Белок ATM имеет очень высокую гомологию своих С-терминальных последовательностей с каталитическим доменом phosphatidylinositol-3-OH kinase ( PI(3)K). ATM-подобные белки некоторых организмов имеют сходные размеры и структуру (Табл.1. ATM-related proteins), и все они содержат PI(3)K-подобные домены. Но некоторые из них - такие как ДНК-зависимая протеин киназа (ДНК-PK) и mTOR (target of rapamycin) — являются serine/threonine протеин киназами.

In vitro, ATM м. фосфорилировать белок опухолевого супрессора p53 по serine 15. Активность энзима возрастает после экспозиции клеток ионизирующим излучением или радиомиметическими веществами им.б. устранена мутацией двух законсервированых аминокислот. ATM лбнаруживает соизмеримую липид киназную активность.

Сравнение ATM с двумя родственными белками млекопитающих — ATR (ataxia-telangiectasia и Rad3-related киназа) и ДНК-PK — выявило некоторые отличия. Многие члены семейства ATM , по-видимому, нуждаются в Mn²⁺ для своей протеин-киназной активности — p110 каталитическая субъединица PI(3)K также обладает Mn²⁺-зависимой serine/threonine киназной активностью в дополнение к своей липид-киназной активности.

Др. биохимическим различием между этими тремя сходными энзимами является их зависимость от ДНК концов и Ku белков для их оптимальной активности. Белки Ku (KU70 и KU80) связываются специфически с концами двунитчатой ДНК и усиливают активность ДНК-PK, которая участвует в репарации DSBs. Однако ни иммунопреципитированная, ни очищенная ATM ,по-видимому, непосредственно не активируется концами ДНК. Но их связь обнаруживается при atomic-force microscopу. Более того, ATM-зависмое фосфорилирование REPLICATION PROTEIN A ( RPA) м.б. стимулировано экзогенными концами ДНК, при этом RPA подвергается конформационному изменению, что делает его лучшим субстратом для ATM. Неясно, активируется ли ATR концами ДНК.

Мыши, мутантные по каталитической субъединице ДНК-PK (ДНК-PK_CS) обнаруживают тяжелый иммунодефицит (благодаря нарушению V(D)J RECOMBINATION), но имеют низкие частоты lymphoid malignancies. Напротив, мыши и люди с отсутствием АЕМ имею довольно среднюю иммунонедостаточность, но сильную lymphoid malignancies. Делеция же ATR обусловливает эмбриональную летальность.

Checkpoints являются системами надзора, которые поддерживают геномную интеграцию после повреждения ДНК или других клеточных макромолекул. Эти checkpoints или вызывают запрограммированную гибель (apoptosis), чтобы элиминировать поврежденные клетки или останавливают клеточный цикл, чтобы предупредить репликацию потенциально поврежденной ДНК. Сell-cycle-checkpoint, отвечающая на ионизирующее облучение, относительно нормальна у клеток с отсутствием g ДНК-PK_CS, но аномальна в ATM-дефицитных клетках.

Биохимические и фенотипические различия между этими тремя родственными энзимами указывают на то, что они, по-видимому, имкют разные клеточные субстраты или отвечают на разные сигналы
(Рис.1.) . ATM фосфорилирует очтатки серина или треонина только если они сопровождаются глютамином ( 'SQ/TQ' мотив). Позитивно заряженные аминокислоты вблизи мишени serine/threonine, по-видимому, в целом уменьшают фосфорилирование, тогда как гидрофобные или негативно заряженные аминокислоты усиливают его. И хотя ATM, ATR и ДНК-PK имеют сходные предпочтения к последовательнотям мишеням, даже in vitro обнаруживаются различия в их substrate specificities (Табл.2.)

Cell-cycle checkpoints

Обычно клеточный цикл останавливается перед S фазой или во время S фазы (G1 и S-phase checkpoints, соотв.)или перед митозом ( G2 checkpoint). Нарушение этих механизмов ведет к геномной нестабильности и предрасположенности к опухолям.

Клетки от людей с ataxia-telangiectasia имеют специфические дефекты ответа ДНК на ионизирующую радиацию. Обнаруживаются нарушения ареста клеточного цикла в G1, S фазе и G2.

The G1 checkpoint. G1 checkpoint вызывается повреждением ДНК, которое индуцирует повышение клеточного уровня p53. Сигналом для индукции р53 после ионизирующего олучения является разорванная ДНК, хотя и др. клеточные стрессы - такие как кислородное голодание и падение ribonucleotide triphosphates — также м. увеличивать его уровень. Благодаря активности своего transcription-factor p53 активирует продукцию p21 (известного также как WAF1 или CIP1)
(Рис.2.) , который в свою очередь ингибирует cyclin E и его партнера CDK2 — комплекс, необходимый для продолжения клеточного цикла от G1 до S фазы.
(Animated online)

Было установлено, что ионизирующие излучения индуцируют фосфорилирование p53 по serine 15 и это фосфорилирование уменьшено в ATM-дефицитных клетках. Далее было показано. что ATM непосредственно фосфорилирует p53 в том же месте, Ser 15 (but for a twist in this tale, see Box 3).

Однако, неясно, участвует ли это фосфорилирование в индукции p53. Известно, что мутация Ser 15 в alanine — эффективно предупреждающая фосфорилирование p53 — оказывает незначительный эффект на период полу-жизни p53 или его способность останавливать клеточный цикл или вызывать апоптоз. Предполагается, что фосфорилирование Ser 15 м. облегчать другие пост-трансляционные модификации p53, напр., ацетилирование лизина 382. На самом деле фосфорилирование Ser 15, по-видимому, влияет на способность р53 связываться с другим фактором транскрипцииr, p300, и это также модулирует трансактивацию генов-мишеней с помощью p53.

Если фосфорилирование Ser 15 не влияет на уровень p53, то некоторые другие мишени ATM kinase д.б. ответственны. Наилучшим кандидатом является белок, называемый MDM2, важный регулятор деградации p53, обнаруживающий ATM-зависимое фосфорилирование после облучения
(Рис.2.) .

Итак, после ионизирующего облучения фосфорилирование Ser 395 в MDM2 с помощью ATM снижает способность MDM2 переносить p53из ядра в цитоплазму, в результате p53 белок накапливается в ядре.

Имеется и финальный поворот пути передачи сигналов ATM в G1 checkpoint. Ионизирующая радиация индуцирует фосфорилирование др. сериновго остатка p53 — Ser 20 — ATM-зависимым способом. Ser 20 находится в середине домена p53, который связывает MDM2, и мутации в этом остатке нарушают стабильность p53 в ответ на повреждения ДНК. Следовательно, фосфорилирование p53 по Ser 20 после ионизирующего облучения должно обеспечить стабилизацию p53 путем нарушения его взаимодействия с MDM2. Несмотря на эту зависимость ни АТМ, ни ATR не м. фосфорилировать Ser 20 in vitro. Следовательно, м. предположить, что Ser 20 фосфорилируется после ионизирующего облучения некими др. киназами, которые в свою очередь прямо или косвенно активируются ATM. Киназа CHK2 участвует на данной ступени. In vitro, CHK2 м. фосфорилировать p53 по Ser 20; CHK2 фосфорилируется АТМ-зависимым способом после облучения и АТМ м. непосредственно фосфорилировать CHK2 in vitro.

The S-phase checkpoint. ATM-дефицитные клетки характеризуются феноменом RADIORESISTANT ДНК SYNTHESIS (RDS). Хотя G1 checkpoint также дает снижение репликации ДНК, S-phase checkpoint является отдельным процессом
(Рис.2.) . Тогда как p53-зависимый G1 арест происходит внутри G1, перед точкой RESTRICTION , RDS измеряется синтезом ДНК сразу после облучения. Следовательно, она отражается на клетках, которые уже в S фазе, чем на клетках, вступающих в S фазу, и не зависит от p53. Она ингибирует инициацию новых REPLICON и это не синоним пути ареста S-фазы при действии HYDROXYUREA

Потенциальным сусбтратом для ATM consensus target sequence является p95/ NBS1. Ген, кодирующий этот белок, мутантен при сходном заболевании — Nijmegen breakage syndrome (NBS). В обоих случаях пациенты чувствительны к радиации (radiation sensitivity, RDS), предрасположены к опухолям и хромосомной нестабильности. Однако, из нейрологических аномалий у пациентов NBS наблюдается MICROCEPHALY , скорее, чем прогрессивная ATAXIA .

Клонирование гена p95/NBS1 выявило, что белок является частью комплекса, который кроме того содержит RAD50 и MRE11. Этот комплекс связан с репарацией DSBs. Известно, что NBS1 является частью комплекса, который располагается на DSBs, и что ATM активруется такими разрывами нитей в клетке. ATM и NBS1 связаны общим путем передачи сигналов. Сайтом мишенью на NBS1, который фосфорилируется ATM киназой — Ser 343. Это фосфорилирование необходимо для ионизацией индуцированного S-phase checkpoint
(Рис.2.) .

S-phase checkpoint м. нуждаться и в других факторах. Так, мутация MRE11 обусловливает еще один синдром ataxia-telangiectasia-like disorder, характеризующийся радиочувствительностью, RDS и нейродегенерацией. Функция MRE11 м.б. необходима для этой checkpoint. Кроме того, BRCA1 м.б. выделен из комплекса с NBS1/MRE11/RAD50, и также м.б. частью этого сигнального пути.

Наконец, резонно предположить, что CHK2 также м. участвовать в этой checkpoint. Mec1p и Rad3p (Table 1) и гомологи CHK2 (Rad53p и Cds1p) входят в состав индуцируемой повреждениями ДНК S-phase checkpoint дрожжей. BRCA1 и CHK2 являются также субстратами ATM
(Рис.2.) , и MRE11 содержит ATM target site, ATM м. контролировать S-phase checkpoint, фосфорилируя некоторые белки комплекса - также как и при ATM-опосредованном контроле G1 checkpoint (Рис.2).

The G2 checkpoint. Не идентифицированы еще белки мишени для ATM в этой точке надзора. Переход клеток от G2 в M после ионизирующей радиации происходит (примерно через 30 - 90 мин). Следовательно, ataxia-telangiectasia клетки имеют не обычный арест клеточного цикла, и продолжают вступать в митоз. (Этот быстрый арест в G2 независим от p53.) При нарушениях клеточного цикла с помощью PROPIDIUM IODIDE ASSAY после облучения ataxia-telangiectasia клетки, по-видимому, имеют более продолжительный арест G2 arrest.

Однако, ataxia-telangiectasia клетки, обллученные в G1 или S фазе не только арестовываются, когда они вступают в G2, но и арест этот более продолжителен. Объяснением этого м.б. различные сигналы для ареста G2 в зависимости от фазы клеточного цикла, в которой клетки облучены. Параллельные, но независимые пути передачи сигналов м. оперировать через ATM-подобный белок ATR, который, по-видимому. более важен для ответа на УЛ свет и hydroxyurea, чем ионизирующеее облучение (Box 3).

Модель G2 у человека представлена на Рис.2. Фаза начинается с фосфорилирования фосфатазы CDC25, по Ser 216, с помощью CHK1 киназы. Фосфорилированная CDC25затем соединяется с 14-3-3 PROTEIN и секвестрируется в цитоплазме. Злесь CDC25 не м. выполнять свою обычную для ядра работу —дефосфорилировать CDC2. Дефосфорилирование CDC2 обычно позволяет переход из G2 в M фазу, поэтому этот процесс эффективно блокируется. ATM м. оказывать сходный эффект путем активироваия CHK2 kinase, которая подобно CHK1, фосфорилирует CDC25.

Подтверждена роль CHK1 или CHK2 в контроле G2–M checkpoint. На основании функциональной роли Chk1p и Cds1p/Rad53p у дрожжей их человечьи гомологи (CHK1 и CHK2) являются мишенями для ATM в G2–M checkpoint пути. Хотя ATM-зависимое фосфорилирование CHK2, по-видимому, является функцией G1 checkpoint, но оно или ATR-dependent фосфорилирование CHK1, м. участововать и в аресте G2. BRCA1 — мишень для ATM и CHK2 — м. также участвовать в контроле G2 checkpoint. Кроме того, G1 checkpoint, ATM–CHK2 и ATR–CHK1 пути м. кооперировать и с G2–M checkpoint.

ATM targets in ДНК repair

Хотя дефектов в репарации DSB не обнаружено, АТМ-дефицитные клетки обнаруживают повышенные частоты хромосомных разрывов после ионизирующих излучений. Нарушения репарации ДНК м.б. обусловлены аномальной организацией хроматина. Быстрое дефосфорилирование гистона Н1 в ответ на облучение зависит от АТМ и ATM связывается с HISTONE DEACETYLASE .

Репарация двойных разрывов возможна двумя путями (Рис.3) — гомологичная рекомбинация или негомологичное соединение концов (NHEJ;известная также какs illegitimate recombinational repair). Высокая доля внутрихромосомных рекомбинаций обнаружена в ATM-дефицитных клетках, также как и error-prone recombination и повышенные уровни внехромосомной рекомбинации. Обнаружена связь между АТМ м гомологичной рекомбинацией.
(Рис.3.)

A role of ATM in ДНК double-strand break repair pathways.

ATM kinase м. также модулировать радиочувствительность через свое взаимодействие с BRCA1, NBS1 или CHK2 (<Рис.3) . Наконец, т.к. ATM обнаруживается также в больших белковых комплексах с BRCA1 и многочисленными ассоциированными с репарацией ДНК белками (p95/ MRE11/ RAD50, MSH2, MSH6, MLH и BLM), то возможны и другие потенциальные механизмы, с помощью которых ATM м. влиять на репарацию ДНК и радиочувствительность.

Other targets for ATM

Наблюдение, что мыши дефицитные по энзиму репарации ligase IV, имеют дефекты в развитии нейронов, зависящих от АТМ, указывает на то, что повреждения ДНК в развивающейся нервной системе дело привычное и что передача сигналов АТМ важный детерминант для выживания нейрональных клеток после подобных повреждений.

Вовлечение АТМ в др. физиологические пути также м. объяснить нейрологические симптомы ataxia-telangiectasia. Подозрение, что и существуют др. функции и мишени для АТМ, исходят из данных, касающихся c-Abl и NF-κB сигнальных путей; из того, что она м.б. связана с везикулярным белком β-adaptin; и и из того что они обнаруживаются в большом количестве в цитоплазме нейронов. Напр., инсулин активирует АТМ киназу и стимулирует фосфорилирование трансляционного регуляторного белка 4E-BР1. Однако, трудно объяснить нарушения клеточных мембран, нарушения передачи сигналов инсулина и цитоскелетные дефекты в ATM-дефицитных клетках, если проблема в ответе на повреждения ДНК.

Many substrates, many functions

ATM является протеин киназой. которая, по-видимому, обладает многими субстратами. Из-за многочисленных процессов, которые затрагиваются АТМ, при отсуствии белка возникают различные болезненные фенотипы у мышей и человека. Некоторые мишени участвуют в ответе на повреждения ДНК и объясняют некоторые аномалии checkpoint ATM-дефицитных клеток. Другие субстраты, очевидно будут идентифицированы в будущем позволят объяснить эти checkpoint пути и объяснить эффекты АТМ на репарацию или рекомбинацию. ATM имеет тенденцию фосфорилировать несколько белков в комплексах и вообще достигнуть функциональных конечных точек за счет нескольких перекрывающихся механизмов.

Ингибирование ATM или др. белков его пути является потенциальной целью для увеличения радиочувствительности опухолевых клеток.

Nature Reviews Molecular Cell Biology 1, 179-186 (2000)
THE MANY SUBSTRATES и FUNCTIONS OF ATM
Michael B. Kastan & Dae-sik Lim

Links

Boxes

The ATM family

Cell-cycle checkpoints

A role of ATM in ДНК double-strand break repair pathways.

Other targets for ATM

Many substrates, many functions

Nature Reviews Molecular Cell Biology 1, 179-186 (2000) THE MANY SUBSTRATES и FUNCTIONS OF ATM Michael B. Kastan & Dae-sik Lim

Links

Boxes

The ATM family

Cell-cycle checkpoints

A role of ATM in ДНК double-strand break repair pathways.

Other targets for ATM

Many substrates, many functions

Nature Reviews Molecular Cell Biology 1, 179-186 (2000)
THE MANY SUBSTRATES и FUNCTIONS OF ATM
Michael B. Kastan & Dae-sik Lim