Okamoto, I. et al. Proteolytic release of CD44 intracellular domain and its role in the CD44 signaling pathway. J. Cell Biol. 155, 755-762 (2001)
FURTHER READING
Pure, E. & Cuff, C. A. A crucial role for CD44 in inflammation. Trends Mol. Med. 7, 213-221 (2001)
Bajorath, J. Molecular organization, structural features, and ligand binding characteristics of CD44, a highly variable cell surface glycoprotein with multiple functions. Proteins 39, 103-111 (2000)
Lesley, J. & Hyman, R. CD44 structure and functions. Front. Biosci. 3, D616-D630 (1998)
Ранее было установлено, что эктодомен CD44 м. протеолитически расщепляться с помощью membrane-associated metalloproteases (MMPs), продуцируя растворимую CD44 и связанные с мембраной продукты расщепления эктодомена CD44. Т.к. это расщепление регулирует функцию клеточной миграции CD44, то Okamoto и др. изучали, как протеолиз будет влиять на др. функции CD44.
Индуцируя приток calcium или используя воздействие 12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), авт. вызывали активацию MMPs в клетках глиомы человека. Используя immunoblot анализ, они обнаружили продукты расщепления эктодомена CD44, но, позднее, они также наблюдали небольшие фрагменты CD44, которые соответстовали intracellular domain (ICD). Они покзали, что после того, как MMPs генерирует продукты расщепления эктиодомена, дальнейшее расщепление с помощью внутриклеточных протеаз дает продукты CD44ICD.
На временно трансфицированных клетках Okamoto и др. показали, что меченные (tagged) CD44ICD локализуются в ядре. Это продемонстирировано и для эндогенного CD44ICD, который м.усиливать транскрипцию, которая обеспечивается посредством TPA-responsive element (TRE), и транслокация CD44ICD в ядро существенна для этого усиления. Ингибиторы MMP блокируют усиливают CD44-зависимую транскрипцию и усиление не наблюдается, если CD44 мутирует, в результате удаляется внутриклеточный протеолитический сайт расщепления. is mutated to remove the intracellular proteolytic cleavage site. Следовательно, последовательное протеолитическое расщепление CD44 и высвобождение CD44ICD существенно для CD44-зависимого усления транскрипции.
Затем авт. показали, что CD44ICD один вряд ли способен дейстовать как транскрипционный фактор. Они проверяли гипотезу, что он влияет на др. транскрипционные факторы - c-Fos и c-Jun - или транскрипционные коактиваторы - CREB-binding protein (CBP) и p300 - участвуя в TRE-опосредованной транскрипции. CD44ICD не влияет на GAL4-c-Fos- или GAL4-c-Jun-индуцированную транскрипцию с GAL4-зависимого промотора, но он усиливает транскрипцию с помощью GAL4-CBP и GAL4-p300. Осуществляется ли CD44ICD трансактивация через CBP/p300 остается определить.
Чтобы идентифицировать эндогенные гены-мишени для CD44ICD, авт. сравнивали HeLa клетки, трансфицированные или контрольными плазмидами или кодирующими CD44ICD. Ген CD44 содержит TRE последовательности в своем промоторе и Okamoto и др. нашли, что CD44ICD индуцирует экспрессию CD44. Они предположили, что эта CD44ICD-индуцированная транскрипция CD44 способствует быстрому обмену CD44, который необходим для миграции клеток.
Пути передачи сигналов, как полагают, используют взаимодействия между белками клеточной поверхности и цитоплазматическим белками, которые, в свою очередь, регулируют транскрипцию генов. Однако, было показано, что CD44 обходит эту ступень пути, т.к. CD44ICD сам по себе м. активировать транскрипцию генов. Кроме того в этой работе выявлена важная функциональная связь между протеолитическим процессингом адгезивных молекул клеточной адгезии и активацией транскрипции в ядре.
CD44: FROM ADHESION MOLECULES TO SIGNALLING REGULATORS
Helmut Ponta, Larry Sherman & Peter A. Herrlich (peter.herrlich@igen.fzk.de) Nature Reviews Molecular Cell Biology Vol 4, No 1, 33-45 (2003)
Cell-adhesion molecules, once believed to function primarily in tethering cells to extracellular ligands, are now recognized as having broader functions in cellular signalling cascades. The CD44 transmembrane
glycoprotein family adds new aspects to these roles by participating in
signal-transduction processes — not only by establishing specific
transmembrane complexes, but also by organizing signalling cascades
through association with the actin cytoskeleton. CD44 and its associated
partner proteins monitor changes in the extracellular matrix that
influence cell growth, survival and differentiation.
Box 3 | Roles of CD44 in bacterial infection
Several studies have implicated CD44 in direct
interactions between bacteria and host cells, as well as in
signalling events that alter host cells and make them more
susceptible to infection. Streptococcus pyogenes, for
example, attaches to cells through its hyaluronan-rich
polysaccharide capsule (or cell wall). Hyaluronan binds to CD44,
which in turn triggers tyrosine phosphorylation of several host-cell proteins, as well as cytoskeletal rearrangements that cause ruffles and the extension of lamellipodia.
As a result, the intercellular adhesion is loosened owing to a
reduced number of tight junctions and of E-cadherin, a process that allows the entry of
bacteria into subepithelial tissue. Consistent with these data,
CD44-deficient mice are resistant to oropharynx colonization by
S. pyogenes.
CD44 is also involved in the entry of Shigella into
epithelial cells by the binding of a secreted bacterial protein,
IpaB. When cells were pre-treated with a CD44 antibody, both
bacterial entry and Shigella-induced host-cell cytoskeletal reorganization were inhibited.
The entry of Listeria monocytogenes into cells seems to take advantage of a co-receptor function of CD44 (see main text). LnIB, a
bacterial surface protein, activates the receptor tyrosine kinase Met, which promotes endocytosis.
Interestingly, CD44 has been implicated in mediating the activation
of Met, including the activation of Met by LnIB (V. Orian-Rousseau
and H.P., unpublished observations). In addition, CD44 is involved
in the cell-to-cell transfer of bacteria after the replication
phase. Listeria recruits F-actin tails for its movement in the cytoplasm Once Listeria reaches the inner surface of the plasma membrane, CD44 and ezrin become concentrated at that region of the
membrane before protrusion formation.
Protrusion formation and bacterial transfer could be blocked by
inhibiting the CD44–ezrin interaction (S. Pust, H. Morrison, A.
Sechi, J. Wehland and P.A.H., unpublished observations).
In conclusion, during bacterial infections, CD44 seems to mediate
signal transduction, which leads to events such as endocytosis.
Furthermore, the bacterial systems showed that there is a link
between CD44 and the cytoskeleton.
Box 4 | CD44 in cancer
The discovery of CD44 splice variants
and, in particular, the discovery that a certain splice variant
(CD44v4–7) is involved in the metastatic spread of tumour
cells,
sparked a new area of CD44 research. Since then, a vast number of
publications have addressed the relevance of CD44 and CD44 splice
variants as diagnostic and prognostic parameters for human tumours.
Although the results from these studies are often controversial,
there is now substantial evidence that CD44 variants are aberrantly
expressed in many human tumours. In some instances, such as with
colorectal carcinomas, the expression of CD44 variants predicts poor
prognosis. Interestingly, the upregulation of CD44 expression seems to be an
early event in colon carcinogenesis
and requires adenomatous polyposis coli (APC) gene
inactivation.
There are some tumour types, however, including neuroblastomas and
prostate carcinomas, in which the absence of CD44 expression
(including CD44 variants) correlates with transformation and poor prognosis.
Interestingly, overexpression of CD44 in prostate carcinoma cells even suppressed metastatic behaviour.
In most cancers, the misregulated expression of CD44 is not the
result of CD44 mutations. Instead, genes that are implicated in
promoting carcinogenesis control the patterns of CD44 expression in
cancer cells. Alternative splicing, for example, is under the
control of mitogenic signals including the Ras–MAP kinase
cascade.
In addition, the loss of different subunits of the SWI/SNF chromatin
remodelling complex, which are mutated in numerous cancers, results
in the loss of CD44 transcription.
Aberrant CD44 expression is therefore inextricably linked to genetic
alterations that lead to tumour growth and
metastasis.
Box 5 | Hyaluronan receptors Hyaluronan is a hydrophilic, linear, extracellular polysaccharide with a molecular weight of up to 10,000 kDa and a
brief, but variable, half-life (from minutes to weeks depending on the tissue.
It is composed of repeating units of D-glucuronate (1-β-3)
and N-acetyl-D-glucosamine (1-β-4).
Hyaluronan is crucial for the normal development and life of
vertebrates (reviewed in Ref. .
For example, injection of excess hyaluronidase disturbs
organogenesis, and mice with a targeted mutation in one of the
hyaluronan synthases die from heart and vascular defects by
embryonic day 10 .
The effect of hyaluronan on cells is mediated by specific
receptors. In addition to CD44, several other receptors have
hyaluronan-binding motifs: the transmembrane protein layilin;
HARE (hyaluronan receptor for endocytosis), a receptor for
hyaluronan endocytosis in sinoidal cells and lymph nodes;
and, in lymphatic endothelium, LYVE1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan 1;).
Hyaluronan-derived oligosaccharides, which are often present in
inflammatory regions, can bind to Toll-like receptor 4 (Ref. .
Intracellular proteins also carry hyaluronan-binding motifs,
although a hyaluronan-mediated function has not yet been
identified.
There is a host of literature on cellular responses to
hyaluronan. High- and low-molecular-weight hyaluronan can induce
different effects in the same cells, but, unfortunately, in most
studies, the size of hyaluronan was not monitored, nor were the
receptors or the signalling pathways responsible identified. Only in
a few cases have the receptors been defined. For example,
high-molecular-weight hyaluronan has been reported to enhance Ras
signalling through CD44 in ovarian tumour cells.
Consistent with this idea, if soluble hyaluronan was titrated away
by soluble CD44, mammary tumour cell growth in vivo was
retarded.
However, in Schwannomas, for example, high-molecular-weight
hyaluronan inhibited tumour cell growth.
The inconsistencies between these and other studies remain to be
resolved. By contrast, low-molecular-weight hyaluronan can induce angiogenesis
and the expression of numerous genes involved in the inflammatory response
Пути передачи сигналов не представляются больше как линейная последовательность биохимических модификаций, а скорее как сеть с несколькими уровнями сложности. Эти сети запускаются внеклеточными лигандами, которые взаимодействуют с рядом рецепторов клеточной поверхности и часть сложности заключается в организации этих рецепторов. Некоторые молекулы клеточной адгезии, куда входят и , участвуют в образовании комплексов, которые состоят из внеклеточных лигандов, и цитоскелетных белков.
Установлено, что CD44 класс I трансмембранных гликопротеинов обеспечивает реакцию клеток на их клеточные микроусловия. CD44 белки участвуют во многих клеточных процессах, включая регуляциюроста, жизнеспособность, дифференцировка и подвижность. Нарушение экспрессии или дисфункция CD44 белков ведет к многочисленным патологическим явлениям.
The CD44 protein family
Эпитоп CD44 впервые выявлен как антиген, которые распознается моноклональнми антителами против клеток белой крови человека. Далее было установлено, что этот эпитоп является общим для полиморфной группы белков ( размером в 80–200 kDa), которые присутствуют на поверхности большинства клеток позвоночных. Белки CD44 кодируются одиночным высоко законсервированным геном. Гетерогенность белковых продуктов частично обусловлена пост-трансляционными модификациями, которые отличаются в зависисмости от типа клеток и условвий роста. Кроме того, транскрипты CD44 являются субъектом , который затрагивает преимущественно внеклеточные, ближайшие к мембране стволовые (stem) структуры CD44 белков (Рис. 1a,b; Box 1).
The hyaluronan-binding, amino-terminal domain.
Первые 5 (неменяющиеся) экзоны CD44 кодируют N-терминальный глобулярный белковый домен (Рис. 1b). Этот домен содержит мотивы, которые функционируют как доки (docking sites) для некоторых компонентов ECM. In vitro взаимодействия CD44 с , коллагеном, ламинином и фибронектином, по-видимому способствуют matrix-зависимой миграции. Но нет доказательств in vivo физиологической роли этих взаимодействий и — помимо hyaluronan связывающего сайта — остальные сайты связывания не картированы в точности.
В N-терминальной глобулярной области CD44, участок в 90 аминокислот (остатки 32–123) обнаруживают существенную гомологию с хрящ связывающим белком и со стрежневым белком протеогликана. Это тот домен (Рис. 1c), который, как известно, является связующим ('link') доменом, который позволяет CD44 связываться с hyaluronan,
а также с др. (GAGs).
Сродство CD44 к GAGs зависит от пост-трансляционных модификаций (напр., изменения в гликозилировании), которые являются клеточно- и growth-condition-специфическими. Имеются некоторые данные, подтверждающие связь между соединением с hyaluronan и образованием кластеров CD44. Напр., олигомеры определенных CD44 сплайс-вариантов обнаруживают повышенное сродство к hyaluronan, а активирующие CD44 моноклональные антитела индуцируют связывание гиалуронана только как бивалентной молекулы или если моновалентные фрагменты скомплексованы. Только производные hyaluronan олигосахариды, которые состоят более чем из 20 остатков связыаются с CD44,причем связывание происходит более чем с одной молекулой CD44.
The stem structure.
N-терминальный глобулярныый домен самой маленькой из изоформ CD44 (стандарнтная изоформа или CD44s) отделен от плазматической мембраны короткой (46 аминокислот) стволовой структуройe. Этот ствол содержит предполагаемый сайт протеолитического расщепления. Стволовая структура м.б. увеличена за счет последовательностей, которые кодируются альтернативно сплайсируемым вариантом ('v') экзона CD44 (Рис.1d). Включение вариантного экзона зависит, по крайней мере, частично от митогенных сигналов, которые регулируют альтернативный сплайсинг(Box
1). Опухолевые клетки, напр., часто экспрессируют большие CD44 варианты. Мало что известно о структуре этих v-exon-кодирующих сегментов, хотя некоторые из них включают мотивы для специфических пост-трансляционных модификаций. Сильное O-гликозилирование указывает на то, что stem образует стеблеобразую структуру. Последовательности, кодируемые экзоном v3, напр., включают сайт heparan-sulphate (Рис.
1d), модификация, к которой прикрепляются некоторые heparin-связывающие белки.
The transmembrane and cytoplasmic-tail region.
Трансмембранная область состоит из 23 гидрофобных аминокислот и цистеинового остатка (Рис. 1e), который в некоторых случаях, по-видимому, участвует в формировании CD44 олигомеров. Трансмембранная область м.б. ответственна за ассоциацию CD44 белков с . Однако, функциональное значение этого включения в липидные плотики неизвестно.
И мотивы в цитоплазматической хвостовой области и внутриклеточные белковые партнеры CD44 важны для его субклеточной локализации (напр., на базолатеральных поверхностях поляризованного эпителия и на ведущем крае и ламеллоподиях мигрирующих клеток. Белки, которые соединяются с цитоплазматическим хвостом участвуют также в ассоциации CD44 с цитоскелетом. Первым идентифицированным внутриклеточным партнерским белком CD44 был ankyrin, белок, которые обеспечивает контакт с цитоскелетным компонентом spectrin (Рис. 1e). Предполагается, что связывание анкирина модулируется с помощью ГТФ и CD44 партнерских белков. Хотя значение взаимодействий CD44–ankyrin до конца неясно, однако эти взаимодействия участвуют в обеспечении hyaluronan-зависимой клеточной адгезии и подвижности.
Члены , в особенности т. наз. ERM (, и ) белки (Box 2), взаимодействуют с basic-аминокислотным мотивом в цитоплазматическом хвосте CD44, который расположен между трансмембранной областью CD44 и ankyrin-связывающим сайтом (Рис. 1e). ERM белки являются, как полагают, важными для регуляции миграции клеток и формы клеток. Белки Band 4.1 и ERM поперечно связывают актиновый цитоскелет с CD44 и др. белками. Белок супрессирующий обухоли , который родственен семейству ERM, также соединяется с ERM-связывающим мотивом в цитоплазматическом хвосте CD44, но он, по-видимому, служит не для поперечного связывания с актином (Box 2). Интересно, что связывание band 4.1 белков с CD44 м. ингибировать взаимодействие CD44–ankyrin, но значение этого явления непонятно.
Упорядоченное фосфорилирование и/или дефосфорилирование serine (Ser)остатка в цитоплазматическом хвосте CD44, запускаемое protein kinase C (PKC), увеличивает связывание ERM белков с CD44. В покоящихся клетках Ser325 фосфорилирован. Однако, активация PKC не меняет состояние общего фосфорилирования CD44, но вызывает дефосфорилирование Ser325 и фосфорилирование Ser291. Интересно, что связывание ankyrin также зависит от фосфорилирования и участвует в активации Rho kinase с помощью CD44-связанной Rho A. Доминантно-негативная Rho kinase конструкция устраняыет фосфорилирование CD44, подвижность мембраны, клеточную миграцию и метастазирование. Однак, неясно фосфорилирование CD44, ERM белки или ankyrin ответственны за эти фенотипы.
Фосфорилирование ERM белков и также влияет на их взаимодействия с CD44 и др. белками (Box 2). ERM белки фосфорилируются или по tyrosine (Tyr) остатку (для ezrin, Tyr145 и Tyr353 фосфорилируются с помощью некоторых рецепторов факторов роста, включая receptor tyrosine kinase ), или threonine (Thr) (для ezrin, Thr567 фосфорилируется с помощью PKCα, которая обнаруживается в ассоциации с ezrin при заживлении ран). Оба эти события фосфорилирования активируют ezrin и индуцируют связывание с CD44. Напротив, merlin фосфорилируется с помощью serine/threonine protein kinase в ответ на активацию Rac, но это инактиврует merlin и ингибирует его связывание с CD44.
Эти события фосфорилирования и дефосфорилирования м. влиять на взаимодействия между N- и С-концами (внутримолекулярные взаимодействия), и между членами семейства ERM и др. белками (межбелковые взаимодействия). Интересно, что дефосфорилирование merlin запускается или с помощью высокой плотности клеток или добавлением гиалуронана высокого молекулярного веса и это происходит, если merlin ассоциирован с CD44.
CD44 function in health and disease
CD44 выполняют важные функции и их отсутствие или дисфункция вызывает патогенные фенотипы. Для выявления их роли часто используются специфические антитела или против всех молекул CD44 (pan-CD44 антитела) или субнаборов вариантов белков. CD44-зависимые процессы, ка известно, вклюдают органогенез, ведение нейрональных аксонов, многочисленные иммунные функции и гематопоэз (Табл. 1 и Boxes 3,4).
Неожиданно, CD44-нулевые мыши оказались жизнеспособными и имели досольно незначительные фенотипические отклонения (). Напр., CD44-нулевые мыши имели средней выраженности аномалии в миграции миэлоидных предшественников, колонизации костного мозга и в наведении (или миграции) лимфоцитов в лимфатические узлы или тимус. Интересно, что активированные Т клетки выживали дольше у нулевых мышей, что ведет к устойчивости к гепатиту, которая м.б. объяснена вовлечением CD44 в передачу pro-apoptotic сигналов. В самом деле, усиление активности Fas зависит от CD44, а экспрессия CD44 сплайс-вариантов увеличивается в Т клетках Fas-дефектных мышей в ответ на инфекцию Listeria monocytogenes. У беременных CD44-нулевых мышей, сохранение лактации post-partum нарушено, а инволюция матки ускорена.
Множество более выраженных фенотипов наблюдалось у мышей с делеционными мутациями CD44. Напр., инфекция Cryptosporidium parvum вызывает образование exaggerated гранулем у животных с отсутствием CD44, в сравнении с их дикого типа сибсами. Внутритрахейное воздействие bleomycin вызывает накопление избыточных апоптических нейтрофилов и про-воспалительных фрагментов hyaluronan; гибель таких мышей м. предупредить инъекциями CD44-позитивных лейкоцитов. Напротив, инфильтрация суставов с помощью нейтрофилов при развитии коллаген-индуцированных артритов и индуцированная инфильтрация с помощью цитотоксических Т клеток (ведущая к повреждению эндотелиальных клеток и к ) были сильно редуцированы у CD44-нулевых мышей. Др. тип несоответствия установлен при скрещивании CD44-нулевых мышей с линиями, которые имеют генетическую склонность к атеросклерозу. Ряд повреждений аорты и рекрутирование макрофагов к повреждениям редуцированы, а пролиферация и де-дифференцировка гладкомышечных клеток нарушена по сравнению с мышами дикого типа.
Экспрессия сплайс-вариантов CD44 в метастазирующих опухолях (Box 4) заставила исследовать нарушения показателей или поведения опухолей на CD44-нулевом фоне. Водном исследовании SV40-трансформированные CD44-нулевых фибробласты были туморогенны у nude мышей. Этот фенотип оказалось возможным ревертировать с помощью инфекции клеток ретровирусом, который управляет экспрессией CD44s кдНК. CD44 м. , следовательно, супрессировать туморогенез в некоторых случаях (Box 4). однако, если CD44-nнулевые мыши скрещиваются с мышами, которые несут targeted mutation 1 (tm1) of p53 (p53+/tm1), то у животных развиваются доброкачественные остеосаркомы, тогда как у контрольных животных развиваются злокачественные опухоли. Интересно, что количества опухолей не меняются у этих мышей, это подтверждает идею, что CD44 играет критическую роль в метастазировании, но не в инициации туморогенеза (Box 4>).
Делеция индивидуальных CD44 сплайс-вариантных экзонов также дает видимые фенотипы. Мыши, у которых отсутствуют экзоны v6 и v7. обнаруживают редуцированную воспалительную реакцию в толстом кишечнике после воздействия trinitrobenzene sulphonic acid у редуцирует колиты при скрещивании с мышами, склонными к колитам
В противоположность к довольно слабым фенотипам у мышей с нарушениями гена CD44 в зародышевой линии, др. подходы для уменьшения экспрессии или функции CD44 в тканях вызывали заметные нарушения в коже (напр., задержка локальной воспалительной реакции, заживление ран и возобновление роста волос, уменьшение эластичности кожи и снижение ответа эпидермиса на воздействие канцерогенов) и ингибировали развитие конечностей (). Все это указывает на то, что the потеря функции CD44 в позднем развтии м. б. нетолерантной к тому же самому пути, если он отсутствует, начиная с раннего развития. OОблитерация CD44 в раннем эмбриогенезе м. вызывать индукцию гена или генов, которые замещают CD44 в некоторых случаях. Подтверждение этой идеи получено при анализе развития конечностей у limb CD44-null мышей. В то время как мезенхимные клетки почки конечности у животных докого типа нуждаются в heparan-sulphate-модифицированном CD44 tи в fibroblast growth factor (FGF) для индукции пролиферации, мезенхимные клетки нокаутных животных отвечают только на воздействие FGF. Кандидатом на роль такого компенсаторного механизма претендует неизвестный heparan-sulphate-модифицируемый белок, который экспрессируется в мезенхимных клетках нокаутных, но не дикого типа мышей.
В целом ясна роль CD44 в формировании опухолей (Box 4), в некоторых аспектах иммунной системы и гематопоэза, а также в бактериальной инфекции (Box 3). В то же время обнаруживаются распространенные компенсации потерь CD44.
Molecular mechanisms of CD44 function
Отсутствие очевидного фенотипа у мышей с целенаправленными CD44 мутациями ставит вопрос о том, как и когда разные CD44 белки необходимы для нормального здрового организма. Однако, если др. макромолекулы м. замещать CD44 во время раннего развития, то CD44 белки возможно выполняют лишь небольшое количество молекулярных действий.
Во-первых, CD44 м. действовать как лиганд-связывающий рецептор путем взаимодействия с ECM и др. компонентами внеклеточного матрикса или м. функционировать как специализированная 'platform' для ростовых факторов и (MMPs). Во-вторых, CD44 м. функционировать как ко-рецептор, напр., для модулирования активации рецепторов факторов роста. В-третьих, на молекулярном уровне CD44 м. действовать как организатор кортикального актинового цитоскелета.
CD44 as a ligand-binding surface protein
CD44 м. взаимодействовать с растворимыми внеклеточными компонентами и с ECM. Эта способность м. регулироваться извне клетки, напр., с помощью определенных модификаций CD44 или за счет увеличения количества CD44, которые влияют на его связывающее сродство, возможно путем увеличения шансов образования кластеров. Эти взаимодействия м.б. результатом внутриклеточной передачи сигналов и запуска клеточных реакций или они м.б. представленны пассвной адгезивной функцией. Вторая категория взаимродействий CD44 с лигандом представлена функцией CD44 в качестве белка клеточной поверхности, который свфзывет энзимы с их субстратами.
Adhesion to and migration through the ECM.
Хотя CD44 и взаимодействует с различными компонентами ECM, это не является существенным — за исключением взаимодействия CD44 с hyaluronan. Сродство CD44 к hyaluronan, по-видимому, модулируется извне клеток, т.к. его сродство к всязыванию усиливается митогенными стимулами, зависящими от состояния гликозилирования внеклеточных доменов и возможно от фосфорилирования специфических остатков серинав цитоплазматическом хвосте CD44. Модуляция связывающего сродства CD44 , по-видимому, важна для клеточной миграции в богатом hyaluronan матриксе,и для CD44- и
hyaluronan-зависимого . Так, CD44 локализуется в ведущем крае и ламеллоподиях некоторых типов клеток in vitro.
Обнаружение, что внеклеточная часть CD44 является субъектом протеолитического расщепления (возможно с помощью MMP) в некоторых линиях опухлевых клетоки в опухолях человека указывает на то. что м.б. и др. механизмы регулируемого связывания CD44–hyaluronan. Хотя протеаза, которая ответственна за это расщеплние еще неидентифицирована, очевидно, однако, что тонко регулируется с помощью путей внутриклеточной передачи сигналови с помощью serine протеаз. Ингибирование расщепления CD44 ведет к ингибированию миграции опухолеввых клеток на hyaluronan субстрате, это указывает на то, что расщепление вызывает высвобождение клеток, которые были связаны гиалуронаном.
Интересно, что связывание hyaluronan с CD44 запускает также метаболизм hyaluronan. Hyaluronan м. приниматься клетками CD44-зависимым образом. Неясно, какой сигнальный процесс запускает эндоцитоз, хотя ассоциированная receptor tyrosine kinase м. участовать. Итак, по крайней мере, при некоторых условиях CD44 м. сам вовлекаться в регуляцию околоклеточного гиалуронанового матрикса, обеспечивая тем самым др. механизм, с помощью которого CD44 м. влиять на адгезию и де-адгезию с ECM.
CD44 участвует также в некоторых 'passive' функциях, которые не нуждаются в прямой активации сигальных каскадов. Напр., известно, что hyaluronan м. действовать как адгезивная образующая мостики молекула между клетками, которые экспрессируют CD44. CD44 м. также влиять на нахождение пути аксонами. CD44 экспрессируется временной популяцией нейрон-подобных клеток, которые V-образно располагаются внутри границ будущего зрительного перекреста. Аксоны нейронов от развивающихся ганглиев сетчатки проецируются в направлении этих клеток и они или пересекают срединную линию или достигают срединной линии и образуют синапсы ipsilaterally. CD44 , по-видимому, блокирует пересечение или рост аксонов поверх срединной линии, возможно противодействуя функции L1 молекул клеточной адгезии, которые способствуют росту аксонов. Это действие CD44, по-видимому. пассивно, т.к. CD44 на поверхности погибших клеток ингибируют рост аксонов, а рост нейритов нейронов ганглиев дорсальных корешков сходным образом блокируется, даже растворимыми CD44.
Assembling enzymes and substrates.
CD44 м. функционировать как специализированные платформы для факторов роста и MMPs, взаимодействия с которыми необходимы для различных событий передачи клеточных сигналов. Так, CD44 рекрутирует на клеточную поверхность клеточной линии карциномы груди мышей. В этой системе, MMP9 способствует деградации коллагена IV и опосредует инвацию опухолевых клеток. MMP9 колокализуется с CD44 в участках, чувствительных к hyaluronidase; однако, MMP9, по-видимому, связывается с CD44 вне hyaluronan-связывающего мотива, т.к. CD44 антитела, которые взаимодействуют с hyaluronan связыванием все еще ко-иммунопреципитируют MMP9.
Помимо деградации коллагена IV в таких клетках карциномы груди мышей, MMP9 м. конвертировать неактивный предшественник проформы transforming growth factor (TGF)-β в активную форму. Эта активация наблюдается только, если MMP9 связана с клеточной поверхностью при помощи CD44, после чего активный TGF-β запускает неоваскуляризацию. Потеря CD44 вызывает нарушения активности TGF-β после повреждений в легких, вызыванных bleomycin.
Увеличение легочных метастазов после инъекции клеток карциномы груди, вызываемое действием MMP9, зависит от связывания hyaluronan и интернализации. Уменьшение метастазов клетками, которые неспособны связывать hyaluronan, обусловлены снижением миграции опухолевых клеток в легкие, дефектом пролиферации или увеличением апоптоза. В такой in vivo ситуации, связывание hyaluronan с помощью CD44, по-видимому, препятсвует апоптозу опухолевых клеток скорее, чем способствует их миграции или инвазивности. Итак, в одной и той же линии опухолевых клеток, три процесса — ингибирование апоптоза, деградация кооагена IV и неоваскуляризация — , по-видимому. зависят от CD44, и каждый из этих процессов является критическим для метастазирования.
(известная также как matrilysin) рекрутируется на поверхность клеток, по-видимому, с помощью CD44. MMP7 запускает протеолитическое расщепление heparin-binding epidermal growth factor (), которое зависит от связывания pro-form с боковой цепью heparan-sulphate, которая кодируется экзоном v3 of CD44 (Рис. 2a). Изоформы CD44, которые содержат v3 последовательности, обычно модифицируются с помощью боковых цеполчек heparan-sulphate, которые коныертируют CD44 в (HSPG). Соединение heparin-связывающих факторов роста с HSPG является предварительным условием для активации их рецепторов высокого сродства. Активированный HBEGF привлекается к участию в ремоделировани репродуктивных тканей самок путем активации receptor tyrosine kinase (известной также как HER4), которая передает сигналы, необходимые для выживания клеток.
Итак, привлечение MMP7 с помощью CD44 м. объяснить супрессию апоптоза, обнаруживаемого в опухолевых клетках.
В развивающихся конечностях HSPG формируемый клетками, экспрессирущими CD44, в апикальном эктодермальном гребне, необходим для презентации FGFs их рецепторам высокого сродства, которые локализованы в клетках подлежащей мезенхимы, это стимулирует их пролиферацию (Рис. 2b). В клетках линии Burkitt lymphoma отсутствует и CD44 и growth factor receptor Met, трансфекция только рецепторов Met недостаточна для их активации с помощью соответствующего лиганда — scatter factor/hepatocyte growth factor () — необходима и ко-трансфекция CD44 изоформ, которые имеют аминокислотные последовательности экзона v3. Однако, в др. линиях клеток зависимости от экзона v3 не обнаружено и активация нуждается в др. механизме.
Взаимодействие белков CD44, которые содержат экзонами v6- и v7-кодируемые последовательности, с фосфорилированным кислым гликопротеином () участвует в поддержании интеграции воспаленных тканей. CD44 антитела ингибируют способность OPN обеспечивать жизнеспособность клеток еостного мозга мышей. Потеря взаимодействия CD44–OPN м. также объяснить фенотип, наблюдаемый у мышей, дефицитных по экзонам v6 и v7. Эти мыши обнаруживают заметное ослабление воспаления при индуцированном экспериментальном колите и увеличивает апоптоз в воспаленной слизистой, это согласуется с функцией OPN по супрессии апоптоза в условиях воспаления (). Необходимо отметить, что др. функции CD44 (напр., взаимодействие с hyaluronan или ко-рецепторная функция) м. также объяснить его участие в воспалении.
Следовательно, белки CD44 м. отлавливать и концентрировать факторы, которые имеют отношение к росту и приводить в соприкосновение субстраты и энзимы. Эта функция платформ важна для различных процессов, где дальнодействующие и короткодействующие сигнальные события м.б. сконцентрированы и интегрированы на клеточной поверхности — напр., установление морфогенетических градиентов в ureteric зачатках и молочных железах, и взаимодействие опухолевых клеток или гематопоэтических клеток с их стромой.
CD44 as a co-receptor
Клетки воспринимают многие внеклеточные стимулы через посредство рецепторных тирозин киназ. Эти рецепторы пересекают плазматическую мембрану, а их цитоплазматические домены обладают каталитической киназной активностью и мотивами фосфорилирования, которые после активации рецептора образуют доки (docking sites) для многочисленных компонентов внутриклеточной сигнальной сети. Активация рецептора достигается с помощью взаимного межмолекулярного аутофосфорилирования субъединиц рецептора, эта ассоциация индуцируется или стабилизируется в рецепторе лигандом. Известно, что активация рецепторов более сложна у тех рецепторов, которые обычно ассоциируют с белками, которые влияют на активацию рецептора. В частности, т.наз. ко-рецепторы — у которых отсутствует киназный домен — кооперируют с рецепторными тирозин киназами для активации рецептора или модуляции киназной активности.
Итак, молекулы клеточной адгезии м. функционировать как ко-рецепторы. Напр., neural cellular adhesion molecule (NCAM) сотрудничают с .
CD44 такде м. действовать как ко-рецептор. Напр. , CD44 изоформы, которые содержат экзон v6 м. действовать как важные ко-рецепторы для активации Met. В некоторых линиях клеток и в первичных кератиноцитах, CD44 v6 сплайс-варианты катализируют образование комплекса с Met и с его лигандом (Рис. 2c). CD44 exon-v6-специфические антитела устраняют активацию Met. Более того, в линии опухолевых клеток, в которой экспрессируются только CD44s и Met рецепторы, Met не м.б. активирован несмотря на присутствие CD44 вариантов с exon-v6-кодирующими последовательностями. Для CD44 белков с функцией корепрессоров v3-кодируемые последовательности, которые делают возможными модификации sheparan-sulphate, не нужны. В соответствии с этим, a мутанты SF/HGF, которые лишены способности HSPG активировать Met в той же самой степени, что и белок дикого типа, несмотря на тот факт, что SF/HGF является HSPG-связывающим фактором роста.
CD44 функционирует также как ко-рецептор в отношении семейства ERBB receptor tyrosine kinase (Рис. 2d). CD44 м.б.ко-преципитирован с (известного также как EGFR/HER1), (известного также как HER2/neu), (известного также как HER3) и ERBB4 в некоторых клеточных линиях и первичных клетках.
Функция взаимодействий ERBB4–CD44 , по-видимому, связана с процессингом HBEGF с помощью MMP7. Взаимодействия между CD44 и др. членами семейства ERBB оказались критическими для активации рецепторов как в линиях карциномных клеток , так и в первичных Шванновских клетках. CD44s, по-видимому, обеспечивает ERBB2–ERBB3 гетеродимеризацию в ответ на (Рис. 2d), функция, которая существенна для дифференцировки, жизнеспосбности и пролиферации Шванновских клеток в периферической нервной системе.
Итак, различные CD44 сплайс-варианты функционируют как ко-рецепторы для разных рецепторных тирозин киназ. Однако, эта 'variant exon code' гипотеза нуждается в экспериментальной проверке. Возможно, что имеется просто эффект формирования кластеров, чтобы стабилизировать рецепторные димеры. Или напротив, формирование кластеров будет исключать белки, которые в отсутствие лиганда, регулируют негативно киназную активность.
Rj-рецепторная функция м. объяснить, по крайней мере, частично, как CD44 влияет на передачу сигналов в клетках. Тем не менее, непосредственны перенос сигналов через CD44 не м.б. исключен неспотря на отсутствие внутренне присущей каталитической активности на цитоплазматическом конце. Некоторые внутриклеточные белки, которые участвуют в процессах передачи сигналов, ассоциируют с CD44 цитаплазматическим хвостом.
Это и Src, Rho GTPase, Rho kinase, Rho GDP-dissociation inhibitor (GDI), T-lymphoma invasion and metastasis-inducing protein 1 (), , the proto-oncogene protein-tyrosine kinases и , PKC и прото-онкогены . Однако, неясно, являются ли эти взаимодействия прямыми или косвенными и являются ли они функциональными. Более того, имеются данные, что CD44 лиганды индуцируют передачу сигналов, особенно в иммунных клетках. Напр., CD44 антитела усиливают синтез MMP2 и индуцируют дифференцировку миэлоидных лейкемичных клеток. CD44 анитела и hyaluron фрагменты кроме того обнаруживают анти-апоптическую активностьи индуцируют экспрессию цитокинов с помощью макрофагов во время гематопоэза. Hyaluronan-зависимые эффекты коротко рассмотрены в Box 5. Сходным образом, CD44 кластеры с компонетами T-cell-receptor комплекса — как указывает активация внутриклеточного LCK или активация Rac с помощью на действие CD44-специфических антител. При этом не установлено, что сигнал проходит через CD44 скорее, чем через ассоциированные рецепторы.
Единственное, что указывает на прямой перенос сигнала через CD44, это исследование, в котором обработка клеток митогенами вызывает протеолитическое расщепление внутриклеточного домена CD44, обнаруживаемое в ядре. В экспериментах по ко-трансфекции внутриклеточный домен усиливает транскрипцию репортерной конструкции и эндогенного CD44 гена. Неясно, обусловливается ли эта активация транскрипции собственно цитоплазматическим хвостом CD44 или др. белками, ассоциированными с хвостом, или на пути (en route) к ядру или после того как хвост оказывается в ядре.
Rj-рецепторная функция CD44 изоформ объясняет роль CD44 в метастазировании опухолей и в миграции нормальных клеток (напр., дендритных клеток, которые нуждаются как в Met , так и в CD44 для своего путешествия через ткани. И platform и co-receptor функции м. б. ответственны за действие CD44 в гематопоэзе и в клетках иммунной системы во время стимулирования антиогенами,воспаления и при аутоиммунных заболеваниях.
Organizer of the cortical actin cytoskeleton
Способность CD44 взаимодействовать с белками, которые соединены с актиновым цитоскелетом — напр., ERM белками — указывает на др. способ, с помощью которого CD44 м. влиять на передачу клеточных сигналов. Так, избыточная экспрессия CD44 цитоплазматических хвостов ведет к тяжелому подавлению передачи сигналов от Met к Ras и ERK. Возможно, избыточная экспрессия ведет к секвестрированию с избыточно экспрессируемыми хвостами нормального набора внутриклеточных белков, которые ассоциируют с эндогенными CD44 молекулами. Такое секвестрирование невозможно, когда используются цитоплазматические хвосты с мутантным сайтом связывания ERM, это указывает на то, что ERM белки возможно функционируют в CD44–Met-опосредованной передаче сигналов. Возможно, что ERM белки, а, возможно, актиновый цитоскелет, связанный с ERM белками, участвуют в переносе сигналов (Рис. 2e, 3). Корреляция между состоянием актиновго цитосклета и передачей сигналов наблюдалась ранее при активации транскрипционных факторов SRF (serum response factor) и Jun. В этих случаях, однако, неполимерный G-actin , по-видимому, сам контролиует функцию SRF, а деструкция цитоскелета высвобождает ингибирующий блок, чтобы активировать Jun.
На основе того, что белки ERM необходимы для передачи сигналов CD44
авт. предположили, что передача сигналов нуждается в связях CD44–actin и локальной цитоскелетной организации . Эта гипотеза подтверждается событиями передачи сигналов, которые являются результатом соединения merlin с ERM-связывающим мотивом в цитоплазматическом хвосте CD44. В результате merlin, будучи активирован дефосфорилированием и связан с CD44, не м. связывать CD44 с actin. Активация merlin вызывает заметную реорганизацию кортикального актинового цитоскелета и в то же самое время блокирует активацию Ras, а также Ras-зависимую передачу сигналов. Активация merlin, по-видимому, происходит после инактивации белков ERM; merlin замещает белки ERM pво всех ERM-связывающих сайтах и ингибирует перенос сигналов от некоторых рецепторных тирозин киназ. Эти данные указывают, во-первых, что процесс передачи сигналов структурно организован — преформированные компоненты модулей сигнальной трансдукции м. функционировать в ассоциации с актиновым цитоскелетом, который организован с помощью ERM белков, связанных с CD44. Во-вторых, ассоциация CD44 сплайс вариантов со специфическими рецепторными тирозин киназами фокусируют такие сигнальные модули на этих рецепторах.
Интересно, что Met-зависимая передача сигналов также м. зависеть от комплексов, формируемых с α6β4-integrin.
Интегрин функционирует как сигнальный амплификатор, который не зависит от его внеклеочной части, которая содержит лиганд-связывающий мотив. Хотя интегрины и CD44 м. ко-преципитироваться, однако CD44–Met–integrin комплексы не м.б. обнаружены в лизатах клеток, стимулированных SF/HGF и содержащих CD44v6 варианты, α6β4-integrin
b Met.
A molecular switch between growth and arrest
Молекулярные свойства семейства CD44 белков м.б. учтены в модели, которая объясняет большинство из функций, приписываемых CD44. Белки CD44 собираются во внутриклеточные комплексы, которые важны для сигнальной трансдукции (Рис. 3). Ключевыми игроками в такой регуляции являются ERM белки, с одной стороны, и merlin, с др. стороны. В то время как ERM белки являются биологически активными, если фосфорилированы, то merlin активен, если дефосфорилирован. Фосфорилированные белки ERM соединяются с трансмембранными белками, такими как CD44, и поддерживают пролиферацию клеток. Дефосфорилированный merlin также связывает CD44, но это связывание вызывает ингибирование передачи сигналов и арест роста клеток (Box 2). Комплексы, которые связаны с CD44, отличаются в opfdbcbvjcnb от внеклеточных условий. После митогенной стимуляции комплекс содержит фосфорилированные ERM белки (плюс 'inactive' фосфорилированный merlin), по
tyrosine или serine (различные protein kinases, как полагают, действуют на ERM белки; Box 2). В таком growth-permissive состоянии (напр., при стимуляции факторами роста), CD44 м. формировть мультимерные комплексы, которые включают рецепторные тирозин киназы и др. партнерские белки, которые обеспечивают оптимальную способность передачи сигналов и усиливают рост, жизнеспособность, подвижность или др. функции клеток. ERM белки способствуют передаче сигналов от Met к Ras и к нижестоящим ERK, которые представляют собой принципиальную силу в управлении клеточного цикла. Напротив, др. стимулы от клеточной среды, которые предают сигналы к аресту роста (напр., высокая плотность клеток или накопление гиалуронана высокого молю веса; Рис. 3), запускают инактивацию ERM, сопровождаемую активацией merlin за счет неизвестной фосфатазы. Это ведет к ингибированию роста и инвазивности благодаря взаимодействию с передачей сигналов от рецепторов к Ras. Итак, белки CD44 действуют как интерпретаторы внеклеточной среды и осуществляют переключение между рост- и инвазивность-персиссивным и непермиссивным состоянием.
В дополнение к непосредственной реакции на внеклеточные сигналы молекулярное переключение меняет экспрессию и самого CD44 itself. Рост-пермиссивное состояние способствует транскрипции CD44 и включению последовательностей variant экзона. Напр., в опухолях или условиях, которые управляют пролиферацией посредством активации Ras и возможно др. онкогенов, CD44 транскрипционно активируется и мндуцирует включение variant экзонов. Напротив, merlin-зависимое непермиссивное состояние ингибируетакттивность промотора CD44 и вызывает пропуск variant экзона (Box 1).
Concluding remarks
Итак, белки семейства CD44 осуществляют три молекулярнных действия. Во-первых, CD44 м. связывать лиганды, котлорые влияют на поведение клеток независимо от взаимодействий с рецепторными тирозин киназами и актиновым цитоскелетом. Эти функции следующие: адгезия с гиалуронаном и др. компонентами внеклточного матрикса, а также навелдение аксонов, их действие в качестве платформ для ростовых факторов и др. молекул (напр., HSPG), и их регуляция сборки, разборки или использование околоклеточного базирующегося на гиалуронане матрикса.
Во-вторых, CD44 м. функционировать как ко-репрессоры, которые опосредуют передачу сигналов от рецепторных тирозин киназ. Эта функция белков CD44 важна, по крайней мере, для небольшой группы рецепторых тирозин киназ, которая включает Met и членов ERBB семейства рецепторных тирозин киназ. Большинство активностей. приписываемых CD44, в частности те, которые имеют отношение к росту опухолевых клеток, инвазиии и метастазированию, м.ю. объяснены этими взаимодействиями. Ясно, что многие из этих рецепторов и их партнерских белков присутствуют в виде больших комплексов, которые м. б. вовлечены в липидные платформы (lipid rafts), предполагается, что CD44 помогает организовывать ансамбли этих комплексов, гарантируя, что они будут передавать сигналы с оптимальной эффективностью.
В-третьих, CD44 м. обеспечивать связь между плазматической мембраной и актиновым цитосклетом. CD44 взаимодействет с белками, включая ERM белки, которые поперечно связывают трансмембранные рецепторы с актиновым цитоскелетом. Взаимодействие между ERM белками и merlin на CD44 м. обеспечивать динамику, которая необходима для движения клеток. В то же самое время, ERM белки и merlin противоположны в передаче сигналов от рецепторных тирозин киназ, причем белки ERM поддерживают передачу сигналов от рецепторных тирозин киназ к Ras, а merlin прерывает передачу.
Неясно, как CD44 м.б. опухолевым супрессором (напр., при раке простаты и нейробластоме; Box 4), как и большинство др. репрессоров опухолей CD44, по-видимому, действует как молекула. способствующая метастазированию. Обнаружение, что CD44 интерпретирует внеклеточные сигналы и переключает между рост- и инвазивность-способствующим и -супрессирующим состоянием указывает на то. что имеется тонкий баланс между этими состояниями.
