Мы не обнаружили никакой разницы в общем соотношении нейронов к глии или возбуждающих нейронов к тормозящим нейронам. Кроме того, мы не наблюдали потери какого-либо подтипа нейронов при непатологическом старении, а также не наблюдали признаков увеличения реактивной микроглии в мозге пожилых людей (в возрасте более 65 лет) (расширенные данные на рис. 1 и дополнительная таблица 3). Однако мы выявили подкластеры нейронов и астроцитов, которые состояли исключительно или почти исключительно из ядер младенцев-доноров (рис. 2а). В целом, нейронный кластер, специфичный для младенцев, напоминал нейроны L2/3, но при более тщательном изучении были выявлены группы клеток в этом кластере, экспрессирующие маркеры нейронов L4 или L5/6 (расширенные данные, рис. 2), и выявлено, что гены, участвующие в развитии и миграции нейронов (рис. 2b), такие как такие, как SLIT3 и ROBO1, также были представлены в этой группе (дополнительные таблицы 4 и 5). Анализ данных MERFISH, полученных с помощью платформы Ultra от подгруппы из четырех доноров (0,4-летнего мужчины, 15-летней женщины, 28-летнего мужчины и 57-летнего мужчины), показал, что нейроны младенцев в основном демонстрировали правильную работу, ламинарное позиционирование с нейронами CUX2+ L2/3, нейронами RORB+ L4 и нейронами HS3ST4+ L5/620, демонстрирующими сходное распределение по донорам (рис. 2c, d и расширенные данные рис. 3). HS3ST4 также, по-видимому, маркирует нейроны белого вещества у всех доноров, подобно TLE4, каноническому маркеру L5/621. Эти данные позволяют предположить, что кластер L2/3-2 представляет собой незрелые возбуждающие нейроны, которые населяют различные слои неокортекса младенца. Астроциты, специфичные для младенцев, экспрессировали гены, отвечающие за развитие нервной системы, которые маркируют незрелые астроциты; например, HES5, ID4, MFGE8 и DCC (ссылки 22-24) (рис. 2b, дополнительные таблицы 4 и 5). Наш повторный анализ опубликованного набора данных snRNA-seq PFC человека, в котором изучалось развитие от плода до взрослого²⁵, подтвердил паттерны понижающей и повышающей регуляции генов, которые мы наблюдали в нейронах и астроцитах младенцев (Расширенные данные Рис. 4 и дополнительные рис. 3).



Рис. 2. Изменения в транскрипционном состоянии клеток головного мозга на протяжении всей жизни человека.

Количество OPCs уменьшалось с возрастом (P = 1,31 x 10^-2, критерий суммы рангов Уилкоксона), будучи самым высоким у младенцев-доноров и снижаясь с течением жизни (рис. 2е), тогда как количество зрелых олигодендроцитов в головном мозге увеличивалось с возрастом (P = 1,31 x 10^-2, критерий суммы рангов Уилкоксона при сравнении младенцев с другими донорами), взрослыми и пожилыми). Эти данные свидетельствуют о том, что пул OPCs дифференцируется в зрелые олигодендроциты в течение жизни с неполной заменой; таким образом, способность генерировать новые олигодендроциты у пожилых людей может снижаться.

Повышенная межклеточная вариабельность транскрипции при старении была выявлена в тканях, не относящихся к мозгу^26-28, и считается, что это является следствием связанных со старением нарушений в геноме, эпигеноме и транскриптоме. В наших данных мы обнаружили только один тип клеток — нейроны IN-SST — со значительным увеличением коэффициента вариации транскриптома в мозге пожилых людей (рис. 2f; P = 4,30 ? 10-2, критерий суммы рангов Уилкоксона). Мы наблюдали аналогичные тенденции при анализе нашей когорты в трех возрастных группах (15-39, 40-69 и 70 лет и старше; дополнительный рис. 4). Кроме того, экспрессия SST и VIP, которые являются маркерами двух различных классов тормозных нейронов, значительно снижалась с возрастом (кратные изменения составили -2,63 и -1,46; скорректированные значения P < 2,2 x 10^-16) в клетках IN-SST и IN-VIP пожилых людей, соответственно (рис. 2g). Потеря этих функционально важных маркерных генов в сочетании с повышенной вариабельностью транскрипции позволяет предположить, что тормозные нейроны претерпевают фундаментальные изменения в процессе старения. В предыдущем отчете описывалось уменьшение количества тормозных нейронов IN-SST и IN-VIP в процессе старения человеческого мозга¹⁶. Хотя мы не обнаружили этого феномена (расширенные данные на рис. 1с, г), наши данные согласуются с представлением о том, что в пожилом мозге нарушена передача сигналов торможения.

Дифференциальный анализ экспрессии по типам клеток, при сравнении 7 пациентов пожилого возраста с 10 пациентами взрослого возраста, выявил 2803 гена, которые значительно изменялись с возрастом (log2 (пожилой/взрослый) более 0,5, скорректированный P < 0,05) (рис. 3а и дополнительная таблица 6). Мы получили аналогичные результаты, когда наша когорта была разделена на три группы или при использовании альтернативного метода линейной модели (расширенные данные на рис. 1). 5 и дополнительную таблицу 7). Повторный анализ опубликованных данных от контрольных доноров в возрасте от 38 до 93 лет²⁹ и от когорты пожилых доноров³⁰ подтвердил наши результаты (расширенные данные, рис. 5). В каждом типе клеток при старении снижалось количество генов, а не повышалось (критерий Вилкоксона с ранговым знаком, P = 2,44 х 10^-4), и большинство сниженных генов были идентифицированы в нейронах. Возбуждающие нейроны L2/3 обладали наибольшей активацией генов (201 и 1273 соответственно) из всех типов клеток. В общей сложности 124 гена, которые были снижены при старении, обычно были снижены во многих типах клеток (рис. 3b и дополнительная таблица 8), что отражает увеличение по сравнению со случайной вероятностью (P < 0,001, тест случайной перестановки). Например, белок теплового шока HSPA8, белок цитоскелета TUBA1A и восемь других генов были значительно снижены во всех 13 типах клеток головного мозга в процессе старения. Другие гены, которые обычно снижают свою активность в разных типах клеток, включают другие гены цитоскелета, такие как TUBB3 (снижены в 12/13 типах клеток), TUBA4A (10/13) и TUBB (9/13); гены кальмодулина CALM2 и CALM3 (9/13 и 12/13 соответственно); и везикулярный белок VAMP2 (13/13). Напротив, только два транскрипта — антисмысловой транскрипт UBA6, фермента, модифицирующего убиквитин, и TMTC1, белка эндоплазматического ретикулума, участвующего в гомеостазе кальция, - обычно активировались во многих типах нейронов и глии.



Рис. 3. Общее снижение активности генов в клетках разных типов.

Общей чертой, наблюдаемой у всех типов клеток стареющего мозга, является повсеместное снижение активности генов "домашнего хозяйства". Действительно, анализ генов с пониженной регуляцией с помощью генной онтологии (GO) выявил общие признаки для всех типов клеток, за исключением эндотелиальных клеток (рис. 3в и дополнительная таблица 9). Этот результат был получен при равномерном распределении списков дифференциально экспрессируемых генов по типам клеток (Дополнительная таблица 10). В неэндотелиальных клетках термины, относящиеся к функциям "домашнего хозяйства", таким как трансляция, метаболизм, гомеостаз, рибосомы, внутриклеточная локализация и внутриклеточный транспорт, были значительно обогащены генами с пониженной регуляцией. Чтобы дополнительно и непредвзято оценить изменения экспрессии генов с общими клеточными функциями, мы определили набор генов домашнего хозяйства в нашем наборе данных как те гены, которые стабильно экспрессировались во всех типах клеток головного мозга (средний логарифм (количество на миллион (CPM)) > 0,1 в каждом типе клеток и с различиями менее 0,1 между типами клеток), включая эндотелиальные клетки и микроглию, которые имеют отличное эмбриологическое происхождение от нейронов и других глиальных клеток (Дополнительная таблица 11), и измеряли изменения их экспрессии в процессе старения (дополнительный рис. 5а). Следуя той же логике, мы определили нейрон-специфичные гены как те, которые обнаружены во всех подтипах нейронов, но отсутствуют в клетках, не относящихся к нейронам (Дополнительная таблица 11). Экспрессия этих генов "домашнего хозяйства" снижена у пожилых людей по сравнению со взрослыми нейронами разных подтипов (рис. 3d). Напротив, количество нейрон-специфичных генов в нейронах не уменьшается с возрастом (дополнительный рис. 5б). Таким образом, нейроны теряют экспрессию генов, связанных с общей функцией клеток, но сохраняют клеточную идентичность в стареющем мозге.

База данных DepMap оценивает важность гена на основе показателей выживаемости после нокаута в сотнях линий раковых клеток. Используя DepMap, мы обнаружили, что гены, регуляция которых снижалась с возрастом в нейронах и микроглии, чаще оказывались необходимыми для выживания клеток, чем гены, регуляция которых повышалась (нейроны: P = 7,33 x 10^-7; микроглия: P = 9,09 x 10^-7, двусторонний t-тест) (рис. 3e и дополнительная таблица 11), предполагая, что гены, которые снижаются при старении, снижают жизнеспособность клеток головного мозга.

RPS3A, RPL26 и RPL15 (все кодирующие рибосомные белки) были значительно снижены в процессе старения в 11 из 13 типов клеток (Дополнительная таблица 8), и 14 других генов рибосомных белков были обычно снижены. Это побудило нас изучить уровень экспрессии всех рибосомальных генов. Мы наблюдали почти повсеместную тенденцию снижения экспрессии генов, кодирующих малые и большие субъединицы рибосом, в процессе старения — гораздо большую, чем можно было бы ожидать случайно (значения P < 3,76 ? 10-6; точный критерий Фишера) (рис. 3f и дополнительный рис. 6). Чтобы подтвердить этот вывод, мы провели эксперименты с морскими рыбками на мозге трех пожилых людей (82 года (мужчины), 82 года (женщины) и 87 лет (мужчины)) и трех взрослых (28 лет (мужчины), 42 года (женщины) и 49 лет (женщины)). Наши результаты показали, что во всех типах клеток экспрессия девяти рибосомальных белков снижалась в мозге пожилых людей, причем во всех клетках, кроме OPCs, наблюдалось значительное снижение (рис. 3g, Расширенные данные рис. 6 и дополнительная таблица 11). Белки, кодируемые ядрами митохондриальной цепи переноса электронов, за исключением генов комплекса II, также демонстрировали согласованную понижающую регуляцию как snRNA-seq, так и MERFISH (расширенные данные рис. 6d, e и дополнительный рис. 7). Анализ нашей когорты snRNA-seq в трех возрастных группах вместо двух показывает, что как рибосомные, так и митохондриальные гены значительно снижаются после 40 лет, причем у доноров в возрасте 40-69 лет экспрессия этих генов аналогична экспрессии у доноров в возрасте 70-104 лет (расширенные данные рис. 7). Эти данные свидетельствуют о том, что нейроны становятся менее метаболически активными в течение жизни. Таким образом, экспрессия ранних генов, которые быстро активируются при стимуляции нейронов³¹, снижается при старении мозга (рис. 3h).

Соматические мутации накапливаются в клетках в течение жизни для многих типов клеток по всему человеческому организму^9,32-35, в том числе в постмитотических нейронах головного мозга^6,8,9. Частота соматических мутаций в нейронах коррелирует с транскрипцией, измеряемой с помощью bulk RNA-seq в головном мозге^5-7,9, что позволяет предположить, что соматические мутации могут влиять на важные программы регуляции генов мозга. Анализ мутационных сигнатур показал, что активность нескольких генов, отвечающих за репарацию ДНК, приводит к возникновению соматических мутаций в нейронах^5,7,10. Таким образом, как первичные причины, так и последующие последствия соматических мутаций в одной клетке могут быть изучены с помощью экспрессии генов в одной клетке.

Чтобы связать изменения в нейрональном транскриптоме с изменениями в бремени соматических мутаций в отдельных нейронах, мы провели SCWG с использованием первичной матрично-направленной амплификации (PTA)^7,36 на нейронах из той же области мозга и донорах, проанализированных с помощью snRNA-seq (Дополнительная таблица 12). Мы использовали алгоритм SCAN²⁶ для идентификации соматических однонуклеотидных вариантов (sSNV) в данных scWGS по каждому образцу (Дополнительная таблица 13). В соответствии с предыдущими отчетами^6,7,9, наш анализ показал, что sSNV накапливаются со скоростью 15,1 на нейрон в год (R2 = 0,87, P = 2,20 x 10^-16) (расширенные данные рис. 8а). Общая картина мутаций напоминает известную сигнатуру под названием SBS5 (косинусоидальное сходство 0,96), впервые выявленную в Каталоге соматических мутаций консорциума Cancer (COSMIC), которая накапливается в течение жизни во многих тканях³⁷ (Расширенные данные Рис. 8b,c).

Мы сравнили изменения в экспрессии генов в нейронах с возрастными паттернами соматических мутаций в нейронах, чтобы исследовать взаимосвязи между геномом и транскриптомом при старении. Мы обнаружили, что общий, SBS5-подобный спектр нейронных sSNV состоит из двух различных сигнатур, которые мы назвали A1 и A2 (рис. 4a, Дополнительный рис. 8 и расширенный рис. 8c). Сигнатура A1 напоминала SBS5 (косинусоидальное сходство 0,88) и сильно коррелировала с возрастом донора (R2 = 0,88, P = 3,30 x 10^-50) (рис. 4b), что составляло 12,1 из 15,1 мутаций в год. Уровень сигнатуры A1 также сильно коррелировал с уровнями экспрессии генов в нейронах (рис. 4c и дополнительный рис. 8; критерий хи-квадрат), демонстрируя, что транскрипция в нейронах повышает чувствительность некоторых локусов к определенным типам соматических мутаций. В соответствии с этим, значительное смещение транскрипционных цепей в sSNV, которое, как полагают, является результатом асимметричного повреждения и скорости репарации матричных и нематричных цепей в транскрибируемых локусах³⁸, наблюдалось в генах со средней и высокой экспрессией, но не в генах, экспрессируемых на низких уровнях (рис. 4d; звездочками отмечены значительные отклонения от нормы). 50:50). Кроме того, сигнатура A1 была обогащена активными состояниями хроматина в мозге человека в местах запуска активной транскрипции (TSS), энхансерах, двухвалентных TSS и слабо репрессированных участках polycomb, но обеднена в местах покоя и слабой транскрипции (рис. 4g и дополнительная таблица 14; критерий хи-квадрат).



Fig. 4: scWGS reveals sSNV mutational signatures linked to expression.

На сигнатуру A2 приходилось меньше возрастных мутаций в год (3; R2 = 0,42, P = 6,60 x 10^-14), и большинство sSNV в нейронах младенцев были получены из сигнатуры A2 (рис. 4b, e и дополнительная таблица 13). Сигнатура A2 показала высокое сходство с мозаичными мутациями в развитии, выявленными в трех отдельных исследованиях, в которых использовались ортогональные методы для scWGS^39-41 (косинусное сходство 0,77, 0,81 и 0,83; расширенные данные на рис. 9а). sSNV, выявленные у наших новорожденных доноров, также были похожи на те, у которых были подтверждены мозаичные изменения в развитии (косинусоидальное сходство 0,82, 0,85 и 0,88, расширенные данные на рис. 9а). Сигнатура A2 сгруппирована с COSMIC сигнатурой SBS30 (косинусоидальное сходство 0,82) (расширенные данные на рис. 8с). Частота характерных мутаций A2 не коррелирует с уровнями экспрессии генов нейронов и увеличивается в межгенных областях (рис. 4f), что согласуется с тенденциями, наблюдаемыми для SBS30 (база данных COSMIC). В соответствии с его обогащением генами, экспрессируемыми на низких уровнях, сигнатура A2 в мозге человека обогащена в состояниях хроматина, обнаруживаемых в местах слабой транскрипции, и обеднена в подавленных и слабо подавляемых участках polycomb (рис. 4h и дополнительная таблица 14; критерий хи-квадрат).

Тем не менее, сигнатура A2 отличается от SBS30 некоторыми ключевыми особенностями. SBS30 содержит почти исключительно варианты C>T, и эти варианты ограничены CpG-динуклеотидами (расширенные данные, рис. 9в). Напротив, сигнатура A2 содержит замены в дополнение к C>T, такие как C>A, которые мы ранее связывали с повышенным окислительным повреждением ДНК при старении, и T>C, которое увеличивается с возрастом^7,8. Аналогично подтвержденным клональным мозаичным мутациям, выявленным в ходе других исследований с использованием методов, отличных от non-scWGS^39-41, сигнатура A2 демонстрирует вклад SBS1 и SBS5 в дополнение к SBS30 (расширенные данные, рис. 9b). Сигнатура A2 показывает большее количество вариантов CpG>TpG, чем у SBS30,это позволяет предположить, что дезаминирование метилированных цитозинов играет определенную роль в генезе сигнатуры A2, как это происходит в подтвержденных мозаиках (расширенные данные, рис. 9c). Высокая концентрация C>T в CpG-динуклеотидах отличает биологические признаки мутаций от технических в геномике одноклеточных^7,42.

Различия, наблюдаемые между сигнатурами A1 и A2 в отношении скорости их накопления в год, их дифференциальной корреляции с экспрессией генов в нейронах, их различной относительной нагрузки в генных и негенных областях и их дифференциальной корреляции с состояниями хроматина мозга, подтверждают предположение о том, что эти сигнатуры представляют собой биологически различные компоненты общего SBS5- подобного спектра мутаций, наблюдаемого в отдельных нейронах человека. Сигнатура A1 является основным источником возрастных SNV в нейронах и коррелирует с экспрессией генов в нейронах, подтверждая, что транскрипция напрямую определяет частоту нейрональных sSNV. Сигнатура A2, по-видимому, более активна в процессе развития и в раннем возрасте, но мутации сигнатуры A2 продолжают накапливаться в процессе старения в транскрипционно неактивных локусах.

Соматические мутации возникают в результате повреждения ДНК, которые происходят по-разному. При старении во многих органах происходит снижение регуляции работы длинных генов — эффект, который объясняется естественным повышением вероятности случайного повреждения ДНК, блокирующего транскрипцию. ^43-45. Мы обнаружили, что частота sSNV коррелирует с экспрессией нейрональных генов^6,7 (рис. 4с), что позволяет предположить связь между транскрипцией и повреждением ДНК. Неизвестно, как длина гена и уровень экспрессии связаны с изменениями транскрипции при старении и коррелируют ли различия в характере соматических мутаций, основанные на размере гена или транскрипции, с возрастными изменениями.

Чтобы исследовать влияние длины гена и уровня экспрессии на изменения транскрипции при старении, мы провели множественный линейный регрессионный анализ. Мы обнаружили, что высокая базовая экспрессия предсказывает снижение экспрессии у пожилых доноров (рис. 5а, Дополнительный рис. 9а и дополнительная таблица 15). Мы подтвердили эту взаимосвязь, используя данные о массовой экспрессии генов в мозге, полученные от консорциума GTEx. Однако более выраженный эффект наблюдался в отношении размера гена. Была выявлена положительная корреляция между длиной гена и экспрессией в нейронах пожилого возраста по сравнению со взрослыми нейронами. Другими словами, более длинные гены с большей вероятностью сохранят или увеличат свою экспрессию во время старения, и, в отличие от других органов, гены с пониженной регуляцией в нейронах, скорее всего, будут короткими. Значительный, но менее выраженный эффект наблюдался также в отношении длины экзона и экспрессии, что позволяет предположить, что этот эффект был обусловлен в основном длиной гена, а не длиной транскрипта. Этот эффект удлинения был сильнее в возбуждающих и тормозящих нейронах (R = 0,59 и 0,57 соответственно), чем в глии (средний R = 0,35), а гены с пониженной регуляцией в нейронах были короче, чем в глии (рис. 5b), что указывает на специфический для типа клеток эффект. Несмотря на то, что наши данные противоречат взаимосвязи, наблюдаемой во многих тканях, они согласуются с данными, полученными из лобной коры мышей⁴⁵ и ганглиозных клеток сетчатки, в которых сохраняется длительная экспрессия генов в течение старения⁴⁵.

Рис. 5. Снижение регуляции генов при старении связано с размером гена, уровнем экспрессии, типом гена и распространенностью sSNV.

Больший процент нейронов, чем не нейронов, экспрессирует топоизомеразы TOP1 и TOP2B, а также топоизомеразные взаимодействующие элементы PARP1, TDP1 и BTBD1 (P = 8,17 x 10^-5; критерий суммы рангов Уилкоксона) (рис. 5в). Нейроны полагаются на активность топоизомеразы, чтобы смягчить напряжение кручения, возникающее при раскручивании нейрональных генов во время транскрипции⁴⁶, которые, как правило, длиннее, чем широко экспрессируемые гены домашнего хозяйства47 (рис. 5d), что позволяет предположить, что высокая экспрессия топоизомеразы защищает длинные гены в нейронах.

Результаты нашей модели множественной линейной регрессии в целом согласуются с результатами анализа GO, который показал, что гены "домашнего хозяйства" снижаются при старении (рис. 3c), поскольку гены "домашнего хозяйства", как правило, короткие (рис. 5d) и имеют высокую экспрессию^48-50 (рис. 5e и дополнительный рис. 9b,c).

Наш объединенный набор одноклеточных геномных и транскриптомных данных позволил нам исследовать взаимосвязь между размером гена, повреждением генома и возрастными изменениями экспрессии на уровне отдельных нейронов. Поскольку длина гена и его функция в головном мозге взаимосвязаны (нейрональные гены, как правило, имеют большую длину), мы отдельно проанализировали взаимосвязь между длиной гена и изменением экспрессии при старении возбуждающих нейронов в специфичных для нейронов генах и генах домашнего хозяйства. Гены домашнего хозяйства показали положительную корреляцию между длиной гена и изменением экспрессии при старении (R2 = 0,50, P = 1,35 x 10^-281) (рис. 5f и дополнительный рис. 10), так что самые короткие гены были наиболее подавлены, в то время как самые длинные не показали изменений или слегка увеличились в старых клетках. Этот паттерн напоминал подавление активности коротких генов, наблюдаемое в общем транскриптоме (рис. 5б). Однако между нейронспецифическими генами наблюдалась значительно более слабая взаимосвязь (преобразование Фишера от r к z, P = 2,08 x 10^-11) между длиной гена и изменением экспрессии в мозге пожилых людей (R2 = 0,20, P = 1,24 x 10^-3) (рис. 5g и дополнительный рис. 11).. Эти выводы были подтверждены анализом ранее опубликованных наборов данных и анализом наших данных с использованием различных группировок или с использованием метода линейной модели (расширенные данные, рис. 10). Анализ MERFISH 33 генов короткого домоводства, 33 генов длинного домоводства, 24 генов, специфичных для коротких нейронов, и 21 гена, специфичных для длинных нейронов, подтвердил снижение активности генов короткого домоводства в образцах от пожилых доноров по сравнению с образцами от взрослых доноров (P = 3,4 x 10^-5, критерий суммы рангов Уилкоксона) и не выявил каких-либо существенных изменений в длинных генах ведения хозяйства или нейронспецифичных генах любого размера (рис. 5h).

В пределах классов генов частота sSNV отражала изменения в экспрессии при старении; в генах домашнего хозяйства, частота sSNV снижалась по мере увеличения длины гена (R2 = 0,44, P = 3,52 x 10^-2) (рис. 5i и дополнительная таблица 16), тогда как в генах, специфичных для нейронов, не было выявлено значимой взаимосвязи между длиной и частотой SNV генов (R2 = 0,02, P = 0,706) (рис. 5j и дополнительная таблица 16). Эти данные свидетельствуют о том, что существуют различные модели повреждения и репарации ДНК в генах, отвечающих за ведение домашнего хозяйства, и в генах, специфичных для нейронов (рис. 5к). Таким образом, длина гена, его функция и повреждение генома в совокупности влияют на транскриптом стареющего мозга.

Здесь мы использовали snRNA-seq, scWGS и пространственную транскриптомику для изучения геномных и транскриптомных изменений в головном мозге в течение жизни. Мы пришли к выводу, что короткие гены домашнего хозяйства с высокой экспрессией демонстрируют высокую скорость накопления sSNV в течение жизни, что коррелирует со снижением экспрессии. К такому выводу нас подводят несколько свидетельств. Во-первых, функции ведения домашнего хозяйства были наиболее часто используемыми терминами GO для обозначения генов с пониженной регуляцией, в частности, доминирующих в нейронах, в то время как специфичные для нейронов гены в целом оставались неизменными при старении без существенных изменений в экспрессии. Во-вторых, гены ведения домашнего хозяйства были короткими и с высокой экспрессией, что согласуется с предыдущей литературой. В-третьих, частота sSNV в нейронах коррелирует с уровнями экспрессии генов в нейронах. Действительно, самые короткие гены домашнего хозяйства, которые показали высокий уровень экспрессии, показали самый высокий уровень sSNV. Наконец, модель множественной линейной регрессии показала, что высокая экспрессия коррелирует с вероятностью снижения регуляции транскрипции при старении, а большая длина гена коррелирует с поддержанием или повышением уровня транскрипции при старении. Взаимосвязь между длиной гена и транскриптомом старения была предметом любопытства в этой области, но до сих пор эта связь варьировала в зависимости от тканей^43-45. Наш анализ показывает, что в нейронах длинные гены, связанные с идентичностью клеток, сохраняются при старении, в то время как короткие гены домашнего хозяйства накапливают соматические мутации и уменьшаются в количестве в течение жизни.

Эту взаимосвязь можно объяснить несколькими механизмами. Во-первых, мутации могут непосредственно генерировать преждевременные стоп-кодоны или изменять паттерны сплайсинга РНК, вызывая нонсенс-опосредованный распад мутантных транскриптов. Во-вторых, аберрантные процессы репарации ДНК, участвующие в возникновении соматических мутаций, вызывают локальную эпигенетическую дисрегуляцию⁵¹, что влияет на уровни транскриптов. В-третьих, дифференциальная репарация генов, отвечающих за ведение домашнего хозяйства, и генов, специфичных для нейронов, может играть определенную роль в различиях в распространении sSNV. Недавно было показано, что повреждения одноцепочечной ДНК сохраняются в клетках человека в течение длительных периодов времени - вплоть до лет — в отсутствие активной репарации ДНК ⁵². Частота sSNV может быть высокой в коротких генах с высокой экспрессией, поскольку они демонстрируют преимущественную репарацию ДНК, связанную с транскрипцией^53-55, это означает, что повреждения ДНК, возникающие во время транскрипции⁵⁶, могут быть эффективно преобразованы в постоянные двухцепочечные мутации из-за ошибок репарации. Нейроны могут отличаться от клеток других органов из-за их постмитотической природы или из-за высокой экспрессии генов топоизомеразы, которые защищают длинные гены.

Наша работа также выявила другие изменения в мозге человека в течение здорового образа жизни. В мозге младенца мы выявили популяции незрелых нейронов и астроцитов, а также повышенное соотношение предшественников олигодендроцитов к зрелым олигодендроцитам, что подтверждает предположение о том, что развитие клеток мозга продолжается после рождения. В соответствии с предыдущей работой, scWGS показали, что sSNV с общим спектром, напоминающим Discussion SBS5, увеличиваются в стареющих нейронах. Анализ сигнатур de novo выявил две сигнатуры, A1 и A2, в которых преобладают переходы T>C и C>T, соответственно, которые группируются с известными соматическими мутационными сигнатурами при раке, SBS5 и SBS30, соответственно. Этиология SBS5 неизвестна, но сообщалось, что он действует подобно часовому механизму в головном мозге и других тканях^8,9,32,37. Сигнатура A2 несколько напоминает SBS30 и содержит варианты C>A и T>C — типы мутаций, которые связаны с окислительным повреждением ДНК и старением, соответственно. SBS30 был связан со снижением активности базового белка репарации при удалении NTHL1, а наша предыдущая работа связала варианты нейронов C>A с базовым белком репарации при удалении OGG1. Наши данные snRNA-seq показали, что и NTHL1, и OGG1 экспрессируются в нейронах, и что эта экспрессия остается динамичной в процессе старения, но необходимы дальнейшие исследования, чтобы связать эти изменения с сигнатурой A2. Мы отмечаем, что, несмотря на большое сходство между сигнатурой A2 и SBS30, A2 в нейронах отличается от этой сигнатуры опухоли более высокими уровнями C>T в CpG-динуклеотидах. Сигнатура A1 была обогащена кодирующими областями, высоко экспрессируемыми генами и известными открытыми участками хроматина, тогда как A2 демонстрировала противоположную картину, будучи обогащенной некодирующими областями, с наибольшим количеством репрессированных генов и локусами, несущими репрессивные хроматиновые метки.

Поскольку применение scWGS-технологий расширяется и включает в себя другие типы клеток головного мозга, станет возможным дальнейшее изучение взаимосвязи между соматическими мутациями и экспрессией генов в процессе старения. Это расширит понимание исследователями геномного и транскриптомного ландшафта стареющего мозга.