширные процессы пассивного и активного деметилирования ДНК происходят на ранней доимплантационной стадии развития в оплодотворенных in vivo эмбрионах человека и других видов млекопитающих [81-83], Liu et al [73] и Rodriguez-Osorio et al. [36] сообщили, что аберрантно перепрограммированные донорские ядерные геномы мышиных и бычьих SCNT-эмбрионов на стадии 4-х бластомеров демонстрируют относительно гиперметилированный статус по сравнению с их аналогами после одного деления расщепления. Согласно исследованию Liu et al. [73], анализ, направленный на определение профилей экспрессии ферментов семейства DNMT и TET, показывает, что дифференциальные транскрипционные уровни генов Dnmt1 и Tet1 могут оказывать преимущественное влияние на неправильное и дисрегулярное метилирование ДНК в ядерно-трансфецированных эмбрионах мыши, подвергшихся блоку расщепления между 2- и 4-бластомерными стадиями, во время нарушения материнско-эмбрионального перехода (MET) контролирующего транскрипционную активность. Точные исследования, направленные на выявление корреляции между эпигенетическими модификациями, связанными с H3K9me3, уровнями метилирования ДНК и подавлением или инициацией/поддержанием транскрипционной активности, привели, с одной стороны, к выявлению отрицательной корреляции между частотой встречаемости H3K9me3 на промоторах генов и степенью экспрессии генов в соматических клетках ядерных доноров и клонированных эмбрионов на 2-бластомерной стадии. С другой стороны, была показана положительная корреляция между количественными профилями модификаций H3K9me3 и уровнями метилирования ДНК на промоторах генов [73]. Liu и соавторы продемонстрировали, что одновременная интраооплазматическая микроинъекция мРНК, кодирующих H3K9me3-специфическую деметилазу (Kdm4b) и H3K4me3-специфическую деметилазу (Kdm5b), перед SCNT эффективно отменяет гиперметилированный статус ДНК у клонированных эмбрионов мыши между 2-клеточной и бластоцистной стадиями [73]. Учитывая важность Kdm5b как H3K4me3-селективной деметилазы и роль H3K4me3 как одной из меньшинства меток метилирования гистонов, ответственных не за репрессию транскрипции, а за активацию транскрипции, возможно, что модификация H3K4me3 с первичной эпигенетической памятью, унаследованной от ядерно-специфической сигнатуры клеток-доноров, также может быть подавляющим препятствием для функционального перепрограммирования транскрипционных профилей в SCNT-опосредованном эмбриогенезе у таких видов позвоночных, как мыши [73], амфибии/anurans Xenopus laevis [84] и человек [84], а также крупный рогатый скот [7]. Тем не менее, деметилирование H3K4me3-ассоциированных меток путем эктопической сверхэкспрессии Kdm5b ослабило эпигенетическую память, направленную на транскрипционную активность генов, высоко экспрессируемых в ядерных соматических клетках доноров и клонированных эмбрионов (но не в их оплодотворенных in vitro аналогах), а также привело к повышению эффективности размножения SCNT-произведенных бластоцистов и/или потомства [7,73,84].

Вышеупомянутые результаты дают механистические доказательства существования межтранскриптомной и межпротеомической связи между метилированными метками лизина в молекулах гистона H3 в нуклеосомном ядре и метками метилирования, обнаруженными на остатках цитозина в ядерном геноме. Кроме того, это подтверждает наличие комплементарного взаимодействия либо между специфическими гистоновыми метилтрансферазами и ДНК-метилтрансферазами, либо между ДНК-деметилазами, связанными с семейством TET, и селективными гистоновыми H3-деметилазами [73]. Как было доказано в исследовании Matoba et al. [85], соматические клетки ядерных доноров часто характеризуются высоким уровнем метилирования ДНК и одновременной повышенной частотой встречаемости H3K9me3. После активации ооцитов, полученных методом SCNT, клонированные эмбрионы мыши подвергаются глобальному деметилированию ДНК, хотя деметилирование не прекращается на стадии поздних одноклеточных бластомеров и требуется несколько этапов репликационно-независимого стирания/удаления унаследованных от ядерной ДНК соматических клеток паттернов метилирования в пределах гиперметилированных кластеров CpG-островков/динуклеотидов. Учитывая тот факт, что нарушения развития у эмбрионов с ядерным переносом в первую очередь происходят во время активации эмбрионального генома (EGA), также называемой материнско-эмбриональным переходом (MET), контролирующим транскриптомный механизм, который преимущественно начинается на стадии 2 бластомеров у мышей и между стадиями 4 и 8 клеток у свиней, крупного рогатого скота и человека [86], было предположено, что процесс EGA у клонированных эмбрионов связан с широким спектром функциональных нарушений в результате неопределенных эпигенетических барьеров, возникающих в геноме ядерных клеток-доноров. Хотя широкий спектр аберрантно экспрессируемых генов был идентифицирован у 2-клеточных бластомерных клонированных эмбрионах мыши [87-89] и в поздних преимплантационных клонированных эмбрионах человека [90], молекулярные механизмы, лежащие в основе ранее упомянутых эпигенетических препятствий и их взаимосвязи с неправильными событиями EGA до сих пор точно не установлены. Результаты исследования, проведенного Matoba et al. [85], подтвердили существование 222 геномных доменов, демонстрирующих устойчивость к EGA которые были обозначены как регионы, устойчивые к перепрограммированию (RRR). Было установлено, что они обогащены транскрипционно репрессивными модификациями H3K9me3, унаследованными от ядер клеток-доноров. Следует подчеркнуть, что у клонированных эмбрионов мыши на стадии 2-х бластомеров наблюдается большая частота сбоев в начале транскрипционной активности RRRs по сравнению с их аналогами, полученными с помощью ЭКО [85]. Таким образом, Были успешно применены два подхода к эпигеномной трансформации, направленные на стирание внутренних ковалентных модификаций на основе H3K9me3: либо экстернальное индуцирование трансляционной активности H3K9me3-селективной деметилазы (Kdm4d) путем микроинъекции пост- активированных ооцитов SCNT с транскриптами мРНК, кодирующими Kdm4d, либо вызвать двойную функциональную инактивацию изоформ H3K9-специфической метилтрансферазы (Suv39h1 и Suv39h2) путем нокдауна их генов в ядерных клетках-донорах. Оба эти подхода способствовали эффективному смягчению влияния RRRs на частоту нарушений в процессах EGA и, как следствие, привели к увеличению частоты возникновения достоверного и полного эпигенетического перепрограммирования [85].

Кроме того, исследование, проведенное Matoba и соавторами [85], было направлено на выявление возможного взаимодействия между представителем H3K9me3-специфических деметилаз под названием Kdm4d (трансляционно синтезируется из микроинъекционных транскриптов мРНК Kdm4d) и представителем не-специфических ингибиторов деацетилазы гистонов (HDAC) под названием трихостатин A (TSA; добавляется в среду для активации/пост-активационной обработки ядерно-трансфецированных мышиных ооцитов). Восьмичасовая обработка 1-клеточных бластомерных эмбрионов одним только TSA в концентрации 15 нМ привела к увеличению частоты образования бластоцист с 26,0 % до 53,8 %, как и в предыдущих исследованиях, посвященных клонированию соматических клеток мышей [91,92]. Однако сочетание микроинъекции мРНК Kdm4d с воздействием TSA привело к значительному увеличению процента образовавшихся бластоцист, составившему 87,5 %, что оказалось сопоставимо с показателем, наблюдавшимся только при микроинъекции мРНК Kdm4d (88,6 %). Это является эмпирическим обоснованием того, что комбинированная обработка SCNT-эмбрионов на стадии 1 клетки TSA и микроинъекция мРНК Kdm4d не влияют синергетически на процесс эпигенетического перепрограммирования в течение преимплантационного развития мышиных клонированных эмбрионов. Вышеуказанный вывод также позволяет предположить, что воздействие TSA может происходить по аналогичному сценарию, как и в случае с Kdm4d, и механистически связано с отменой избыточного уровня H3K9me3, что привело к неизменному результату развития ядерно-трансфецированных эмбрионов мыши в результате воздействия TSA в сочетании с микроинъекцией мРНК Kdm4d [85].

Напротив, исследования Liu и соавторов [71], направленные на успешную SCNT-опосредованную генерацию первых представителей нечеловеческих приматов, т.е, клонированных макак (Macaca fascicularis), предоставили убедительные эмпирические доказательства того, что микроинъекция пост-активированных SCNT-оцитов с мРНК-конструкциями, кодирующими Kdm4d, и одновременная 10-часовая обработка клонированных эмбрионов на стадии 1 клетки 10 нМ TSA в значительной степени способствовали весьма значимому улучшению таких параметров, как: (1) потенциал их развития до стадии бластоцисты; (2) частота наступления беременности после трансплантации перенесенных ядерных эмбрионов суррогатным самкам обезьян; и (3) эффективность размножения клонированных зародышей и потомства. Одновременно следует отметить, что иммунофлуоресцентное окрашивание клонированных эмбрионов макак, предварительно подвергнутых микроинъекции мРНК-конструкций, кодирующих Kdm4d, наглядно продемонстрировало, что частота встречаемости сайтов H3K9me3 в ядерном хроматине донорских клеток значительно снизилась до частоты, сопоставимой с частотой встречаемости эмбрионов макак, полученных с помощью ICSI. Более того, транскриптомный анализ подтвердил, что Kdm4d мРНК-опосредованная эпигеномная модуляция SCNT-полученных эмбрионов макак привела к повышению транскрипционной активности эмбрионального генома в донорских клетках, наследующих RRR, на стадии 8 бластомеров до уровня экспрессии генов, почти сопоставимого с таковым у ICSI-полученных эмбрионов макак [71].

В свою очередь, благодаря сочетанию биопсии эмбриона и секвенирования одноклеточного транскриптома (scRNA-seq), исследования Liu et al. [73] привели к обнаружению в общей сложности 7248 генов, которые, как было доказано, демонстрируют сигналы H3K9me3 на промоторах, резистентные к ядерному донору, в эмбрионах мыши, полученных в результате SCNT на стадии 2 клеток. Более того, было показано, что сигналы H3K9me3, вызывающие сопротивление, уменьшаются в Kdm4b мРНК-микроинжектированных клонированных эмбрионах на 2-клеточной стадии по сравнению с таковыми в клетках доноров ядер и не-микроинжектированных эмбрионах. Анализ на основе scRNA-seq в единичных бластомерах, полученных из клонированных эмбрионов с мРНК Kdm4b, подвергшихся микроинъекции, выявил, в значительной степени, реактивацию генов, ранее заглушенных эпигенетическими метками, связанными с сопротивлением сигналам H3K9me3 на их промоторах, характерным для ядерных доноров. Эти научные данные дают молекулярное представление о ключевой роли H3K9me3-опосредованных модификаций в транскрипционно перепрограммированном ядерном геноме эмбрионов, полученных в результате SCNT, как основного препятствия для клонированных эмбрионов. Примечательно, что этот эпигенетический барьер подвергается неправильному или неполному устранению в SCNT-полученных эмбрионах, арестованных на стадии 2-х бластомеров. Более того, Kdm4b играет важную функцию в качестве внутреннего стирателя препятствий H3K9me3 во время преимплантационного развития клонированных эмбрионов, ускоряя события EGA [73]. Согласно исследованию Antony et al. [93], не вызывает сомнений, что эктопическое включение экспрессии Kdm4b в мышиных эмбриональных стволовых клетках (служащих донорами ядер) приводило к усилению развития in vitro с внесенными ядрами эмбрионов на 30 %. Исследования Liu et al. [73] продемонстрировали значительное увеличение уровня экспрессии Kdm4b в бластоцистах, развивающихся из эмбрионов, полученных в результате SCNT, биопсированных на стадии 2-х бластомеров, по сравнению с их биопсированными аналогами, арестованными на стадии 2 клеток. Этот вывод указывает на то, что скорее повышение трансляционной активности мРНК Kdm4b, а не повышенные количественные профили Kdm4d, может быть обязательным условием для внутренних эпигеномных механизмов, необходимых для преодоления H3K9me3-опосредованной транскрипционной задержки у клонированных эмбрионов. Эпигенетическая инактивация гена Kdm4b, достигнутая путем микроинъекции коротких интерферирующих РНК (siRNA), нацеленных на аллель Kdm4b, в энуклеированные ооциты стадии метафазы II (MII), вызвала значительное снижение скорости образования бластоцист, отмеченное для мышиных эмбрионов, полученных в результате SCNT. Напротив, возможности развития эмбрионов, полученных методом SCNT, до стадии бластоцисты были значительно повышены благодаря микроинъекции мРНК Kdm4b в оопласты MII, подвергшиеся впоследствии клонированию соматических клеток, и эти возможности оказались даже выше, чем у оопластов, подвергшихся микроинъекции с конструкциями мРНК, кодирующими Kdm4b [73].

Стоит также отметить, что, помимо остановки развития эмбрионов мышей, полученных методом SCNT, которые начинают быть транскрипционно активными на стадии 2-х бластомеров, также признано, что блок расщепления 4-бластомеров преимущественно происходит во время эмбриогенеза SCNT. По этой причине многогранное исследование функциональных ошибок в транскриптомных сетях, возникающих в результате ошибочной экспрессии (повышения или понижения регуляции) внутренних эпигенетических факторов, определяющих репрограммирование ядер донорских клеток в течение MET-ассоциированного блока расщепления на стадии 4-х бластомеров, было признано чрезвычайно важным [73]. Burton et al. [94] продемонстрировали, что повышенная транскрипционная активность генов, кодирующих внутренние модификаторы плюрипотентности, по-видимому, ответственна за повышенную способность оплодотворенных in vivo эмбрионов мыши завершить свое развитие до стадии бластоцисты. Кроме того, Liu et al. [73] дали научное обоснование тому, что в общей сложности 5 генов в кластере генов, транскрипционно подавляемых в клонированных эмбрионах мыши, арестованных на стадии 4-х бластомеров, были признаны важнейшими детерминантами, сохраняющими статус плюрипотентности. В кластере этих генов преобладающая роль отводится гену, кодирующему лизин-гистоновую деметилазу, названному Kdm5b, который представлен как участник транскрипционной репрессии. Чтобы подчеркнуть исключительную значимость этого недавно открытого эпигенетического модификатора Kdm5b для потенциала развития эмбрионов, перенесенных с помощью ядерной трансфекции, перед клонированием на основе SCNT было проведено эктопически индуцированное подавление аллелей этого гена путем микроинъекции энуклеированных ооцитов MII стадии siRNA, селективно нацеленной на инактивацию гена Kdm5b. В результате было отмечено не только значительное снижение скорости образования бластоцистов, но и заметное ослабление параметров качества бластоцистов. Тем не менее, если избыточная экспрессия эпигенетического модификатора Kdm5b была вызвана интраооплазматической микроинъекцией мРНК, кодирующей эту гистон-лизиновую деметилазу, то частота возникновения блока дробления, связанного с 4 клеточными этапами, значительно снизилась, а эффективность генерации клонированных бластоцистов отличного качества значительно повысилась. Наконец, Kdm5b-опосредованная рекапитуляция верного перепрограммирования при правильных транскриптомных значениях, сопоставимых с теми, которые были определены для оплодотворенных in vivo у эмбрионов мыши [73]. Более того, было обнаружено, что одновременное интраооплазматическое совместное введение мРНК Kdm4b и Kdm5b синергично отменяет неправильное перепрограммирование транскриптомных ландшафтов соматических клеток в клонированных эмбрионах и, как следствие, точно восстанавливает безошибочные паттерны экспрессии генов, часто характерные для in vivo оплодотворенных эмбрионов мыши. Это Kdm4b+ 5b-опосредованное перекрестное взаимодействие привело не только к тому, что почти все мышиные эмбрионы, полученные в результате SCNT, достигают стадии бластоцисты (на уровне более 95 %), но и к тому, что более 11 % эмбрионов способны развиваться до родов [73].

Аналогично мышиным клонированным эмбрионам, проходящим процесс MET на стадии 2-х бластомеров [73], бычьи SCNT-эмбрионы, полученные на стадии 8 бластомеров, в которых начинает развиваться EGA демонстрируют состояние гиперметилирования хроматина в целом, определяемое по количественным профилям три- и ди-метилирования H3K9 (H3K9me3/2), однако до сих пор внутриклеточное понимание молекулярных причин этих эпигенетических сетей не дало глубокого объяснения этому явлению [74]. Учитывая результаты исследования Liu et al. [74], гены, кодирующие два изофермента H3K9-деметилазы, обозначенные как лизин-специфические деметилазы 4D (KDM4D) и 4E (KDM4E), вовлечены в процессы активного деметилирования H3K9me3/2 у бычьих эмбрионов, оплодотворенных in vitro, но их транскрипционная активность ослаблена в ядерно-трансформированных эмбрионах, проходящих EGA между 8- и 16-бластомерными стадиями. Кроме того, результаты исследования Liu et al. [74] подтвердили, что внутренний эпигенетический модификатор KDM4E играет более важную роль в контексте определения возможностей развития как ЭКО, так и SCNT-эмбрионов. Кроме того, немаловажное значение имеет многогранное молекулярное взаимодействие между изоферментом KDM4E и транскриптомным механизмом, что в значительной степени подчеркивает неизбежную функцию KDM4E-опосредованного деметилирования H3K9 в процессе инициации активности эмбрионального генома у бычьих оплодотворенных in vitro и клонированных эмбрионов. Все эти выводы были обоснованы тем, что относительное обилие транскриптов KDM4E, как оказалось, по меньшей мере в четыре раза выше, чем у их аналогов KDM4D в бычьих оплодотворенных in vitro и клонированных эмбрионах на стадии 8 бластомеров, на которой происходит MET [74]. Более того, было показано, что профили экспрессии мРНК KDM4D и KMD4E в эмбрионах, полученных в результате SCNT, значительно ниже, чем в эмбрионах, полученных в результате ЭКО и подвергшихся процессу EGA. По этой причине было установлено, что нехватка изоформы KDM4E H3K9-специфической деметилазы, которая может возникать из-за снижения транскрипции генов и/или уменьшения трансляционной активности транскрибируемых молекул мРНК, служит внутренним дефектным фактором, способствующим, благодаря синергетическому взаимодействию с изоферментом KDM4D, часто необратимому препятствию активности H3K9me3/2 для эффективного эпигенетического перепрограммирования в бычьих SCNT-выведенных эмбрионах [74]. В то время как недостаточная транскрипционная активность генов KDM4D и KDM4E, по-видимому, вызывает увеличение частоты повышенных уровней H3K9me3/2 в бычьих клонированных эмбрионах, эктопически индуцированная избыточная экспрессия присущего эпигенетического модификатора KDM4E, которая была вызвана интрацитооплазматической микроинъекцией пост-активированных SCNT ооцитов конструкциями мРНК KDM4E, способствовала рекапитуляции достоверного перепрограммирования транскриптомных ландшафтов, повышению скорости образования бластоцист и, наконец, повышению эффективности размножения клонированного потомства у крупного рогатого скота [74].

Соответственно, у эмбрионов человека, полученных методом SCNT, преобладающее влияние на способность проходить EGA и развиваться до стадии бластоцисты оказывает постепенное устранение эпигенетического препятствия, связанного с перепрограммированием, создаваемого триметилированием - опосредованной модификацией лизиновых остатков гистона H3 [72]. Ранее упомянутый эпигеномный барьер в клонированных эмбрионах человека оказался успешно преодолен благодаря повышению уровня экспрессии изофермента KDM4A H3K9me3-селективной деметилазы, который был запущен микроинъекцией пост-реактивированных SCNT-ооцитов с конструкциями мРНК на основе KDM4A. Эта стратегия привела к снижению количественных профилей эпигенетических меток, связанных с H3K9me3 [72]. Благодаря ускорению транскрипционного перепрограммирования унаследованного от донорских клеток ядерного генома было отмечено значительное улучшение, с одной стороны, скорости образования бластоцистов у микроинъецированных мРНК KDM4A и терапевтически клонированных эмбрионов. С другой стороны, наблюдается значительное повышение эффективности создания плюрипотентных и генетически аутологичных эмбриональных стволовых клеток (ESC) из этих эмбрионов стадии бластоцисты, развивающихся из активированных ядерно-трансферированных ооцитов, реконструированных с помощью соматических клеток, полученных от взрослых пациентов, страдающих подтипом возрастной макулярной дегенерации (AMD), обозначенным как central areolar choroidal dystrophy (CACD) [72].

В совокупности широкий спектр исследований дал прямое эмпирическое подтверждение частому возникновению дисрегуляций в эпигеномных сигнатурах у SCNT-полученных эмбрионов по отношению к их in vivo- или in vitro-оплодотворенным аналогам, что, в свою очередь, подтверждается выявлением таких аберраций в ядерном репрограммировании донорских клеток, как гиперметилирование ДНК у кроликов [95] и крупного рогатого скота [96], гипоацетилирование гистонов у крупного рогатого скота [47,[97] и гиперметилирование гистонов у свиней [98,99]. Тем не менее, недавно было продемонстрировано, что H3K9me3 является основным эпигенетическим препятствием для перепрограммирования транскриптомных ландшафтов в преимплантационной фазе эмбриогенеза, опосредованного SCNT. Это эпигенетическое препятствие, обогащенное в устойчивых к перепрограммированию регионах на протяжении всего процесса EGA было показано на клонированных эмбрионах человека и мыши [72,85]. Общие профили гиперметилирования, отмеченные как для триметилирования H3K9 (H3K9me3), так и для диметилирования H3K9 (H3K9me2), также были широко обнаружены при нарушении эпигенетического перепрограммирования транскрипционной активности геномной ДНК соматических клеток в клонированных эмбрионах свиньи и быка [98-102]. Приведенные выше результаты четко обосновывают существование унаследованной от донорских клеток ядерной модификации H3K9me3 как высоко-консервативного барьера развития (как на филогенетическом, так и на онтогенетическом уровнях), ограничивающего перепрограммирование эпигеномных и транскриптомных сигнатур в эмбрионах млекопитающих, полученных в результате SCNT. Наконец, в этом контексте стоит подчеркнуть, что идентификация видоспецифичных эпигенетических препятствий (obstacles), ослабляющих или замедляющих эмбриогенез у соответствующих видов млекопитающих, представляется самой сложной задачей для выхода из «ловушки низкой эффективности» как на современном этапе исследований, так и в ближайшем будущем исследований, направленных на размножение (propagating) и умножение эмбрионов с помощью таких современных методов ARTs, как SCNT-опосредованное клонирование и ЭКО путем совместного культивирования гамет или ICSI.

Неправильные перестройки в эпигенетическом ремоделировании и перепрограммировании ядерного генома эмбриона (эпимутации) приводят к аномальным изменениям в паттернах экспрессии генов, отвечающих за регуляцию эмбриогенеза [3,6,7,57]. Чрезмерное деметилирование остатков цитозина геномной ДНК, сопровождающееся гипометилированием и гиперацетилированием гистонов ядра нуклеосом ядерного хроматина, приводит к избыточной экспрессии этих генов [37,49,85,103]. В свою очередь, избыточное метилирование цитозиновых остатков ДНК, сохраняющее гиперметилирование и гипоацетилирование гистонов ядерного хроматина ядра, глушат транскрипционную активность генов, контролирующих эмбриогенез [5,48,68]. Эпигенетические мутации, которые часто наблюдаются у развивающихся эмбрионов животных и плодов, полученных с помощью таких методов ARTs, как клонирование соматических клеток и экстракорпоральное оплодотворение, приводят к многочисленным негативным последствиям. К наиболее серьезным последствиям эпимутаций относятся: 1) низкий пре- и пост-имплантационный потенциал развития эмбрионов [55]; 2) низкое качество преимплантационных эмбрионов [57]; 3) аномальная имплантация бластоциста в эндометрий, аномальная плацентация и многочисленные анатомо-гистологические дефекты плаценты [69,104]; 4) высокая пери-имплантационная и перинатальная смертность эмбрионов и плодов [105,106]; 5) высокая частота потери беременности (резорбция плода) в первом триместре гестации [107,108]; 6) неопластическая трансформация клеток у эмбрионов и плодов, а также в тканях и органах потомства [70], [109-113]; 7) аномальные процессы дифференцировки клеток в рамках их тканевой и органной специализации в ходе гисто- и органогенеза [70,108,113]; 8) пороки развития плода и потомства вследствие летальных или сублетальных анатомо- и гистопатологических эффектов в различных внутренних органах [114-116]; 9) появление фенотипических признаков, характерных для синдрома большого потомства (СБП), а также гиперплазии и гипертрофии плаценты, т. e., плацентомегалии (также называемой синдромом большой плаценты, СБП) [117-119]; а также 10) отсутствие спонтанных родов [109,110,120].

Не только потенциал пре- и пост-имплантационного развития, но и качество эмбрионов определяется степенью генетических модификаций их ядерного генома. Снижение транскрипционной активности может быть вызвано быстрым увеличением частоты таких изменений в эпигенетической памяти эмбриональных клеток (бластомеров), как: 1) процессы метилирования цитозиновых остатков ДНК и 2) процессы деацетилирования лизиновых молекул гистонов, образующих нуклеосомные ядра ядерного хроматина [5,42,44,48,49,55,57]. Однако эти биохимические преобразования ядерного генома, пагубные для физиологических функций и выживания бластомеров, могут быть подавлены, отменены/ослаблены или даже обращены вспять в сторону увеличения интенсивности экспрессии генов, благоприятной для метаболической и пролиферативной активности эмбриональных клеток. Одним из способов обратить вспять прогрессирующие изменения в паттерне ковалентных эпигенетических модификаций, включающих быстрое метилирование ДНК и снижение уровня ацетилирования гистоновых белков, представляется искусственная модуляция профиля эпигенетической памяти в ядерном геноме (рис. 5) путем воздействия на культивируемые in vitro соматические клетки, ооциты и/или эмбрионы млекопитающих синтетических аналогов ингибиторов собственных ДНК-метилтрансфераз (DNMTi), а также ингибиторов гистоновых деацетилаз (HDACi) [62,121,122]. К группе не-селективных ингибиторов DNMT относятся: 1) 5-азацитидин (5-аза-С) [63] и его производное 5-аза-2'-дезоксицитидин (децитабин; 5-аза-DC) [123-126];2) zebularine (1-(β-D-рибофуранозил)-2(1H)-pyrimidinone; нуклеозидный аналог цитидина) [127-129]; и 3) S-adenosylhomocysteine (SAH) [130]. В свою очередь, вторая группа экзогенных эпигенетических модуляторов, представляющая семейство не-специфических ингибиторов HDAC, включает в себя: 1) трихостатин А (N-арил/N-фенильное производное гидроксамовой кислоты; TSA) [131-133]; 2) scriptaid (6-(1,3-диоксо-1H,3H-benzo[de]isoquinolin-2-yl)-гексаноиновой кислоты hydroxyamide) [43,134,135]; 3) valproic acid (2-пропилпентаноиновая кислота/2-пропилвалериановая кислота; VPA) или вальпроат натрия (sodium 2-propylpentanoate/sodium 2-propylvalerate; SV) [136-138]; 4) oxamflatin (ароматическое/N-фенильное производное сульфонамида гидроксамовой кислоты) [139,140]; 5) бутират натрия (NaBu) [141-143]; и 6) m-carboxycinnamic acid bishydroxamide (CBHA) [122], [144-146].



Fig. 5 . Modulating profile of nuclear genome epigenetic memory in cloned caprine embryos generated by somatic cell nuclear transfer (SCNT).

Результаты всех вышеперечисленных исследований свидетельствуют о том, что использование ингибиторов DNMT и/или ингибиторов HDAC для искусственной трансформации профиля эпигенетической памяти в ядерном геноме культивируемых in vitro соматических клеток, ооцитов и эмбрионов различных видов млекопитающих (свинья, крупный рогатый скот, коза, овца, домашний як, дикий азиатский/водный буйвол - речной или болотный буйвол, леопардовый кот, мышь) оказывает положительное влияние на сложные процессы перепрограммирования транскрипционной активности генов. Этот положительный эффект выражается в восстановлении сценария достоверного и полного перепрограммирования эпигеномного и транскриптомного ландшафтов ядер клеток-доноров в развивающихся эмбрионах и плодах, а также в восстановлении правильного паттерна экспрессии ключевых групп генов (напр, генов, связанных с плюрипотентностью), в их клетках это происходит за счет увеличения частоты пассивного и активного деметилирования цитозиновых остатков ДНК и снижения интенсивности деацетилирования (т.е. усиления гиперацетилирования) лизиновых остатков гистонов ядерного хроматина [62,147,148]. Правильный процесс функционального перепрограммирования транскрипционных профилей геномной ДНК в эпигеномно трансформированных/модулированных эмбрионах, созданных с помощью ARTs, таких как SCNT-опосредованное клонирование, стандартное ЭКО через совместное культивирование гамет или микрохирургическое ЭКО через ICSI, приводит к: (1) повышение потенциала развития эмбрионов и плодов ex vivo и/или in vivo (измеряется процентом эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, процентом подов, развившихся до рождения, или процентом родившихся потомков по сравнению с контрольной не-модулированной группой); (2) повышение цитологического качества бластоцистов, оцениваемое на основе определения общего количества клеток; (3) снижение частоты аномалий развития и анатомо-гистологических дефектов плодов; а также (4) улучшение состояния физического здоровья (снижение заболеваемости/смертности) полученного потомства [55,56,127,149]. Сравнительный и многогранный аналитический обзор благоприятного влияния внешних модификаторов (представителей семейств не-специфических HDACi и/или DNMTi) на эпигенетическую перепрограммируемость транскрипционных профилей ядерного генома, компетенции развития и качественные параметры эмбрионов, полученных с помощью таких современных методов ARTs, как клонирование на основе SCNT или ЭКО, подробно представлен в таблице 1.

Таблица 1. Репрезентативные примеры преимущественного влияния эктопических эпигенетических модуляторов на транскрипционную перепрограммируемость, потенциал развития и качественные параметры эмбрионов млекопитающих, полученных с помощью современных ARTs (SCNT или ЭКО).

На современном этапе исследований искусственная эпигенетическая модуляция клеток также находит практическое применение в современной противораковой терапии (epigenetic therapies) [28,30,31,153-155]. С одной стороны, эпигенетическая терапия рака нового поколения направлена на использование эпигенетических модуляторов/модификаторов - экспериментально, доклинически, клинически и фармакокинетически проверенных на потенциальные онкогенные и тератогенные свойства - из группы неспецифических или специфических экзогенных ингибиторов DNMT и/или HDAC или из группы эктопических гистоновых ацетилтрансфераз/ацетилаз (HATs) и/или H3 и H4 гистоновых деметилаз лизиновых остатков (HDMs), вызывать относительно быструю и эффективную инактивацию каскада патогенетических процессов внутриклеточного канцерогенеза [156-161]. С другой стороны, целью этих инновационных методов эпигенетически обусловленной химиотерапии рака является запуск процессов необратимого разрушения (т.е. старения и гибели) неопластических/раковых клеток путем активации анти-митогенного/цитостатического профиля воздействия путей эпигеномно-зависимого подавления злокачественной онкогенной трансформации клеток [29,162-168]. Вышеупомянутые стратегии эпигенетической терапии рака все чаще используются в доклинических исследованиях и клинических испытаниях, направленных на разработку и оптимизацию лечения: 1) герминогенных опухолей (тератомы и дисгерминомы яичников, семиномы, хориокарциномы, медуллобластомы); 2) гематологические злокачественные опухоли (острый/хронический миелоидный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, множественная миелома, миелодиспластические синдромы, злокачественные неходжкинские В- и Т-клеточные лимфомы, лимфома Ходжкина); и 3) колоректальный (кишечник), рак простаты и молочной железы.

Кроме того, возросла применимость искусственной эпигенетической трансформации клеток с помощью эктопических ингибиторов DNMT и/или HDAC или ацетилаз и/или деметилаз лизиновых остатков гистоновых белков (HATs и/или HDMs) за счет их внедрения в современные эпитерапевтические методики, используемые не только для диагностики нейродегенеративных заболеваний у пациентов, но и для выявления заболеваний, входящих в существующие психиатрические классификации [20,158,169-175].

Эти инновационные методы эпигенетической терапии направлены на доклинические испытания и клиническую практику в случае таких нейродегенеративных заболеваний, как: 1) эпилепсия; 2) болезнь Альцгеймера; 3) болезнь Паркинсона; 4) болезнь Хантингтона (хорея Хантингтона); 5) рассеянный склероз (РС); и 6) боковой амиотрофический склероз (болезнь двигательных нейронов, болезнь Лу Герига - ALS) [176-189].

Вышеуказанные методы терапии нового поколения также находят все большее применение на доклинических и клинических этапах исследований, направленных на разработку современных и совершенствование существующих методов лечения психических заболеваний, таких как: 1) биполярное аффективное расстройство (маниакальная депрессия); 2) шизофрения; 3) большое депрессивное расстройство (клиническая депрессия); 4) аутизм; 5) деменция; 6) алкоголизм; 7) суицидальные, саморазрушительные и невротические тенденции [20-23,26,172,174], [190-194].

О значимости неправильных биохимических модификаций ДНК и хроматина как эпимутаций, определяющих возникновение различных фенотипов заболеваний, свидетельствует развитие биомедицинских баз данных, охватывающих взаимосвязи между генетическими (генные и хромосомные) мутациями и эпигенетическими мутациями в коде метилирования ДНК (метиломе), гистонового кода хроматина (гистоновый эпигеном), пространственной структуры (архитектуры) перестроек ядерного хроматина и развития генотипических и фенотипических признаков, характерных для определенных заболеваний [153,156,159,172,173,178,180,185]. Наиболее полным каталогом на сегодняшний день, учитывающим все эти взаимосвязи, является база данных DAnCER (Disease-Annotated Chromatin Epigenetics Resource) [183,184], [195-197].

На современном этапе исследований и в относительно ближайшем будущем представители некоторых классов искусственных эпигенетических модуляторов уже нашли или найдут практическое применение в эпитерапии нового поколения, которая может оказаться чрезвычайно ценным биомедицинским инструментом в лечении некоторых эпигенетических заболеваний человека. Прекрасным примером такой деятельности в медицинском и биофармацевтическом секторе являются эпигенетические терапии, направленные на клиническое лечение некоторых нейродегенеративных (например, эпилепсии) и психических (например, биполярного аффективного расстройства) заболеваний, а также клиническое лечение строго определенных неопластических гематологических заболеваний (например, миелодиспластические синдромы, лимфомы, острый/хронический миелоидный лейкоз), которые получили юридическое и биоэтическое одобрение и были одобрены Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (USFDA) [155,198,199].

Кроме того, результаты широкого спектра работ по разработке новых стратегий эпигенетических преобразований/модуляций, которые служат для повышения эффективности умножения и разведения эмбрионов у отдельных видов млекопитающих и пород сельскохозяйственных животных с использованием современных методов репродуктивной биотехнологии и гаметической/эмбриональной геномной инженерии (клонирование на основе SCNT, ЭКО или внутриядерная микроинъекция генных конструкций в зиготы), в силу их большой значимости для развития экономики и относительно высокого потенциала применения в сельском хозяйстве, промышленности и научно-исследовательском секторе, могут реально лидировать в ближайшем будущем и должны внести вклад в течение нескольких лет:

1) сохранение генетических ресурсов и создание генетических резерватов для исчезающих видов млекопитающих и эндемичных пород скота;.

2) восстановление и размножение субпопуляций исчезающих и редких видов млекопитающих и пород скота для сохранения биоразнообразия и повышения степени внутрипопуляционной и межвидовой генетической изменчивости;.

3) улучшение генетических (селекционных) и продуктивных достоинств сельскохозяйственных животных, в том числе их молочной, мясной и репродуктивной продуктивности;.

4) внедрение результатов разработок в различные отрасли отечественной экономики, в том числе в биотехнологический сектор сельского хозяйства, с целью получения биотехнологической животноводческой продукции для агропищевой и биофармацевтической промышленности; для ксенотрансплантации, регенеративной и восстановительной медицины и тканевой инженерии человека с использованием тканей сельскохозяйственных животных (особенно свиней); для доклинических и клинических испытаний; для создания in vitro и in vivo животных исследовательских моделей при лечении генетически обусловленных или приобретенных заболеваний человека.

Таким образом, выявление и всестороннее изучение молекулярных путей, связанных с возникновением видоспецифических или филогенетически и онтогенетически консервативных эпигенетических барьеров, нарушающих транскрипционную активность ядерного генома, может способствовать разработке и оптимизации стратегий, позволяющих отменить или преодолеть эпигеномные препятствия, связанные с памятью, у млекопитающих (включая человека и виды домашнего скота) путем повышения уровня устойчивых к перепрограммированию областей в геномной ДНК и хроматине. Это, в свою очередь, может позволить гораздо шире применять современные ARTs, такие как SCNT, ЭКО или ICSI, для терапевтического получения клонированных из соматических клеток или полученных с помощью ЭКО/ICSI эмбрионов, плодов и потомства, нацеленных на получение аутогенных или полуаутогенных/полуаллогенных трансплантатов на основе стволовых клеток, пригодных для биомедицинских и трансгенных исследований. Последние могут включать персонализированную, регенеративную и восстановительную медицину для людей и животных, страдающих от врожденных или приобретенных заболеваний, включая эпимутации.